專利名稱：納米細(xì)菌纖維素醛基化改性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種納米細(xì)菌纖維素醛基化改性的方法，屬于納米生物材料研究范疇。
背景技術(shù)：
纖維素是高分子水凝膠材料的一種，是地球上最為豐富的一類生物大分子，它可被 分為植物纖維素和納米纖維素，其中植物纖維素是植物體最主要的組成部分；細(xì)菌纖維 素是微生物細(xì)胞外大分子物質(zhì)的代表，是初級代謝的特定產(chǎn)物。細(xì)菌纖維素與植物纖維 素的最大區(qū)別在于化學(xué)純度，前者是一種純纖維素，而后者通常與難以除去的半纖維素 及木質(zhì)素相連。細(xì)菌纖維素在培養(yǎng)基中自發(fā)形成了精細(xì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而這種特殊的結(jié)構(gòu) 決定了纖維素的化學(xué)和物理性能。
細(xì)菌纖維素良好的力學(xué)性能、透氣性能、生物相容性等性質(zhì)使其在生物醫(yī)用領(lǐng)域中
具有十分廣泛的商業(yè)化應(yīng)用潛力。細(xì)菌纖維素制備出的現(xiàn)代創(chuàng)傷敷料在1987年就有了
成功用于治愈燒傷、燙傷及皮膚移植的例子。至今為止，細(xì)菌纖維素的醫(yī)用商品已經(jīng)出
現(xiàn)了很多，如Biofi^、 Gengiflex⑤等。
最近細(xì)菌纖維素作為軟組織工程支架的研究也有了進(jìn)展。雖然己經(jīng)有很多種高分子 材料用于制備軟骨組織支架，如天然高分子材料中的膠原、纖維蛋白、藻酸鹽等，人工 合成高分子材料中的PGA、 PLA等，但軟組織工程支架不僅要求具有足夠的力學(xué)性能、 良好的生物相容性和降解性能，還要有微孔結(jié)構(gòu)用以細(xì)胞的生長和物質(zhì)的傳輸。以上的 材料都不能夠很好的符合軟組織工程支架的要求。細(xì)菌纖維素的各項(xiàng)性能能夠較好的滿 足軟組織工程支架的要求，有很好的應(yīng)用潛力。軟骨細(xì)胞在細(xì)菌纖維素基體上的繁殖速 度雖然僅為在膠原11上的50%，但在相同的體外免疫反應(yīng)程度下，軟骨細(xì)胞在細(xì)菌纖維 素基體上的生長速度要高于在藻酸鹽基體上的生長速度；軟骨細(xì)胞在經(jīng)磷化處理和硫化 處理的細(xì)菌纖維素膜上的生長速度沒有明顯的提高。在這種由細(xì)菌纖維素構(gòu)成的支架 上，軟骨細(xì)胞保持了分化型。細(xì)菌纖維素的楊氏模量與關(guān)節(jié)軟骨組織的相似，拉伸強(qiáng)度 則高于膠原網(wǎng)狀組織；細(xì)菌纖維素的壓縮模量與藻酸鹽相似，但低于關(guān)節(jié)軟骨組織的壓 縮模量。
細(xì)菌纖維素G 10nm)雖然具有天然精細(xì)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、優(yōu)良的力學(xué)性能和生物相 容性，但是細(xì)菌纖維素與細(xì)胞的黏附以及載藥方面的表現(xiàn)并不突出。為使細(xì)菌纖維素成 為更加適宜的組織工程支架，對其進(jìn)行改性就顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種納米細(xì)菌纖維素醛基化改性的方法，釆用氧化的方法，將 醛基接枝在細(xì)菌纖維素分子鏈上，醛基可以為細(xì)胞黏附、固定蛋白、接枝藥物和抗體提
供活性位點(diǎn)，從而大大的提高了細(xì)菌纖維素的反應(yīng)活性和細(xì)胞黏附性，以提高其反應(yīng)活 性和細(xì)胞黏附性，滿足細(xì)菌纖維素作為組織工程支架的要求。
本發(fā)明提供的一種納米細(xì)菌纖維素醛基化改性的方法包括如下步驟
1) 利用微生物發(fā)酵方法制備納米細(xì)菌纖維素水凝膠，經(jīng)過堿液純化處理并充分清 洗后，得到納米纖維素水凝膠；
2) 將上述的納米纖維素懸浮于水中，加入含有2， 2, 6， 6-四甲基哌啶氧化物與溴 化鈉的溶液中充分?jǐn)嚢瑁?br> 3) 在堿性條件加入次氯酸鈉溶液，維持堿性反應(yīng)體系；
4) 在20 3(TC條件下，反應(yīng)20 40分鐘后，加入無水乙醇終止反應(yīng)，取出纖維素 水凝膠膜，充分清洗后置于4'C冰箱中保存待用。
所述的微生物為根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、氣 桿菌屬、固氮菌屬、木醋桿菌的一種或幾種。
所述的懸浮于水中的細(xì)菌纖維素為30 60 g，加入2， 2， 6， 6-四甲基哌啶氧化物 0.1 0.3g、 NaBrl 3g;所述的有效氯為5% 10%的次氯酸鈉溶液0.5 0.2 g。
所述的堿液為NaOH、 KOH或氨水溶液的一種或幾種。
所述的堿性反應(yīng)體系的pH為10 12。
本發(fā)明提供的一種納米細(xì)菌纖維素醛基化改性的方法包括如下步驟
1) 利用木醋桿菌作為生物反應(yīng)器，經(jīng)過發(fā)酵制備出乳白色的細(xì)菌纖維素水凝膠膜；
2) 將細(xì)菌纖維素水凝膠懸浮于去離子水中，加入2， 2， 6， 6-四甲基哌啶氧化物和 NaBr，充分?jǐn)嚢瑁?br> 3) 向反應(yīng)體系中加入次氯酸鈉溶液，并加入堿液保證反應(yīng)體系維持堿性條件10
12;
4) 在20 3(TC條件下，攪拌20 40分鐘后，加入無水乙醇終止反應(yīng)，取出纖維 素水凝膠膜，充分清洗后置于4'C冰箱中保存待用。
所述的細(xì)菌纖維素水凝、2， 2， 6， 6-四甲基哌啶氧化物和NaBr的質(zhì)量比為30 60: (U 0.3: 1 3。所述的次氯酸鈉溶液是有效氯為5% 10%的次氯酸鈉溶液。
本發(fā)明是利用有機(jī)物羥基可以被氧化成醛基的反應(yīng)機(jī)理，并結(jié)合細(xì)菌纖維素分子富 含豐富羥基的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)后探索出一種對細(xì)菌纖維素進(jìn)行醛基改性的方 法。本發(fā)明在十分溫和的條件下制備了含有醛基的納米細(xì)菌纖維素，大大的提高了細(xì)菌 纖維素的反應(yīng)活性和細(xì)胞黏附性，以提高其反應(yīng)活性和細(xì)胞黏附性，滿足細(xì)菌纖維素作 為組織工程支架的要求，可以極大的拓展納米細(xì)菌纖維素的應(yīng)用領(lǐng)域。


圖1是經(jīng)過反應(yīng)后的細(xì)菌纖維素的SEM照片。 圖2是用來鑒定醛基的指示劑。 圖3是將反應(yīng)后的細(xì)菌纖維素置于指示劑充分混合后的照片。
具體實(shí)施方式
實(shí)例1
利用木醋桿菌作為生物反應(yīng)器，經(jīng)過發(fā)酵制備出乳白色的細(xì)菌纖維素水凝膠膜[L.
Hong, Y丄.Wang, S.R. Jia, Y. Huang, C. Gao, Y.Z. Wan Hydroxyapatite/bacterial cellulose composites synthesized via a biomimetic route, Materials Letters 60 (2006) 1710 -1713.]。木醋桿菌菌種置于瓊脂固體培養(yǎng)基中，在4。C下冷藏保存。
將由木醋桿菌生成的細(xì)菌纖維素50g懸浮于去離子水中，加入2， 2， 6， 6-四甲基 哌啶氧化物0.1g和溴化鈉1.3g，充分?jǐn)嚢?。然后緩慢加入有效氯?0%的次氯酸鈉溶 液0,25g，并加入0.5M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的pH為11。開始計(jì)時，在25'C下反 應(yīng)30min后，加入40ml無水乙醇終止反應(yīng)。將細(xì)菌纖維素取出用去離子反復(fù)沖洗后， 即得到醛基化細(xì)菌纖維素。
將實(shí)例1得到的醛基化細(xì)菌纖維素可以由以下方式進(jìn)行評價 微觀結(jié)構(gòu)
反應(yīng)細(xì)菌纖維素利用環(huán)境掃描電鏡(ESEM)觀察其微觀結(jié)構(gòu)如圖l所示。氧化細(xì) 菌纖維素依然保持精細(xì)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。符合組織工程支架的要求。 醛基鑒定
在100 ml錐形瓶中加入50 ml黃色指示劑如圖2所示，該指示劑遇醛基則由黃色 變?yōu)闇睾偷姆奂t色。將反應(yīng)后的細(xì)菌纖維素水凝膠膜切成小塊置于指示劑中充分振蕩混 合。由圖3可以看出指示劑變?yōu)闇睾偷姆奂t色，說明按照本發(fā)明的改性方法可以將醛基 接枝到細(xì)菌纖維素分子上，成功制備出醛基化細(xì)菌纖維素。
指示劑的配制在250ml錐形瓶中加入100ml鹽酸羥胺的甲醇溶液(20g/L)，然后 向錐形瓶內(nèi)滴加8滴百里酚藍(lán)的乙醇溶液(O.lg百里酚藍(lán)溶于100ml 20%的乙醇中)。 若此時溶液呈黃色則作為指示劑待用，否則用氫氧化鈉的甲醇溶液(0.03mol/L)滴至黃 色后再作為指示劑使用。 實(shí)例2
將由木醋桿菌生成的細(xì)菌纖維素50g懸浮于去離子水中，加入2， 2, 6， 6-四甲基 哌啶氧化物0.1g和溴化鈉1.3g，充分?jǐn)嚢?。然后緩慢加入有效氯?%的次氯酸鈉溶液 0.5g，并加入0.5 M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的pH為10。開始計(jì)時，在3(TC下反應(yīng)20min 后，加入40ml無水乙醇終止反應(yīng)。將細(xì)菌纖維素取出用去離子反復(fù)沖洗后，即得到醛 基化細(xì)菌纖維素。評價方法同實(shí)例l。
權(quán)利要求
1、一種納米細(xì)菌纖維素醛基化改性的方法，其特征在于包括如下步驟1)利用微生物發(fā)酵方法制備納米細(xì)菌纖維素水凝膠，經(jīng)過堿液純化處理并充分清洗后，得到納米纖維素水凝膠；2)將上述的納米纖維素懸浮于水中，加入含有2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物與溴化鈉的溶液中充分?jǐn)嚢瑁?)在堿性條件加入次氯酸鈉溶液，維持堿性反應(yīng)體系；4)在20～30℃條件下，反應(yīng)20～40分鐘后，加入無水乙醇終止反應(yīng)，取出纖維素水凝膠膜，充分清洗后置于4℃冰箱中保存待用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于所述的微生物為根瘤菌屬、八疊 球菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、氣桿菌屬、固氮菌屬、木醋桿菌的一種 或幾種。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于所述的懸浮于水中的細(xì)菌纖維素為 30 60g，加入2， 2， 6， 6-四甲基哌啶氧化物0.1~0.3g、 NaBrl 3g;所述的有效氯 為5% 10%的次氯酸鈉溶液0.5 0.2g。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于所述的堿液為NaOH、 KOH或氨水溶液的一種或幾種。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于所述的堿性反應(yīng)體系的pH為10 12。
6、 一種納米細(xì)菌纖維素醛基化改性的方法，其特征在于包括如下步驟1) 利用木醋桿菌作為生物反應(yīng)器，經(jīng)過發(fā)酵制備出細(xì)菌纖維素水凝膠膜；2) 將細(xì)菌纖維素水凝膠懸浮于去離子水中，加入2， 2， 6， 6-四甲基哌咬氧化物和 NaBr，充分?jǐn)嚢瑁?) 向反應(yīng)體系中加入次氯酸鈉溶液，并加入堿液保證反應(yīng)體系維持堿性條件10 12;4) 在20 30。C條件下，攪拌20 40分鐘后，加入無水乙醇終止反應(yīng)，取出纖維 素水凝膠膜，充分清洗后置于4'C冰箱中保存待用。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6中所述的方法，其特征在于所述的細(xì)菌纖維素水凝、2， 2, 6， 6-四甲基哌啶氧化物和1 3gNaBr的質(zhì)量比為30 60: (U 0.3: 1 3。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6中所述的方法，其特征在于所述的次氯酸鈉溶液是有效氯為5 % 10%的次氯酸鈉溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及納米細(xì)菌纖維素醛基化改性的方法。該方法以納米級細(xì)菌纖維素為基本原料，其中納米細(xì)菌纖維素具有精細(xì)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且微纖維直徑為3～10nm；將納米細(xì)菌纖維素懸浮于去離子水中，向去離子水中加入氧化劑，其中氧化劑為2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物、溴化鈉和次氯酸鈉；在20～30℃的堿性環(huán)境下反應(yīng)20～40min，其中堿性溶液的pH為10～12。本發(fā)明在十分溫和的條件下制備了含有醛基的納米細(xì)菌纖維素，可以極大的拓展納米細(xì)菌纖維素的應(yīng)用領(lǐng)域。
文檔編號C12P19/00GK101182561SQ20071015074
公開日2008年5月21日 申請日期2007年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日
發(fā)明者萬怡灶, 芳 何, 羅紅林, 川 高, 遠(yuǎn) 黃 申請人:天津大學(xué)