專利名稱：：一種銅活化細菌及其用于土壤重金屬污染的植物修復(fù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種銅活化細菌及其用于土壤重金屬污染的植物修復(fù)方法，屬于農(nóng)業(yè)和環(huán)境污染治理
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及利用一種細菌強化植物提取土壤中的銅重金屬，從而實現(xiàn)土壤重金屬污染的植物修復(fù)。二、技術(shù)背景重金屬是土壤環(huán)境來源廣泛、危害性很大的一類積累性污染物，不僅退化土壤肥力、降低作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，惡化水環(huán)境，并通過食物鏈危及人類的生命和健康。土壤重金屬污染日益嚴(yán)重，因此，修復(fù)重金屬污染土壤已顯得非常迫切。與成本昂貴、操作繁瑣的傳統(tǒng)理化方法相比，植物修復(fù)技術(shù)因其具有價廉、環(huán)保等優(yōu)點而倍受關(guān)注。植物修復(fù)技術(shù)包括植物穩(wěn)定、植物揮發(fā)和植物提取，其中植物提取技術(shù)已經(jīng)被公認為是重金屬污染土壤最具有潛力的修復(fù)技術(shù)。重金屬污染土壤的植物提取技術(shù)(phytoextmction)是指超積累植物種在重金屬污染的土壤上，而該種植物對土壤中的有毒重金屬元素有特殊的吸收和吸附能力，將植物收獲并進行妥善處理(如灰化回收)后即可將該種重金屬移出土體，達到重金屬污染治理與生態(tài)修復(fù)的目的。超積累植物用于重金屬污染土壤的提取修復(fù)盡管已有成功案例，但目前的應(yīng)用范圍仍然十分有限。該項技術(shù)所面臨的主要問題在于(1)目前已發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)超積累植物植株矮小，生物量低，生長緩慢，生長周期長，只對特定重金屬有積累作用，難以直接應(yīng)用；(2)應(yīng)用生物技術(shù)改造超積累植物以提高其生物量，或創(chuàng)造新的具有較高重金屬富集能力的高生物量植物的研究剛剛開始，實現(xiàn)目標(biāo)尚需很長的時間；(3)通過螯合劑、土壤改良劑、植物激素等化學(xué)物質(zhì)有目的的改變重金屬在土壤中的移動性、促進植物生長，但是修復(fù)成本較高，殘留的螯合劑等可能會造成二次污染。因此，尋求一條既能大幅度提高植物修復(fù)效率、又能改善土壤生態(tài)環(huán)境，環(huán)境友好且成本低廉的植物修復(fù)的途徑極為重要。重金屬在土壤中的活性和生物有效性受到多種因素的制約，人們發(fā)現(xiàn)自然環(huán)境中微生物能通過其代謝活動及其產(chǎn)物促進重金屬的溶解，提高重金屬在土壤中的生物有效性，在一定程度上改善了土壤的理化性質(zhì)，促進植物根系對重金屬的吸收和積累；此外微生物還能分泌植物激素促進植物旺盛生長，增大其生物量，提高植物修復(fù)土壤重金屬污染的效率。植物與微生物聯(lián)合對重金屬污染土壤的修復(fù)已經(jīng)成為生物修復(fù)研究熱點。國外Joner等人研究發(fā)現(xiàn)，菌根真菌與植物共生使得植物吸收重金屬Cd的量比非菌根化植物高。由于菌根存在穩(wěn)定性差、不易保存和控制、接種昂貴、效率低等問題，目前菌根的商業(yè)化和規(guī)?；幸欢y度。一般來講，重金屬污染往往導(dǎo)致土壤微生物生物量的減少和種類組成的改變，根際微生物對土壤重金屬污染環(huán)境存在適應(yīng)性分化，長期受金屬污染的環(huán)境可能已存在豐富的耐重金屬微生物資源。從重金屬污染環(huán)境中篩選耐重金屬根際微生物，活化重金屬，提高植物對重金屬的吸收積累，從而強化重金屬超積累植物提取土壤重金屬的效率，促進植物修復(fù)土壤重金屬技術(shù)的應(yīng)用。三
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的就是提供一種重金屬銅活化細菌及其強化土壤重金屬污染的植物提取修復(fù)方法。通過分離篩選超積累植物根際重金屬活化細菌，在植物根際接種，通過細菌對重金屬的活化，實現(xiàn)土壤重金屬銅污染的高效快速的修復(fù)。技術(shù)方案本發(fā)明所提供的重金屬銅活化細菌JYC17菌株(2007年7月26日寄存于在武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號為CCTCCNO:M207117)是從中國江蘇省南京市某銅尾礦區(qū)生長的植物根際土壤中分離得到，經(jīng)鑒定為微桿菌屬(M/cro^"en'wmsp.)。主要生物學(xué)特性為G+，幼齡時菌體為桿狀，無鞭毛，無芽孢，衰亡時細胞呈球狀。乙酰甲基醇(V.P.)試驗，明膠液化，檸檬酸鹽試驗，硫化氫試驗陰性；能發(fā)酵葡萄糖，但不能發(fā)酵乳糖、阿拉伯糖和甘露醇；甲基紅(M.R.)試驗，過氧化氫酶試驗，淀粉水解陽性。有氮培養(yǎng)基上生長良好，單個菌落圓形，邊緣整齊，直徑l3mm，白色，不透明。通過常規(guī)的微生物發(fā)酵方法，可以培養(yǎng)本發(fā)明所述的重金屬銅活化細菌JYC17菌株，并制得以本發(fā)明所述的JYC17菌株為有效成分的生物修復(fù)制劑?？墒褂貌萏?、蛭石等載體吸附配制呈顆粒劑或粉劑等劑型。上述重金屬銅活化細菌用于土壤重金屬污染的植物修復(fù)方法，其特征在于在含重金屬的濕潤土壤中播種植物種子，接種JYC17菌株生物修復(fù)制劑，每千克土壤接種108個細菌/mL的菌液1020mL，分1一2次接種。有益效果本發(fā)明所述的銅活化細菌JYC17菌株能抗多種重金屬(Pb2+600mg/L，Cu2+250mg/L，Cd2+50mg/L，Zn2+100mg/L，Ni2+50mg/L，Cr6+40mg/L)。本發(fā)明所提供的重金屬銅抗性細菌JYC17菌株對溶液中沉淀態(tài)銅有良好的活化作用，活化率達到73%。本發(fā)明所述的重金屬活化細菌及其強化植物土壤重金屬污染修復(fù)的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比有如下優(yōu)點(1)本發(fā)明所述的JYC17菌株具有ACC脫氨酶(1-aminocyclopropane-l-carboxylicacid)活性，產(chǎn)生鐵載體，有助于提高植物抗逆性(抗旱、抗?jié)?、抗鹽堿、抗病蟲害)；該菌株能產(chǎn)生吲哚乙酸，具有固氮、溶磷特性，有助于促進植物生長。(2)利用植物根際重金屬抗性細菌活化重金屬，提高植物提取修復(fù)效率。(3)可以回收重金屬，無二次污染。四具體實施方式本發(fā)明重金屬銅活化細菌JYC17菌株從中國江蘇省南京市銅尾礦區(qū)生長的植物根際土壤中分離純化得到。實施例1菌株JYC17活化溶液中不溶性碳酸銅在250ml的三角瓶中裝入100ml稱有CuC030.100g的有氮培養(yǎng)基(蔗糖10g，(NH4)2S041g，KH2P042g，MgS040.5g，NaCl0.1g，CaC030.5g，酵母膏0.5g),12rC滅菌30min。接種菌株JYC17，在30'C、150r/min搖床振蕩培養(yǎng)，分別于0、18、36、54、72h取樣，測定OD6oo;用pH計測定培養(yǎng)液中pH值；培養(yǎng)液離心，取上清液用原子吸收法測定Ci^+的濃度。結(jié)果見表l。在菌體的生長初期，培養(yǎng)液中的有效銅濃度隨菌體密度的增加而降低，這是由于菌體本身對銅離子有吸附作用，此時菌體的吸附作用占優(yōu)勢；在菌體生長后期，以菌體代謝為主，菌體產(chǎn)酸使得培養(yǎng)液中pH下降，活化出的銅離子遠遠超出菌體自身的吸附作用，培養(yǎng)液中銅離子濃度大大增加?；罨蔬_到73%左右。實施例2菌株JYC17活化土壤中沉淀態(tài)氫氧化銅準(zhǔn)確稱取含氫氧化銅(Pb500mg/kg)和碳酸鎘(Cd500mg,/kg)的土樣10.00g加入50ml離心管，以紗布包口，高壓滅菌。菌株JYC17于28'C搖床培養(yǎng)20h，離心收集菌體，用去離子水制成菌懸液。接種3ml菌懸液于土樣中，以接等量去離子水為對照，每個處理設(shè)3個重復(fù)，定期補充水分。離心管放入培養(yǎng)箱中28X:培養(yǎng)3d、7d、13d和21d后取出。稱2g土于7ml離心管中，加4ml水，搖床震蕩混勻2h，離心取上清液測定水溶態(tài)重金屬Cu濃度。稱lg土于7ml離心管中，加5ml醋酸銨(lmol/L)，搖床震蕩混勻2h，離心取上清液測定交換態(tài)重金屬Cu濃度。重金屬濃度采用原子吸收法測定。結(jié)果見表2。接種JYC17菌株處理的土壤中沉淀態(tài)銅被活化，水溶態(tài)銅和交換態(tài)銅濃度分別增加21.7%和112.7%。實施例3液體制劑將斜面菌種接種于有氮培養(yǎng)基(蔗糖10g，(NH4)2S041g，KH2P042g，MgS040.5g，NaCl0.1g，CaC030.5g，酵母膏0.5g)中，培養(yǎng)18小時后接入種子罐。種子罐為0.5噸，投料量為0.4噸，種子罐培養(yǎng)基成分為蔗糖2.0kg,(NH4)2S040.25kg，KH2P040.7kg，MgSO40.17kg，NaCl0.07kg,CaC030.4kg,酵母膏0.2kg。種子罐須先用蒸汽滅菌并冷卻至28-3(TC,接種量為體積比5%，種子罐培養(yǎng)溫度控制在28-32"C，攪拌速度為220轉(zhuǎn)/分，無菌空氣通入量為1:0.8，培養(yǎng)20小時后將種子液接入生產(chǎn)罐。生產(chǎn)罐為7噸，投料量為4.5噸，培養(yǎng)基成分為蔗糖8kg，淀粉18kg，(NH4)2S044.5kg，KH2PO49.0kg，MgS042.3kg，NaCl0.9kg，CaC034.5kg，酵母膏0.9kg。生產(chǎn)罐預(yù)先用蒸汽滅菌并冷卻至28-30'C，培養(yǎng)溫度控制在28-32'C，攪拌速度為250轉(zhuǎn)/分，無菌空氣通入量為1:0.8。培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)液中菌體數(shù)量達到10億/ml以上。培養(yǎng)液即可灌裝為生物修復(fù)制劑。實施例4粉劑將實施例3所得的培養(yǎng)液用草炭吸附，培養(yǎng)液與草炭之比為1:3.5，攪拌混合、粉碎，即得制劑。實施例5重金屬活化細菌強化油菜提取土壤中的銅采集重金屬銅污染的土壤，風(fēng)干磨碎，裝入塑料盆缽，每盆2kg，加水使含水量為田間持水量的60%，保持2d，每盆播入油菜種子7粒。接種實施例3所得的以JYC17菌株為有效成分的生物修復(fù)菌劑10ml，對照分別接等量無菌水和滅活菌液。植株生長期間每天以稱重法加入蒸餾水，保持土壤濕度為田間持水量的60%。生長30天后再接種實施例3所得的以JYC17菌株生物修復(fù)菌劑10ml—次。播種60d收獲，沿土面剪取植株地上部，同時洗出根系，在105'C下殺青，7(TC烘干，稱量根、莖、葉的干重，植物樣品磨碎后用硝酸-高氯酸法消煮，原子吸收分光光度計測定植株中重金屬Cu含量。結(jié)果見表3。接種JYC17菌株使得油菜干重增加12.2^,植株中重金屬銅濃度提高35.2%，尤其根中012+濃度提高76.8%，促進植物生長和銅的吸收。實施例6超積累植物印度芥菜接種重金屬活化細菌提取土壤中的銅采集重金屬銅污染的土壤，風(fēng)干磨碎，裝入塑料盆缽，每盆2kg，加水使含水量為田間持水量的60%，保持2d，每盆播入印度芥菜種子7粒。接種實施例3所得的以JYC17菌株為有效成分的生物修復(fù)菌劑10ml，對照接等量無菌水。植株生長期間每天以稱重法加入蒸餾水，保持土壤濕度為田間持水量的60%。生長30d后再接種實施例3所得的以JYC17菌株為有效成分的生物修復(fù)菌劑10ml—次。播種60d收獲，沿土面剪取植株地上部，同時洗出根系，在105'C下殺青，7(TC烘干，稱量根、莖、葉的干重，植物樣品磨碎后用硝酸-高氯酸法消煮，原子吸收分光光度計測定植株中重金屬Cu含量。結(jié)果見表4。接種JYC17菌株促進植物生長，油菜干重增加16.6%，土壤重金屬銅活化效率達到8%左右，012+向印度芥菜地上部轉(zhuǎn)移，莖和葉中重金屬012+濃度分別達到13.02mg/kg禾卩22.28mg/kg。表l菌株JYC17對溶液中不溶性碳酸銅的活化作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2菌株JYC17對土壤中沉淀態(tài)氫氧化銅的活化作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3重金屬活化細菌JYC17強化油菜提取土壤中的銅<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表4重金屬活化細菌JYC17強化超積累植物印度芥菜提取土壤中的銅<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1.一種重金屬銅活化細菌，其特征在于該微生物是革蘭氏染色陽性的微桿菌屬(Microbacteriumsp.)的菌株JYC17，2007年7月26日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號為CCTCCNOM207117。2.—種含有權(quán)利要求1所述重金屬銅活化細菌的生物修復(fù)制劑，其特征在于液體制劑含有JYC17菌株有效活菌數(shù)為10億個以上/毫升，固體制劑含有效活菌數(shù)2億個以上/克。3.權(quán)利要求1所述的重金屬銅活化細菌用于土壤重金屬污染的植物修復(fù)方法，其特征在于在含重金屬的濕潤土壤中播種植物種子，接種JYC17菌株生物修復(fù)制劑，每千克土壤接種1()S個細菌/mL的菌液1020mL，分l一2次接種。全文摘要本發(fā)明涉及一種銅活化細菌及其強化植物土壤重金屬污染修復(fù)的方法，屬于農(nóng)業(yè)和環(huán)境污染治理
技術(shù)領(lǐng)域：
。重金屬銅活化細菌菌株JYC17為微桿菌屬(Microbacteriumsp.)。液體制劑含有有效活菌數(shù)為10億個以上/毫升，固體制劑含有效活菌數(shù)2億個以上/克。用法為在含重金屬的濕潤土壤中播種植物種子，接種JYC17菌株生物修復(fù)制劑，每千克土壤接種10⁸個細菌/mL的菌液10～20mL，分1-2次接種。該菌株對溶液中沉淀態(tài)銅有良好的活化作用，活化率達到73％以上。在含重金屬的濕潤土壤中種植植物，接種生物修復(fù)制劑，促進植物對重金屬銅的吸收提取，提高植物提取修復(fù)效率。文檔編號C12N1/20GK101153273SQ20071013224公開日2008年4月2日申請日期2007年9月26日優(yōu)先權(quán)日2007年9月26日發(fā)明者何琳燕,江春玉,盛下放,馬海艷申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)