專利名稱：丙型肝炎病毒rna依賴的rna聚合酶體外活性測定方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明丙型肝炎病毒RNA依賴的RNA聚合酶體外活性測定方法及應(yīng)用涉及的是一 種利用基因工程技術(shù)，制備可溶性的丙型肝炎病毒RNA依賴的RNA聚合酶(RDRP酶或 NS5B)蛋白，并制備磁性納米顆粒。將RNA模板一端固定在磁性納米顆粒上，加入96 孔反應(yīng)板微孔內(nèi)，再加入RNA依賴的RNA聚合酶蛋白等構(gòu)成RNA復(fù)制體系,在磁性納 米顆粒上復(fù)制的RNA雙鏈，摻入標(biāo)記了生物素。RNA復(fù)制后，用外磁場的磁鐵將磁性 納米顆粒吸附在微孔底部，反復(fù)洗滌吸附后與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的親和素 結(jié)合，吸附洗滌后，加入辣根過氧化物酶的底物顯色。利用建立的方法，可從中藥庫 及化合物庫內(nèi)篩選新的RNA依賴的RNA聚合酶的活性抑制劑。本發(fā)明涉及基因工程技 術(shù)、納米磁分離富集和RNA相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
丙型肝炎呈世界性分布，各國丙型肝炎病毒(HCV)感染率為O. 1% 10%，平均為3%， 約l. 7 2億人感染HCV。我國也是丙型肝炎高發(fā)地區(qū)之一，我國一般人群HCV感染率為 3.2%，約3800萬人感染HCV。急性HCV感染者中大約有8(^的患者會成為慢性持續(xù)性感 染者，其中20%的患者經(jīng)歷20 30年后可進(jìn)展為肝硬化，1% 5%患者可進(jìn)展為肝細(xì)胞性 肝癌(HCC)。
雖然目前慢性丙型肝炎的抗病毒治療進(jìn)入第三階段，主要應(yīng)用聚乙二醇干擾素 (PEG-IFN)聯(lián)合利巴韋林治療方案,可使半數(shù)以上的患者取得持續(xù)性病毒應(yīng)答，但是 對于聚乙二醇干擾素(PEG-IFN)聯(lián)合利巴韋林的治療,還有一部分患者的療效應(yīng)答不 理想,這一部分患者的治療是慢性丙型肝炎研究領(lǐng)域的一個難題。因?yàn)槁员透窝谆?者可供選擇的治療藥物種類非常有限，因此，探索新的治療藥物是當(dāng)務(wù)之急?？梢灶A(yù)期， 丙型肝炎非結(jié)構(gòu)3區(qū)、非結(jié)構(gòu)5B區(qū)(HCVNS3、 NS5B)蛋白酶等特異靶點(diǎn)抑制劑的臨床 應(yīng)用，將進(jìn)入到慢性丙型肝炎抗病毒治療的第四個階段,必將進(jìn)一步提高持續(xù)性病毒 應(yīng)答。
丙型肝炎病毒(HCV)是一條長約9.6kb的正鏈RNA,包括5'非編碼區(qū)(5' -UTR)、 開放讀碼框架(ORF)以及3'非編碼區(qū)(3' -UTR) 。 ORF翻譯產(chǎn)生一條多肽鏈,它隨后 被加工成至少10種不同的蛋白質(zhì)，其中包括l種殼(核心)蛋白，2種包膜蛋白(E1和E2) 和5種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2 ,NS3 ，NS4 , NS5A和NS5B)。其中NS5B蛋白是一種RNA依賴的 RNA多聚酶(RDRP),它是HCV復(fù)制的關(guān)鍵酶。
重組HCV NS5B聚合酶蛋白具有模板引物依賴性，能在體外用HCV 3'端的相同核 苷酸作為復(fù)制引物，起始HCV RNA負(fù)鏈的合成。這一研究成果為建立細(xì)胞外復(fù)制模型 奠定了基礎(chǔ)。分子水平高通量HCV聚合酶模型，與整體動物和組織器官的篩選相比較， 分子水平的HCV聚合酶藥物篩選模型具有材料用量少，藥物作用機(jī)制比較明確，可實(shí) 現(xiàn)大規(guī)模的篩選等特點(diǎn)。理論上講，阻斷上述病毒復(fù)制周期的NSSB聚合酶，可抑制病 毒復(fù)制。
開展以丙型肝炎病毒RNA依賴的RNA聚合酶(HCV RDRP酶)為靶位的抗病毒藥物的篩 選，首先要進(jìn)行RNA依賴的RNA聚合酶活性的測定。因此，RNA依賴的RNA聚合酶活性的 測定的新方法和新模型的建立正日益受到重視。目前，國外對該酶活性的體外測定方 法進(jìn)行了研究，并用于酶抑制劑的篩選。但是建立的活性測定方法復(fù)雜、不實(shí)用，主 要使用同位素標(biāo)記技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對上述不足之處提供一種丙型肝炎病毒RNA依賴的RNA聚合酶 (RDRP酶或NS5B蛋白)體外測定方法及應(yīng)用，是利用基因工程技術(shù)，制備可溶性的 丙型肝炎病毒NS5B蛋白，并制備磁性納米顆粒。將RNA模板一端固定在磁性納米顆 粒上，加入96孔反應(yīng)板微孔內(nèi)，再加入RNA引物、NS5B蛋白、核糖核酸(NTP)、生 物素標(biāo)記的11位尿苷三磷酸(Biotin-ll-UTP)等構(gòu)成RNA復(fù)制體系，在磁性納米顆 粒上復(fù)制的RNA雙鏈，摻入標(biāo)記了生物素。RNA復(fù)制后，用外磁場磁鐵將磁性納米顆 粒吸附在微孔底部，反復(fù)洗滌吸附后與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的親和素結(jié)合， 吸附洗滌后，加入辣根過氧化物酶(HRP)的底物顯色。加入NS5B蛋白酶抑制劑，可 抑制RNA的復(fù)制，阻斷顯色。利用建立的方法，從中藥庫及化合物庫內(nèi)篩選新的NS5B 蛋白酶活性抑制劑。本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)、納米磁分離富集和RNA相關(guān)技術(shù)領(lǐng) 域。
丙型肝炎病毒RNA依賴的RNA聚合酶體外活性測定方法及應(yīng)用是采取以下方案實(shí) 現(xiàn)的 1. NS5B片段的PCR (聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增C端截短21個氨基酸的HCV NS5B基因片斷(HCV NS5B-C21)。 2.表達(dá)HCV NS5B-C21蛋白片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建
提取質(zhì)粒pET28a(+)，用^s歷H I和i7w I雙酶切，電泳后回收酶切的質(zhì)粒大片 段，溶于去離子水內(nèi)。同樣用Sa/* I和J力o I雙酶切PCR擴(kuò)增的NS5B-C21蛋白基因
片段，電泳回收后，溶于去離子水內(nèi)。
取等摩爾濃度的上述兩種酶切后DNA片段，在同一離心管內(nèi)用T4 DNA連接酶連 接，使NS5B蛋白基因片段插入到載體pET28a(+)內(nèi)的^g』I和i7w I位點(diǎn)之間，與 載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達(dá)一個融合蛋白。 3.重組質(zhì)粒和表達(dá)融合蛋白工程菌的篩選與鑒定
將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布含卡那霉素(60ug/ml)LB平板，置 37°C過夜。次日隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落和一個對照菌，對照菌為質(zhì)粒pET28a轉(zhuǎn)化菌，誘 導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白，收集菌體進(jìn)行十二垸基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 檢測，重組子表達(dá)相對分子量約為65 kD的HCV NS5B-C21蛋白，而對照菌BL21(DE3) 無此蛋白帶。
將篩選出的陽性克隆表達(dá)菌提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定和酶切鑒定，鑒定正確的 質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果完全正確。
4. 表達(dá)的NS5B-C21蛋白的純化
1) 表達(dá)NS5B蛋白工程菌的超聲裂解
將誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的工程菌離心收菌，菌體重懸于裂解液內(nèi)，冰浴超聲破菌， 離心收集上清，棄沉淀。收集的上清液用于下一步的親和純化。
2) 鎳瓊脂糖凝膠(Ni-S印harase 6 Fast Flow)親和層析法純化 將鎳瓊脂糖凝膠(Ni-S印harase6FastFlow)親和層析柱連接至常壓層析系統(tǒng)，
先用平衡液沖洗平衡，細(xì)菌超聲裂解上清液加鎳瓊脂糖凝膠(Ni-S印harase 6 Fast Flow)室溫結(jié)合，上柱后收集穿過峰。用結(jié)合緩沖液洗滌柱子，接著用分別含100raM、 200 mM、 300 mM、 500 mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，十二烷基硫酸鈉一聚丙烯 酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測目的蛋白。
5. 純化的NS5B蛋白用作抗原檢測HCV抗體
將純化的HCV NS5B蛋白用50 mmol/L的碳酸鹽pH9. 6倍比稀釋后包被酶聯(lián)板，
間接酶聯(lián)免疫法檢測已知的抗丙肝病人陽性血清及正常人血清，NS5B-C21蛋白能與 丙肝病人陽性血清反應(yīng)，不與正常人血清反應(yīng)，說明NS5B-C21蛋白有較好抗原性和 特異性。
6. 磁性納米復(fù)合顆粒修飾
首先，液相載體可采用磁性納米顆粒Si02/(P畫A/Fe304) (二氧化硅/(聚甲基丙 烯酸甲脂/四氧化三鐵))，將之加入乙醇/水的比例為199/1混合溶液中，為了更好地 分散該顆粒，需將該溶液進(jìn)一步超聲。然后，將氨基硅烷化試劑(APTS)滴加到以上 混合溶液，并在室溫下攪拌。最后，利用外加磁場將APTS修飾的磁性顆粒從反應(yīng)介 質(zhì)中分離出，并用乙醇溶液對其清洗。
在修飾完APTS之后，將以上顆粒加入到含3。/。戊二醛的PB溶液中，并在37'C下 攪拌3小時。該過程中通過氨基與醛基之間形成的Schiff堿在磁性顆粒表面修飾上 醛基官能團(tuán)。反應(yīng)結(jié)束后，利用外加磁場將顆粒從反應(yīng)介質(zhì)中分離出，并用PB溶液 反復(fù)清洗產(chǎn)物。
所述的液相載體材料包括磁性納米顆粒、玻片、金屬片、硅片、陶瓷片、塑料片、 硝酸纖維膜或尼龍膜。
所述的液相載體表面以具有雙活性基團(tuán)的長鏈有機(jī)化合物進(jìn)行修飾，常用的具有 雙活性基團(tuán)的長鏈有機(jī)化合物試劑有戊二醛、三羥甲基氨基硅垸、N,N-二乙氧基氨 基丙基三乙氧基硅烷、多聚賴氨酸，可采用其中的一種或其中的兩種的組合。
7. 丙型肝炎RNA依賴的RNA聚合酶(HCV RdRp酶)活性測定方法的建立 化學(xué)合成RNA模板，并在其5'端進(jìn)行氨基(-NH2)修飾。合成兩種RNA模板，
一個為RdRp酶活性測定通用的poly(A)，長度為20個A，該序列為5' NH2—-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-—3';另一個為HCV RNA的3'端的一段特異序列，該 序列為5' NH2-—CTTGGCGTAATCATGGTCAT---3'。將RNA模板修飾固定在核殼結(jié)構(gòu) 復(fù)合磁性納米顆粒上并加入磁分離微孔反應(yīng)板微孔內(nèi)，再加入引物、純化的RdRp酶， 核糖核酸(NTP)，生物素標(biāo)記的ll位尿苷三磷酸(Bio-11-UTP)等，構(gòu)成RNA復(fù)制 反應(yīng)體系。通過摻入生物素標(biāo)記單體，利用NS5B蛋白的RNA依賴的RNA聚合酶的活 性，使另一條RNA鏈得到延伸，在外磁場下分離除去非特異性吸附片段，再與酶標(biāo)記 的親和素結(jié)合，洗滌后，向微孔內(nèi)加入底物顯色劑顯色。同時用磁鐵吸附后將顯色液 轉(zhuǎn)移到96孔酶聯(lián)板內(nèi)，用酶聯(lián)儀測定各孔的吸光值(A450值)。
8.從中藥樣品庫和小分子化合物庫內(nèi)篩選新的NS5B蛋白酶活性抑制劑
用96孔或384孔微孔反應(yīng)板，每個微孔內(nèi)加入結(jié)合有Poly(A) RNA模板的納米磁 性顆粒，每個微孔內(nèi)都形成一個相同的NS5B蛋白酶活性測定體系，在向反應(yīng)體系內(nèi) 加入NS5B蛋白酶之前，先向各孔分別加入不同的待篩選抑制劑，待篩選抑制劑為中 藥成分或大分子化合物或小分子化合物，同時設(shè)立已知NS5B蛋白酶活性特異性抑制 劑陽性對照孔。通過各孔的顯色情況即可判定結(jié)果，同時用磁鐵吸附后將顯色液轉(zhuǎn)移 到96孔酶聯(lián)板內(nèi)，用酶聯(lián)儀測定各孔的吸光值(A450值)。
對篩選到的陽性抑制劑，更換RNA模板，用HCV RNA的3'端一段特異RNA作為 模板，再進(jìn)行抑制試驗(yàn)。
一種丙型肝炎NS5B酶活性測定的方法在丙型肝炎以NS5B為靶位的抗病毒藥物的 篩選中的應(yīng)用，包括篩選大分子化合物庫、小分子化合物庫或中藥庫中的抑制劑。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的優(yōu)點(diǎn)
建立的丙型肝炎病毒NS5B酶活性測定方法有如下優(yōu)點(diǎn)
1本發(fā)明以納米磁顆粒為反應(yīng)介質(zhì)，在微孔反應(yīng)板內(nèi)反應(yīng)，使用生物素標(biāo)記，以 是否顯色判斷反應(yīng)結(jié)果，該方法簡單、實(shí)用、無放射性，可以克服目前的該酶的活性 測定的方法復(fù)雜、不實(shí)用，主要使用放射性同位素標(biāo)記技術(shù)等缺點(diǎn)。
2. 全長NS5B蛋白一般為包涵體的形式存在，本發(fā)明為提高NS5B蛋白的溶解性， 在構(gòu)建NS5B表達(dá)載體時切除了其C端的21aa，結(jié)果在E. coli.中表達(dá)了高度可溶性 蛋白，避免了對酶活性有影響的變性一復(fù)性過程。
3. 本發(fā)明體外活性測定采用納米磁顆粒不僅可以有效捕獲生物大分子，而且可以 起到富集和放大檢測信號的作用而實(shí)現(xiàn)生物大分子的超靈敏識別，正成為特征生物信 息高通量獲取的一種重要工具。
4.利用實(shí)驗(yàn)室建立的抗病毒中藥庫篩選HCVNS5B抑制劑，體現(xiàn)了其特有的優(yōu)越 性和創(chuàng)新性，作用靶點(diǎn)明確，同時又可以闡明中藥的作用機(jī)理。所以建立NS5B蛋白酶 活性體外測定的安全、方便、適合蛋白酶抑制劑的篩選的新方法是十分必要的。


以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明-
圖1是本發(fā)明1%的Agarose凝膠檢測HCV NS5B-C21 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。圖1 中M表示Marker (TaKaRa DL2000); 1表示NS5B-C21 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即圖內(nèi)箭頭標(biāo) 示的位置。 . 圖2是本發(fā)明表達(dá)NS5B-C21蛋白的重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。
圖3是本發(fā)明篩選表達(dá)NS5B-C21蛋白重組菌的SDS-PAGE分析結(jié)果。圖3中標(biāo)號 為1 8表示1 8號重組菌，2 6號重組子均表達(dá)相對分子量約為65000的融合蛋 白，即圖內(nèi)箭頭標(biāo)示的位置；M表示低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(Pharmacia); C表示對照菌 E. coli BL21 (DE3)。
圖4是本發(fā)明1%的Agarose凝膠檢測陽性重組子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切鑒定產(chǎn)物 電泳圖。圖4中M表示Marker (TaKaRa DL2000); 1表示以陽性重組子為模板的 NS5B-C21 PCR產(chǎn)物；2表示陽性重組子酶切鑒定產(chǎn)物。
圖5是本發(fā)明親和層析法純化NS5B-C21蛋白前后的SDS-PAGE分析結(jié)果。圖5中 M表示低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(Pharmacia); 1表示NS5B-C21細(xì)菌裂解上清液；2表示 NS5B-C21穿過峰；3表示含lOOmM咪唑的洗脫液洗脫的目的蛋白；4表示含200mM咪 唑的洗脫液洗脫的目的蛋白；5表示含300mM咪唑的洗脫液洗脫的目的蛋白；6表示 含500mM咪唑的洗脫液洗脫的目的蛋白。
圖6是本發(fā)明HCV NS5B RdRp酶活性測定方法示意圖。
圖7是本發(fā)明丙型肝炎NS5B酶抑制劑的篩選示意圖。圖中1表示磁分離微孔反 應(yīng)板；2表示磁鐵板；3為深灰色孔，表示NS5B酶未被抑制；4為灰色孔，表示NS5B 酶被抑制。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明實(shí)施方式的詳細(xì)說明
丙型肝炎病毒C端截短21個氨基酸NS5B蛋白的克隆、表達(dá)及鑒定 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增HCVNS5B-C21，即C端截短21個氨基酸NS5B蛋白的基因片斷， 將基因片段克隆至質(zhì)粒pET28a(+)內(nèi)的/ /力o1位點(diǎn)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)，篩選獲得了高效表達(dá)NS5B的工程菌，表達(dá)的NS5B蛋白約占菌體蛋白總 量的20%左右。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析法純化目的蛋白表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳進(jìn) 行鑒定。 材料和方法
1. 質(zhì)粒和菌株大腸桿菌BL21 (DE3) 、HCV全長cDNA質(zhì)粒、原核表達(dá)載體pET-28a (+) 均由本室保存。
2. 試劑和儀器高保真DNA聚合酶(Pyrobest DNA Polymerase),脫氧核糖核
酸(dNTP) ， BamHl, Xho I ,質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、 TAE電泳緩沖液、 SDS-PAGE蛋白電泳試劑等由配制(配方參考《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)。PCR擴(kuò)增 儀；高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司)；瓊脂糖凝膠電泳裝置；蛋白電泳裝置 (Bio-Rad公司)；脫色搖床(江蘇興化市分析儀器廠)。
3. 引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)HCV cDNA全長質(zhì)粒DNA序列，并按構(gòu)建融合蛋白 6His-pET-28a(+)-NS5B-C-21表達(dá)載體的要求，設(shè)計(jì)一對引物。目的基因?yàn)镃端截短 21個氨基酸的NS5B(NS5B-C21)。引物設(shè)計(jì)如下
HCVNS5B-C21P1: 5' -GCGGATCCTCGATGTCCTACACATGGAC-3',
HCVNS5B-C21P2: 5' -CGCTCGAGTTAGCGGGGTCGGGCACGAGAC-3';
上游引物5'加入BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物5'加入Xho I酶切位點(diǎn)，按設(shè)計(jì)由
TaKaRa公司合成。
4. HCVNS5B-C21片段的PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系H20:38ul， 2. 5mmol/L dNTP 4ul， 10 Xpyrobest buffer: 5ul，引物Pl和P2各lul， HCV質(zhì)粒:0. 5ul, Pyrobest ■ Taq 酶0.5ul ; PCR擴(kuò)增條件:94'C預(yù)變性4 min,94。C 30s, 57°C 45s， 72°C 2min, 共30個循環(huán)，72'C末次延伸7min。 PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
5. HCVNS5B-C21表達(dá)載體及重組表達(dá)型工程菌的構(gòu)建將獲得的NS5B片段用BamH 1、XhoI雙酶酶切，鑒定正確后回收NS5B-C21片段，連接到pET-28a(+)載體上，轉(zhuǎn) 化到表達(dá)細(xì)菌E.coli BL21(DE3)，用卡那霉素抗性平板篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化菌。
6. 表達(dá)融合蛋白工程菌的篩選鑒定隨機(jī)挑選8個轉(zhuǎn)化子接種至含3mlLB培養(yǎng) 基(含卡那霉素50ug/ml)的試管內(nèi)，37。C振蕩培養(yǎng)3h，加IPTG至終濃度lmraol/L， 繼續(xù)振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)3h，離心收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE檢測。
7. HCVNS5B-C21表達(dá)形式的鑒定用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)重組工程菌，37'C振搖 擴(kuò)增轉(zhuǎn)化細(xì)菌,測定A值,待A 600nm"0. 4 0. 6時，加入異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷
(IPTG)至終濃度l隱ol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，24。C繼續(xù)振搖4 5h后，將誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白 的600ml工程菌離心，離心條件為轉(zhuǎn)速為5000g每分鐘、離心時間20min、溫度4。C, 收集菌體重懸于30ml的PB細(xì)菌裂解液配比為50隱ol/L pH7. 4磷酸鹽緩沖液(PB) +lmmol/L 二硫蘇糖醇(dithiothreitol) +10%甘油(glycerol) +1%表面活性劑
(triton) +20mmol/L咪唑(imidazole) + NaCl (氯化鈉)300mmol/L)+ sodium
deoxycholate (脫氧膽酸鈉)0. 2mg/ml + lysozyme (、溶菌酶)0. 05mg/ml + PMSF (苯甲基磺酰氟化物)1iMiol/L，冰浴超聲破菌，離心條件為轉(zhuǎn)速為5000g每分鐘、 離心時間20分鐘、溫度4'C，收集上清和沉淀包涵體。
8. HCVNS5B-C21蛋白純化上清溶液加已經(jīng)平衡的50%Ni-S印harase 6 Fast Flow 凝膠2ml室溫結(jié)合60min，上樣，收集穿透液。用十倍的柱體積的結(jié)合緩沖液，該緩 沖液的配比為咪唑2Ommol/L，磷酸鹽緩沖液20mmol/L，氯化鈉0. 5mol/L， pH7. 4， 洗滌柱子，接著用3ml分別含100、 200、 300、 500 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液， 該緩沖液的配比為磷酸鹽緩沖液20mmol/L，氯化鈉0. 5mol/L, pH7. 4，洗脫目的蛋白。
9. 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試驗(yàn)采用間接ELISA檢測丙肝病人血清。基本 步驟為用50mmol/L碳酸鹽溶液，pH9. 6，稀釋NS5B蛋白包被酶聯(lián)板，每孔100nl,4 。C過夜。次日用封閉液，配比為10腿ol/L磷酸鹽緩沖液、pH7.4, 10%山羊血清，20 %小牛血清，0. 5%酪蛋白(casein) ， 0. 05%硫硫汞，5%蔗糖，封閉，每孔130u 1, 37 。C lh(或4。C過夜)。將待測的丙肝病人陰、陽性血清，用樣本稀釋液，配比為10mmol/L 磷酸鹽緩沖液、pH7.4, 10%山羊血清，20%小牛血清，0. 5°/。 casein， 0. 05%硫硫汞， 0.5mmol/L NaCl， 1:20稀釋后，分別加至封閉后的酶聯(lián)板孔內(nèi)，每孔100yl， 37°C 反應(yīng)30min，用PBST液(10畫1/L磷酸鹽緩沖液、pH7. 4, 0. 5%吐溫_20)洗5遍后， 加1:5000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG，每孔100pl,37。C反應(yīng)30min，磷 酸鹽緩沖液一0.2%土溫(PBST)洗5遍，加底物三甲氧基苯甲酸酯(TMB)溶液100ii 1,37'C避光顯色10 min，加50nl 4N硫酸混勻終止反應(yīng)，用酶聯(lián)儀測定A450值。 結(jié)果
1. 目的基因的PCR擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增片段大小為1710bp，與預(yù)期結(jié)果相符(見 圖1)。
2. pET28a(+)-NS5B質(zhì)粒構(gòu)建將目的基因克隆到pET28a(+)載體內(nèi)，使目的基 因與載體上的6xHis基因融合，翻譯閱讀框架一致，表達(dá)一個融合蛋白，6xHis位于 融合蛋白的N端(見質(zhì)粒構(gòu)建流程圖2)。
3. 表達(dá)融合蛋白工程菌的篩選鑒定第2、 3、 4、 5、 6號5個轉(zhuǎn)化子表達(dá)相對 分子量約為65kD的HCVNS5B-C21蛋白，而1、 7、8號3個轉(zhuǎn)化子無此蛋白帶(見圖3)。
4. 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-NS5B-C21的鑒定以重組表達(dá)質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，能擴(kuò)增出大小分別約為1710bp的片段。用BamH I 、 Xho I雙酶酶切，重組質(zhì)粒
酶切產(chǎn)物在約1710bp、 5360bp處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期大小相符(見圖4)。
5. 重組蛋白的表達(dá)及表達(dá)形式的鑒定重組菌經(jīng)誘導(dǎo)明顯表達(dá)出6His-NS5B-C21 融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物6His- NS5B-C21表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶性形式存在。結(jié)果表明，C 端截短21個氨基酸的HCV NS5B蛋白表達(dá)成功(見圖5)。
6. ELISA試驗(yàn)將純化的NS5B蛋白與已知不同濃度的牛血清白蛋白共同電泳、 顯色后比較，確定純化的NS5B蛋白濃度約為1. 5rag / ml。用50mmol/L碳酸鹽溶液 (p服6) 1:200、 1:400、 1:800、 1:1600倍比稀釋后包被酶聯(lián)板，檢測已知l份丙肝 病人陽性血清和l份丙肝病人陰性血清。結(jié)果顯示，與陽性血清反，不與陰性血清反 應(yīng)，A450值分別為1.242、 0.708、 0.622、 0.520。說明NS5B蛋白有較好的抗原性和
特異性。
丙型肝炎病毒RNA依賴的RNA聚合酶活性體外測定方法及應(yīng)用 材料和方法 1. 磁性納米顆粒的修飾首先，將12. 3 mg Si02/(PMMA/Fe304)納米顆粒加入2. 5ml 乙醇/水(199/l)混合溶液中，為了更好地分散Fe304顆粒，需將該溶液進(jìn)一步超聲30 分鐘。然后，將50ul APTS (氨基硅烷化試劑)滴加到以上混合溶液，并在室溫下磁 力攪拌7小時。利用外加磁場將APTS修飾的磁性顆粒從反應(yīng)介質(zhì)中分離出，并用乙 醇溶液(95%乙醇)對其清洗5次。在修飾完APTS之后，將以上顆粒加入到1230ul
(1200ul PB,30ul 25%戊二醛)含5%戊二醛的PB溶液(摩爾濃度為0. 01 mol/L)中， 并在37'C下磁力攪拌3小時。該過程中通過氨基與醛基之間形成的Schiff堿在磁性 顆粒表面修飾上醛基官能團(tuán)。反應(yīng)結(jié)束后，利用外加磁場將顆粒從反應(yīng)介質(zhì)中分離出， 并用PB溶液反復(fù)清洗產(chǎn)物，并保存與PB溶液中。
2. 丙型肝炎NS5B酶活性測定新方法的建立
1) 取少量(0. 4mg/管)磁性納米復(fù)合顆粒于PCR管中，用2XSSC洗滌四遍， 加入2XSSC45ul，加入1000 ug/ml 5' NH2，ly(A) 5ul，終濃度為100 ug/ml，同 時加入RNAsin 0.5ul， 37。C搖床2h，使RNA模板5，端氨基與顆粒表面的醛基結(jié)合， RNA模板固定在顆粒表面，同時做兩管，其中一管正常反應(yīng)， 一管為對照，對照為下 面的4步中(1) NS5B-C21替換為DEPC處理水。
2) 用1XRNA buffer (20rnM Tris - HC1， pH 7. 5, 20mM KC1， 4mM MgC12, 1 mM EDTA， lmM dithiothreitol)在磁架上洗滌洗滌四遍，依次加入如下反應(yīng)體系。
反應(yīng)體系(50ul體系)終濃度初濃度加入量
(1) NS5B-C2115ug/ml15ug/ml5ul
(2) 0ligo(U6) or 0ligo(dT6) 25 ug/ml250 ug/ml5ul
(3) 10X bufferIX buffer10X buffer5ul
(4) dithiothreitollraM10 mM5ul
(5) BSA(小牛血清)0.lmg/mllmg/ml5ul
(6) RNAsin(2500U)0. 5U/ul40U/ul25隱63ul)
(RNA酶抑制劑)
(7) DEPC水24.37ul
反應(yīng)條件20°C 20min，放置離心機(jī)。
4)延伸加入500uM Bio-ll-UTP lul孵育30min 3(TC水浴，終濃度為10 uM。
5) 用2XSSC洗滌四遍，5%BSA封閉，37'C搖床lh。
6) 0. 5M sodium phosphate buffer (pH 7. 0)洗滌四遍。
7) Avidin-Peroxidase l:1000ul (1XPBS稀釋)100ul、 37。C搖床30tnin。
8) 0. 5M sodium phosphate buffer (pH 7.0)洗滌四遍。
9) 顯色反應(yīng)TMB避光顯色(50ul 10min，室溫)。
10) 加50 y 1 4N硫酸混勻終止反應(yīng)，。
11) 用酶聯(lián)儀測定A450值。
3.丙型肝炎NS5B酶抑制劑的篩選 利用上步建立的HCV NS5B RdRp酶活性測定新方法篩選抑制劑。將不同的待測抑 制劑分別加入到96孔微孔板各孔中，每種待測抑制劑設(shè)2孔，并設(shè)2孔已知的陽性 抑制劑噻嗪化物(benzo-1， 2， 4-thiadiazine dervatives)對照空。每孔加入HCV NS5B 蛋白酶。再加入反應(yīng)緩沖液、Bio-UTP、 NTP、 RNA引物，最后加入結(jié)合有RNA模板的 磁性納米復(fù)合顆粒。混勻后3(TC孵育30分鐘。反復(fù)洗滌吸附后，加辣根過氧化物酶 標(biāo)記的親和素，37'C孵育30分鐘，反復(fù)洗滌吸附后，加入服P的底物TMB進(jìn)行顯色 反應(yīng)。通過阻斷顯色反應(yīng)篩選可抑制RdRp酶活性的抑制劑。 結(jié)果
丙型肝炎NS5B酶活性陰性對照和陽性對照的A450值分別為0. 003和0. 930， 說明C端截短21氨基酸的HCV NS5B蛋白有很好的活性。
權(quán)利要求
1.一種丙型肝炎病毒RNA依賴的RNA酶聚合酶活性測定的方法，其特征在于(1).NS5B片段的PCR擴(kuò)增利用PCR技術(shù)擴(kuò)增C端截短21個氨基酸的HCV NS5B基因片斷；(2).表達(dá)HCV NS5B-C21蛋白片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建提取質(zhì)粒pET28a(+)，用Bam HI和XhoI雙酶切，電泳后回收酶切的質(zhì)粒大片段，溶于去離子水內(nèi)，同樣用BamH I和XhoI雙酶切PCR擴(kuò)增的NS5B-C21蛋白基因片段，電泳回收后，溶于去離子水內(nèi)；取等摩爾濃度的上述兩種酶切后DNA片段，在同一離心管內(nèi)用T4 DNA連接酶連接，使NS5B蛋白基因片段插入到載體pET28a(+)內(nèi)的BamH I和Xho I位點(diǎn)之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達(dá)一個融合蛋白；(3).重組質(zhì)粒和表達(dá)融合蛋白工程菌的篩選與鑒定將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布含卡那霉素濃度為60μg/ml的LB平板，置37℃過夜；次日隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落和一個對照菌，對照菌為質(zhì)粒pET28a轉(zhuǎn)化菌，誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白，收集菌體進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，重組子表達(dá)相對分子量約為65 kD的HCV NS5B-C21蛋白，而對照菌BL21(DE3)無此蛋白帶；將篩選出的陽性克隆表達(dá)菌提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定和酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果完全正確；(4).表達(dá)的NS5B-C21蛋白的純化1)表達(dá)NS5B蛋白工程菌的超聲裂解將誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的工程菌離心收菌，菌體重懸于裂解液內(nèi)，冰浴超聲破菌，離心收集上清，棄沉淀，收集的上清液用于下一步的親和純化；2)鎳瓊脂糖凝膠親和層析法純化將鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱連接至常壓層析系統(tǒng)，先用平衡液沖洗平衡，細(xì)菌超聲裂解上清液加鎳瓊脂糖凝膠凝膠室溫結(jié)合，上柱后收集穿過峰。用結(jié)合緩沖液洗滌柱子，接著用分別含100mM、200mM、300mM、500mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測目的蛋白；(5).純化的NS5B蛋白用作抗原檢測HCV抗體將純化的HCV NS5B蛋白用50 mmol/L的碳酸鹽pH9.6倍比稀釋后包被酶聯(lián)板，間接酶聯(lián)免疫法檢測已知的抗丙肝病人陽性血清及正常人血清，NS5B-C21蛋白能與丙肝病人陽性血清反應(yīng)，不與正常人血清反應(yīng)，說明NS5B-C21蛋白有較好抗原性和特異性；(6).磁性納米復(fù)合顆粒修飾首先，液相載體可采用磁性納米顆粒，將之加入乙醇/水的比例為199/1混合溶液中，為了更好地分散該顆粒，需將該溶液進(jìn)一步超聲；然后，將氨基硅烷化試劑滴加到以上混合溶液，并在室溫下攪拌；最后，利用外加磁場將氨基硅烷化試劑修飾的磁性顆粒從反應(yīng)介質(zhì)中分離出，并用乙醇溶液對其清洗；在修飾完之后，將以上顆粒加入到含3％戊二醛的PB溶液中，并在37℃下攪拌3小時；該過程中通過氨基與醛基之間形成的Schiff堿在磁性顆粒表面修飾上醛基官能團(tuán)；反應(yīng)結(jié)束后，利用外加磁場將顆粒從反應(yīng)介質(zhì)中分離出，并用PB溶液反復(fù)清洗產(chǎn)物；(7).丙型肝炎RNA依賴的RNA聚合酶活性測定方法的建立化學(xué)合成RNA模板，并在其5’端進(jìn)行氨基修飾，合成兩種RNA模板，一個為RdRp酶活性測定通用的poly(A)，長度為20個A，該序列為5′NH2---AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA---3′；另一個為HCV RNA的3′端的一段特異序列，該序列為5′NH2---CTTGGCGTAATCATGGTCAT---3′；將RNA模板修飾固定在核殼結(jié)構(gòu)復(fù)合磁性納米顆粒上并加入磁分離微孔反應(yīng)板微孔內(nèi)，再加入引物、純化的RdRp酶，核糖核酸，生物素標(biāo)記的11位尿苷三磷酸，構(gòu)成RNA復(fù)制反應(yīng)體系；通過摻入生物素標(biāo)記單體，利用NS5B蛋白的RNA依賴的RNA聚合酶的活性，使另一條RNA鏈得到延伸，在外磁場下分離除去非特異性吸附片段，再與酶標(biāo)記的親和素結(jié)合，洗滌后，向微孔內(nèi)加入底物顯色劑顯色；同時用磁鐵吸附后將顯色液轉(zhuǎn)移到96孔酶聯(lián)板內(nèi)，用酶聯(lián)儀測定各孔的A450吸光值；(8).從中藥樣品庫和小分子化合物庫內(nèi)篩選新的NS5B蛋白酶活性抑制劑用96孔或384孔微孔反應(yīng)板，每個微孔內(nèi)加入結(jié)合有Poly(A)RNA模板的納米磁性顆粒，每個微孔內(nèi)都形成一個相同的NS5B蛋白酶活性測定體系，在向反應(yīng)體系內(nèi)加入NS5B蛋白酶之前，先向各孔分別加入不同的待篩選抑制劑，同時設(shè)立已知NS5B蛋白酶活性特異性抑制劑陽性對照孔，通過各孔的顯色情況即可判定結(jié)果，同時用磁鐵吸附后將顯色液轉(zhuǎn)移到96孔酶聯(lián)板內(nèi)，用酶聯(lián)儀測定各孔的A450吸光值；對篩選到的陽性抑制劑，更換RNA模板，用HCV RNA的3’端一段特異RNA作為模板，再進(jìn)行抑制試驗(yàn)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丙型肝炎NS5B酶活性測定的方法，其特征在于液相載 體材料包括磁性納米顆粒、玻片、金屬片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纖維膜或尼龍膜。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丙型肝炎NS5B酶活性測定的方法，其特征在于液相 載體表面以具有雙活性基團(tuán)的長鏈有機(jī)化合物進(jìn)行修飾，具有雙活性基團(tuán)的長鏈有機(jī)化合物試劑有戊二醛、三羥甲基氨基硅垸、N,N-二乙氧基氨基丙基三乙氧基硅垸、多聚賴 氨酸，采用其中的一種或其中的兩種的組合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丙型肝炎NS5B酶活性測定的方法，其特征在于待篩 選抑制劑為中藥成分或大分子化合物或小分子化合物。
5. 權(quán)利要求1所述的一種丙型肝炎NS5B酶活性測定的方法在丙型肝炎以NS5B為靶 位的抗病毒藥物的篩選中的應(yīng)用，包括篩選大分子化合物庫、小分子化合物庫或中藥庫 中的抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明丙型肝炎病毒RNA依賴的RNA聚合酶體外活性測定方法及應(yīng)用涉及的是建立丙型肝炎病毒RNA依賴的RNA聚合酶(NS5B蛋白)活性體外測定的安全、實(shí)用的方法、應(yīng)用涉及基因工程技術(shù)、納米磁分離富集和RNA相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用基因工程技術(shù)表達(dá)純化可溶性的NS5B蛋白，并制備磁性納米顆粒。將RNA模板一端固定在磁性納米顆粒上，加入96孔反應(yīng)板微孔內(nèi)，再加入NS5B蛋白等構(gòu)成RNA復(fù)制體系，在磁性納米顆粒上復(fù)制的RNA雙鏈，摻入標(biāo)記了生物素。RNA復(fù)制后，用外磁場磁鐵將磁性納米顆粒吸附在微孔底部，反復(fù)洗滌吸附后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素結(jié)合，吸附洗滌后，加入辣根過氧化物酶的底物顯色。利用建立的方法，可從中藥庫及化合物庫內(nèi)篩選新的NS5B蛋白酶活性抑制劑。
文檔編號C12Q1/70GK101168781SQ200710133300
公開日2008年4月30日 申請日期2007年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月17日
發(fā)明者敏 呂, 菁 戚, 李越希, 楊華鳳, 潘明潔, 王正茂 申請人:李越希