專利名稱：一種基于熒光淬滅的核酸測序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種基于熒光淬滅的核酸測序方法，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的基因 組測序方法。
背景技術(shù)：
目前完成一個哺乳動物全基因組的測序大約需要上千萬美元和半年時間的 工作。DNA測序成本正在以每二年降低一半的速度遞減，但是目前通用的DNA測 序方法仍然成本很高和耗時長，遠遠滿足不了生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)發(fā)展的要求，同時 也極大地制約了 DNA測序市場的發(fā)展。人們急需發(fā)展出快速、廉價的個體化基因 信息檢測技術(shù)。
陸祖宏等提出通過單分子多拷貝的全基因組擴增，制備全基因組的高密度 的單分子多拷貝的隨機全基因組DNA測序模板陣列"1，通過固定滾環(huán)產(chǎn)物到載體 上，在這基礎(chǔ)上進行在片延伸測序，每延伸一個堿基有一定熒光強度，當(dāng)熒光強 度積累到一定程度，需要將熒光素淬滅后再進一步延伸，而且不需要光照情況下 為最合適，國外有文獻報道用激光照射氯化二苯碘(DPI)來進行熒光淬滅后再延 伸[2]，但對DNA的損傷比較大、DPI藥品昂貴、有毒而且光照的方式對高通量的 基因芯片測序有一定的局限性。New consideration on uitra-low-cost sequencing for the human whole genome. Proceeding of the 4th Internaitonal Forum of Post-genome Technologies. ZuhongUi， 2006， 46-48.Multiplexed DNAsequencing-by-synthesis. SerfeiA. Aksyonov， MichaelBittner， LindaB.Bloometal. Analytical Biochemistry 348(2006) 127-138. Szemes M， Bonants P， Weerdt M， et al. Diagnostic application of padlock probes—multiplex detection of plant pathogens using universal microarrays[J].Nucl Acid Res， 2005， 33(8) :70.

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種基于熒光淬滅的核酸測序方法，能高 通量、快速、低成本對核酸進行測序。
技術(shù)方案本發(fā)明基于熒光淬滅的核酸測序方法為
1) 制備測序模板把待測序的核酸片段，這里的核酸片段包括DNA(脫氧核
糖核酸)、RNA(核糖核酸)或它們的核酸序列擴增(PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))、 RCA(滾環(huán)擴增)、固相擴增以及橋式擴增等)產(chǎn)物、克隆產(chǎn)物,并將產(chǎn)物固定到 載體上。
2) 在片延伸用反應(yīng)緩沖液(reaction buf f er)，聚合酶以及熒光 標記的dNTP混合液進行延伸。
3)熒光淬滅運用熒光淬滅劑，使熒光淬滅。本發(fā)明幾種核酸測序中 的熒光淬滅劑，是指能夠產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)、自由基等基團的化合物，包括 過氧化氫(HA)、硫酸銅(CuS04)和4' -(4' -二甲基氨基疊氮苯)苯甲酸 (DABCYL)，這些化合物能夠有效淬滅熒光并能使延伸高效率地進行。
4) 在片延伸用反應(yīng)緩沖液(reaction buf f er),聚合酶以及熒光 標記的dNTP混合液進行延伸。
5) 圖象識別對得到的延伸圖象用Matlab進行特征點提取，清除噪聲點 處理實現(xiàn)對芯片的分析或者其他商業(yè)化的軟件直接處理圖像。
所述的熒光淬滅劑，是指能夠產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)、自由基基團的化合物， 即是過氧化氫、硫酸銅和4' -(4' -二甲基氨基疊氮苯)苯甲酸。 測序的程序如下
制備測序模板——在片延伸--------熒光淬滅-------在片延
伸…….-------圖象識別。
有益效果本發(fā)明具有以下優(yōu)點
1. 本發(fā)明結(jié)合了核酸微陣列芯片技術(shù)，能高通量、快速、低成本 對核酸進行大規(guī)模測序。
2. 本發(fā)明運用熒光淬滅進行核酸測序，實施簡單而且有效。
3. 本發(fā)明對得到的延伸圖象用Matlab軟件進行特征點提取，清除噪聲點 等處理，實現(xiàn)了對芯片的分析。


圖l是本發(fā)明的流程示意圖。
具體實施例方式
1. 模板制備通過對滾環(huán)成環(huán)序列
5' -P-TAGCTAGAATCAAAAATGTTGAGTACGACGAM'CTGTATGCTMTGCGGCGTGATGTATTAT GCGTATAGMATAATACAGA—3'禾口
5' -ACCTTTATGTCMCATTTTTGATTCTAGCTATCTGTATTATTTCACCTAGCTT-3'
濃度均為10um各4ul混合后通過變性，自然復(fù)性后成環(huán)。通過用T4連接 酶進行連接。加入探針Aery-probe(lOOum)0.3ul(E3:5'-Aery-(TUATTAGCATACAGATTCGTCGTACT-3，)，通過變性，自然復(fù)性后雜交上。 然后分別加入100XBSA ， dNTP ， Bst酶，40度30小時滾環(huán)。
對滾環(huán)產(chǎn)物用丙烯酰胺膠溶解并固定在丙烯酰胺膠修飾的玻片上。
2. 檢測用luM Cy5-probe ( 5' -Cy5-GCGGCGTGATGTA)與固定的產(chǎn)物雜 交[3]。經(jīng)掃描后，能獲得清晰以及熒光強度較高的圖像。
3. 淬滅對雜交后的滾環(huán)產(chǎn)物用淬滅劑(H202 ) 5分鐘后，熒光完全淬滅。
4. 延伸對淬滅后的滾環(huán)產(chǎn)物進行延伸，用 1 X reaction buffer,0. lU/ul Therminator DNA聚合酶以及0. luMCy5-dNTP混合 液在65度IO分鐘下進行延伸。延伸堿基分別為TTAT、 GCGT，延伸 TTAT后能獲得清晰的熒光圖像，在這個基礎(chǔ)上繼續(xù)延伸GCGT，能獲 得比較強的熒光圖像，為了進一步延伸，需要對熒光淬滅。
5. 淬滅用淬滅劑(H202 ) 5分鐘后，熒光完全淬滅。
6. 延伸力卩入1 Xreaction buffer, 0. lU/ul Therminator DNA 聚合酶以及0. luMCy5-dNTP混合液在65度10分鐘下進行延伸。延伸堿基分別 為ATA、 GAAA，延伸ATA后能獲的清晰的熒光圖像，繼續(xù)延伸GAAA后，獲得較 強的熒光圖像。
7. 通過Matlab軟件編程、特征點提取、清除噪聲點等處理、計 算灰度值，根據(jù)灰度值能分析出本次實驗共延伸15個堿基。
權(quán)利要求
1.一種基于熒光淬滅的核酸測序方法，其特征在于測序的方法為1)制備測序模板把待測序的核酸片段，這里的核酸片段包括脫氧核糖核酸、核糖核酸或它們的核酸序列擴增產(chǎn)物、克隆產(chǎn)物，并將產(chǎn)物固定到載體上，2)在片延伸用反應(yīng)緩沖液、聚合酶以及熒光標記的dNTP混合液進行延伸，3)熒光淬滅運用熒光淬滅劑，使熒光淬滅，4)在片延伸用反應(yīng)緩沖液、聚合酶以及熒光標記的dNTP混合液進行延伸，5)圖象識別對得到的延伸圖象用Matlab進行特征點提取，清除噪聲點處理實現(xiàn)對芯片的分析或者其他商業(yè)化的軟件直接處理圖像。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于熒光淬滅的核酸測序方法，其特征在于 所述的熒光淬滅劑，是指能夠產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)、自由基基團的化合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于熒光淬滅的核酸測序方法，其特 征在于所述的熒光淬滅劑是過氧化氫、硫酸銅和4' -(4' -二甲基氨基疊氮苯) 苯甲酸。
全文摘要
一種基于熒光淬滅的核酸測序方法為1)制備測序模板把待測序的核酸片段，這里的核酸片段包括脫氧核糖核酸、核糖核酸或它們的核酸序列擴增產(chǎn)物、克隆產(chǎn)物，并將產(chǎn)物固定到載體上，2)在片延伸用反應(yīng)緩沖液、聚合酶以及熒光標記的dNTP混合液進行延伸，3)熒光淬滅運用熒光淬滅劑，使熒光淬滅，4)在片延伸用反應(yīng)緩沖液、聚合酶以及熒光標記的dNTP混合液進行延伸，5)圖象識別對得到的延伸圖象用Matlab進行特征點提取，清除噪聲點處理實現(xiàn)對芯片的分析或者其他商業(yè)化的軟件直接處理圖像。本發(fā)明結(jié)合了核酸微陣列芯片技術(shù)，能高通量、快速、低成本對核酸進行大規(guī)模測序。
文檔編號C12Q1/68GK101168773SQ200710133930
公開日2008年4月30日 申請日期2007年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月16日
發(fā)明者華 呂, 肖鵬峰, 錢正瑛, 陸祖宏, 力 高 申請人:東南大學(xué)