專利名稱：：褶皺臂尾輪蟲微核制備技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及到輪蟲微核的制備方法及其作為污染物毒性指標(biāo)的應(yīng)用，是一種應(yīng)用細(xì)胞毒理學(xué)來(lái)進(jìn)行環(huán)境污染物毒性;險(xiǎn)測(cè)的4支術(shù)。
背景技術(shù)：
：在化學(xué)物質(zhì)中，有很多能引起染色體的異常，化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)染色體異常在細(xì)胞核水平表現(xiàn)為染色體丟失或斷片形成而出現(xiàn)的微核，檢測(cè)微核出現(xiàn)的幾率可以作為衡量化學(xué)物質(zhì)毒性的一種指標(biāo)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于從細(xì)胞毒理學(xué)角度研究生物對(duì)環(huán)境污染物的反應(yīng)集中在以下幾個(gè)方面；一是利用植物根尖細(xì)胞在有絲分裂過(guò)程中對(duì)重金屬毒性的反應(yīng)情況，如以蠶豆根尖、洋蔥根尖、大蒜根尖等植物根系放入含有重金屬鎘離子的溶液中培養(yǎng)24小時(shí)，然后對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，觀察并統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生微核的概率，以此來(lái)衡量重金屬鎘離子的毒性；二是利用動(dòng)物細(xì)胞來(lái)做類似的實(shí)驗(yàn)，如利用小白鼠骨髓紅細(xì)胞微核率來(lái)檢測(cè)污染物的毒性。至今未見利用水體浮游生物的細(xì)胞核作為受試材料進(jìn)行微核檢測(cè)的報(bào)道。就水體污染物環(huán)境;f全測(cè)而言，充分利用水體的浮游生物，尤其是浮游動(dòng)物來(lái)檢測(cè)污染的程度是一個(gè)理想的指標(biāo)，目前從細(xì)胞毒理學(xué)角度，尤其是利用陸生動(dòng)植物中已經(jīng)廣泛應(yīng)用的微核技術(shù)來(lái)作為檢測(cè)指標(biāo)還處于空白狀態(tài)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是描述以水體浮游生物褶皺臂尾輪蟲作為衡量水體污染物有害程度的一種微核技術(shù)，主要解決了輪蟲微核的制備技術(shù)及其在水體環(huán)境監(jiān)測(cè)上的應(yīng)用，主要內(nèi)容為先對(duì)輪蟲進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)，再利用壓片法從輪蟲卵母細(xì)胞中制備微核，以統(tǒng)計(jì)微核率的大小作為衡量污染物毒性的指標(biāo)，是一種新型水體環(huán)境檢測(cè)技術(shù)。圖中線條指示的小核為微核，其周圍兩個(gè)大的核為卵母細(xì)胞核分裂后形成的兩個(gè)細(xì)胞核。具體實(shí)施例方式本發(fā)明可以通過(guò)以下幾個(gè)操作步驟實(shí)現(xiàn)一、輪蟲采集及鑒別從野外含有褶皺臂尾輪蟲的水樣中取水樣，經(jīng)慮網(wǎng)篩慮，濃縮含有輪蟲的液體，用虹吸管吸取單個(gè)輪蟲，放置于載玻片上，在解剖鏡(4xl0-40倍鏡)下鑒別輪蟲的種類，挑選出褶皺臂尾輪蟲。二、輪蟲擴(kuò)大培養(yǎng)從以上野外采集的水樣中選取1000個(gè)左右的褶皺臂尾輪蟲放入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中選用淡水小球藻作為褶皺臂尾輪蟲的辨料投喂淡水小球藻時(shí)，小球藻與輪蟲培養(yǎng)液的比例為1:50。三、重金屬鎘離子攻毒培養(yǎng)以上輪蟲集中培養(yǎng)2-3天后，把其平均分成8組分別放入12孔培養(yǎng)板中進(jìn)行鎘離子攻毒實(shí)驗(yàn)，方法如下根據(jù)鎘離子毒性劑量試驗(yàn)所測(cè)得的濃度范圍，確定八個(gè)實(shí)驗(yàn)鎘離子濃度即0.1mg/L，0.2mg/L，0.4mg/L，0.8mg/L,1.2mg/L,2,4mg/L,4.8mg/L和原培養(yǎng)液對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。分別取上述濃度的鎘離子處理液2毫升放在12孔培養(yǎng)板中，再在每個(gè)培養(yǎng)孔中放入大約200個(gè)活力較強(qiáng)的輪蟲，然后每個(gè)培養(yǎng)孔中再加入0.5毫升的淡水小球藻，最后調(diào)節(jié)處理液的PH值使其達(dá)到8.0左右。把培養(yǎng)板放入25。C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24-48小時(shí)。四、微核鏡檢與制片觀察分別用吸管吸取一滴各濃度鎘離子輪蟲培養(yǎng)液滴在載玻片上，加入10%Giemsa染色液進(jìn)行活體染色十五分鐘，加上蓋玻片后放在10x10倍顯微鏡下用解剖針輕輕擠壓蓋玻片，此時(shí)一邊觀察顯微鏡中輪蟲形態(tài)的變化，一邊反復(fù)擠壓蓋玻片，直至看見有液體從輪蟲尾部流出為止；調(diào)整顯微鏡視野，觀察蓋玻片下所有輪蟲的形態(tài)變化情況，直至利用解剖針把約80%左右的輪蟲都從其尾部擠出液體為止。此時(shí)，用濾紙輕輕擦、吸干蓋玻片周圍的液體，調(diào)整顯微鏡，利用10x100倍的油鏡進(jìn)行觀察。此時(shí)會(huì)在視野中發(fā)現(xiàn)大量的處于細(xì)胞核分裂狀態(tài)的卵母細(xì)胞核出現(xiàn)，由于輪蟲屬于主要營(yíng)孤雌生活的浮游生物，其繁殖力很強(qiáng)，所以每個(gè)輪蟲都可以觀察到15-30個(gè)左右的這樣卵母細(xì)胞的存在。同時(shí)，在這些卵母細(xì)胞處于分裂期的細(xì)胞核周圍，還會(huì)出現(xiàn)處于染色較深狀態(tài)小細(xì)胞核(稱之為微核)的存在。五、微核統(tǒng)計(jì)與分析對(duì)微核出現(xiàn)的數(shù)目和觀察到的總卵母細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)鎘離子濃度下約觀察5000個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)微核率，微核率(％)=微核數(shù)目/總觀察細(xì)胞數(shù)。微核率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1表1輪蟲微核率統(tǒng)計(jì)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>從表1中可以看出，用不同濃度的鎘離子處理輪蟲，輪蟲細(xì)胞中出現(xiàn)的微核幾率存在著差異，且隨著鎘離子濃度從最低濃度Omg/L到0.4mg/L的范圍內(nèi)，所產(chǎn)生的微核率呈遞增趨勢(shì)，而0.4mg/L至4.8mg/L的范圍內(nèi)，輪蟲微核率又呈遞減趨勢(shì)。前者微核率逐漸遞增變化說(shuō)明以輪蟲微核率作為衡量重金屬鎘離子的毒性是很有規(guī)律可循的，可以把這種微核出現(xiàn)的幾率作為評(píng)價(jià)重金屬等水體污染物毒性的指標(biāo)；后者微核率又呈逐漸遞減趨勢(shì)的變化是由于隨著鎘離子濃度提高，其毒性越強(qiáng)，產(chǎn)生了毒性抑制，輪蟲卵母細(xì)胞核不再進(jìn)行分裂，輪蟲的正常生殖能力受到了干擾造成的。權(quán)利要求1、褶皺臂尾輪蟲微核制備方法利用重金屬如鎘離子溶液對(duì)褶皺臂尾輪蟲進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，處理24小時(shí)后以10％Giemsa染料進(jìn)行蟲體整體染色，染色15分鐘后在輪蟲上蓋上蓋玻片；在10×10＝100倍的顯微鏡下，先找到輪蟲，再利用解剖針在輪蟲的位置向下擠壓蓋玻片，力量由輕逐漸加重，反復(fù)多次，直至看見帶有細(xì)胞核的卵母細(xì)胞由輪蟲身體尾部從兩側(cè)流出，擠壓至完全流出為止；利用油鏡，10×100＝1000倍的顯微鏡下檢驗(yàn)卵母細(xì)胞核，發(fā)現(xiàn)在主細(xì)胞核附近出現(xiàn)一些小的細(xì)胞核，即微核。全文摘要本發(fā)明是一種褶皺臂尾輪蟲微核的制備技術(shù)，其特征在于，水體中環(huán)境污染物(如重金屬鎘離子)可以對(duì)水體中大量生存的浮游生物——輪蟲產(chǎn)生毒性，在細(xì)胞水平上表現(xiàn)為輪蟲卵母細(xì)胞的核分裂受到影響，可以產(chǎn)生小的細(xì)胞核，即微核，統(tǒng)計(jì)這種微核出現(xiàn)的次數(shù)，計(jì)算微核率，進(jìn)一步可以以微核率的大小來(lái)衡量環(huán)境污染物的毒性大小。本發(fā)明以重金屬鎘離子對(duì)輪蟲細(xì)胞微核率的影響為例，具體闡述了褶皺臂尾輪蟲微核的制備方法，包括輪蟲攻毒、壓片、染色和觀察等幾個(gè)操作步驟，摘要附圖中顯示了輪蟲細(xì)胞微核的大小和形態(tài)。文檔編號(hào)C12Q1/02GK101131385SQ200710132449公開日2008年2月27日申請(qǐng)日期2007年9月17日優(yōu)先權(quán)日2007年9月17日發(fā)明者靜徐,李曉英,趙艷景,閻斌倫,陳建華,煥高申請(qǐng)人:淮海工學(xué)院