專利名稱：cs-acslg特異基因標記鑒定黃瓜雌性系技術(shù)的制作方法
cs-acs^特異基因標記鑒定黃瓜雌性系技術(shù)所屬技術(shù)領(lǐng)域本技術(shù)涉及一種利用PCR技術(shù)鑒定黃瓜雌性系的方法，即在基因水平上對黃瓜種質(zhì)資源 進行篩選。
技術(shù)背景黃瓜的性別表現(xiàn)和性別分化直接與產(chǎn)量有關(guān)，黃瓜雌性系是黃瓜育種中的重要種質(zhì)資源， 是提高產(chǎn)量的基礎(chǔ)。因此，研究黃瓜的性別分化機理及其遺傳標記，進行性別調(diào)控，尤其是 在幼苗期時鑒定植株的性別，具有重要的理論意義和實踐價值。如何快速、準確的進行黃瓜種質(zhì)資源鑒定這一問題目前尚未得到有效解決。目前，劃分 黃瓜性型類別的主要方法是田間觀察，即通過花期調(diào)査統(tǒng)計雌雄比和第一雌花節(jié)位等數(shù)據(jù)， 粗略的劃分雌性系和非雌性系。田間觀察通常認為雌雄比較大，第一雌花節(jié)位較低的品種為 雌性系，對于一些雌性不強的品種，往往與非雌性系之間相互混淆，并且營養(yǎng)因素、栽培環(huán) 境等外在因素對黃瓜性別分化影響較大，由此可見，利用分子生物學(xué)手段，在基因水平上劃 分黃瓜種質(zhì)資源可以有效地避免外界干擾，并且鑒定結(jié)果比其他方法準確、迅速。 發(fā)明內(nèi)容本技術(shù)對解決黃瓜性別鑒定問題具有重要作用，它克服了田間調(diào)査方法鑒定黃瓜雌性系 準確性不高、時間跨度大、工作量大、過程繁瑣等問題。本發(fā)明的技術(shù)方案是通過聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)(PCR技術(shù))，從待鑒定的黃瓜品種中提 取基因組DNA，以此DNA為PCR反應(yīng)的模板，利用cs-3cWg基因的一對上、下游特異引物， 在特定的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序條件下進行PCR擴增，對擴增結(jié)果進行瓊脂糖凝膠電泳分析， 若某一黃瓜品種中擴增出一條長約1013bp的條帶，對該條帶進行回收、測序分析，且測序結(jié) 果與"-acs&基因序列具有高度的同源性，說明此黃瓜品種為雌性系品種；相反，沒有擴增 出此特異條帶的為非雌性系品種。本技術(shù)的有益效果是，可以實現(xiàn)準確鑒定出黃瓜雌性系品種的目的，為加快黃瓜品種選 育，提高育種效率提供有效手段。并且操作過程簡易，免去了周圍環(huán)境對黃瓜性別鑒定的影 響，具有較高的生產(chǎn)實用性和可行性。
具體實施方式
首先提取不同性型品種的黃瓜基因組DNA，以此為模板，利用本技術(shù)所提供的一對上、 下游特異引物，按照下面給出的反應(yīng)體系、反應(yīng)程序，進行PCR擴增反應(yīng)，通過瓊脂糖凝膠 電泳檢測其擴增結(jié)果。若黃瓜品種中擴增出一條長約1013bp的條帶，且測序結(jié)果與下面所給出的cs-3"/^基因序列具有95%以上的高度同源性，則說明此黃瓜品種為雌性系品種；反之，沒有擴增出此特異條帶的為非雌性系品種，從而實現(xiàn)對黃瓜性型的快速鑒定與檢測。 兩條特異引物序列如下引物1 5' GATGGGTCTTGCCGAGAA 3'引物2 5' GAGCGAAGCTGGACATTTTAGT 3'PCR反應(yīng)的程序為:95 °C預(yù)變性(Predenaturation) lOmin94 。C變性(Denaturation) 1 min53°C退火(Annealing) 30 sec72°C延伸 (Elongation) 1 min30 sec循環(huán)次數(shù)(Cycles) 3572°C延伸 (Final Elongation) 10 min 4°C終止反應(yīng)PCR反應(yīng)的體系(25 )為10xbuffer 25 mM MgCl2 2 mM dNTP DNA模板(50ng/nl) Forward primer (20—) Reverse primer (20 (xM) ddH20TaqDNA聚合酶(5U/nl)3'.3'.3',B'u'!i00 u.cs-acs7g基因序列(長約I0l3bp)為: lGATGGGTCTT GCCGAGAATC AAGTA
權(quán)利要求
1.一項利用cs-acslg特異基因標記鑒定黃瓜雌性系的技術(shù)。本技術(shù)是一種利用聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)(PCR技術(shù))鑒定黃瓜雌性系的方法，即在基因水平上對黃瓜種質(zhì)資源進行篩選。
2. 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一項利用a"/《特異基因標記鑒定黃瓜雌性系的技術(shù)，其特 征是采用一對黃瓜雌性系特異基因引物(包括上、下游兩條)，通過聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)(PCR 技術(shù))，能夠擴增出長約1013bp特異條帶的黃瓜品種為雌性系品種，從而實現(xiàn)特異鑒定黃瓜 雌性系的目的。一對雌性系特異引物序列如下引物l 5' GATGGGTCTTGCCGAGAA 3'引物2 5' GAGCGAAGCTGGACATTTTAGT 3'。
3. 根據(jù)權(quán)利要求書l、 2所述的一項利用a"&特異基因標記鑒定黃瓜雌性系的技術(shù)，其 特征是從待鑒定的黃瓜品種中提取基因組DNA，以此DNA為PCR反應(yīng)的模板，利用 基因的一對上、下游特異引物，在特定的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序條件下進行PCR擴增，對擴增 結(jié)果進行瓊脂糖凝膠電泳分析，若黃瓜品種中擴增出一條長約1013bp的條帶，對該條帶進行 回收、測序分析，且測序結(jié)果與cs-3"&基因序列具有95%以上的高度同源性，說明此黃瓜 品種為雌性系品種；相反，沒有擴增出此特異條帶的為非雌性系品種。特定PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下PCR反應(yīng)的體系(25 Pi )為、10xbuffer 2.5 jil、25 mM MgCl2 2.0 (al、2 mM dNTP 2.5 nlDNA模板(50ng/nl) 1.0^1 Forward primer (20^M) 1.0 Reverse primer (20nM) 1.0 (xlddH20 14.8 nlTaq DNA聚合酶(5 U/pl) 0.2 ^PCR反應(yīng)的程序為、95 °C預(yù)變性(Predenaturation) lOmin、94 °C變性(Denaturation) 1 min、53°C退火 (Annealing) 30 sec 、72°C延伸 (Elongation) 1 min30sec循環(huán)次數(shù)(Cycles) 35、 72。C延伸 (Final Elongation) 10 min 4°C終止反應(yīng) 。
全文摘要
一項利用cs-acslg特異基因標記鑒定黃瓜雌性系的技術(shù)，是利用本技術(shù)所提供的一對黃瓜雌性系特異引物(包括上、下游兩條)，以黃瓜基因組DNA為模板，通過聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)(PCR技術(shù))，在特定的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系下進行PCR擴增，黃瓜雌性系品種可以擴增出一條長約1013bp的特異條帶，通過與cs-acslg基因序列比對，從而實現(xiàn)對黃瓜雌性系的快速、準確鑒定。解決了長期以來田間調(diào)查的繁瑣、不準確性等問題，為黃瓜種質(zhì)資源快速鑒定、提高育種效率、縮短育種年限提供了行之有效的技術(shù)方法。
文檔編號C12Q1/68GK101220391SQ20071014437
公開日2008年7月16日 申請日期2007年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月27日
發(fā)明者周秀艷, 秦智偉, 程立寶, 金曉霞 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)