專利名稱：：銀杏愈傷組織或懸浮細胞的快速繁殖方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及植物組織或細胞的繁殖方法，尤其涉及含有較高黃酮類化合物的銀杏愈傷組織或懸浮細胞的快速繁殖方法，屬于植物生物
技術(shù)領域：
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背景技術(shù)：
：銀杏(G/dgo&7o6"L.)是原產(chǎn)我國的古老孑遺植物，集藥用、食用、觀賞、材用于一體，銀杏葉中存在特有的兩類重要生理活性物質(zhì)一一黃酮類化合物(flavonoides)和萜內(nèi)酉旨(銀杏內(nèi)酉旨ginkgolides，GKs包括A,B,C,J，M和白果內(nèi)酯bilobalides，BB)。這兩類藥物對中老年冠心病、高血壓等心腦血管病、內(nèi)毒素休克、器官排異反應、氣管炎、哮喘等均有較好的效果。另外銀杏藥物還具有抗衰老、抗老年性癡呆癥、增強記憶力的功效，用于研制營養(yǎng)口服液、保健食品和化妝品等添加劑。由于銀杏制品存在著巨大的市場潛力，先后在法國、德國、韓國、美國、日本等掀起了銀杏葉制劑、藥品的研制、開發(fā)與銷售，世界上銀杏制劑的年銷售額為20億40億美元。在大力開發(fā)研制銀杏產(chǎn)品的同時，存在著對資源的掠奪，人力物力的浪費。銀杏黃酮和萜內(nèi)酯主要來源于銀杏葉片，但含量很低，銀杏葉黃酮含量為0.3%~3.8%，萜內(nèi)酯在銀杏葉內(nèi)含量更低，比黃酮含量低一個數(shù)量級(約0.1%~0.3%)大面積的建立葉用林是不現(xiàn)實的，同時存在地理環(huán)境、季節(jié)等諸多因素的限制，且提取、分離時操作繁瑣費時。利用植物細胞或愈傷組織的大量培養(yǎng)生產(chǎn)銀杏次生物質(zhì)代謝產(chǎn)物，可以工業(yè)化的生產(chǎn)銀杏黃酮類化合物，是銀杏黃酮類化合物的一條有效制備途徑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種銀杏愈傷組織或懸浮細胞的快速繁殖方法，由該快速繁殖方法所制備得到銀杏愈傷組織或懸浮細胞有較高含量的銀杏黃酮類化合物，可以規(guī)?；臑樗帍S提供銀杏黃酮化合物的來源。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種銀杏愈傷組織或懸浮細胞的快速繁殖方法，包括無菌葉源的獲得、愈傷組織誘導及繼代培養(yǎng)、懸浮細胞培養(yǎng)等步驟，其主要步驟如下-1、按照常規(guī)植物組織培養(yǎng)的芽或葉片增殖的方法，獲得大量無菌的銀杏芽苗或葉片；2、將步驟1所獲得的銀杏無菌芽苗或葉片接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，初代培養(yǎng)后連續(xù)繼代56次，獲得松散的愈傷組織；3、將步驟2所獲得的松散愈傷組織接種在含有萘乙酸(Naphthalene-aceticacid，NAA)、激動素(Kinetin，KT)的MS(MS培養(yǎng)基的配方請參考下述文獻劉慶昌，吳國良主編的植物細胞培養(yǎng)技術(shù)[M]，中國農(nóng)業(yè)大學出版社，33)液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，其中繼代培養(yǎng)2次，得到液體懸浮培養(yǎng)細胞；4、將所得到的液體懸浮培養(yǎng)細胞接種在下述任意一種液體培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)(1)MS液體培養(yǎng)基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+稀土0.5~5mg/L，或(2)MS液體培養(yǎng)基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+水楊酸0.55mg/L;收集細胞培養(yǎng)物，即得；或?qū)⒉襟E2中所得到的愈傷組織繼代在下述任意一種固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)(1)MS固體培養(yǎng)基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+稀土0.5~5mg/L，或(2)MS固體培養(yǎng)基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+水楊酸0.55mg/L，收獲愈傷組織培養(yǎng)物，即得。上述制備方法中，優(yōu)選的，步驟1中所述的銀杏芽或葉片增殖的方法，步驟如下(1)將銀杏成熟種胚消毒后接種在DCR、WPM3或改良MS中的任一種基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)(優(yōu)選培養(yǎng)30天)形成幼苗；其中，所述的種胚消毒方式優(yōu)選如下將銀杏成熟種胚用5%的84消毒液浸泡10min后，剝?nèi)ス琴|(zhì)中種皮，依次用70%乙醇浸泡約2min和0.1。/。HgCb浸泡810min，無菌水清洗5次，然后用無菌的濾紙吸去材料表面的水分；(2)取步驟(1)所得到的無菌幼苗，剪取(優(yōu)選為剪取lcm左右)帶芽莖段接種在下述的任意一種固體培養(yǎng)基上進行芽和葉片的誘導培養(yǎng)(優(yōu)選為培養(yǎng)l個月)改良MS固體培養(yǎng)基+NAA0.10.5mg/L+6-節(jié)基嘌呤(6-benzyladenine，6-BA)0.51.0mg/L，或DCR培養(yǎng)基+NAA0.10.5mg/L+6-BA0.51.0mg/L;(3)將步驟(2)所獲得的芽或葉片轉(zhuǎn)接到改良MS或DCR基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)(優(yōu)選為培養(yǎng)l個月)，進行芽的增殖和葉片的生產(chǎn)，獲得大量無菌的銀杏芽苗或葉片。步驟1中銀杏芽和葉片增殖的另外一種優(yōu)選的方法，包括取室外銀杏雌株的實生苗春季嫩梢(優(yōu)選為3月下旬~4月上旬的苗春季嫩梢)接種在接種在以下任意一種固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個月(30天繼代一次)(1)改良MS固體培養(yǎng)基+0.25%活性炭(Aactivecarbon,AC)、或(2)WPM培養(yǎng)基+0.25%AC;獲得大量的無菌的銀杏芽苗和葉片。步驟2中，作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，將步驟1所獲得的銀杏無菌芽苗葉片剪成0.5cm2方塊，接種到下述任意一種愈傷組織誘導培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導(1)MS固體培養(yǎng)基+NAA0.51.5mg/L+BA0.51.0mg/L、或(2)MS固體培養(yǎng)基+NAA0.5~1.5mg/L+KT0.5mg/L;初代培養(yǎng)30天后連續(xù)繼代5~6次，繼代周期20天，獲得松散的愈傷組織；步驟3中，所述的含有NAA、KT的MS液體培養(yǎng)基的具體組成為MS液體培養(yǎng)基+NAAL0mg/L+KT0.5mg/L。步驟1-3中所述的MS液體培養(yǎng)基中蔗糖重量用量為30g/L，不添加瓊脂；所述的MS固體培養(yǎng)基中蔗糖重量用量為30g/L，瓊脂重量用量為6.5g/L。所述培養(yǎng)基消毒方式為在12rC下滅菌20min，培養(yǎng)基的pH值為5.85.9。上述制備方法中，步驟1-3中所述的培養(yǎng)條件優(yōu)選為溫度25土2。C，采用光照強度1000~20001x的日光燈照明，光照時間1014小時/天。步驟1-3中所述的改良MS培養(yǎng)基指MS基本培養(yǎng)基中大量元素減半；所述的稀土優(yōu)選是硝酸鑭稀土。采用分光光度法或高效液相色譜法測定結(jié)果表明，由本發(fā)明方法所制備得到的銀杏愈傷組織或懸浮細胞，其總黃酮苷的含量范圍多為0.5~1.9%。本發(fā)明利用組織及細胞培養(yǎng)生產(chǎn)含有較高黃酮類化合物的銀杏愈傷組織或懸浮細胞，不僅可以節(jié)約大量的土地資源、人力資源和物力資源，保護生態(tài)環(huán)境，而且不受季節(jié)等外界條件的限制，源源不斷的提供銀杏黃酮類化合物藥源。本發(fā)明方法利用稀土和水楊酸誘導子對細胞的培養(yǎng)和黃酮類化合物的生產(chǎn)進行有目的的調(diào)控，在短期內(nèi)可獲得大量的制藥原料，降低生產(chǎn)成本，可以與制藥廠形成一體化進行規(guī)?；⒐S化生產(chǎn)，將對銀杏產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展、制藥領域的進一步開拓具有重要的現(xiàn)實意義。具體實施方式以下通過具體實施方式對本發(fā)明進行進一步說明。這里想要指出的是，下面的具體實施方式僅用來說明本發(fā)明，本領域技術(shù)人員在理解本發(fā)明精神的前提下，可以根據(jù)本
技術(shù)領域：
的現(xiàn)有技術(shù)和公知知識對本發(fā)明進行相應變換，這些技術(shù)方案均落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明中所用到的各種常規(guī)培養(yǎng)基的配方見表1表1培養(yǎng)基的配方fMS(1962)l<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>說明本發(fā)明中實施例l、實施例2所用的銀杏品種為大佛指；實施例3、實施例4所用的銀杏品種為馬鈴；實施例5和實施例6所用的銀杏為室外的雌株春季嫩梢。實施例11.銀杏成熟胚用5。/。的84消毒液浸泡10min后，剝?nèi)ス琴|(zhì)中種皮，依次用70%乙醇浸泡約2min和0.P/。HgCl2浸泡810min，無菌水清洗5次，然后用無菌的濾紙吸去材料表面的水份，在無菌條件下從胚乳中取出胚，接種在不加調(diào)節(jié)劑的改良MS基本培養(yǎng)基(蔗糖用量為30g/L，瓊脂6.5g/L，pH值5.85.9，培養(yǎng)基在121'C下滅菌20min)上。培養(yǎng)溫度25士2'C，光照強度1000~20001x的日光燈照明，光照時間1014h/d。接種后胚開始萌發(fā)，8d后成完整小苗，30d后苗高可達23cm;2.將步驟1得到的1個月齡的無菌幼苗，剪掉胚根、子葉，將幼莖剪成lcm左右?guī)а啃《谓臃N到改良MS(NH4N03減半)基本培養(yǎng)基，附加NAA0.1mg/L+6-BA0.5mg/L，培養(yǎng)1個月后，再在不加NAA和6-BA的改良MS(NHUN03減半)基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)l個月。接種后芽開始分化、頂芽、腋芽長出、葉片也逐漸增多，面積增加，60d的芽苗高可達3cm,葉片數(shù)達8片；3.將步驟2所得到的莖段誘導的無菌芽苗葉片剪成0.5cm2方塊，接種到MS+NAA0.5mg/Lmg/L+BA0.5mg/L的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中蔗糖用量為30g/L，瓊脂6.5g/L,pH值5.85.9，培養(yǎng)基在121。C下滅菌20min。培養(yǎng)室溫度25士2'C，光照強度1000~20001x的日光燈照明，光照時間1014h/d。初代培養(yǎng)30d，愈傷組織誘導率達8090%以上，連續(xù)繼代56次，繼代周期20d,獲得大量松散的愈傷組織；4.上述步驟3中繼代5~6次的松散的愈傷組織，接種在MS+NAA1.0mg/L+1^0.511^/1^硝酸鑭稀土0.511^/1^的固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20d后收集愈傷組織培養(yǎng)物，吸干水分稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為12.53mg/g.干重；5.將步驟3所培養(yǎng)的松散愈傷組織接種到MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L的不加瓊脂的液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中蔗糖用量為30g/L，pH值5.85.9，在121。C下滅菌20min)中振蕩培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速為110r/min，振幅25cm。培養(yǎng)一周后，用無菌脫脂棉濾去大細胞團，濾液繼續(xù)培養(yǎng)，每10~15d繼代一次。培養(yǎng)室溫度25士2'C，光照強度10002000k的日光燈照明，光照時間1014h/d，懸浮細胞生長量較愈傷組織的高，得到大量的液體懸浮培養(yǎng)細胞；6.將上述步驟5中繼代2次的液體懸浮培養(yǎng)細胞接種在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+硝酸鑭稀土0.5mg/L的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)23d后收集培養(yǎng)物，抽濾稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；高效液相色譜法測定總黃酮苷的成分及含量。測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為13.99mg/g.干重；總黃酮苷中主要成分的組成比例為槲皮素山柰素異鼠李素=70.09:13.60:16.31實施例21.銀杏成熟胚用5%的84消毒液浸泡10min后，剝?nèi)ス琴|(zhì)中種皮，依次用70%乙醇浸泡約2min和0.1。/。HgCl2浸泡810min，無菌水清洗5次，然后用無菌的濾紙吸去材料表面的水份，在無菌條件下從胚乳中取出胚，接種在不加調(diào)節(jié)劑的改良MS基本培養(yǎng)基(蔗糖用量為30g/L，瓊脂6.5g/L，pH值5.85.9，培養(yǎng)基在121。C下滅菌20min)上，培養(yǎng)溫度25士2。C，光照強度1000~20001x的日光燈照明，光照時間1014h/d。接種后胚開始萌發(fā)，8d后成完整小苗，30d后苗高可達2~3cm;2.將步驟1得到的1個月齡的無菌幼苗，剪掉胚根、子葉，將幼莖剪成lcm左右?guī)а啃《谓臃N改良MS(NH4N03減半)基本培養(yǎng)基，附加NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L,培養(yǎng)1個月后，再在不加NAA，6-BA的改良MS(NH4NCb減半)基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個月。接種后芽開始分化、頂芽、腋芽長出、葉片也逐漸增多，面積增加，60d的芽苗高可達3cm，葉片數(shù)達8片；3.將步驟2所得到的莖段誘導的無菌芽苗葉片剪成0.5cm2方塊，接種到MS+NAA1.5mg/Lmg/L+BA1.0mg/L的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中蔗糖用量為30g/L，瓊脂6.5g/L，pH值5.85.9，培養(yǎng)基在121'C下滅菌20min。培養(yǎng)室溫度25土2'C，光照強度1000~20001x的日光燈照明，光照時間1014h/d。初代培養(yǎng)30d，愈傷組織誘導率達8090%以上，連續(xù)繼代5~6次，繼代周期20d，獲得大量松散的愈傷組織；4.上述步驟3中繼代5~6次的松散的愈傷組織，接種在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+硝酸鑭稀土0.5mg/L的固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15d后收集愈傷組織培養(yǎng)物，吸干水分稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為10.41mg/g.干重；5.將步驟3所培養(yǎng)的松散愈傷組織接種到不加瓊脂的液體培養(yǎng)基MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L(培養(yǎng)基中蔗糖用量為30g/L，pH值5.8~5.9，在121'C下滅菌20min)中振蕩培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速為110r/min，振幅25cm。培養(yǎng)一周后，用無菌脫脂棉濾去大細胞團，濾液繼續(xù)培養(yǎng)，每1015d繼代一次，共繼代二次。培養(yǎng)室溫度25土2。C，光照強度10002000k的日光燈照明，光照時間1014h/d。懸浮細胞生長量較愈傷組織的高，得到大量的液體懸浮培養(yǎng)細胞；6.將上述步驟5中的液體懸浮培養(yǎng)細胞接種在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+硝酸鑭稀土0.5mg/L的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16d后收集培養(yǎng)物，抽濾稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；高效液相色譜法測定總黃酮苷的成分及含量。測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為9.57mg/g.干重；總黃酮苷中各成分的組成比例為槲皮素山柰素異鼠李素=69.95:15.02:15.03實施例31.銀杏成熟胚用5%的84消毒液浸泡10min后，剝?nèi)ス琴|(zhì)中種皮，依次用70%乙醇浸泡約2min和0.1。/。HgCl2浸泡810min，無菌水清洗5次，然后用無菌的濾紙吸去材料表面的水份，在無菌條件下從胚乳中取出胚，接種在不加調(diào)節(jié)劑的WPM基本培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度25士2。C，光照強度1000~20001x的日光燈照明，光照時間1014h/d。接種后胚開始萌發(fā)，8d后成完整小苗，30d后苗高可達23cm;2.將步驟1所得到的1個月齡的無菌幼苗，剪掉胚根、子葉，將幼莖剪成lcm左右?guī)а啃《谓臃N到DCR基本培養(yǎng)基，附加NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L，培養(yǎng)1個月后，再在不加NAA,6-BA的DCR基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個月。接種后芽開始分化、頂芽、腋芽長出、葉片也逐漸增多，面積增加，60d的芽苗高可達3cm，葉片數(shù)達8片；3.將步驟2所得到的莖段誘導的無菌芽苗葉片剪成0.5cm2方塊，接種到MS+NAA0.5mg/L+KT0.5mg/L的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基中蔗糖用量為30g/L，瓊脂6.5g/L，pH值5.85.9，培養(yǎng)基在121'C下滅菌20min)，培養(yǎng)室溫度25±2°C，光照強度100020001x的日光燈照明，光照時間1014h/d。初代培養(yǎng)30d，愈傷組織誘導率達8090%以上。連續(xù)繼代56次，繼代周期20d，獲得大量松散的愈傷組織；4.上述步驟3中繼代5~6次的松散的愈傷組織,接種在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+水楊酸0.52.0mg/L的固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12d后收集愈傷組織培養(yǎng)物，吸干水分稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為18.719.0mg/g.干重；5.將步驟3所得到的松散愈傷組織接種到不加瓊脂的液體培養(yǎng)基MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L(培養(yǎng)基中蔗糖用量為30g/L，pH值5.85.9，在121'C下滅菌20min)中振蕩培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速為110r/min，振幅25cm。培養(yǎng)一周后，用無菌脫脂棉濾去大細胞團，濾液繼續(xù)培養(yǎng)，每1015d繼代一次，共繼代二次。培養(yǎng)室溫度25土2。C，光照強度100020001x的日光燈照明，光照時間1014h/d;6.將上述步驟5中繼代2次的液體懸浮培養(yǎng)細胞接種在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+水楊酸0.5mg/L的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10d后收集培養(yǎng)物，抽濾稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；高效液相色譜法測定總黃酮苷的成分及含量。測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為9.19mg/g.干重；實施例41.銀杏成熟胚用5%的84消毒液浸泡10min后，剝?nèi)ス琴|(zhì)中種皮，依次用70%乙醇浸泡約2min禾卩0.1。/。HgCl2浸泡810min，無菌水清洗5次，然后用無菌的濾紙吸去材料表面的水份，在無菌條件下從胚乳中取出胚，接種在不加調(diào)節(jié)劑的WPM基本培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度25土2'C，光照強度1000~2000k的日光燈照明，光照時間1014h/d。接種后胚開始萌發(fā)，8d后成完整小苗，30d后苗高可達2-3cm;2.將步驟1所得到的1個月齡的無菌幼苗，剪掉胚根、子葉，將幼莖剪成lcm左右?guī)а啃《谓臃N到DCR基本培養(yǎng)基，附加NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L，培養(yǎng)1個月后，再在不加NAA,6-BA的DCR基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)l個月。接種后芽開始分化、頂芽、腋芽長出、葉片也逐漸增多，面積增加，60d的芽苗高可達3cm，葉片數(shù)達8片；3.將步驟2所得到的莖段誘導的無菌芽苗葉片剪成0.5cm2方塊，接種到MS+NAA1.5mg/L+KT0.5mg/L的愈傷組織誘導培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基中蔗糖用量為30g/L，瓊脂6.5g/L，pH值5.8~5.9，培養(yǎng)基在121。C下滅菌20min)，培養(yǎng)室溫度25士2。C，光照強度10002000k的日光燈照明，光照時間1014h/d，初代培養(yǎng)30d，愈傷組織誘導率達8090%以上。連續(xù)繼代5~6次，繼代周期20d，獲得大量松散的愈傷組織；4.上述步驟3中繼代56次的松散的愈傷組織，接種在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+水楊酸0.52.0mg/L的固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20d后收集愈傷組織培養(yǎng)物，吸干水分稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為13.815.8mg/g.干重；5.將步驟3所得到的松散愈傷組織接種不加瓊脂的液體培養(yǎng)基MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L(培養(yǎng)基中蔗糖用量為30g/L，pH值5.8~5.9，在121。C下滅菌20min)中振蕩培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速為110r/min，振幅25cm。培養(yǎng)一周后，用無菌脫脂棉濾去大細胞團，濾液繼續(xù)培養(yǎng)，每1015d繼代一次。培養(yǎng)室溫度25士2。C，光照強度10002000k的日光燈照明，光照時間1014h/d，懸浮細胞生長量較愈傷組織的高，得到大量的液體懸浮培養(yǎng)細胞；6.將上述步驟5中繼代2次的液體懸浮培養(yǎng)細胞接種在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+水楊酸0.5mg/L的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16d后收集培養(yǎng)物，抽濾稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；高效液相色譜法測定總黃酮苷的成分及含測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為9.55mg/g.干重；總黃酮苷中各成分的組成比例為槲皮素山柰素異鼠李素=58.52:11.63:29.85實施例51、取室外銀杏雌株的春季嫩梢(3月下旬4月上旬)接種在改良MS+0.25。/oAC培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個月(30d繼代一次)。嫩梢逐漸抽長高，葉片逐漸長出，苗高達3~4cm，葉片數(shù)達10~12片，葉面積可達3.3cm2。上述各培養(yǎng)基中蔗糖用量為30g/L,瓊脂6.5g/L，pH值5.85.9。培養(yǎng)基在121。C下滅菌20min，培養(yǎng)室溫度25土2。C，光照強度1000~20001x的日光燈照明，光照時間1014h/d;2、將上述莖段誘導的無菌芽苗葉片剪成0.5cm2方塊，接種到MS+NAA1.5mg/Lmg/L+BA0.5mg/L的愈傷組織誘導培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中蔗糖用量為30g/L，瓊脂6.5g/L，pH值5.85.9，培養(yǎng)基在12rC下滅菌20min)中。培養(yǎng)室溫度25±2°C，光照強度1000~20001x的R光燈照明，光照時間1014h/d。初代培養(yǎng)30d，愈傷組織誘導率達80~90%以上。連續(xù)繼代56次，繼代周期20d，獲得大量松散的愈傷組織；3.將上述歩驟2中的愈傷組織繼代在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+硝酸鑭稀土0.5mg/L的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中蔗糖用量為30g/L，瓊脂6.5g/L,pH值5.85.9，培養(yǎng)基在12rC下滅菌20min)上，培養(yǎng)15d收獲培養(yǎng)物，抽濾稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；高效液相色譜法測定總黃酮苷的成分及含量。測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為14.8mg/g.干重；總黃酮苷中各成分的組成比例為槲皮素山柰素異鼠李素=89.15:8.29:2.56實施例61、取室外銀杏雌株的春季嫩梢(3月下旬4月上旬)接種在WPM+0.25%AC培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中蔗糖用量為30g/L，瓊脂6.5g/L，pH值5.8~5.9)中培養(yǎng)2個月(30d繼代一次)，嫩梢逐漸抽長，葉片逐漸長出，苗高達34cm，葉片數(shù)達10~12片，葉面積可達3.3cm2。培養(yǎng)基在121。C下滅菌20min，培養(yǎng)室溫度25±2°C，光照強度100020001x的日光燈照明，光照時間1014h/d;2.將上述莖段誘導的無菌芽苗葉片剪成0.5cm2方塊，接種到MS+NAA1.5mg/L+KT0.5mg/L的愈傷組織誘導培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中蔗糖用量為30g/L，瓊脂6.5g/L，pH值5.8~5.9)中，培養(yǎng)基在12rC下滅菌20min。培養(yǎng)室溫度25土2。C，光照強度100020001x的日光燈照明，光照時間1014h/d。初代培養(yǎng)30d，愈傷組織誘導率達80~90%以上。連續(xù)繼代56次，繼代周期20d，獲得大量松散的愈傷組織；3.將上述步驟2中的愈傷組織繼代在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+硝酸鑭稀O.5mg/L的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基中蔗糖用量為30g/L，瓊脂6.5g/L，pH值5.85.9，培養(yǎng)基在12rC下滅菌20min)上，培養(yǎng)20d收獲培養(yǎng)物，抽濾稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；高效液相色譜法測定總黃酮苷的成分及含量。測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為13.06mg/g.干重；對比試驗例1將實施例1中步驟3中繼代5~6次的松散的愈傷組織，接種在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L固體培養(yǎng)基中，其余步驟或方法完全同實施例1;培養(yǎng)20d后收集愈傷組織培養(yǎng)物，吸干水分稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為10.01mg/g.干重；將實施例1中步驟5中繼代2次的液體懸浮培養(yǎng)細胞接種在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L的液體培養(yǎng)基中，其余步驟或方法完全同實施例1;培養(yǎng)23d后收集培養(yǎng)物，抽濾稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；高效液相色譜法測定總黃酮苷的成分及含量。測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為6.01mg/g.千重?？傸S酮苷中各成分的組成比例為槲皮素山柰素異鼠李素=75.4:13.21:11.39對比試驗例2將實例2中步驟3中繼代5~6次的松散的愈傷組織,接種在MS+NAA1.0mg/L+0"0.511^1的固體培養(yǎng)基中，其余步驟或方法完全同實施例2滯養(yǎng)15d后收集愈傷組織培養(yǎng)物，吸干水分稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為7.19mg/g.干重；將實施例2中步驟5中繼代2次的液體懸浮培養(yǎng)細胞接種在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L的液體培養(yǎng)基中，其余步驟或方法完全同實施例2;培養(yǎng)16d后收集培養(yǎng)物，抽濾稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；高效液相色譜法測定總黃酮苷的成分及含量。測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為8.27mg/g.干重?？傸S酮苷中各成分的組成比例為槲皮素山柰素異鼠李素=76.54:8.62:14.84對比試驗例3將實例3中步驟3中繼代5~6次的松散的愈傷組織,接種在MS+NAA1.0mg/L+10^.5!1^/1^的固體培養(yǎng)基中，其余步驟或方法完全同實施例3;培養(yǎng)12d后收集愈傷組織培養(yǎng)物，吸干水分稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為15.7mg/g.干重；將實施例3中步驟5中繼代2次的液體懸浮培養(yǎng)細胞接種在MS+NAA1.0mg/L+&丁0.511^/1^的液體培養(yǎng)基中，其余步驟或方法完全同實施例5;培養(yǎng)10天后收集培養(yǎng)物，抽濾稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；高效液相色譜法測定總黃酮苷的成分及含量。測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為6.88mg/g.干重?？傸S酮苷中各成分的組成比例為槲皮素山柰素異鼠李素=38.8:0:61.2對比試驗例4將實例4中步驟3中繼代5~6次的松散的愈傷組織，接種在MS+NAA1.0mg/L+1^0.51^凡的固體培養(yǎng)基中，其余步驟或方法完全同實施例4;培養(yǎng)20d后收集愈傷組織培養(yǎng)物，吸干水分稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為12.67mg/g.干重；將實施例4中步驟5中繼代2次的液體懸浮培養(yǎng)細胞接種在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L的液體培養(yǎng)基中，其余步驟或方法完全同實施例4;培養(yǎng)16d后收集培養(yǎng)物，抽濾稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；高效液相色譜法測定總黃酮苷的成分及含量。測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為6.88mg/g,干重?？傸S酮苷中各成分的組成比例為槲皮素山柰素異鼠李素=38.8:0:61.2對比試驗例5將實施例5步驟3中繼代2次的液體懸浮培養(yǎng)細胞接種在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L的液體培養(yǎng)基中，其余步驟或方法完全同實施例5;培養(yǎng)15d后收集培養(yǎng)物，抽濾稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；高效液相色譜法測定總黃酮苷的成分及含量。測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為11.14mg/g.干重?？傸S酮苷中各成分的組成比例為槲皮素山柰素異鼠李素=40.92:53.86:5.22對比試驗例6將實施例6歩驟3中繼代2次的液體懸浮培養(yǎng)細胞接種在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L的液體培養(yǎng)基中，其余步驟或方法完全同實施例6;培養(yǎng)20d后收集培養(yǎng)物，抽濾稱取鮮重、干重，用分光光度法測定總黃酮苷；測定結(jié)果為總黃酮苷的含量為11.99mg/g.干重。權(quán)利要求1、一種銀杏愈傷組織或銀杏懸浮細胞的快速繁殖方法，包括無菌葉源的獲得、愈傷組織誘導及繼代培養(yǎng)、懸浮細胞培養(yǎng)等步驟，其主要步驟如下(1)、按照常規(guī)植物組織培養(yǎng)的芽或葉片增殖的方法，獲得無菌的銀杏芽苗或葉片；(2)、將步驟(1)所獲得的銀杏無菌芽苗或葉片接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導培養(yǎng)，初代培養(yǎng)后連續(xù)繼代5～6次，獲得松散的銀杏愈傷組織；(3)、將步驟(2)所獲得的銀杏愈傷組織接種在含有NAA和KT的MS液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)2次，得液體懸浮培養(yǎng)細胞；(4)、將步驟(3)所得到的液體懸浮培養(yǎng)細胞接種在下述任意一種液體培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)(a)MS液體培養(yǎng)基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+稀土0.5～5mg/L，或(b)MS液體培養(yǎng)基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+水楊酸0.5～5mg/L；收集細胞培養(yǎng)物，得銀杏懸浮細胞；或?qū)⒉襟E(2)中所獲得的銀杏愈傷組織繼代在下述任意一種固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)(a)MS固體培養(yǎng)基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+稀土0.5～5mg/L，或(b)MS固體培養(yǎng)基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+水楊酸0.5～5mg/L，收獲愈傷組織培養(yǎng)物，得銀杏愈傷組織。2.按照權(quán)利要求1的快速繁殖方法，其特征在于步驟(1)中所述無菌的銀杏芽或葉片按照下述方法增殖得到(a)將銀杏成熟種胚消毒后接種在DCR、WPM3或改良MS培養(yǎng)基中的任一種基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)形成無菌幼苗；其中，所述的銀杏成熟種胚消毒方式如下將銀杏成熟種胚用5%的84消毒液浸泡10min后，剝?nèi)ス琴|(zhì)中種皮，依次用70%乙醇浸泡2min和0.1。/。HgCl2浸泡810min，無菌水清洗5次，然后用無菌的濾紙吸去材料表面的水分；(b)取步驟(a)所得到的無菌幼苗，剪取帶芽莖段接種在下述的任意一種固體培養(yǎng)基上進行芽和葉片的誘導培養(yǎng)(i)改良MS培養(yǎng)基+NAA0.10.5mg/L+6-BA0.5~1.0mg/L，或(ii)DCR培養(yǎng)基+NAA0.10.5mg/L+6-BA0.5~1.0mg/L;(c)將步驟(b)所獲得的芽或葉片轉(zhuǎn)接到改良MS或DCR基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進行芽的增殖和葉片的生產(chǎn)，獲得無菌的銀杏芽苗或葉片。3、按照權(quán)利要求l的快速繁殖方法中，其特征在于步驟(1)中所述的銀杏芽和葉片按照下述方法增殖得到取室外銀杏雌株的春季嫩梢接種在以下任意一種固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個月(1)改良MS固體培養(yǎng)基+0.25。/。AC，或(2)WPM培養(yǎng)基+0.25%AC;獲得大量的無菌的銀杏芽苗和葉片。4、按照權(quán)利要求1的快速繁殖方法，其特征在于步驟(2)中，將步驟(1)所獲得的銀杏無菌芽苗葉片剪成0.5cm2方塊，接種到下述任意一種愈傷組織誘導培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導(1)MS固體培養(yǎng)基+NAA0.51.5mg/L+BA0.51.0mg/L，或(2)MS固體培養(yǎng)基+NAA0.51.5mg/L+KT0.5mg/L;初代培養(yǎng)30d后連續(xù)繼代56次，繼代周期20d，獲得松散的愈傷組織。5、按照權(quán)利要求1的快速繁殖方法，其特征在于步驟(3)中所述的含有NAA、KT的MS液體培養(yǎng)基的組成為MS液體培養(yǎng)基+NAAl.Omg/L+KT0.5mg/L。6、按照權(quán)利要求1的快速繁殖方法，其特征在于所述的MS液體培養(yǎng)基中蔗糖用量為30g/L，不添加瓊脂；所述的MS固體培養(yǎng)基中蔗糖用量為30g/L，瓊脂用量為6.5g/L。7、按照權(quán)利要求1的快速繁殖方法，其特征在于所述的培養(yǎng)條件為溫度25±2°C;采用光照強度為10002000bc的日光燈照明，光照時間1014小時/天。8、按照權(quán)利要求2的快速繁殖方法，其特征在于所述的改良MS培養(yǎng)基指MS基本培養(yǎng)基中大量元素減半。9、按照權(quán)利要求l的快速繁殖方法，其特征在于步驟(4)中所述的稀土是硝酸鑭稀土。全文摘要本發(fā)明公開了一種銀杏愈傷組織或懸浮細胞的快速繁殖方法，包括無菌葉源的獲得、愈傷組織誘導及繼代培養(yǎng)、懸浮細胞培養(yǎng)、愈傷組織或懸浮細胞中產(chǎn)生黃酮類化合物等步驟，本發(fā)明方法所制備的銀杏愈傷組織或懸浮細胞中有較高含量的銀杏黃酮類化合物。本發(fā)明方法利用稀土、水楊酸等誘導子對銀杏愈傷組織或懸浮細胞的培養(yǎng)和黃酮的生產(chǎn)進行有目的的調(diào)控，可以在短期內(nèi)獲得大量的制藥原料，并能有效降低生產(chǎn)成本。文檔編號C12N5/04GK101130763SQ200710143210公開日2008年2月27日申請日期2007年8月8日優(yōu)先權(quán)日2007年8月8日發(fā)明者曹福亮,胡春宏,穎陳申請人:南京林業(yè)大學