專利名稱：Dc-sign啟動子熒光素酶報告質粒的構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，涉及DC-SIGN啟動子熒光素酶報告質粒的構建方法。
背景技術：
DC-SIGN是DCs表面重要的功能分子，在機體免疫過程中起重要的作用。通過DCs的 抗原呈遞作用，DC將機體感染的病毒、細菌和原蟲呈遞到效應細胞周圍，通過效應細胞的 直接和間接殺傷，發(fā)揮機體的免疫作用，從而消除或者抑制感染機體的病原微生物。在這個 過程中，位于DC表面的DC-SIGN起著核心作用。到目前位置，已經(jīng)知道，DC-SIGN是多 種病原微生物的受體，包括HIV， HCV， CMV， SARS，登革熱病毒，埃博拉病毒，結核桿 菌，大腸桿菌核心成份，利什曼原蟲等等。
以HIV為例，DC-SIGN可以和HIV-gpl20蛋白高親和力結合，這種親和力比HIV-gpl20 一CD4分子間的親和力更高。DC-SIGN通過識別、結合和攜帶HIV顆粒，將HIV病毒顆粒 從外周感染部位運送到所在部位的二級引流淋巴結，在淋巴節(jié)內感染T細胞，從而進一步將 病毒向全身傳播。在此過程中，DC-HIV-CD4+細胞形成一個結合體，這種結合體，在空間 上拉近了 HIV和CD4+ T細胞的距離，使HIV的配體和CD4+T細胞的受體易于對合，增加 了 CD4+T細胞感染的機會。另外，HIV還可以和DCs表面的TLR (Toll Like Receptor)結 合，通過TLR下游的反應，使DCs分泌細胞因子，上調DC-IGN的表達。這說明DC-SIGN 在DC細胞的表達，不僅受內在因素的調節(jié)作用，也受外界因素的影響。
在體外的表達模型中，DC-SIGN主要受IL-4作用調控。從人外周血分離的單個核細胞， 經(jīng)過IL-4和GM-CSF的聯(lián)合刺激，或者血液系統(tǒng)來源的細胞株THP-1, Jurknt等經(jīng)過IL-4 和PMA的剌激，都可以使這些細胞表達活性DC-SIGN，在體外作為DC-SIGN表達模型。 而在體內，DC-SIGN僅僅表在皮膚表皮粘膜下的某些種類的DCs上，以及在腸道淋巴結和 胎盤等處，表達相對局限。
在真核細胞，基因表達調控機制相對復雜，但是，基因的啟動子在基因的表達調控中仍 然起主要作用。DC-SIGN基因啟動子區(qū)對于病毒感染有著重要意義，因此，我們首先分離 DC-SIGN基因啟動子，并構建在熒光素酶報告載體中，分別轉染Hela、Hacat 、 Wish和HuVEC 細胞株，通過熒光素酶的活性測定，對DC-SIGN啟動子的活性進行調查，研究DC-SIGN的 生物學特點，探討DC-SIGN表達機制以及DC-SIGN啟動子在DC-SIGN表達過程中的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供DC-SIGN啟動子熒光素酶真核報告質粒的構建方法。 本發(fā)明DC-SIGN啟動子熒光素酶報告質粒的構建方法包括以下步驟
(1) 參考GeneBank AF209479的DC-SIGN啟動子序列，設計DC-SIGN啟動子的一對引物， 在5'端和3，端分別引入MluI和BglII識別位點ACGCGT禾n AGATCT,用PCR法高保 真擴增DC-SIGN啟動子片段，并純化PCR產物，備用；
(2) 對DC-SIGN啟動子片段和它的表達載體pGL3-basic分別進行雙酶切，并將純化后的酶 切產物進行連接，連接產物轉化DH-5a感受態(tài)細胞，挑單個白色菌落擴增，抽提重組質粒 DNA，作雙酶切鑒定。
上述DC-SIGN啟動子的 一對引物序列如下 sense primer: ATCATACGCG TATGAGTCCT TCTCCCTGTC ，含有MluI酶切位點； antisense primer: TGTAAGATCT GTCACCCCAC TCTCCCCCAG ，含有Bgl II酶切位點。


圖1為pGL3-basic和pGL3-contro1的結構圖。
圖2為DC-SIGN啟動子擴增結果圖，DNAmarker為lOObp marker。 圖3為DC-SIGN啟動子的序列特征圖。
圖4為DC-SIGN-promoter-pGL3-Basic酶切結果圖。左邊第1泳道為200bp DNA ladder,第 2泳道為DC-SIGN promoter PCR產物對照，3-7泳道為DC-SIGN-promoter-pGL3-Basic雙 酶切結果，第8泳道為pGL3-Basic雙酶切結果，第9泳道為VHind III DNAladder。 圖5為DC-SIGN啟動子在不通細胞中得相對活性圖。
具體實施例方式
1.構建dc-sign啟動子熒光素酶報告質粒 1.1擴增dc-sign啟動子
取正常人外周血，分離PBMC，使用PCR引物擴增DC-SIGN基因的啟動子。所用的 上游引物為sense primer:: ATC ATACGC GTATGAGTC CTT CTC CCT GTC,含有MluI酶 切位點，antisense primer: TGT AAG ATC TGT CAC CCC ACT CTC CCC CAG，含有Bgl II酶 切位點。使用Invtrigon的Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity, PCR反應體系如下
5X PCR bufferlOjiL
2.5mM dNTP mix4pL
50mM MgS042|jL
1 OmM sense primer2pL
1 OmM antisense primer2pL
High Fidelity Taq(2U/pL)O單
DNA(lng/pL)l^L
DdH2028.5pL
Total volumes50pL
按如下程序在PCR儀器上進行擴增
1. 95。CX3min
2. 94。CX20sec 58。CX30sec
72。CX25sec 共30個循環(huán)
3. 72。CX5min 4 4"C保存
1.2 PCR產物純化
使用過柱離心的方法，操作步驟和方法按著產品說明書進行 1.3構建DC-SIGN啟動子熒光素酶報告質粒
pGL3-basic質粒經(jīng)過大腸桿菌DH-5a擴增后，使用質粒小量抽提試劑盒進行抽提，操作 按說明書進行。然后將所得質粒和在l.l中所得PCR經(jīng)Bgl II和Mlu雙酶切,所用內切酶為 Takara公司得內切酶，體系如下A.B
10 X Buffer H10 X Buffer H4^1
BglII (10，)BglII (10U/|il)l^il
Mlu (10U/(xl)1^1Mlu (lOU/pDl^d
PGL3-Basic/Enhancer(0. lug/pl)10plDC-SIGN promoter(50ng/nl)20|_il
ddH202Vd膽2014(xl
total volume40nltotal volume40^1
將上述體系輕混勻，離心，37'C酶切過夜。酶切產物在1%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳電壓 大小根據(jù)水平電泳槽兩個電極間得距離進行設定，大小為5V/cm，電泳完畢后，進行DNA 凝膠回收。然后將所得純化得DC-SIGN啟動子片段(40ng4d)和pGL3-Basic質粒切割片 段(80ng/pl)用T4連接酶進行連接
10 X T4 ligation Buffer 1単
pGL3-Basic 3単 DC-SIGN promoter 1単
T4 ligase (5U/W) 1.5pl
ddH20_3，
Total volume 10|al
將上述混合物混勻，離心，在16'C反應3小時。 1.4將連接產物導入感受態(tài)細胞將事先用一步法感受態(tài)細胞制備溶液制好并且分裝在滅菌Ep管中的DH-5a感受態(tài)細胞 lOOpl至于冰上，然后按如下步驟操作
(1) 感受態(tài)細胞冰上預冷20min
(2) 向感受態(tài)細胞中加入5nl的連接產物，輕輕混勻，冰上放置30分鐘
(3) 42'C水浴箱中熱休克90sec，立即冰上放置20分鐘
(4) 加入800W無抗性的LB培養(yǎng)基
(5) 在水平恒溫搖床中37°C 200rpm搖動1小時
(6) 4000rpm離心5分鐘，去掉800^1上清
(7) 將剩余的100nl液體和沉淀混勻，均勻涂在含有氨芐青霉素(100嗎/mL)的LB固體培養(yǎng) 平板上
(8) 先將平板在37'C細菌培養(yǎng)箱中正放30min，然后底面向上，細菌面向下，37"培養(yǎng)過夜。
(9) 挑取單克隆菌落，放于3mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，以300rpm在37'C振蕩12-16 小時
卿提取質粒，進行PCR和雙酶切鑒定
(11)將經(jīng)過鑒定含有正確克隆的菌液放于300mL(含有100pg/mL)的LB進行擴增 (19使用質粒中量高純質粒抽提試劑盒抽提DC-promoter-pGL3-Basic
1.5抽提DC-promoter-pGL3-Basic
(1) 平衡液EQ平衡質粒抽提過濾柱
(2) 將300mL菌液8000rpm離心5min，徹底去上清
(3) 加入Lysis Buffer,徹底混勻，室溫放置5min
(4) 加入中和液N buffer中和5min， 13000rpm高速離心15min
(5) 小心取上清，加入以被平衡的過濾柱，過濾，收集過濾所得液體
(6) 向收集的過濾液體中加入70%體積的異丙醇，混勻
(7) 13000rpm高速離心15分鐘，小心去上清
(8) 70%乙醇洗滌沉淀一次，然后高速離心10min，小心去掉乙醇
(9) 干燥儀中將沉淀風至半干
(10) 加入ddH2O400^L融解質粒
1.6質粒DC-SIGN-promoter-pGL3-Basic (DSPGB)轉染真核細胞
(1) 轉染前一天，使用無不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，并按0.6X104cell/ L，接種細胞到 96孔板
(2) 質粒按0.2叱/孑L(約2pL)， Opti-MEM reduced medium按25^L/孔的標準，將2pL的ddH20
作為空白對照，2nLpGL3-basic空載體作為陰性對照，2pLDSPGB，禾Q 2pLpGL3-control作 為陽性對照，分別稀釋到Opti-MEM reduced medium中，混勻
(3) 將Lipofectamine 2000 Transfection Reagent按0.5pL/孔的用量稀釋到25^iL的Opti-MEM 中，室溫孵育5min
(4) 將稀釋的Lipofectamine 2000 Transfection Reagent加入質粒-Opti-MEM中，輕輕混勻，室 溫孵育20分鐘
(5) 吸去96孔培養(yǎng)板細胞的培養(yǎng)基，加入50pL的Lipofectamine 2000-質粒混合物書，水平 方向輕輕搖動，使加入的液體混合物均勻分布于培養(yǎng)板底部
(6) 6小時后吸去上述液體，加入普通培養(yǎng)基
(7) 在細胞培養(yǎng)箱柱孵育30小時，然后檢測熒光素活性
1.7熒光素酶活性檢測 轉染后30小時檢測熒光素酶活性，按以下步驟進行(在室溫下進行)
(1) 將Bright-Glo Luciferase buffer禾fl Bright-Glo Luciferase substrate混勻，做成Bright-Glo Luciferase Assay reagent,分裝,置于-80。C備用
(2) Bright-Glo Luciferase Assay reagent中的試劑從-80。C取出，融化，在室溫放置30min
(3) 將細胞從培養(yǎng)箱中取出，在室溫放置5min，吸去培養(yǎng)板中細胞培養(yǎng)上清，用PBS洗滌1-2 次，去掉PBS
(4) 力口入100|jLBright-Glo Luciferase Assay reagent,
(5) 水平振蕩Glo Lysis Buffer幾次，確保Bright-Glo Luciferase Assay reagent覆蓋底壁所有細 胞
(6) 室溫孵育5min
(7) 在Orion II microplate luminometer進行檢測，每孔檢測時間為5sec
結果分析
1. DC-SIGN啟動子的擴增
將PCR擴增的結果在2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，所得的DNA片段大小為237bp，如 圖l所示；
2. DC-SIGN啟動子報告載體的構建
將DC-SIGN啟動子和pGL3-Basic雙酶切后，進行連接，連接產物轉化大腸桿菌后，提 取質粒，進行酶切鑒定，結果如圖3;
3. DC-SIGN基因啟動子在不通細胞中活性結果的測定
我們發(fā)現(xiàn)，DC-SIGN啟動子在Hacat和Hela細胞中的活性相對較高，而在HuVEC和Wish中的活性相對較低，這說明，DC-SIGN啟動子在不同的細胞中，有著不同的表達活性， 這種表達活性，可能與細胞內的微環(huán)境有關。與含有SV40啟動子的pGL3-contro1相比， DC-SIGN啟動子報告基因產生得熒光素酶活性要低得多。 結論
我們成功構建了 DC-SIGN啟動子熒光素酶報告質粒，并將其分別導入Hela、 HaCat、 Wish和HuVEC304中，通過熒光素酶活性檢測，發(fā)現(xiàn)在不同細胞株中表達活性不同，在表 皮細胞來源的HaCat和上皮來源的Hela細胞株中表達活性相對較高。 序列表
sense primer: ATCATACGCG TATGAGTCCT TCTCCCTGTC antisense primer: TGTAAGATCT GTCACCCCAC TCTCCCCCAG
權利要求
1、DC-SIGN啟動子熒光素酶報告質粒的構建方法，其特征在于下述步驟(1)參考GeneBank AF209479的DC-SIGN啟動子序列，設計DC-SIGN啟動子的一對引物，在5’端和3’端分別引入Mlu I和Bgl II識別位點ACGCGT和AGATCT，用PCR法高保真擴增DC-SIGN啟動子片段，并純化PCR產物，備用；(2)對DC-SIGN啟動子片段和它的表達載體pGL3-basic分別進行雙酶切，并將純化后的酶切產物進行連接，連接產物轉化DH-5α感受態(tài)細胞，挑單個白色菌落擴增，抽提重組質粒DNA，作雙酶切鑒定。
2、 根據(jù)權利要求1所述DC-SIGN啟動子熒光素酶報告質粒的構建方法，其特征在于所述 DC-SIGN啟動子的一對引物序列如下sense pri證ATCATACGCG TATGAGTCCT TCTCCCTGTC antisense primer: TGTAAGA丁CT GTCACCCCAC TCTCCCCCAG 。
全文摘要
本發(fā)明公開了DC-SIGN啟動子熒光素酶報告質粒的構建方法。通過構建DC-SIGN啟動子片段與熒光素酶報告載體pGL3-Basic的重組真核表達質粒DC-promoter-pGL3-Basic，并將該質粒在Hela、Hacat、Wish和HuVEC細胞株中進行表達和活性鑒定，本發(fā)明成功構建了DC-promoter-pGL3-Basic DC-SIGN啟動子熒光素酶報告質粒。通過在Hela、Hacat、Wish和HuVEC細胞株進行表達和熒光素酶活性檢測，證明了DC-SIGN啟動子在不同細胞株中表達活性不同，在表皮細胞來源的HaCat和上皮來源的Hela細胞株中表達活性相對較高。
文檔編號C12N15/65GK101182539SQ20071015650
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月6日 優(yōu)先權日2007年11月6日
發(fā)明者吳南屏, 許利軍, 靳昌忠 申請人:浙江大學