專利名稱：：乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后分子分型基因群及其基因芯片制備和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及功能基因組學(xué)及基因芯片制備、雜交和分析技術(shù)。具體而言是在人功能基因組表達(dá)譜范圍內(nèi)篩選可用于乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后分子分型的基因群，并制備成基因芯片，應(yīng)用于乳腺癌患者的轉(zhuǎn)移和預(yù)后預(yù)測。
背景技術(shù)：
：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國近年來發(fā)病率逐年上升，且呈年輕化趨勢，成為婦女健康的重大威脅。盡管臨床診斷和治療措施不斷改進，但乳腺癌患者的死亡率仍得不到有效控制，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因。提高乳腺癌患者的生存率、改善預(yù)后的關(guān)鍵在于早期對乳腺癌患者的轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后進行準(zhǔn)確評估，從而指導(dǎo)臨床進行及時、有效的治療。乳腺癌是全身性疾病，腫瘤細(xì)胞的淋巴道和血道播散導(dǎo)致的全身轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者治療失敗和死亡的關(guān)鍵所在。目前臨床仍然采用腫瘤大小，臨床分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)受累狀況及激素受體表達(dá)等作為常規(guī)預(yù)后因素，并用于指導(dǎo)術(shù)式和放療的局部治療范圍的選擇，以及化療和激素治療的全身控制方案的制定。但臨床資料顯示20-30%淋巴結(jié)陽性患者在15-30年內(nèi)不會發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而大約30%淋巴結(jié)陰性乳腺癌患者在術(shù)后5-10年內(nèi)可能發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移有些發(fā)生在腫瘤進展的晚期，但也可能出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生的早期。對于前者的患者群，目前臨床常規(guī)的預(yù)后指標(biāo)可以比較準(zhǔn)確的預(yù)測患者的預(yù)后，而國內(nèi)外各種治療方案的制定策略也是針對于這部分患者；但對于后者的患者群，由于依據(jù)臨床常規(guī)的預(yù)后指標(biāo)不能預(yù)測患者的高轉(zhuǎn)移潛能，因此使這部分患者往往失去綜合治療的有利時機，無轉(zhuǎn)移生存期和總生存期大大縮短。組織細(xì)胞轉(zhuǎn)移表型的獲得是以涉及轉(zhuǎn)移生物學(xué)過程的基因型改變?yōu)榛A(chǔ)，轉(zhuǎn)移生物學(xué)過程的復(fù)雜性和乳腺癌組織細(xì)胞生長的異質(zhì)性，決定了這種基因型并非是單基因或少數(shù)幾個基因的異常改變，因此目前已知的轉(zhuǎn)移預(yù)后相關(guān)基因c-erbB-2、p53等并不能實現(xiàn)對臨床患者的預(yù)后預(yù)測。而功能基因組學(xué)的技術(shù)方法如消減雜交、mRNA差異顯示、代表性差異分析、RNA指紋技術(shù)、抑制性削減雜交和基因表達(dá)序列分析等是在基因組表達(dá)譜范圍內(nèi)篩選新的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的有效方法。基因芯片技術(shù)則以高通量平行篩選疾病相關(guān)基因的技術(shù)優(yōu)勢，為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展中多基因改變的分子機制提供了有力的工具，特別在轉(zhuǎn)移基因群的篩選和預(yù)后分子分型中具有特殊優(yōu)勢。本發(fā)明利用人表達(dá)譜基因芯片，通過比較乳腺原發(fā)癌與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌，以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性與轉(zhuǎn)移陽性患者的原發(fā)癌，篩選乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后預(yù)測基因群，用于乳腺癌患者預(yù)后的分子分型，篩選高危轉(zhuǎn)移和亞臨床轉(zhuǎn)移患者，以期指導(dǎo)臨床實施個體化治療，延長患者無病生存期和總生存期。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明利用人表達(dá)譜基因芯片篩選得到由79個基因組成的"淋巴結(jié)陽性乳腺癌預(yù)后預(yù)測基因群"，它們在多病例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺的原發(fā)癌與配對的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌間有相同的差異表達(dá)趨勢，不但可以區(qū)分乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌，而且可以預(yù)測淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者的預(yù)后；利用人表達(dá)譜基因芯片篩選得到由56個基因組成的"乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷基因群"，它們是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性病例與轉(zhuǎn)移陰性病例的乳腺原發(fā)癌間差異表達(dá)的基因群，能準(zhǔn)確判斷乳腺癌患者的腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移狀態(tài)；在原發(fā)癌與配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌篩選得到的79個差異表達(dá)基因和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性與轉(zhuǎn)移陽性乳腺原發(fā)癌間的56個差異表達(dá)基因的基礎(chǔ)上，篩選得到由32個基因組成的"淋巴結(jié)陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移預(yù)測基因群"，基于這一基因群可以篩選淋巴結(jié)陰性乳腺癌中的高危轉(zhuǎn)移患者。以上三組基因群可以制備成"乳腺癌轉(zhuǎn)移預(yù)報基因芯片"，用于通過乳腺癌患者原發(fā)癌或針吸活檢組織樣本進行轉(zhuǎn)移和預(yù)后分子分型，即用"乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷基因群"判斷患者的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者用"淋巴結(jié)陽性乳腺癌預(yù)后預(yù)測基因群"預(yù)測患者預(yù)后，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者用"淋巴結(jié)陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移預(yù)測基因群"篩選高危轉(zhuǎn)移患者。由此，為臨床患者的轉(zhuǎn)移預(yù)后預(yù)測和適時個體化治療提供客觀依據(jù)。圖1是基于26例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺原發(fā)癌"淋巴結(jié)陽性乳腺癌預(yù)后預(yù)測基因群"的基因表達(dá)譜對病例的聚類結(jié)果。圖2是基于20例乳腺原發(fā)癌"乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷基因群"的基因表達(dá)譜對病例的聚類結(jié)果。圖3是基于49例常規(guī)病理診斷轉(zhuǎn)移陰性乳腺原發(fā)癌"淋巴結(jié)陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移預(yù)測基因群"的基因表達(dá)譜對病例的聚類結(jié)果。圖4是基于"淋巴結(jié)陽性乳腺癌預(yù)后預(yù)測基因群"分類9例驗證病例的聚類結(jié)果。圖5是基于"淋巴結(jié)陽性乳腺癌預(yù)后預(yù)測基因群"對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌患者預(yù)后分子分型的Kaplan-Meier生存分析結(jié)果。圖6是基于"乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷基因群"對29例驗證樣本聚類結(jié)果。圖7是基于包括"淋巴結(jié)陽性乳腺癌預(yù)后預(yù)測基因群"和"乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷基因群"的134個基因?qū)?9例乳腺原發(fā)癌的k-mean聚類結(jié)果。圖8是轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組Kaplan-Meier生存分析結(jié)果。具體實施例方式通過以下實施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。表1是淋巴結(jié)陽性乳腺癌預(yù)后預(yù)測基因群。表2是乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷基因群。表3是淋巴結(jié)陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移預(yù)測基因群。實施例l、淋巴結(jié)陽性乳腺癌預(yù)后預(yù)測基因群篩選和應(yīng)用材料方法1.病例選擇及標(biāo)本處理所有標(biāo)本均取自2002年1月至2003年12月天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺科收治的行乳腺根治術(shù)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌患者，病理類型為浸潤性導(dǎo)管癌，有2個以上轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)。每一病例分別取乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌樣本，經(jīng)組織切片HE染色證實淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中癌細(xì)胞占75%以上，組織樣本經(jīng)液氮速凍后-8(TC保存。以26例淋巴結(jié)陽性乳腺癌病例作為訓(xùn)練病例(trainingcases)，平均隨訪43個月，其中11例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；另外9例淋巴結(jié)陽性乳腺癌病例作為驗證病例(testingcases)，平均隨訪43個月，其中5例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。病例資料見表4。表426例訓(xùn)練樣本和9例驗證樣本病例資料臨床資料訓(xùn)練病例(26例)驗證病例(9例)臨床分期(UICC腫瘤分期)I41II73m125IV30腫瘤大小(cm)《2732國5134>562淋巴結(jié)陽性數(shù)l國31054國933》10131組織學(xué)分級I10II165III94ER陽性145陰性12443個月內(nèi)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移陽性115陰性1542.樣本的熒光標(biāo)記細(xì)胞RNA提取及純化采用TrizolReagent(Invitrogen公司，美國)提取樣本組織細(xì)胞總RNA，方法按照試劑說明。用無RNA酶水溶解RNA，紫外分光光度法檢測RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，RNeasymidikit(Qiagen公司，美國)純化。雙鏈cDNA合成取10iig純化的細(xì)胞總RNA，以T7-01igo(dT)15，(5'畫AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGCGCTTtttttTTTTTTTTTV-3，V為G、C禾口A,上海博亞生物技術(shù)有限公司)為引物，用cDNASynthesisKit(大連寶生物有限公司，中國)合成雙鏈cDNA，QIAquickPCRPurificationKit(Qiagen)純化合成的雙鏈cDNA。以cDNA為模板體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA:用T7RiboMAXExpressLargeScaleRNAProductionSystem(Promega公司，美國)進行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用RNeasymidikit(Qiagen公司，美國)純化。以cRNA為模板體外反轉(zhuǎn)錄使用SuperscriptII反應(yīng)體系和9mer隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用QIAquickPCRPurificationKit純化。隨機引物標(biāo)記使用隨機引物標(biāo)記試劑盒(大連寶生物有限公司，中國)，以cRNA的體外反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進行隨機引物標(biāo)記。Cy3標(biāo)記乳腺原發(fā)癌樣本，Cy5標(biāo)記轉(zhuǎn)移癌樣本。標(biāo)記產(chǎn)物用QIAquickPCRPurificationKit純化。標(biāo)記產(chǎn)物離心濃縮抽干并溶于16.8ul去離子水中，準(zhǔn)備用于芯片雜交。3.基因芯片雜交人表達(dá)譜基因芯片為北京博奧生物芯片有限公司制備的人Oligo芯片。芯片上所有基因取自Qiagen公司的人類基因70merOligo庫，點樣在一張75mmX25mm、經(jīng)過化學(xué)修飾的載玻片上，含約23232個基因點，包括21329個人功能基因，以12個看家基因作為陽性對照，12個人工合成的與人基因沒有同源性的70merOligoDNA作為陰性對照，以及擬南芥的3個基因作為外標(biāo)。整個點陣分成48個亞陣，每個亞陣有22行，22列。點間距為185um，點的直徑約為140um?；蛐酒?jīng)60。C水合，250mJ紫外交聯(lián)，0.5。/。SDS及無水乙醇清洗后用于雜交。將原發(fā)癌與轉(zhuǎn)移癌樣本的熒光標(biāo)記產(chǎn)物溶于30uL雜交液(3xSSC,0.2%SDS,5xDenhart's，25%甲酰胺)中，與基因芯片在42'C雜交過夜?；蛐酒诤?.2e/。SDS的2xSSC中42。C洗5min，在0.2xSSC中室溫洗5min，離心甩干玻片。4.雜交芯片的掃描及生物信息學(xué)分析雜交芯片的掃描及數(shù)據(jù)初步提取雜交后熒光標(biāo)記的基因芯片用ScanArrayExpress雙通道激光掃描儀(PackardBioscience公司，美國)掃描。采用GenePixPro4.0圖像分析軟件(Axon公司，美國)對芯片圖像進行分析，熒光強度采用Lowess方法進行標(biāo)準(zhǔn)化[1]。Cy3和Cy5的熒光強度值同時小于100的基因為無效基因，Cy3或Cy5之一的熒光強度值大于100的為有效表達(dá)基因，從其中篩選差異表達(dá)基因。共同差異表達(dá)基因篩選計算Lowess方法標(biāo)準(zhǔn)化后Cy5與Cy3的比值為mtio值，ratio值大于1.5或小于0.67為1.5倍差異表達(dá)基因。篩選26例中14例以上有1.5倍共同差異表達(dá)、Cy3與Cy5熒光強度值之差大于500、且配對t檢驗尸0.05的基因為共同差異表達(dá)基因。樣本聚類采用Cluster軟件和Treeview軟件基于表1中的差異表達(dá)基因?qū)θ橄僭l(fā)癌進行平均聚類分析。5.統(tǒng)計學(xué)分析采用Kaplan-Meier法和COX比例風(fēng)險回歸對基于差異基因分組的患者的43個月的隨訪結(jié)果進行生存期分析。結(jié)果判斷1.差異表達(dá)基因篩選有79個基因在26例訓(xùn)練病例中的14例，存在原發(fā)癌與轉(zhuǎn)移癌達(dá)1.5倍以上共同差異表達(dá)趨勢(上調(diào)或下調(diào))，且配對t檢驗尸0.05，見表l。其中包括58個基因在轉(zhuǎn)移癌中較原發(fā)癌上調(diào)和21個在轉(zhuǎn)移癌中較原發(fā)癌基因下調(diào)。這些基因涉及細(xì)胞粘附運動、細(xì)胞外基質(zhì)成分、細(xì)胞生長代謝、信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)過程。2.基于原發(fā)癌差異基因表達(dá)的預(yù)后分型用79個差異表達(dá)基因?qū)?6例訓(xùn)練病例的原發(fā)癌進行平均聚類分析，結(jié)果可以將患者分兩組(18例和8例)，43個月內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病例分別為9/18和2/8，統(tǒng)計學(xué)分析P〈0.05，分別稱為轉(zhuǎn)移"高危組"和"低危組"兩個亞組，見圖1。由此認(rèn)為由79個差異基因組成的基因群可以預(yù)測淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者的預(yù)后。為了驗證該基因群對預(yù)后分型的準(zhǔn)確性，在26例訓(xùn)練病例中加入9例驗證病例重新聚類。結(jié)果驗證病例中，5例有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病例均被分類到"高危組"；4例無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病例中，3例分類到"低危組"，1例分類到"高危組"，見圖4。Kaplan-Meier生存分析表明"低危組"43個月無轉(zhuǎn)移生存期高于"高危組"，差異有顯著性(尸=0.026)，見圖5。本研究同時采用Kaplan-Meier方法分析了組織學(xué)分級、腫瘤大小、雌激素受體(ER)狀態(tài)、臨床分期和陽性淋巴結(jié)數(shù)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果組織學(xué)分級(尸=0.002)、腫瘤大小(尸=0.018)和ER(戶=0.008)與乳腺癌預(yù)后相關(guān)，而臨床分期(尸=0.059)和陽性淋巴結(jié)數(shù)(尸=0.138)與乳腺癌預(yù)后無關(guān)。隨后，79個差異基因組成的基因表達(dá)譜、組織學(xué)分級、腫瘤大小和ER狀態(tài)被引入Cox，s風(fēng)險比例回歸模型中，結(jié)果通過基因表達(dá)譜分類的"高危組"淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者43個月內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的危險度較"低危組"高4.65倍(95%CI1.02-21.13,尸=0.047)，優(yōu)于組織學(xué)分級(OR=3.015，95%CI1.01-9.02)和ER(OR=2.95，95%CI0.97-9.01)，而腫瘤大小被從回歸方程中剔除。技術(shù)優(yōu)勢腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)是臨床乳腺癌患者預(yù)后預(yù)測及制定治療方案的重要依據(jù)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者的預(yù)后較差，生存期顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。根據(jù)現(xiàn)行的乳腺癌系統(tǒng)治療原則，所有淋巴結(jié)陽性患者都需要接受乳房(或腫物)切除、腋窩淋巴結(jié)清掃、和/或胸大肌、胸小肌切除、輔助化療和術(shù)后放療(臨床T3或T4期；N2或N3期；鎖上、鎖下或內(nèi)乳淋巴結(jié)浸潤；4個以上陽性淋巴結(jié)的患者)。但是。臨床資料顯示，有20-30%淋巴結(jié)陽性患者在15-30年內(nèi)不會發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這些患者不能為常規(guī)病理學(xué)方法識別而接受不必要的過度治療，患者并不能從輔助治療中獲益，反而遭受其潛在的副作用。基因芯片技術(shù)可以實現(xiàn)在基因表達(dá)譜范圍內(nèi)對疾病相關(guān)基因進行比較研究，特別是對腫瘤發(fā)生、發(fā)展中涉及復(fù)雜生物學(xué)過程的多基因異常改變的研究具有特殊的優(yōu)勢。利用基因表達(dá)譜芯片篩選乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和進行預(yù)后分型的研究已有報道。Van'tVeer等^使用包含25,000個基因的cDNA芯片對78例淋巴結(jié)陰性55歲以下乳腺癌患者的基因表達(dá)譜進行分析，并根據(jù)每個差異表達(dá)基因與隨訪預(yù)后的相關(guān)性對其中78例腫瘤進行監(jiān)督系統(tǒng)聚類(supervisedhierarchicalclustering)分析，篩選到一組包含70個基因的基因群，基于原發(fā)癌該基因群的表達(dá)譜可以對患者預(yù)后進行準(zhǔn)確的分類，其中，"預(yù)后不良組"(poorprognosis)5年內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的概率是"預(yù)后良好組"(goodprognosis)的28倍。Wang等[3]也篩選到一個由76個基因組成的基因群可以預(yù)測5年內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性乳腺癌患者的預(yù)后。這些研究表明乳腺原發(fā)癌的基因表達(dá)譜可以預(yù)測患者預(yù)后。也有一些研究[4—7]比較乳腺原發(fā)癌和配對轉(zhuǎn)移癌的基因表達(dá)譜差異，但由于樣本量小或隨訪時間短，未能對這些差異基因的預(yù)后預(yù)測能力進行分析。本研究將淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌作為乳腺原發(fā)癌的高轉(zhuǎn)移亞克隆，采用表達(dá)譜基因芯片篩選在多病例中乳腺原發(fā)癌與配對的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌有共同差異表達(dá)趨勢的基因。篩選得到一組包括79個基因的基因群，基于該基因群不但可以區(qū)分淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌和原發(fā)癌，而且可以將乳腺原發(fā)癌聚類為"高危組"和"低危組"兩個亞組，"高危組"患者43個月內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險高于"低危組"4.65倍(95%CI1.02-21.13)，表明基于乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌間的差異基因群的基因表達(dá)譜可以預(yù)測淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者的預(yù)后，且是獨立的預(yù)后預(yù)測指標(biāo)。根據(jù)本組預(yù)后分子分型的結(jié)果，大約30%淋巴結(jié)陽性患者將不發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此，手術(shù)前可以針吸活檢患者的原發(fā)癌組織，通過檢測預(yù)測基因群的表達(dá)譜可以預(yù)測患者預(yù)后，從而指導(dǎo)臨床縮小手術(shù)切除范圍，降低放、化療的過度治療。本組研究篩選得到的在乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中差異表達(dá)的基因群，不僅可以區(qū)分乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌，同時還可以對淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者的預(yù)后進行預(yù)測，指導(dǎo)臨床實施個體化治療。實施例2、乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷基因群篩選和應(yīng)用材料和方法1.病例選擇和標(biāo)本處理本組49例乳腺癌原發(fā)癌組織均取自2002年1月至2003年12月天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺科收治的行乳腺根治術(shù)的乳腺癌患者，經(jīng)病理組織切片的HE染色證實為浸潤性導(dǎo)管癌(WHO分類)，平均隨訪時間43個月。隨機選取10例淋巴結(jié)陰性乳腺癌患者和10例淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者作為訓(xùn)練病例，19例淋巴結(jié)陰性患者和IO例淋巴結(jié)陽性患者作為驗證病例，病例資料見表5。另外，取32例乳腺腫瘤患者的正常乳腺組織提取RNA后等量混合作為對照樣本。所有組織樣本均經(jīng)液氮速凍后于-S(TC保存?zhèn)溆?。?20例訓(xùn)練樣本和29例驗證樣本病例資料<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.組織樣本標(biāo)記總RNA提取、雙鏈cDNA合成、體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA、cRNA的反轉(zhuǎn)錄、cDNA的熒光標(biāo)記和基因芯片雜交的方法同實施例1。各實驗樣本標(biāo)記Cy5，正常對照樣本標(biāo)記Cy3。3.基因芯片雜交每一Cy5標(biāo)記的49例乳腺癌樣本與Cy3標(biāo)記的由32例正常乳腺組織混合而成的正常對照樣本在同一芯片上雜交，方法同實施例1。4.生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)初步提取雜交的基因芯片掃描后得到的熒光強度值采用Lowess方法進行標(biāo)準(zhǔn)化[1]，計算各實驗樣本與對照樣本的比值。Cy3或Cy5之一的熒光強度值大于100的為有效表達(dá)基因。差異表達(dá)基因篩選篩選在80%病例中表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性與轉(zhuǎn)移陰性組間t檢驗尸0.05且與淋巴結(jié)狀態(tài)的相關(guān)系數(shù)大于0.55的基因作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組間的差異表達(dá)基因。.樣本聚類采用Cluster軟件和Treeview軟件基于差異基因的表達(dá)譜對訓(xùn)練病例和驗證病例進行平均聚類。結(jié)果判斷1.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性與轉(zhuǎn)移陰性乳腺原發(fā)癌的差異表達(dá)基因本組篩選得到56個在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性和轉(zhuǎn)移陰性乳腺癌原發(fā)癌間差異表達(dá)的基因。其中43個在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌中較轉(zhuǎn)移陰性乳腺癌表達(dá)上調(diào)，13個基因在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌中較轉(zhuǎn)移陰性乳腺癌表達(dá)表達(dá)下調(diào)。這些基因涉及細(xì)胞粘附運動、細(xì)胞生長代謝、信號傳導(dǎo)等與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)過程，見表2。2.差異基因預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)基于乳腺原發(fā)癌的56個差異基因的表達(dá)譜對20例訓(xùn)練病例進行平均聚類分析，結(jié)果將淋巴結(jié)陽性和陰性患者完全分開，即分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性兩組，見圖2。為了驗證56個基因的基因群對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測能力，將29例驗證病例原發(fā)癌的差異基因表達(dá)譜加入訓(xùn)練病例中，結(jié)果10例淋巴結(jié)陽性驗證病例全部分類正確，而19例淋巴結(jié)陰性病例中的18例分類正確，僅l例錯分到淋巴結(jié)陽性組中，而該病例在2年內(nèi)發(fā)生腦轉(zhuǎn)移。見圖6。技術(shù)優(yōu)勢乳腺癌患者的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)是臨床預(yù)后預(yù)測和治療方案制定的重要參考指標(biāo)。在預(yù)后判斷上，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者的預(yù)后較轉(zhuǎn)移陰性患者差，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性數(shù)與患者預(yù)后反向相關(guān)。在治療上，隨著乳腺癌早期診斷率的不斷提高，手術(shù)范圍由大趨小，因此，對于臨床早期(1、II期)乳腺癌患者，保乳手術(shù)已逐漸成為首選術(shù)式。前哨淋巴結(jié)(sentinellymphnodes,SLN)活檢后的病理診斷成為判斷早期乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)是決定接受保乳手術(shù)者是否實施腋淋巴結(jié)清掃(axillarylymphnodesdissection,ALND)的依據(jù)。但常規(guī)病理診斷往往不能檢出〈2mm的微轉(zhuǎn)移灶，而前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移陽性者發(fā)生局部淋巴結(jié)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的概率顯著高于無微轉(zhuǎn)移者；同時，5.519.2%的跳躍性轉(zhuǎn)移(skipmetastases)也是SLN診斷的技術(shù)盲點，影響淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的正確檢出，而得不到根治性治療[8]。本組研究采用基因芯片技術(shù)篩選得到由56個基因組成的基因群，可以準(zhǔn)確分類淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性和轉(zhuǎn)移陰性的原發(fā)癌，僅有l(wèi)例(C31-3)淋巴結(jié)陰性患者被錯分到淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組。但臨床資料表明，該病例患者在術(shù)后2年內(nèi)發(fā)生腦轉(zhuǎn)移。由此推測其在手術(shù)時可能已存在淋巴和/或血行的微轉(zhuǎn)移?；谠撊橄僭l(fā)癌組織的該基因群的表達(dá)譜可以準(zhǔn)確判斷患者的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)，因此，將該組基因群命名為"淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷基因群"。該基因群經(jīng)大樣本臨床病例驗證后，有望用于通過針吸獲得乳腺原發(fā)癌樣本對淋巴結(jié)狀態(tài)進行預(yù)測，指導(dǎo)臨床實施個體化局部治療和全身化療，既可避免淋巴結(jié)陰性患者ALND的過度治療，又可避免存在淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移或高危轉(zhuǎn)移的患者由于術(shù)式選擇和綜合治療的姑息治療引起的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。實施例3、淋巴結(jié)陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移預(yù)測基因群篩選及其應(yīng)用乳腺癌具有組織細(xì)胞異質(zhì)性的生物學(xué)特性，腫瘤細(xì)胞發(fā)生、進展直至轉(zhuǎn)移的過程，既有在原發(fā)部位克隆性生長的量變的積累，也隨時伴發(fā)選擇性生長的高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞獲得了逃逸和播散的能力，在腋窩淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處臟器形成繼發(fā)的轉(zhuǎn)移癌。因此，轉(zhuǎn)移癌有些是發(fā)生在腫瘤進展的晚期的所謂"異質(zhì)性轉(zhuǎn)移"，但也可能是出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生早期的所謂"同質(zhì)性轉(zhuǎn)移"。本研究第一部分篩選得到79個基因在多病例乳腺原發(fā)癌和配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌間有共同差異趨勢，這些基因表達(dá)改變是異質(zhì)性轉(zhuǎn)移的生物學(xué)基礎(chǔ)，由于同質(zhì)性轉(zhuǎn)移的原發(fā)癌與配對的轉(zhuǎn)移癌具有相同的基因的特征，而不能被篩選出來；本研究第二部分篩選得到的56個基因是在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者和轉(zhuǎn)移陰性患者乳腺原發(fā)癌間有共同差異趨勢，這些基因表達(dá)的差異是不同病例的原發(fā)癌具有不同轉(zhuǎn)移能力的同質(zhì)性轉(zhuǎn)移的生物學(xué)基礎(chǔ)。由于兩種轉(zhuǎn)移模式同時存在，因此認(rèn)為兩組基因的組合更能全面反映腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移生物學(xué)基礎(chǔ)，可能會更好地對患者進行分子分型和轉(zhuǎn)移預(yù)后預(yù)測。本組研究將實施例1和實施例2的差異基因合并和優(yōu)化用于乳腺原發(fā)癌分子分型和轉(zhuǎn)移預(yù)后預(yù)測。數(shù)據(jù)來源1.候選基因群包括實施例1篩選得到的在原發(fā)癌與配對轉(zhuǎn)移癌之間差異表達(dá)的基因79個和實施例2篩選得到的在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性和轉(zhuǎn)移陽性原發(fā)癌之間差異表達(dá)的基因56個，其中NEFL為兩組基因中重合的基因，共計134個基因。2.驗證病例及候選基因表達(dá)第二部分中全部49例乳腺癌病例及其基因芯片雜交結(jié)果中候選基因群基因表達(dá)量的全部數(shù)據(jù)作為該組研究的驗證病例和這些病例原發(fā)癌的候選基因的相對表達(dá)量。結(jié)果判定基于49例乳腺原發(fā)癌的134個候選基因群的基因表達(dá)譜對病例進行k-mean聚類，聚類參數(shù)設(shè)為基因4類，樣本4類。k-mean聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn)A組基因群(見表3)在不同淋巴結(jié)狀態(tài)及不同預(yù)后病例的原發(fā)癌間表達(dá)量有顯著改變。結(jié)果見圖7。進一步基于A組的32個基因的原發(fā)癌表達(dá)譜對49例病例進行平均聚類分析。結(jié)果淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性病例和平均隨訪43個月發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病例均分布在右側(cè)"轉(zhuǎn)移組"，見圖3。"轉(zhuǎn)移組"中腫瘤分期高(P-0.003)、組織學(xué)分級差(P=0.006)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性(P=0.012)和43個月內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P-0.033)的病例多于"非轉(zhuǎn)移組"，差異均有顯著性(PO.05)，而兩組間腫瘤大小和雌激素受體狀態(tài)無統(tǒng)計學(xué)差異(P〉0.05)，見表6。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果表明，"轉(zhuǎn)移組"與"無轉(zhuǎn)移組"無瘤生存期差異具有顯著性，P=0.02，見圖8。表6基于轉(zhuǎn)移預(yù)測基因群的分子分組與臨床因素的關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>本組研究聯(lián)合第一部分和第二部分篩選得到的差異基因?qū)θ橄僭l(fā)癌進行分類，K-mean聚類結(jié)果提示，其中32個基因可以將遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例聚類在一起，組成"轉(zhuǎn)移組"，只有一例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移陽性病例分類在"非轉(zhuǎn)移組"，因此該基因群可以作為"乳腺癌轉(zhuǎn)移預(yù)測基因群"。另外，根據(jù)該基因群對病例的聚類，在"轉(zhuǎn)移組"中有部分淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性病例，預(yù)示這些病例已經(jīng)存在或即將發(fā)生淋巴結(jié)或血行轉(zhuǎn)移，是轉(zhuǎn)移的高?；颊摺，F(xiàn)行的淋巴結(jié)陰性乳腺癌患者行輔助治療的適應(yīng)征大都以St.Gallen標(biāo)準(zhǔn)(腫瘤直徑》2cm，ER陰性，組織學(xué)分級2-3級，年齡<35歲)[16]和NIH標(biāo)準(zhǔn)(腫瘤直徑》lcm，ER陰性，組織學(xué)分級2-3級，年齡<35歲)[17]作為指導(dǎo)原則。根據(jù)這些原則，90%以上的淋巴結(jié)陰性的年輕乳腺癌患者應(yīng)接受系統(tǒng)的輔助治療。但這些患者中70-80%不發(fā)展為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，所以這些患者不僅不能從治療中獲益，反而遭受潛在的副作用。基于乳腺原發(fā)癌的"乳腺癌轉(zhuǎn)移預(yù)測基因群"的基因表達(dá)譜可以篩選常規(guī)診斷為淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移陰性患者中的高危轉(zhuǎn)移者和非轉(zhuǎn)移者，為個體化治療提供了客觀依據(jù)。綜上所述，本發(fā)明共篩選得到三組可用于乳腺癌分子分型的基因群由79個基因組成的"淋巴結(jié)陽性乳腺癌預(yù)后預(yù)測基因群"，由56個基因組成的"乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷基因群"，由32個基因組成的"淋巴結(jié)陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移預(yù)測基因群"。這三組基因群可以分別以及合并制備成"乳腺癌轉(zhuǎn)移預(yù)報基因芯片"，用于乳腺癌患者原發(fā)腫瘤針吸組織樣本的分子分型，用"乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷基因群"判斷患者的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者用"淋巴結(jié)陽性乳腺癌預(yù)后預(yù)測基因群"預(yù)測患者預(yù)后，淋巴結(jié)陰性者用"淋巴結(jié)陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移預(yù)測基因群"篩選高危轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移患者，由此，為臨床轉(zhuǎn)移預(yù)后預(yù)測和實現(xiàn)個體化治療提供客觀依據(jù)。本發(fā)明是從中國人乳腺癌病例標(biāo)本中篩選得到適于中國人乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后預(yù)測的基因群。參考文獻(xiàn)1.YangYH,DudoitS，LuuP,etal.NormalizationforcDNAmicroarraydata:arobustcompositemethodaddressingsingleandmultipleslidesystematicvariation.NucleicAcidsRes,2002,30:el5.2.Van'tVeerLJ，DaiH,vandeVijverMJ,etal.Geneexpressionprofilingpredictsclinicaloutcomeofbreastcancer.Nature,2002,415:530-536.3.WangY,KlijnJG,ZhangY，Gene-expressionprofilestopredictdistantmetastasisoflymph-node-negativeprimarybreastcancer.Lancet,2005，365:671-9.4.WeigeltB，GlasAM,WesselsLF,etal.Geneexpressionprofilesofprimarybreasttumorsmaintainedindistantmetastases.ProcNatlAcadSci，2003，100:15901-15905.5.WeigeltB,WesselsLF，BosmaAJ,etal.Nocommondenominatorforbreastcancerlymphnodemetastasis.BrJCancer,2005,93:924-932.6.HaoX,SunB，.HuL,etal.DifferentialgeneandproteinexpressioninprimarybreastmalignanciesandtheirlymphnodemetastasesasrevealedbycombinedcDNAmicroarrayandtissuemicroarrayanalysis.Cancer,2004，100:1110-1122.7.MontelV,HuangTY,MoseE，etal.Expressionprofilingofprimarytumorsandmatchedlymphaticandlungmetastasesinaxenogeneticbreastcancermodel.AmJPathol,2005，166:1565-1579.8.IvensD,HoeAL，PoddTJ，etal.Assessmentofmorbidityfromcompleteaxillarydissection.BrJCancer，1992,66:136-138.<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表2乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷基因群<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>AK027107FILIP1AK027705NID67AK027847AK055231AK056651ATP8A2AL390129ROXANH63GLI4EPHX1ALBATP2B1CDC25AFCN1BECN1CNKFCGRTPOU4F2BC003697BC004857BC012124BC014165畫—000120麗—000477麗—001682NM一001789畫—002003NM—003766畫—004073NM—004107麗004575HomosapienscDNA:FLJ23454fis,cloneHSI06959KIAA1275proteinPutativesmallmembraneproteinNID67HomosapienscDNAFLJ30669fis，cloneFCBBF1000684HomosapienscDNAFLJ32089fis，cloneOCBBF2000712ATPase，aminophospholipidtransporter-like,ClassI，type8A,member2Homosapiens,cloneMGC:5564,mRNA，completecdsHomosapiens,cloneIMAGE:3690478，mRNA,partialcdsHomosapiens,cloneMGC:20188IMAGE:4564707，mRNA，completecdsHomosapiens,Similartozincfingerprotein16(KOX9)，cloneMGC:20886IMAGE:4549240，mRNA，compleEpoxidehydrolase1，microsomal(xenobiotic)AlbuminATPase,Ca++transporting,plasmamembrane1Celldivisioncycle25AFicolin(collagen/fibrinogendomaincontaining)1Beclin1(coiled-coil,myosin-likeBCL2interactingprotein)Cytokine-induciblekinaseFcfragmentofIgG，receptor,transporter,alphaPOUdomain,class4，transcriptionfactor2人類FLJ23454cDNA，HSI06959克隆KIAA1275蛋白假想小膜蛋白人類FLJ30669cDNA，F(xiàn)CBBF1000684克隆人類FLJ32089cDNA，OCBBF2000712克隆ATP酶，氨基磷酸酯轉(zhuǎn)移因子樣基因，I類，8A型，成員2人類MGC5564克隆，mRNA全序列人類IMAGE3690478克隆，mRNA部分序列人類MGC20188，IMAGE4564707克隆，mRNA全序列人類，類似于鋅指蛋白16(KOX9)，MGC:20886IMAGE:4549240克隆，mRNA全序列環(huán)氧化物水解酶l，微粒體(異生素)白蛋白ATP酶，03++轉(zhuǎn)運，質(zhì)膜1細(xì)胞分裂周期25AFicolin(包括膠原/纖維蛋白原區(qū)域)1Beclinl(巻曲一螺旋，肌球蛋白樣BCL2作用蛋白)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的激酶IgG的Fc段，受體，轉(zhuǎn)運體，aPOU區(qū)域，4類，轉(zhuǎn)錄因子2200710153983.2勢溢也被22/26:a;<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>權(quán)利要求1.三組可用于乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后分子分型的基因群(1)由79個基因組成的“淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性乳腺癌預(yù)后預(yù)測基因群”，見表1；(2)由56個基因組成的“乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷基因群”，見表2；(3)由32個基因組成的“淋巴結(jié)陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移預(yù)測基因群”，見表3。2.分別由權(quán)利要求書1所述的三組基因群的cDNA或寡核苷酸探針點樣于固相支持物表面制備的三種基因芯片(1)"淋巴結(jié)陽性乳腺癌預(yù)后預(yù)測基因芯片"，(2)"乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移診斷基因芯片"，(3)"淋巴結(jié)陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移預(yù)測基因芯片"；以及(4)由權(quán)利要求書1所述的三組基因群中所有基因的cDNA或寡核苷酸探針點樣于固相支持物表面制備的"乳腺癌轉(zhuǎn)移預(yù)后分子分型基因芯片"?；蛐酒奶卣鳛槊總€基因探針可以敏感且特異性地與來源于組織細(xì)胞樣本中相應(yīng)基因的cDNA或其擴增產(chǎn)物雜交。3.三種分別基于乳腺原發(fā)癌組織通過權(quán)利要求1所述的基因群制備的權(quán)利要求2所述的基因芯片獲得的(1)可以分類淋巴結(jié)陽性乳腺癌患者預(yù)后的非監(jiān)督聚類基因圖譜；(2)可以分類淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者的非監(jiān)督聚類基因圖譜；(3)可以分類淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性乳腺癌高危轉(zhuǎn)移患者和低危轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移患者的非監(jiān)督聚類基因圖譜。非監(jiān)督聚類基因圖譜的特征為乳腺癌原發(fā)癌組織樣本的cDNA或其擴增產(chǎn)物熒光標(biāo)記后與權(quán)利要求2所述的基因芯片雜交，基于它們的權(quán)利要求1所述基因的熒光強度值，利用非監(jiān)督聚類方法獲得的基因表達(dá)譜。4.一種使用權(quán)利要求2所述的基因芯片和權(quán)利要求3所述的基因圖譜對乳腺癌患者轉(zhuǎn)移和預(yù)后進行分子分型的方法，包括以下步驟(1)從乳腺癌患者手術(shù)切除樣本或針吸活檢組織樣本中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，(2)對樣本的cDNA或其擴增產(chǎn)物進行熒光標(biāo)記，(3)用標(biāo)記后的樣本與權(quán)利要求2中所述的基因芯片雜交。(4)用非監(jiān)督聚類分析樣本基因表達(dá)譜，與權(quán)利要求3中所述的基因圖譜比較對樣本進行轉(zhuǎn)移和預(yù)后的分子分型。全文摘要本發(fā)明公開了三組可以對乳腺癌進行轉(zhuǎn)移和預(yù)后分子分型的基因群；公開了由這些基因群的特異性cDNA或寡核苷酸以點陣形式點樣于固相支持物表面制備的乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后分子分型的基因芯片；公開了基于乳腺癌患者的原發(fā)癌組織標(biāo)本的cDNA或其擴增產(chǎn)物熒光標(biāo)記后與乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后分子分型的基因芯片雜交得到的基因表達(dá)譜對患者進行轉(zhuǎn)移和預(yù)后分子分型的非監(jiān)督聚類圖譜；公開了利用乳腺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后分子分型的基因芯片和基因表達(dá)譜對乳腺癌患者轉(zhuǎn)移和預(yù)后分子分型的方法。文檔編號C12N15/12GK101173313SQ20071015398公開日2008年5月7日申請日期2007年9月18日優(yōu)先權(quán)日2006年9月19日發(fā)明者馮玉梅,孫保存,微張,李曉青,郝希山申請人:天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院