專利名稱：半定量表達序列標簽擴增多態(tài)性的分子標記及其分析方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，特別是涉及一種半定量表達序列標簽擴增多 態(tài)性的分子標記及其分析方法。
技術背景DNA分子標記是新興的分子生物學技術，能夠從DNA水平直接反映生物的 遺傳本質(zhì)，具有數(shù)量多、多態(tài)性高、不受季節(jié)、環(huán)境影響、檢測手段簡單迅 速等多種優(yōu)點。分子標記已經(jīng)成為生命科學的前沿領域，廣泛應用于生物遺 傳多態(tài)性分析、遺傳連鎖圖譜構建、種質(zhì)資源鑒定、基因定位、親緣關系分 析、性別鑒定、基因組作圖、基因克隆、文庫構建和分子標記輔助選擇育種 等等多個方面，促進了農(nóng)業(yè)、林業(yè)、牧業(yè)，以及醫(yī)學包括法醫(yī)學等方面的快 速發(fā)展。1980年，分子標記RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism, 限制片段長度多態(tài)性，Botstein D， White R L， Skolnick M， Davis R W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. American Journal of Human Gene-tics, 1980， 32:314 331)以文獻報道形式出現(xiàn)。由于核苷酸序列的改變 遍及整個基因組，遺傳標記的數(shù)量已不再成為限制因素，其優(yōu)點明顯超過經(jīng)典 的蛋白質(zhì)多態(tài)性，從此開創(chuàng)了利用DNA多態(tài)性進行分子標記的新階段。但是 RFLP的缺點也很明顯必須經(jīng)過酶切和DNA雜交，因此，DNA需要量大，檢 測技術繁雜，難以大范圍推廣使用，開發(fā)新的分子標記技術勢在必行。1990 年，美國杜邦公司的科學家Williams (Williams J G K， Kubelik A R， Livak K J， et al. DNA Polymorphisms Amplified by Arbitrary Primers Are Useful as Genetic Markers [J]. Nucl Acid Res. 1990， 18: 6531-6535 )和加利 福尼亞生物研究所Welsh (Welsh J, McClelland M， Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Research, 1990, 18(24) :7213 7218 )分別領導的兩個小組幾乎同時將PCR 技術應用于分子標記，發(fā)展出一種新型的分子標記技術RAPD( random amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)性DNA)。 RAPD技術快速、簡便， 成本低廉。但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)該技術存在一定的缺陷RAPD為顯 性標記，不能提供完整的信息；易受實驗條件影響；穩(wěn)定性差；結果不能區(qū) 分純合體和雜合體。1989年，Tautz提出了SSR (Simple Sequence R印eat，簡單序列重復，Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers [J]. N ucleic Aci ds Research ，1989 ，17 :6463 647U)，又稱微衛(wèi)星DNA (Microsatelite 腿(Litt and Luty 1989， LittM， LutyJA. A hypervariable microsatellite revealed by in vit2ro amplification of dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. A merican Journal of Human Genetics ， 1989 ， 44 :397 40U)。 SSR標記是利用其兩端特定的DNA序列設計一對引物進行 PCR擴增，然后凝膠電泳，數(shù)據(jù)分析。該技術具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，DNA 用量少，重復性高。但她的開發(fā)和合成新的SSR引物投入高、難度大，必須 有大量的前期工作。1991年Moore等(Moore SS, Sargeant LL， King TJ， et al. The conservation of dinucleotide microsatellites among mammalian genomes allows the use of heterologous PCR primer pairs in closely related species [J]. Genomics, 1991,10: 654 660 )創(chuàng)立了 SSR即微衛(wèi) 星DNA分子標記。SSR分布廣、多態(tài)性豐富，但前期開發(fā)及合成SSR引物投入 高、難度大。SSR標記往往遠離功能基因，對研究功能基因不利。由于SSR突 變率高，開發(fā)出來的引物不能通用。1992年，荷蘭學者Zabeau Marc和Vos Pieter (VosP， Hogers R， BleekerMetal. AFLP:a new technique for DNA finger printing .Nucleic Acids Research, 1995， 21: 4407 4414)把RAPD禾n RFLP 技術結合起來，發(fā)明了新的分子標記AFLP技術(amplified fragment length ploymorphism，擴增片段長度多態(tài)性)，1993年獲歐洲專利局專利，專利號為 EP0534858A1 ( Zabeau M， Vos P. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA finger printing[P]. European Patent Office Publication 1993， 0535858AI.)。該技術快速、高效，分辨率 高、重復性好、易于標準化，很快被推廣到生物學的各個領域。但也存在明 顯的缺點技術繁瑣；過程時間長；檢測的不是等位片段；費用昂貴；AFLP 標記是顯性標記，不能提供完整信息。另外，它常常使用放射性同位素，假 陽性頻繁。1995年，Umethara等(Umethara Y， Inagaki A， Tanou H， Yasukochi Y， Nagamura Y, Saji S， 0tsuki Y， Fujimura T， Kurata N， Minobe Y， Construction and characterization of rice YAC library for physical mapping. Molecular Breeding, 1995,1， 79 - 89)用cDNA作為探針構建水 稻染色體的物理圖譜，該標記是一種EST標記(Expressed Sequence Tag, 即表達序列標簽)。2001年，Schubert等(Schubert R， Starck GM， Riegel R (2001) Development of EST-PCR markers and monitoring their intra populational genetic variation in Picea abies ) Karst. Theoretical and Applied Genetics, 103， 1223 - 1231)應用EST-PCR分子標記進行了歐洲云杉基因變異的研究。但EST的高度的保守性造成其多態(tài)性極低，難以大 量應用。1996年，美國MIT的科學家Lander (Lander ES. The new genomics: Global views of biology. Science, 1996,274:536 539)提出了 SNP (single nucleotide polymorphism,單核苷酸多態(tài)性)。SNP數(shù)量極多，其遺 傳穩(wěn)定性遠高于SSR，可以進行快速、規(guī)?；Y查，易于基因分型。和SSR — 樣，SNP也需要前期工作基礎，制作一個SNP圖需要多個SNP，且難以確定哪 個SNP出錯，并對數(shù)據(jù)進行有效分析。2001年，美國加州大學的Li與Quiros <Xi G， Quiros C F. Sequence—related amplified polymorphism (SRAP) ， A new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica. Theor Appl Genet, 2001， 103:455 461 )發(fā)表了 一種新型分子標記SRAP (sequence-related amplified polymorphism,相關序列擴增多態(tài)性)，又叫SBAPsequence-based amplified polymorphism,基于序列擴增多態(tài)性)。2003年，美國農(nóng)部北方作物科學實驗 室Hu與Vick (Hu J， Vick BA. Target region amplification polymorphism, a novel marker technique for plant genotyping. Plant Mol Biol Rep. 2003， 21， 289-294)在SRAP的基礎上又提出了 TRAP分子標記，TRAP的一個引物直 接應用SRAP，另一個根據(jù)EST設計。TRAP和SRAP的優(yōu)點是操作簡便、產(chǎn)量 中等、條帶易于分離及可測序，操作過程簡單，不須使用同位素。但這二種 技術存在一個共同缺陷PCR的起始退火溫度過低，假陽性率太高。從上述情況可以看到，分子標記的研究不斷有文獻報道，特別是90年代 以來，發(fā)展十分迅速。 一般來說，后來的研究都吸收了前者的優(yōu)點而克服了 他們的不足，使之不斷優(yōu)化，但現(xiàn)有的分子標記技術缺陷仍然十分明顯。除第一個分子標記RFLP是基于DNA Southern雜交技術外，后來發(fā)展的 分子標記基于PCR技術，他們的技術核心是引物的設計。表達序列標簽(Expressed Sequence Tags, EST)是Venter (Adams MD， Dubnick M， Kerlavage AR, Moreno R, Kelley JM, Utterback TR, Nagle JW， Fields C， Venter JC. Sequence identification of 2,375 human brain genes. Nature. 1992 Feb 13;355(6361):632~634)于1991年提出的一個概念，從cDNA文庫中取出一 個克隆，從5'端或3'端對其測序，所測得的約500bp的序列就稱為一個EST。 每個EST代表一個表達基因的部分轉(zhuǎn)錄片段。EST只測定部分序列，也不需要 對克隆排序，而且具有經(jīng)濟、高效的特點，通過對EST分析，有助于新基因 的發(fā)現(xiàn)。分析EST在不同組織的表達特異性，可以建立DNA的物理圖譜。目前，還沒有一種半定量的表達序列標簽(EST)擴增多態(tài)性的分子標記。 因此，開發(fā)一種半定量的EST擴增多態(tài)性，且經(jīng)濟、簡便、實用的新分子標 記技術十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種操作簡便、價格低廉、 重復性好半定量表達序列標簽擴增多態(tài)性的分子標記及其分析方法。 本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)的
一種半定量表達序列標簽擴增多態(tài)性的分子標記，其特征在于是根 據(jù)表達序列標簽設計固定引物，以CACGC為核心序列設計隨機引物，通過 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應而得到特定表達序列標簽多態(tài)性。
而且，所述的固定引物的序列如下
El: 5'ATTCAGCCGATTGCAAGAGA 37 CV171606 E2: 5'TATCTTGACCAGGCGAGACCT 37 CV171904。
而且，所述的隨機引物的序列如下
C1: 5 ，GACTGCGTACGCACGCTGA 3' C2: 5, GACTGCGTACGCACGCTGA 3' C3: 5 ， GACTGCGTACGCACGC AAC3 ，。
一種半定量表達序列標簽擴增多態(tài)性的分子標記的分析方法，包括以下
歩驟
(1) .確定目標EST;
(2) .在基因庫的EST庫查詢目標EST序列；
(3) .根據(jù)目標EST序列設計固定引物和隨機引物；
(4) .合成引物應用DNA合成儀合成設計好的固定引物和隨機引物引物；
(5) .RNA的提?。?br> (6) .RT-PCR擴增:應用oligod(T)做引物，對RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 應用固定引物和隨機引物，對cDNA進行PCR擴增；
(7) .擴增產(chǎn)物的檢測PCR擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；數(shù)據(jù)分析:
銀染以顯示擴增條帶，應用數(shù)據(jù)分析軟件進行分析。
而且，所述的隨機引物和固定引物的組合為 C1/E1, Cl/E2; C2/E1; C2/E2, C3/E1, C3/E2。
本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點是
1. 本發(fā)明可以直接研究目標EST的多態(tài)性，且經(jīng)濟、簡單、高效。
2. 本發(fā)明通過引物設計，保留了最新創(chuàng)立的分子標記SRAP和TRAP技術的 優(yōu)點，克服了他們的缺陷，除具備操作簡便、產(chǎn)量中等、條帶易于分離及可 測序，不需使用同位素等優(yōu)點之外，還具有半定量的特點?？捎糜谘芯恐参?、 動物、人類以及微生物的遺傳多態(tài)性分析、種質(zhì)資源鑒定、基因定位、親緣 關系分析和分子標記輔助選擇育種等。
具體實施例方式
本發(fā)明通過以下實施例進一步詳述，下述實施例是說明性的，不是限定 性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。 不同產(chǎn)地丹參多態(tài)性實驗研究
1. 實驗材料:河南、四川、陜西和江蘇丹參的葉。
2. 實驗儀器低溫高速離心機、超低溫冰箱、水浴箱、超凈工作臺、752 分光光度儀、電泳儀、電泳圖象分析系統(tǒng)、DNA擴增儀、旋渦混合器、微型高 速離心機、水平電泳儀
3. 試布J: ^t氛酸狐，SuperScript IlRnase H. Reverse Transcriptase(Invitrogen),Tris-HCL(PH 8.0),EDTA,p-巰基乙醇、NaCL、 NH4Ac (Promega Corp)、氯仿、異丙醇、無水乙醇、瓊脂 糖、Tris飽和酚、RNA酶、冰乙酸，Spfu-DNA Polymerase (賽百盛公司)，dNTPS,Acrylamiole, bis, 1 OxTBE,TEMED, 10% Ammonium Pers函te
4. 實驗方法 4. 1 RNA提取
a).準備工作預熱恒溫水浴箱、預冷低溫高速離心機、超凈工作臺紫外
線消毒滅菌、預冷。
(2) .取丹參樣品約500mg，液氮下研磨。
(3) .將上面已經(jīng)研磨成面的樣本倒入印pendorf管中。
(4) .加入異硫氰酸胍提取液或Trizollml，放置10分鐘；用吸頭反復吹打 數(shù)次，使混合均勻。
(5) .加入氯仿200ul，混勻，室溫放置15分鐘；然后，4°C， 12000rpm， 離心15分鐘；吸取上層水相至另一 印pendorf管中。
(6) .加入異丙醇0.5ml，混勻，室溫放置10分鐘；4°C， 12000rpm，離心 IO分鐘；棄上清，RNA沉淀于管底。
(7) .加入75。/。乙醇lml，溫和震蕩懸浮沉淀；4°C， 8000rpm,離心5分鐘， 棄上清，用吸水紙吸干多余乙醇，涼干15-20分鐘。
(8) .加入經(jīng)過DEPC處理的去離子水50ul， 60°C， 10分鐘，取出檢測其完
整性及純度。
DnaseI消化總RNA中殘留的DNA:
(1) .取20pg總RNA，加入5xDnase緩沖液4ial， Dnase I (1U/nl)5)nl，力口DEPC 水至總體積為20pl， 37'C溫浴10min。
(2) .反應結束，加入180iulDEPC水，200pl水飽和酚氯仿異戊醇(50: 49: 1)抽提一次。
(3) .取上清液加入3M的醋酸鈉(pH5.2)至終濃度為0.3M，并加2. 5倍的無 水乙醇，-80。Clh。(4) . 12000rpm， 4。C離心15min，棄上清。
(5) .沉淀物用75%的乙醇洗兩次，空氣干燥后加入20^dDEPC處理水，調(diào) RNA濃度為1(ag/W， -80°。保存?zhèn)溆谩?br> 4.2引物設計
(1) .固定引物的設計a.在丹參的EST數(shù)據(jù)庫査找到丹參素生物合成相關 的苯丙醇(phenylpropanol)代謝途徑目標序列為CV171606和CV171904; b.將 這2個序列調(diào)入PCR引物設計軟件oligo6.0; c.根據(jù)軟件提示，分別設置參數(shù);d. 從軟件產(chǎn)生的引物中，每個EST選1個引物作為固定引物，2個EST選2個引物， 其序列及NCBI登陸號如下
E1: 5 ， ATTCAGCCGATTGCAAGAGA 3 V CV171606 E2: 5'TATCTTGACCAGGCGAGACCT 37 CV171904
(2) .隨機引物的設計隨機引物包括3部分核心序列，前置序列和后前置 序列，核心序列為一段內(nèi)含子保守序列"CACGC"。前置序列和后前置序列 來自SRAP和TRAP。其序列如下
C1: 5 ，GACTGCGTACGCACGCTGA 3' C2: 5 ， GACTGCGTACGCACGCTGA 3 ，
(3) .隨機引物和固定引物的組合如下 C1/E1， C2/E2。
4. 3反轉(zhuǎn)錄反應
引物應用oligod(T) 18，轉(zhuǎn)錄時為保證各組之間的可比性，每個反應均加 入RNA2ul，其濃度為0. lug/ul，具體步驟如下
(1) .在微量離心管中加入下列物品 RNA 2ul oligod(T)18 lul
(2) .混勻，70°C， 10min，冰浴2min。
(3) .再向體系中加入
去離子水 8.8ul
5 XRT-Buffer 4ul dNTP mix 2ul DTT 2ul Superscript II RT enzyme 0. 2ul 整個反應體系為20ul。
(4) .將反應管置于PCR儀上，按如下溫度操作；
25°C， 5min; 50°C， 50min ; 70。C， 15min， _^ 4°C。
(5) .反應結束后，儲存于-2X:C備用。ii 35cycle:
iii
IV
4. 4. PCR擴增
(1) .反應體系
cDNA 2ul 10XPCR Buffer 2ul dNTPS(10mMeach) 0.5ul 隨機和固定引物(30pmo1) 各lul s-pfuDNA聚合酶(2.5U) 0.5ul 去離子水加至 20 ul
加各種試劑后，蓋緊薄壁管蓋，短暫離心混勻。向需要滴加石蠟油的PCR 薄壁管中滴加石蠟油30ul，放進PCR擴增儀中。
(2) .將反應管置于PCR儀上，按下面溫度操作
i 94 。C 4mi
94°C 45sec 52 。C 1 min
72°C lmin30sec 72 °C 10min 4°C 終止 取出擴增的樣品，4。C保存。 4. 5變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析 4. 5.1準備制膠玻板
(1) .洗潔精清洗大小玻璃板，自來水沖洗數(shù)遍，蒸餾水沖洗3遍，涼干。 大小玻璃板清洗必須潔凈，否則影響后面灌膠。洗前用彩色透明膠布做好標 記以區(qū)分未經(jīng)處理的一面。
(2) . 95。/。乙醇清洗大小玻璃板。
(3) .處理小玻板噴灑適量"雨敵"于小玻板，衛(wèi)生紙將其均勻涂抹在整 個表面。室溫干燥10分鐘，輕輕擦去多余的"雨敵"。
(4) .處理大玻板:在通風櫥中準備Bind-Silane，將150 u 1 Bind Silane， 150ul冰醋酸加于1.2ml的95。/。乙醇中，充分混合，全部加到大玻板上，衛(wèi)生 紙均勻涂抹整個表面。室溫10分鐘，輕輕擦去多余的Bind-Silane。
(5) .清洗間隔條、加樣梳，將處理好的大玻板置于水平制膠模具上，放置 間隔條，壓上小玻板對齊，夾好長尾夾子，準備制膠。
(6) .變性聚丙烯酰胺凝膠60ml，迅速加入 TEMED 60ul 10% Ammonium persulfate 240ul 輕輕混勻(7) .用20ml注射器小心吸取凝膠混合液，加入兩塊玻板間，讓液體自頂 端向下流動直到液面到達玻板底部，注入過程可以根據(jù)具體情況，用拳頭輕 輕捶打震動玻板，以便凝膠混合液流動。注入過程應該連續(xù)，避免氣泡產(chǎn)生。 一旦有邊緣處產(chǎn)生氣泡，立即用細絲插入將其引出。如果中間產(chǎn)生大量氣泡， 只能廢棄再從新灌膠。(8) .灌膠成功后，迅速插入加樣梳(齒向上)于頂端兩玻板間，并用長尾 夾固定頂端。(9) .室溫聚合l小時以上。 4. 5. 2.預電泳a).凝膠聚合好后，去掉長尾夾，放置凝膠板于垂直電泳槽上，對齊后擰 緊固定螺絲。(2) .在垂直電泳槽的上下槽中分別加入約500ml 1XTBE緩沖液。(3) .小心去掉加樣梳，用小吸管沖洗加樣槽。(4) .接通電源，調(diào)節(jié)電壓，恒壓85v預電泳0. 5小時。 4. 5. 3.電泳(1) .擴增產(chǎn)物lOul，加入5ul上樣緩沖液。(2) .95'C變性10分鐘，立即取出置于冰上冷卻。(3) .凝膠預電泳結束后，切斷電源。再次沖洗加樣槽，吹去氣泡。(4) .小心插入梳子(齒向下)，沖洗二遍。然后自左向右依次將樣本和DNA marker加入凝膠加樣槽。(5) .恒電壓lOOv電泳1. 5小時。 4. 5. 4.銀染(1) .電泳結束后，打開固定螺絲，從電泳槽上取下凝膠玻板置于水平制膠 模具上。拔掉梳子，松動間隔條，小心去掉小玻璃板，凝膠粘附在大玻板上。(2) .將大玻板輕輕放入2000ml固定液盒中，打開旋轉(zhuǎn)搖床緩慢搖動固定 20min。(3) .蒸餾水水洗2次，每次5min。(4) .轉(zhuǎn)入2000ml銀染液盒中，旋轉(zhuǎn)搖床緩慢搖動銀染30min。(5) .水洗10s。(6) .迅速轉(zhuǎn)入2000ml顯影液盒中，旋轉(zhuǎn)搖床緩慢搖動直至譜帶顯出，再 顯影片刻。(7) .在顯影液中，待條帶稍稍清晰時，直接轉(zhuǎn)入固定液中，定影5min。(8) .水洗5min。(9) .取出凝膠，自然干燥。 4.5.5數(shù)據(jù)采集與分析4.5.5.數(shù)據(jù)采集與分析數(shù)碼相機照相，Pharmacia hnagemaster凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析不同 產(chǎn)地丹參的差異、多態(tài)性。4. 5. 6.結果應用2對引物擴增四個產(chǎn)地的丹參共8個樣品得到82條擴增 條帶，其中多態(tài)性條帶12條，占14.6%。擴增片斷大小在144 卯0bp之間，平 均每對引物可以產(chǎn)生41個條帶，6個多態(tài)性條帶。
權利要求
1.一種半定量表達序列標簽擴增多態(tài)性的分子標記，其特征在于是根據(jù)目標表達序列標簽設計固定引物，以CACGC為核心序列設計隨機引物，通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應而得到特定表達序列標簽多態(tài)性。
2. 根據(jù)權利要求1所述的半定量表達序列標簽擴增多態(tài)性的分子標記，其特征在于所述的固定引物的序列如下El: 5'ATTCAGCCGATTGCAAGAGA 37 CV171606 E2: 5 ，TATCTTGACCAGGCGAGACCT 3 7 CV171904 。
3. 根據(jù)權利要求1所述的半定量表達序列標簽擴增多態(tài)性的分子標記， 其特征在于所述的隨機引物的序列如下C1: 5 ，GACTGCGTACGCACGCTGA 3' C2: 5' GACTGCGTACGCACGCTGA 3' C3: 5 ， GACTGCGTACGCACGC AAC3'。
4. 一種如權利要求l所述的半定量表達序列標簽擴增多態(tài)性的分子標記的分析方法，其特征在于分析方法包括以下步驟(1) .確定目標EST;(2) .在基因庫的EST庫査詢目標EST序列；(3) .根據(jù)目標EST序列設計固定引物和隨機引物；(4) .合成引物應用DNA合成儀合成設計好的固定引物和隨機引物引物；(5) .RNA的提??；(6) .RT-PCR擴增應用oligod(T)做引物，對RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA， 應用固定引物和隨機引物，對cDNA進行PCR擴增；(7) .擴增產(chǎn)物的檢測PCR擴增產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；數(shù)據(jù)分析: 銀染以顯示擴增條帶，應用數(shù)據(jù)分析軟件進行分析。
5. 根據(jù)權利要求4所述的半定量表達序列標簽擴增多態(tài)性的分子標記的分 析方法，其特征在于所述的隨機引物和固定引物的組合為C1/E1, Cl/E2; C2/E1; C2/E2, C3/E1， C3/E2。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種半定量表達序列標簽擴增多態(tài)性的分子標記及其分析方法，是根據(jù)目標表達序列標簽設計固定引物，以CACGC為核心序列設計隨機引物，通過RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應)而得到特定表達序列標簽多態(tài)性。本發(fā)明通過引物設計，保留了最新創(chuàng)立的分子標記SRAP和TRAP技術的優(yōu)點，克服了他們的缺陷，除具備操作簡便、產(chǎn)量中等、條帶易于分離及可測序，不需使用同位素等優(yōu)點之外，還具有半定量的特點。可用于研究植物、動物、人類以及微生物的遺傳多態(tài)性分析、種質(zhì)資源鑒定、基因定位、親緣關系分析和分子標記輔助選擇育種等。
文檔編號C12Q1/68GK101225438SQ200710150328
公開日2008年7月23日 申請日期2007年11月22日 優(yōu)先權日2007年11月22日
發(fā)明者盧全生, 康立源, 萌 張, 張伯禮, 王慶浩, 陳愛華 申請人:天津中醫(yī)藥大學