專利名稱：不同產(chǎn)地明黨參植物的分子鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及不同產(chǎn)地明黨參植物的分子鑒別方法，屬于生藥學(xué)領(lǐng)域。
技術(shù)背景-
明黨參C/z""g/謂扁;;m/ozWM Wolf始見(jiàn)于《本草綱目拾遺》，是傘形科明黨參屬單種植物， 分布于我國(guó)華東地區(qū)的江蘇、浙江、安徽、湖北、江西等狹小的范圍，干燥根因具有滋補(bǔ)強(qiáng) 壯、潤(rùn)肺化痰、平肝解毒、安中和胃等功效被收載在《中國(guó)藥典》中，是我國(guó)特有的名貴中 藥材，同時(shí)也是江蘇道地藥材之一。
道地藥材是該藥材原物種在其產(chǎn)地的種系與區(qū)系的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，長(zhǎng)期受著孕育該物 種的歷史環(huán)境條件與人類活動(dòng)作用而形成的特殊產(chǎn)物，是具有特定的生產(chǎn)區(qū)域(地理學(xué)及生態(tài) 學(xué))，悠久的產(chǎn)銷歷史(商品集散地)，其產(chǎn)品具有良好的社會(huì)信譽(yù)并能產(chǎn)生可觀經(jīng)濟(jì)效益的藥 材，其產(chǎn)品貨真、質(zhì)優(yōu)，品質(zhì)穩(wěn)定可靠，為世人稱道者。中藥的產(chǎn)地及其質(zhì)量、療效間有密 切關(guān)系，在傳統(tǒng)上， 一貫對(duì)藥材是否來(lái)自原產(chǎn)地給予很大重視，往往以地產(chǎn)、地道藥材作為 質(zhì)優(yōu)的標(biāo)志。由于同種藥用植物的外形在其分布區(qū)內(nèi)基本沒(méi)區(qū)別，從形態(tài)上很難對(duì)它們的來(lái) 源進(jìn)行鑒別。道地產(chǎn)區(qū)與非道地產(chǎn)區(qū)的明黨參在形態(tài)上沒(méi)差別，僅在質(zhì)量上有差距，運(yùn)用形 態(tài)學(xué)手段不可能對(duì)其進(jìn)行來(lái)源鑒別。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鑒別不同產(chǎn)地明黨參植物的分子鑒別方法，其特證在于用特定
的DNA序列對(duì)明黨參進(jìn)行來(lái)源鑒別，使明黨參的來(lái)源鑒別更可靠、準(zhǔn)確，同時(shí)為道地藥材 的鑒別提供高特異性鑒別方法。
本發(fā)明首先對(duì)不同產(chǎn)地明黨參的rDNAITS區(qū)進(jìn)行測(cè)序，得到部分ITS1序列及完整的5.8S 和ITS2的序列，再通過(guò)序列比對(duì)找到不同產(chǎn)地明黨參的鑒別性位點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上對(duì)道地產(chǎn) 區(qū)江蘇句容的明黨參進(jìn)行了高特異性PCR鑒定。
本發(fā)明中利用rDNAITS區(qū)DNA序列對(duì)明黨參進(jìn)行來(lái)源鑒別所采用的歩驟如下
(1) 總DNA提取
取待檢明黨參植物新鮮的葉片，用無(wú)菌水處理后，在液氮中研磨成細(xì)粉，用CTAB法提取 總DNA，然后用北京萊博生物實(shí)驗(yàn)材料研究所生產(chǎn)的DNA純化回收試劑盒純化，溶解于滅菌 雙蒸水中。
(2) PCR擴(kuò)增
明黨參ITS區(qū)擴(kuò)增的引物為ITS區(qū)通用引物ITS4和ITS5，引物序列為 ITS4: 5、-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3、，位于18S上； ITS5: 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3、，位于26S上。 利用該對(duì)引物對(duì)總DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，并以ddH20代替模版DNA作空白對(duì)照。
(3) DNA序列測(cè)定
采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法，單向測(cè)序，測(cè)序引物為PCR引物ITS5，測(cè)序反應(yīng)在ABI 3730 全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行。
(4) DNA序列數(shù)據(jù)分析及植物來(lái)源的鑒別 將所得rDNAITS區(qū)的序列用對(duì)位排列軟件(CLUSTAL軟件)進(jìn)行對(duì)位排列，并輔以人
工校對(duì)，用遺傳分析軟件(MEGA軟件)分析待檢樣品DNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中各序列的差異， 通過(guò)分析比較，最終判定檢明黨參植物的來(lái)源。
本發(fā)明還利用高特異性PCR鑒別引物對(duì)道地產(chǎn)區(qū)江蘇句容的明黨參進(jìn)行了來(lái)源鑒別。首 先參照不同產(chǎn)地明黨參的rDNAITS區(qū)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)江蘇句容明黨參的高特異性鑒別引物， 上游鑒別引物JR: 5、-TGAGTGTCATGTATCGTGTC-3'的設(shè)計(jì)參考了江蘇句容明黨參rDNA ITS區(qū)的5.8S和ITS2部分，江蘇句容3個(gè)明黨參樣品ITS2序列的第8個(gè)位點(diǎn)的堿基都為C， 而其他產(chǎn)地的18個(gè)明黨參樣品在該位點(diǎn)的堿基都為T，故將該位點(diǎn)定為上游鑒別引物3'端的 第一個(gè)堿基，鑒于該特異性位點(diǎn)前的一段序列的GC含量較高，所以在設(shè)計(jì)上游鑒別引物時(shí) 對(duì)3個(gè)位點(diǎn)的堿基進(jìn)行了改動(dòng)，所以上游鑒別引物與江蘇句容明黨參的rDNA ITS區(qū)序列并 不完全互補(bǔ)。下游鑒別引物為ITS區(qū)擴(kuò)增的通用引物ITS4。
在進(jìn)行高特異性PCR鑒別之前，首先用引物ITS4和ITS5對(duì)不同來(lái)源的明黨參進(jìn)行擴(kuò)增， 檢測(cè)是否所有樣品都能擴(kuò)增出約700bp左右的片段以及擴(kuò)增片段的亮度，以驗(yàn)證模版DNA 的質(zhì)量、調(diào)整模版DNA的濃度，然后用鑒別引物JR和ITS4對(duì)模版DNA進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)退火 溫度控制在68'C時(shí)，只有江蘇句容的明黨參能被擴(kuò)增出來(lái)，而其他產(chǎn)地的明黨參均為陰性， 用瓊脂糖凝膠電泳即可檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果。
根據(jù)類似方法可以設(shè)計(jì)出其他產(chǎn)地明黨參的鑒別引物。
本發(fā)明有益效果
本發(fā)明利用特定的重復(fù)多拷貝rDNAITS區(qū)序列，通過(guò)CLUSTAL、 MEGA等分析軟件進(jìn) 行分析比較，最終實(shí)現(xiàn)了明黨參的來(lái)源鑒別。序列分析比較結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地明黨參的rDNA ITS區(qū)序列之間有較大差異，同一產(chǎn)地(居群)明黨參個(gè)體間的rDNAITS區(qū)序列差異在0-3 個(gè)堿基之間，變異不大，序列附表僅列出各居群明黨參一個(gè)樣品的rDNA ITS區(qū)序列。通過(guò) 分析比較得到的變異位點(diǎn)能很好地對(duì)其進(jìn)來(lái)源鑒別，因此，利用本方法對(duì)明黨參進(jìn)行來(lái)源
別具有高度的準(zhǔn)確性。近年來(lái)，DNA測(cè)序成本不斷降低，利用測(cè)序的方法進(jìn)行鑒別已成為一 種趨勢(shì)。
由于測(cè)序費(fèi)用相對(duì)較高、且需要一定的儀器設(shè)備，在對(duì)大批量藥材進(jìn)行來(lái)源鑒別的實(shí)際 操作中受到很大的限制。本發(fā)明還根據(jù)不同產(chǎn)地明黨參的rDNA ITS區(qū)序列，設(shè)計(jì)出鑒別道 地產(chǎn)區(qū)(江蘇句容)明黨參的鑒別引物，從而進(jìn)行高特異性PCR鑒別，為道地藥材的鑒別提 供快速、實(shí)用的方法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例
利用高特異性PCR鑒別引物鑒定江蘇句容明黨參植物
本實(shí)施例取7個(gè)產(chǎn)地共32個(gè)明黨參個(gè)體的新鮮葉片或硅膠干燥的葉片，依次編號(hào)為JR1 -JR5 (江蘇句容)，NJ1-NJ5 (江蘇南京)，AQ1-AQ5 (安徽安慶)，QY1-QY5 (安徽青陽(yáng))， HZ1-HZ5 (浙江杭州)，NB1-NB5 (浙江寧波)，PZ1-PZ2 (江西彭澤)，均通過(guò)以下歩驟進(jìn)行 鑒別
(1 )待檢植物總DNA提取 取待檢明黨參植物樣品新鮮的葉片，用無(wú)菌水處理后，在液氮中研磨成細(xì)粉，用CTAB法 提取總DNA，然后用北京萊博生物實(shí)驗(yàn)材料研究所生產(chǎn)的DNA純化回收試劑盒純化，溶解于 滅菌雙蒸水中。
(2) 模版DNA的質(zhì)量檢測(cè)
用ITS區(qū)通用引物ITS4和ITS5對(duì)待檢明黨參樣品總DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)是否所 有樣品都能擴(kuò)增出約700bp左右的片段以及擴(kuò)增片段的亮度，以驗(yàn)證模版DNA的質(zhì)量、調(diào) 整模版DNA的濃度。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PE-9600 PCR儀上進(jìn)行，20 (^L反應(yīng)體系的組分及終濃度為lx丁aq DNA酶緩沖液(10 mmol/LTris-HCl ， 5Ommol/LKC1 ， 0.1%Trion x-100 ， pH8.4 )， 2.5mmol/LMgC12， lUTaq酶，約50ng模板，0.3pmol/L引物，0.15mmol/L dNTP。擴(kuò)增程序 為94°C，預(yù)變性3.0min; 94。C變性45s， 68。C退火30s， 72。C延伸1 min， 35個(gè)循環(huán)，以 ddH20代替模版DNA作空白對(duì)照。
(3) 運(yùn)用鑒別引物JR和ITS4對(duì)模版DNA進(jìn)行擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增反應(yīng)與模版DNA的質(zhì)量檢測(cè)中的操作一樣，僅將其中的擴(kuò)增引物ITS5更換為 JR。當(dāng)退火溫度控制在68'C時(shí)，只有江蘇句容的5個(gè)明黨參樣品能被擴(kuò)增出來(lái)，而其他產(chǎn)地 的明黨參樣品均為陰性，用瓊脂糖凝膠電泳即可檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果。
綜上所述，本發(fā)明設(shè)計(jì)的高特異性PCR鑒別引物和PCR方法可以準(zhǔn)確鑒別道地產(chǎn)區(qū)江蘇句容的明黨參。建立不同產(chǎn)地明黨參植物的rDNAITS區(qū)，包括部分ITS1序列及完整的5.8S和ITS2 的序列數(shù)據(jù)庫(kù)及各產(chǎn)地明黨參植物的特異性鑒別位點(diǎn)，其特征是按如下歩驟進(jìn)行
(a) 總DNA提取
取待檢明黨參植物新鮮的葉片，用無(wú)菌水處理后，在液氮中研磨成細(xì)粉，用CTAB法提取 總DNA，然后用北京萊博生物實(shí)驗(yàn)材料研究所生產(chǎn)的DNA純化回收試劑盒純化，溶解于滅菌 雙蒸水中
(b) PCR擴(kuò)增
明黨參ITS區(qū)擴(kuò)增的引物為ITS區(qū)通用引物ITS4和ITS5，引物序列為 ITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3、，位于18S上； ITS5: 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'，位于26S上。 利用該對(duì)引物對(duì)總DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，并以ddH20代替模版DNA作空白對(duì)照。
(c) DNA序列測(cè)定
測(cè)序采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法，單向測(cè)序，測(cè)序引物為PCR擴(kuò)增引物ITS5，測(cè)序反應(yīng) 在ABI 3730全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行。
(d) DNA序列數(shù)據(jù)分析及植物來(lái)源的鑒別 待檢明黨參植物的rDNAITS區(qū)的序列一經(jīng)測(cè)定，用對(duì)位排列軟件(CLUSTAL軟件)進(jìn)
行對(duì)位排列，并輔以人工校對(duì)，用遺傳分析軟件(MEGA軟件)分析待檢樣品DNA序列與 數(shù)據(jù)庫(kù)中各序列的差異，通過(guò)分析比較，最終判定待檢明黨參植物的來(lái)源。 2.道地產(chǎn)區(qū)(江蘇句容)明黨參植物的高特異性PCR鑒別方法，其特征是通過(guò)比較不同產(chǎn)地 明黨參植物的rDNAITS序列，設(shè)計(jì)出鑒別江蘇句容明黨參植物的高特異性引物。江蘇句容明 黨參植物的鑒別引物為上游鑒別引物為JR: 5'-TGAGTGTCATGTATCGTGTC-3'，下游鑒別 引物為ITS區(qū)擴(kuò)增的通用引物ITS4。具體步驟為 O)總DNA提取
取待檢明黨參植物新鮮的葉片，用無(wú)菌水處理后，在液氮中研磨成細(xì)粉，用CTAB法提取 總DNA，然后用北京萊博生物實(shí)驗(yàn)材料研究所生產(chǎn)的DNA純化回收試劑盒純化，溶解于滅菌 雙蒸水中。
(2)模版DNA的質(zhì)量檢測(cè)
用ITS區(qū)通用引物ITS4和ITS5對(duì)待檢品總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以驗(yàn)證DNA模版質(zhì)量、調(diào) 整模版DNA的濃度。ITS4和ITS5序列為
ITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，位于18S上；
ITS5: 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3、，位于26S上。(3) 運(yùn)用鑒別引物JR、 ITS4對(duì)模版DNA進(jìn)行擴(kuò)增，將退火溫度升至68'C，能被擴(kuò)增 出來(lái)的即來(lái)源于江蘇句容，而其他來(lái)源的明黨參均為陰性。
(4) 利用高特異性PCR鑒別引物對(duì)道地產(chǎn)區(qū)江蘇句容的明黨參進(jìn)行了來(lái)源鑒別，參照 不同產(chǎn)地明黨參的rDNA ITS區(qū)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)江蘇句容明黨參的高特異性鑒別引物，上游 鑒別引物JR: 5'-TGAGTGTCATGTATCGTGTC-3'的設(shè)計(jì)參考了江蘇句容明黨參rDNAITS區(qū) 的5.8S和ITS2部分，江蘇句容3個(gè)明黨參樣品ITS2序列的第8個(gè)位點(diǎn)的堿基都為C，而其 他產(chǎn)地的18個(gè)明黨參樣品在該位點(diǎn)的堿基都為T。
序列表
〈110〉江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所 〈120〉不同產(chǎn)地明黨參植物的分子鑒別方法 〈160〉 9
<210> 1 <211〉 555 <212〉 DNA
〈213〉來(lái)源于明黨參(C/^"g/wwwy;r"ioz^fey)-江蘇句容居群 〈400〉1
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〈210〉 2
<211〉 555
〈212〉 DNA
<213〉來(lái)源于明黨參(Cto"g山m sm;^m'o/^y)-江蘇南京居群
〈400〉 2
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〈210〉 3
<211> 555
〈212〉腿
〈213〉來(lái)源于日月黨參(C72awg/ww sm少?gòu)S"/cw'&"-安徽安慶居群
〈400〉 3
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〈210〉 4
〈211〉 555
〈212〉 DNA
<213〉來(lái)源于明黨參(C/2""g/wm wy^m'oz'^y)-安徽青陽(yáng)居群
〈400〉 4
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〈210〉 5
〈211〉 555
<212> DNA
〈213〉來(lái)源于明黨參(0 a/7g7'咖-浙江杭州居群
〈400〉 5
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〈210〉 6
<211〉 555
〈212〉 DNA
<213>來(lái)源于明黨參(C/j朋g/www7""/o/fl^)-浙江寧波居群
〈400> 6ggcaagcgtcggtgggcttgattcccccgttgcgaacccc郷caggtgggcgctcccgg60
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〈210〉 7 <211> 555 〈212>腿
〈213〉來(lái)源于明黨參(C7w g/wwj/^ATO'oW^)-江西彭澤居群 <400> 7
ggcaagcgtcggtgggcttggttcccccgttgcgaaccccgcgctcccgg60
gcgctcgtcggccgacgaaatcaaccgggcgcgg犯tgcgccaaggaaat120
ttgtacgtttgcttcccgttcgtggg鄉(xiāng)cggcgtctttcacgactctcg180
tcccggctcttgcatcgatgaagaacgtagcga幼tgcgatacttggtgt240
gaattgcagaatcccgtg犯ccatcgagtctttg33CgC￡Lagttgcgcccgaagccgcta300
ggctg鄉(xiāng)gcacgcctgcctgggtgtcacgcatcgtgctgccccctgaccactcgctcct360
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cctaaaagtgagtctctggtgacagatgttgcgatstttgtggttg3犯taaataccctc■
ttctcttgtcgtgcg肌tgcctgtcaccttggtgagCtCELaggaccctcaagcgccgcaa540
scggcgcgcgcttta555
<210〉 8 <2il> 20 〈212〉 DNA 〈213〉人工引物 <400> 8
tcctccgctt attgatatgc 20
<210〉 9 〈211〉 22 <212> DNA 〈213〉人工引物 〈400〉 9
ggaagtaaaa gtcgt33caa gg 2權(quán)利要求
1.一種不同產(chǎn)地明黨參植物的DNA分子鑒別方法，建立不同產(chǎn)地明黨參植物的rDNAITS區(qū)，包括部分ITS1序列及完整的5.8S和ITS2的序列數(shù)據(jù)庫(kù)及各產(chǎn)地明黨參植物的特異性鑒別位點(diǎn)，其特征是按如下步驟進(jìn)行(1)總DNA提取取待檢明黨參植物新鮮的葉片，用無(wú)菌水處理后，在液氮中研磨成細(xì)粉，用CTAB法提取總DNA，然后用北京萊博生物實(shí)驗(yàn)材料研究所生產(chǎn)的DNA純化回收試劑盒純化，溶解于滅菌雙蒸水中(2)PCR擴(kuò)增明黨參ITS區(qū)擴(kuò)增的引物為ITS區(qū)通用引物ITS4和ITS5，引物序列為ITS45`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`，位于18S上；ITS55`-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3`，位于26S上；利用該對(duì)引物對(duì)總DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，并以ddH2O代替模版DNA作空白對(duì)照；(3)DNA序列測(cè)定測(cè)序采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法，單向測(cè)序，測(cè)序引物為PCR擴(kuò)增引物ITS5，測(cè)序反應(yīng)在ABI 3730全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行；(4)DNA序列數(shù)據(jù)分析及植物來(lái)源的鑒別待檢明黨參植物的rDNAITS區(qū)的序列一經(jīng)測(cè)定，用對(duì)位排列軟件(CLUSTAL軟件)進(jìn)行對(duì)位排列，并輔以人工校對(duì)，用遺傳分析軟件(MEGA軟件)分析待檢樣品DNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中各序列的差異，通過(guò)分析比較，最終判定待檢明黨參植物的來(lái)源。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1不同產(chǎn)地明黨參植物的DNA分子鑒別方法，道地產(chǎn)區(qū)(江蘇句容)明 黨參植物的高特異性PCR鑒別方法，其特征是通過(guò)比較不同產(chǎn)地明黨參植物的rDNAITS序列， 設(shè)計(jì)出鑒別江蘇句容明黨參植物的高特異性引物，江蘇句容明黨參植物的鑒別引物為上游 鑒別引物為JR: 5' -TGAGTGTCATGTATCGTGTC-3'，下游鑒別引物為ITS區(qū)擴(kuò)增的通用引物 ITS4;具體歩驟為(1) 總DNA提取取待檢明黨參植物新鮮的葉片，用無(wú)菌水處理后，在液氮中研磨成細(xì)粉，用CTAB法提取 總DNA，然后用北京萊博生物實(shí)驗(yàn)材料研究所生產(chǎn)的DNA純化回收試劑盒純化，溶解于滅菌雙蒸水中；(2) 模版DNA的質(zhì)量檢測(cè)用ITS區(qū)通用引物ITS4和ITS5對(duì)待檢品總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以驗(yàn)證DNA模版質(zhì)量、調(diào) 整模版DNA的濃度；ITS4和ITS5序列為ITS4: 5、-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',位于18S上； ITS5: 5' -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 、，位于26S上；G)運(yùn)用鑒別引物JR、 ITS4對(duì)模版DNA進(jìn)行擴(kuò)增，將退火溫度升至68'C，能被擴(kuò)增 出來(lái)的即來(lái)源于江蘇句容，而其他來(lái)源的明黨參均為陰性。
3、根據(jù)權(quán)利要求1不同產(chǎn)地明黨參植物的DNA分子鑒別方法，本發(fā)明的特證是利用高 特異性PCR鑒別引物對(duì)道地產(chǎn)區(qū)江蘇句容的明黨參進(jìn)行了來(lái)源鑒別，參照不同產(chǎn)地明黨參的 rDNA ITS區(qū)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)江蘇句容明黨參的高特異性鑒別引物，上游鑒別引物JR: 5、-TGAGTGTCATGTATCGTGTC-3'的設(shè)計(jì)參考了江蘇句容明黨參rDNA ITS區(qū)的5.8S和 ITS2部分，江蘇句容3個(gè)明黨參樣品ITS2序列的第8個(gè)位點(diǎn)的堿基都為C，而其他產(chǎn)地的 18個(gè)明黨參樣品在該位點(diǎn)的堿基都為T。
全文摘要
本發(fā)明涉及不同產(chǎn)地明黨參植物的分子鑒別方法。該方法在對(duì)不同產(chǎn)地明黨參植物進(jìn)行總DNA提取、PCR擴(kuò)增、rDNA ITS序列測(cè)定、分析等過(guò)程的基礎(chǔ)上，找到了鑒別不同產(chǎn)地明黨參植物的堿基位點(diǎn)。當(dāng)待檢測(cè)明黨參植物的rDNA ITS序列與本發(fā)明公開(kāi)的各產(chǎn)地明黨參的DNA序列相符或有該產(chǎn)地明黨參的特異性位點(diǎn)時(shí)為該產(chǎn)地的明黨參。根據(jù)不同產(chǎn)地明黨參植物的rDNA ITS序列，設(shè)計(jì)出可鑒別道地產(chǎn)區(qū)(江蘇句容)明黨參的高特異性鑒別引物，能成功進(jìn)行道地產(chǎn)區(qū)明黨參植物的高特異性PCR鑒別。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101182572SQ200710135290
公開(kāi)日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2007年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月15日
發(fā)明者吳寶成, 杭悅宇, 趙亞美, 韋陽(yáng)連, 顧子霞, 興 高 申請(qǐng)人:江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所