專利名稱:產(chǎn)甘油假絲酵母NAD<sup>+</sup>依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因及其克隆的制作方法
產(chǎn)甘油假絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因及其克隆技術(shù)領(lǐng)域產(chǎn)甘油假絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因及其克隆,涉及微生物 學(xué),基因工程和分子生物學(xué)等領(lǐng)域,特別涉及一種耐高滲產(chǎn)甘油假絲酵母中甘 油合成途徑的關(guān)鍵酶編碼基因NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因及其克隆。
背景技術(shù):
當(dāng)細(xì)胞處于高滲透壓環(huán)境中時(shí),為了保持胞內(nèi)的水分和小分子物質(zhì)向環(huán)境 中外泄,就需要通過自身合成一些生物相容性物質(zhì)來提高胞內(nèi)的滲透壓來平衡 胞內(nèi)和胞外的壓力差,從而起到保護(hù)和防御細(xì)胞的作用。對(duì)于酵母細(xì)胞而言, 在滲透壓脅迫作用時(shí)產(chǎn)生的生物相容性物質(zhì)主要是甘油,還有少量的其他多元 醇。NAD+依賴性3-磷酸甘油脫氫酶是釀酒酵母細(xì)胞以葡萄糖為碳源合成甘油過 程的限速酶,編碼該酶的基因存在兩個(gè)異構(gòu)形式:G^D7和GPD2,前者受滲透 壓誘導(dǎo)表達(dá),而后者在厭氧環(huán)境中起著平衡氧化還原力的作用。G尸D7基因的表 達(dá)水平是受到促有絲分裂源蛋白激酶(MAPK)介導(dǎo)的高滲壓甘油應(yīng)答途徑 (HOG)調(diào)控的。但是對(duì)于沒有經(jīng)過人工誘變或分子改造的釀酒酵母,其甘油 合成能力有限,通常為每升發(fā)酵液中含有幾克到十幾克甘油。產(chǎn)甘油假絲酵母(C朋cfe/ag/ycm'"oge朋W WL2002-5-59,是從自然界中分離 出來的一種優(yōu)良的能夠耐高滲壓的甘油生產(chǎn)菌株,它能在25X葡萄糖或5XNaCl 的高滲透壓培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)繁殖,在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模發(fā)酵中,甘油產(chǎn)量可達(dá)到 12%,即使在工業(yè)化規(guī)模中,甘油產(chǎn)量也可達(dá)到10%,這是用釀酒酵母甘油代謝 理論難以解釋的。目前,該酵母已經(jīng)應(yīng)用于甘油發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn),然而與釀 酒酵母相比,其相關(guān)的分子知識(shí)和遺傳背景非常缺乏。該產(chǎn)甘油假絲酵母 (Ca"&<iag/jcen'"oge"&^ WL2002-5-59巳在中國專利CN1070235C中公開,公告 日2001年8月29日。產(chǎn)甘油假絲酵母(C. g/yceW"oge"^) WL2002-5-59甘油合成的關(guān)鍵酶基因 NAD、甘油3-磷酸脫氫酶基因克隆有以下幾點(diǎn)重要作用1、 為從分子水平上深入研究Caws^fag/少cen'woge"a5高產(chǎn)甘油的代謝機(jī)制奠 定了基礎(chǔ)。2、 為試圖通過分子改造進(jìn)一步提高OzW油g^^"o^"^的發(fā)酵特性提供 了可能性。3、 為研究不同酵母屬種的高滲壓信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間的差異提供了材料。4、 為微生物和真核生物的抗逆性改良研究特別是抗高滲透壓研究提供了更加豐富的優(yōu)良候選基因。 發(fā)明內(nèi)容甘油3-磷酸脫氫酶是假絲酵母(C朋^fog/少cer/wogew^) WL2002-5-59高產(chǎn) 甘油中的限速酶,本發(fā)明的目的在于提供一種新的產(chǎn)甘油假絲酵母甘油3-磷酸 脫氫酶基因及其編碼序列。在本發(fā)明中,術(shù)語"甘油3-磷酸脫氫酶"、"胞漿NAD+-依賴的甘油3-磷 酸脫氫酶"、"3-磷酸甘油脫氫酶"或/和"GPD"可互換使用,都指具有產(chǎn)甘 油假絲酵母甘油3-磷酸脫氫酶氨基酸序列(SEQIDN0.2)蛋白或多肽。甘油3-磷酸脫氫酶脫氫酶催化的反應(yīng)如下sn-Glycerol 3-phosphate+NAD+ _ Glycerol 3-phosphate+NADH一方面,本發(fā)明提供一種包含編碼甘油3-磷酸脫氫酶基因的DNA片段。 更具體的說,本發(fā)明提供包含調(diào)控序列,如啟動(dòng)子和終止子,以及甘油3-磷酸脫氫酶基因的開放閱讀框的DNA分子。本發(fā)明提供編碼Om^/a g/ycm'woge"" WL2002-5-59的甘油3-磷酸脫氫酶 基因的DNA片段。所述DNA是指含有側(cè)翼5、-和3'-非翻譯區(qū)中的短片段之間 的開放閱讀框的DNA或包含有調(diào)控序列如在C^2^Wa g/ycer&oge"" WL2002-5-59表達(dá)甘油3-磷酸脫氫酶基因所必需的啟動(dòng)子和終止子的基因組 DNA。相應(yīng)地,本發(fā)明涉及含有選自下述組的核酸分子的多核苷酸a) 編碼SEQIDNO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸,b) 與編碼含有SEQ ID N0.2的氨基酸序列的多肽至少70%同源性的氨基酸 序列的多肽的多核苷酸,c) 與a)或b)的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸,d) 與a)中經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失或添加的有義突變。 在本發(fā)明的另一方面,提供了一種編碼的多肽,所述多肽具有與SEQ IDNO.2所示氨基酸序列至少70y。同源性的序列或其片段。更佳的,所述多肽是含 有SEQ ID N0.2所示氨基酸序列的多肽。 本發(fā)明的技術(shù)方案一種產(chǎn)甘油假絲酵母(g/ycen'w ge"" ) WL2002-5-59中分離的多核 苷酸,其核苷酸序列為SEQIDNO.l。如上所述的多核苷酸的2082bj>~3249bp的核苷酸序列,編碼基因產(chǎn)甘油假 絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶,其氨基酸序列為SEQ ID N0.2。其2082bp—3249bp的核苷酸序列,經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、置 換、倒位或添加的有義突變。所述的多核苷酸含有SEQ IDNO.l中自起始密碼子ATG上游向前的 l-2081bp核苷酸序列。所述產(chǎn)甘油假絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因的克隆(1) 簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-5-59的甘油3-磷酸脫氫 酶基因片段以GeneBank公布的其他物種的甘油3-磷酸脫氫酶的基因序列為基礎(chǔ),通過 序列比對(duì)分析,設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物CD-U: 5'-TBRTBGGITCHGGYAAITGGG-3', CD-R: 5'-RGCVAIVAYRTTYTTYARIGC-3';通過PCR技術(shù),以WL2002-5-59基因組DNA為模板,以CD-U, CD-R為 引物擴(kuò)增獲得0.63kb的核苷酸片段,經(jīng)過TA克隆,測(cè)序;(2) 反向引物PCR擴(kuò)增WL2002-5-59的甘油3-磷酸脫氫酶基因的全長(zhǎng)序列根據(jù)簡(jiǎn)并引物PCR獲得的DNA序列結(jié)果,設(shè)計(jì)一對(duì)反向引物 Cgl-F: 5'-C CTTATTTCCGTGTTCGTGTTATTAGTG-3', Cgl-R: 5'-CGCCTTCAATCAATTC TTCATAGAC-3';提取WL2002-5-59基因組DNA,分別用萬"wH I 、戶W I 、 1酶切后用 酚、氯仿純化,再用T4DNA連接酶進(jìn)行自身連接環(huán)化,用乙醇沉淀后作模板進(jìn) 行PCR擴(kuò)增分別獲得6.7kb 、 2.5kb、 2.3kb的DNA片段,經(jīng)TA克隆挑選陽性 轉(zhuǎn)化子,序列測(cè)定拼接后獲得全長(zhǎng)的產(chǎn)甘油假絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫 酶編碼基因及其側(cè)翼調(diào)控序列。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用簡(jiǎn)并引物PCR和反向PCR法從產(chǎn)甘油假絲 酵母WL2002-5-59的染色體基因組中克隆出甘油合成的限速酶基因產(chǎn)甘油假 絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因(CgG尸Z))及其側(cè)翼的調(diào)控序列。該 基因全長(zhǎng)4900bp,在2082bp處具有起始密碼子ATG, 3246bp處具有終止密碼 子TAA。該序列無內(nèi)含子,具有1167bp完整的開放閱讀框,編碼388個(gè)氨基酸。 所述基因的氨基酸序列與釀酒酵母(5Wcc/zaram;;cas ce^v^'ae)基因G尸D1同源 性高達(dá)60%,與安格斯畢赤酵母(尸/cWaa"g^to)基因同源性高達(dá)70%。 該基因的克隆擴(kuò)大了微生物抗?jié)B透壓脅迫研究的基因資源,也為產(chǎn)甘油假絲酵 母高產(chǎn)甘油的分子機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。CgG戶Z)基因的克隆為運(yùn)用基因工程技 術(shù)改善微生物及其它高等真核生物的抗逆性改良研究提供了更加豐富的優(yōu)良候 選基因。
圖1、簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增甘油3-磷酸脫氫酶基因0.63kb片段。Lane 1 DNA Marker: DL2000; Lane 2 and Lane 3簡(jiǎn)并引物PCR產(chǎn)物。圖2、反向PCR擴(kuò)增甘油3-磷酸脫氫酶基因及其側(cè)翼序列。
Lane 1, DNA Marker: JDNA/揚(yáng)dlII; Lane 2,以BamH I酶切基因組DNA的反向PCR產(chǎn)物; Lane 3,以尸W I酶切基因組DNA的反向PCR產(chǎn)物; Lane 4,以1酶切基因組DNA的反向PCR產(chǎn)物; Lane 5 , DNA Marker: DL2000 。
具體實(shí)施方式
下面通過具體的實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明。實(shí)施例1:簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增Ca"&A g/少cehwoge"" WL2002-5-59的甘油 3-磷酸脫氫酶基因片段1. 簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)搜索GeneBank公布的相關(guān)酵母和其他真核生物的甘油3-磷酸脫氫酶基因 的序列,通過氨基酸序列的比對(duì)分析,找到兩個(gè)保守區(qū)域?qū)?yīng)的氨基酸序列為 VVGSGNWGT和GALKNVVA,根據(jù)這兩個(gè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物CD-U: 5'-TBRTBGGITCHGGYAAITGGG-3',CD-R: 5'畫RGCVAIVAYRTTYTTY認(rèn)GC-3'。其中I指次黃嘌呤堿基;R指A或G; Y指C或T; H指A、 C或T; V指A、 C或G; B指C、 G或T。2. C朋^ia g(ycenVwge"es WL2002-5-59基因組DNA的提取 產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-5-59染色體DNA制備按參考文獻(xiàn)[酵母遺傳學(xué)技術(shù)手冊(cè)]進(jìn)行。將提取的DNA用DU640核酸蛋白分析儀進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)A260/A28() 的比值判斷所提取的DNA純度,利用260nm下的OD值計(jì)算所提取的DNA濃 度,同時(shí),通過瓊脂糖凝膠電泳判定模板的質(zhì)量。3. PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系50 ML,包含5 10x Hot Start TaqTM Buffer (Mg2+ plus,大連寶生 物公司),化L 2.5mM DNTPs, l^L l.OOmM簡(jiǎn)并引物CD-U和CD-R, IjiL C. g/_ycm'wogewas WL2002-5-59基因組DNA作為模板,加入1.25 U Hot Start Taq,(大連寶生物公司),最后用水補(bǔ)足體積50 nL。 PCR擴(kuò)增條件95°C變性 4分鐘,隨后94'C 50秒、56°C 90s、 72°C 2分鐘進(jìn)行32個(gè)循環(huán),最后以 72。C延伸15鐘。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,獲得片段長(zhǎng)度約為0.63kb的核酸分子, 膠回收后按pGEM-T-Easy (Promega)試劑盒操作說明進(jìn)行TA克隆,測(cè)序結(jié)果獲 得一個(gè)631 bp的序列。將該序列及其編碼蛋白質(zhì)序列用Blast程序在GeneBank (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與 安格斯畢赤酵母的甘油3-磷酸脫氫酶基因有較高的同源性,證實(shí)了簡(jiǎn)并引物的
正確性。實(shí)施例2:反向引物PCR擴(kuò)增甘油3-磷酸脫氫酶基因的全長(zhǎng)序列1、 反向PCR引物的設(shè)計(jì)根據(jù)簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增獲得的序列結(jié)果,設(shè)計(jì)一對(duì)反向PCR引物 CgI畫R: 5'畫CGCCTTCAATCAATTCTTCATAGAC-3'用于PCR擴(kuò)增。2、 PCR模板的制備按上述方法提取C. g(ycen'wogew^ WL2002-5-59的基因組DNA,分別用限 制酶萬"mH I ,戶W I和1各酶切5jig基因組DNA,瓊脂糖電泳檢査酶切效果。 用l: 1的酚和氯仿等體積抽提酶切產(chǎn)物,然后用2.5倍體積的無水乙醇沉淀, 最后溶于50)iL超純水中。在200pL連接體系中,加入O.l昭酶切后的DNA , 20pL的連接緩沖液和10UT4DNA連接酶,用水補(bǔ)足體積,16匸過夜。連接 產(chǎn)物用無水乙醇沉淀后,溶于25(iL無菌超純水中,用于下一步反向PCR擴(kuò)增。3、 反向PCR擴(kuò)增反向PCR擴(kuò)增體系50 ^L: 50 ng自環(huán)化的基因組DNA作為模板,5 pL 10xLA TaqTM Buffer (大連寶生物公司),8|iL 2.5mM的DNTPs,上下游引物各 lpL和1.25 ULATaqW(大連寶生物公司),用無菌水補(bǔ)足體積50 ^。 PCR擴(kuò)增 條件如下95°C變性4分鐘,隨后94°C 50秒、60°C 3分鐘、68°C 3.5 分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后以72 i:延伸IO分鐘。電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,用B謹(jǐn)H I酶切后自環(huán)化的基因組DNA作為模板獲得6.7kb的DNA片段,用i3" I酶 切后自環(huán)化的基因組DNA作為模板獲得2.5kb的DNA片段,用1酶切后自 環(huán)化的基因組DNA作為模板獲得2.3kb的DNA片段,分別膠回收6.7kb、 2.5kb 和2.3kb后,按pGEM-T-Easy (Promega)試劑盒操作說明進(jìn)行TA克隆,通過藍(lán) 白鑒定挑取陽性克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)拼接后獲得全長(zhǎng)的C. g/少cen'"oge"^甘油 3-磷酸脫氫酶基因序列和側(cè)翼序列。實(shí)施例3: C. gfycen'MogMM甘油3-磷酸脫氫酶基因序列信息和同源性分析本發(fā)明產(chǎn)甘油假絲酵母甘油3-磷酸脫氫酶基因的核苷酸序列全長(zhǎng)4900bp, 詳細(xì)序列見SEQIDNO.l,其中開放閱讀框于2082-3246位核苷酸,編碼388個(gè) 氨基酸,并且內(nèi)部編碼框內(nèi)不含有內(nèi)含子。將產(chǎn)甘油假絲酵母甘油3-磷酸脫氫酶基因序列及其編碼蛋白用BSLAT程序translations+PDB+SwissProt +PIR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索,結(jié)果 發(fā)現(xiàn)在氨基酸水平上,它與安格斯畢赤酵母的甘油3-磷酸脫氫酶基因有70%的 同源性,與釀酒酵母的甘油3-磷酸脫氫酶基因有60%的同源性。由此可見,產(chǎn)
甘油假絲酵母甘油3-磷酸脫氫酶基因與其它酵母的甘油3-磷酸脫氫酶基因在蛋 白質(zhì)水平上存在較高的同源性,屬于同一家族蛋白。實(shí)施例4:產(chǎn)甘油假絲酵母甘油3-磷酸脫氫酶蛋白的結(jié)構(gòu)和功能將產(chǎn)甘油假絲酵母甘油3-磷酸脫氫酶蛋白的氨基酸在blocks數(shù)據(jù)庫 (http:/www.blocks.fhcrc.org)中檢索結(jié)構(gòu)域,發(fā)現(xiàn)在該氨基酸序列中存在甘油 3-磷酸脫氫酶蛋白功能模塊,因此可以預(yù)見其具有甘油3-磷酸脫氫酶蛋白的相應(yīng) 功能。用在線預(yù)測(cè)軟件(http:/www.psortnibb.ac.jp)進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位分析 發(fā)現(xiàn),產(chǎn)甘油假絲酵母甘油3-磷酸脫氫酶蛋白是位于細(xì)胞的胞漿中,這進(jìn)一步 驗(yàn)證了所克隆的基因是屬于胞漿NAD+-依賴的甘油3-磷酸脫氫酶。SEQ ID NO.lCtgCagELgtCat ttaaaaaa caacaatgcc agtcccatct cacaggccac acactgtact ttagacgtga agattgcgcagtggtgggtc ggtgaagtgt 鄉(xiāng)ga犯ggc aaatg鄉(xiāng)gggatggttatc caccattatt ttcgccataa gccgcggtta cttttttttc catttccgga cagtctgtac tctccggagt 卿ggtagcg caggLgtcca/t tccgtaaaat atggtt犯ac tggcaatctc ggccacatgc 犯a^cttggc ttggcaaatt ttg犯ggcgt agtggcgttt ttggcaa鄉(xiāng) gtttatttta tctcaaatac gattatctac cagaagacta gtacaattgc atgttaatattctacgtttt ccactacagt gtcg犯3犯c ggc卿caag aggaagtSLgt ctccaacaag aggatctgtt a"gcg鄉(xiāng)g3t agtgcagggt 3ttcta^g8g 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aa^ag3g犯c ctgccagcat tggtgtc卿 gctacaatca caatgatgtcc tgggtccatt tgaaatcgat aatattgtgt gtttgccatc aaagc3c3tt agattattac caeitg犯tac tagtttctcacatccccaca3gcc3gagttaatattcctc 2460 aaggctagag 2520 ctcttcactg 2580 ttagctxctg 2640 gacgatttca 2700 agaccttatt 2760 ctcaag犯tg 2820 gcaaaggctg 2880 ttcgatggct 2940 actacctgtg 3000 tctgcaacgg 3060 actagggaag 3120 accaccacct 3180 gaacctgtgg 3240 agtccgccaa 3300 tttagctgca 3360 cttacctccc 3420 tactagagtt 3480 actgcacggg 3540 atgatggtct 3600 ctgtgcatcc 3660 atatgctcaa 3720 ccctgacaaa 3780 ttgcaagcat 3840 gagaacgaga 3900 caacatcact 3960 acactcagac 4020 acgctaaaga 4080 tgggaacagt 4140 gcagcagcaa 4200 cctactgaga 4260 accgggtttg 4320 atcaacagga 4380 gccaageLtga 4440 ggcgagaaaa 4500 3gaagaa3gg 4560 3aBtaccaaa 4620 tgtttttcct 4680 ctcaaaccaa 4740 ttatttaaac 4800 郷解鄉(xiāng)a^ 4860 4900 SEQ2lD N0.2Met Val Ser Pro Ala 1 5 Lys Pro Asn Arg Lys 20Pro Glu His Pro Phe 35Gly Cys Thr lie Ala 50Pro Arg Gin Phe Gin 65Leu lie Glu Gly Glu 80Glu Asn Val Lys Tyr 95Val Ala Val Pro Asp 110lie Val Phe Asn lie 125Gin Leu Lys Gly Lys 140Leu Lys Gly Leu Asp 155Thr Val lie Thr Glu 170Gly Ala Asn Leu Ala 185Thr Thr Val Ala Tyr 200Lys Asp lie Asp His 215Tyr Phe Arg Val Arg 230Ala Gly Ala Leu Lys 245Glu Arg Leu Ser Thr 10Asp Ser Thr Ser Leu 25Lys Val Thr Val Val 40Lys Val lie Ala Glu 55Arg Asp Val Asn Met 70Lys Leu Thr Glu lie 85Leu Pro Gly lie Lys 100lie Val Glu Ala Cys 115Pro His Gin Phe Leu 130Val Asn Pro Lys Ala 145Val Asn Pro Asn Gly 160Glu Leu Gly lie Tyr 175Pro Glu Val Ala Gin 190Thr lie Pro Asp Asp 205Gin lie Leu Lys Ser 220Val lie Ser Asp Val 235Asn Val Val Ala Met 250lie Ala Ser Thr lie 15Gin Pro Glu Asp Tyr 30Gly Ser Gly Asn Trp 45Asn Thr Val Glu Arg 60Trp Val Tyr Glu Glu 75lie Asn Thr Arg His 90Leu Pro Val Asn Val 105Ala Gly Ser Asp Leu 120Pro Arg lie Leu Ser 135Arg Ala lie Ser Cys 150Cys Lys Leu Leu Phe 165Cys Gly Ala Leu Ser 180Cys Lys Trp Ser Glu 195Phe Arg Gly Lys Gly 210Leu Phe His Arg Pro 225Ala Gly lie Ser lie 240Ala Ala Gly Phe Val 255Glu Gly Leu Gly Trp 260lie Gly Leu Val Glu 275Gly Cys His Ala Ala 290Asp Leu lie Thr Thr 305Arg Tyr Met Ala Gin 320Lys Leu Leu Asn Gly 335Glu Val Tyr Glu Phe 350Pro Leu Phe Thr Thr 365lie Glu Lys Leu Pro 380Gly Asp Asn Ala Lys 265Thr lie Gin Phe Ala 280Thr Phe Thr His Glu 295Cys Ala Gly Gly Arg 310His Ser Val Ser Ala 325Gin Ser Cys Gin Gly 340Leu Ser Asn Met Gly 355Thr Tyr Arg lie lie 370Glu Cys Leu Glu Pro 385Ala Ala Val Met Arg 270Lys Thr Phe Phe Asp 285Ser Ala Gly Val Ala 300Asn Val Arg Val Gly 315Thr Glu Ala Glu Glu 330lie His Thr Thr Arg 345Arg Thr Asp Glu Phe 360Tyr Glu Asn Phe Pro 375Val Glu Asp 388
權(quán)利要求
1、一種產(chǎn)甘油假絲酵母(Candida glycerinogenes)WL2002-5-59中分離的多核苷酸,其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。
2、 如權(quán)利要求1所述的多核苷酸的2082b^3249bp核苷酸序列,編碼基 因產(chǎn)甘油假絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶,其氨基酸序列為SEQ ID N0.2。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種分離的多核苷酸SEQIDNO.l,其特征是其 2082bp~3249bp核苷酸序列,經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、置換、倒位 或添加的有義突變。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種分離的多核苷酸SEQIDNO.l,其特征是所 述的多核苷酸含有SEQ ID NO.l中自起始密碼子ATG上游向前的l-2081bp核苷 酸序列。
5、 如權(quán)利要求2所述產(chǎn)甘油假絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因的 克隆,其特征是(1) 簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-5-59的甘油3-磷酸脫氫 酶基因片段以GeneBank公布的其他物種的甘油3-磷酸脫氫酶的基因序列為基礎(chǔ),通過 序列比對(duì)分析,設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物CD畫U: 5 '網(wǎng)TBRTBGGITCHGGYAAITGGG國3 ', CD畫R: 5 '-RGCVAIVAY R TTYTTYARIGC-3';通過PCR技術(shù),以WL2002-5-59基因組DNA為模板,以CD-U, CD-R為 引物擴(kuò)增獲得0.63kb的核苷酸片段,經(jīng)過TA克隆,測(cè)序;(2) 反向引物PCR擴(kuò)增WL2002-5-59的甘油3-磷酸脫氫酶基因的全長(zhǎng)序列根據(jù)簡(jiǎn)并引物PCR獲得的DNA序列結(jié)果,設(shè)計(jì)一對(duì)反向引物 Cgl-F: 5'-C CTTATTTCCGTGTTCGTGTTATTAGTG-3', CgI畫R: 5'畫CGCCTTCAATCAATTC TTCATAGAC-3';提取WL2002-5-59基因組DNA,分別用BawH I 、 A〉 I 、 &/I酶切后用 酚、氯仿純化,再用T4DNA連接酶進(jìn)行自身連接環(huán)化,用乙醇沉淀后作模板進(jìn) 行PCR擴(kuò)增分別獲得6.7kb 、 2.5kb、 2.3kb的DNA片段,經(jīng)TA克隆挑選陽性 轉(zhuǎn)化子,序列測(cè)定拼接后獲得全長(zhǎng)的產(chǎn)甘油假絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫 酶編碼基因及其側(cè)翼調(diào)控序列。
全文摘要
產(chǎn)甘油假絲酵母NAD<sup>+</sup>依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因及其克隆,屬于微生物分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種新的基因序列SEQID NO.1,采用簡(jiǎn)并引物PCR和反向PCR法從產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-5-59的基因組DNA中克隆出甘油合成的限速酶NAD<sup>+</sup>依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因及其側(cè)翼的調(diào)控序列。該基因全長(zhǎng)4900bp,在2082bp處具有起始密碼子ATG,3246bp處具有終止密碼子TAA。該序列無內(nèi)含子,具有1167bp完整的開放閱讀框,編碼388個(gè)氨基酸。其與釀酒酵母GPD1基因同源性高達(dá)60%,與安格斯畢赤酵母GPD基因同源性高達(dá)70%。該基因的克隆擴(kuò)大了微生物抗?jié)B透壓脅迫研究的基因資源,也為產(chǎn)甘油假絲酵母高產(chǎn)甘油的分子機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/53GK101157931SQ200710131859
公開日2008年4月9日 申請(qǐng)日期2007年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月6日
發(fā)明者方慧英, 微 沈, 王正祥, 諸葛健, 陳獻(xiàn)忠, 饒志明 申請(qǐng)人:江南大學(xué)