專利名稱：五味子活性成分多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種五味子功能活性成分五味子多糖的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Tarcz.)Baill.的成熟果實， 首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功能。 從20世紀50年代開始，中國、日本、前蘇聯(lián)等國學者運用現(xiàn)代科學手法， 作了大量研究，證明五味子可以降低肝炎患者血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶；治療肝臟的化 學毒物損傷；對中樞神經(jīng)有興奮作用，能增強肌體對非特異性刺激的防御能力； 使低血壓患者血壓升高，但不會使正常血壓升高；影響大腦皮層的興奮和抑制， 改善人的智能，增加記憶力；增強腎上腺皮質(zhì)功能，促進心臟活動。其功能 主要源于它的活性成分多糖、木質(zhì)素等。前人研究結(jié)果表明其水提液具延緩衰 老的作用；乙醇提取液具安眠鎮(zhèn)靜作用；木脂素具有保肝護肝作用。
長期以來，我國的科技工作者大多研究的是五味子的栽培和馴化，這些技 術(shù)也日益成熟，從而，五味子的產(chǎn)量劇增，其深加工形勢嚴峻。其加工主要集 中在多糖和木質(zhì)素中，國內(nèi)外也有文獻報道。對于五味子多糖，劉放(中醫(yī)藥 學報.1994. (3): 43-44);張?zhí)m杰(鞍山師范學院學報.2002-03. 4(1): 58—60.); 薛梅，(陜西中醫(yī).9. 003. 24(3)1267—268.);呂子濤(黑龍江醫(yī)藥，1997， 10(2): 190-191)，韓學忠(中國醫(yī)藥學報，2005， 33 (6): 35-36)。仰榴青等人 申請發(fā)明采用提取木脂素后的渣料提取多糖物質(zhì)(申請?zhí)?00610041566.4)。
但是，以上的研究和專利有關(guān)五味子多糖的報道，都是對五味子整果的報 道，而且，大部分都是研究的五味子干果，未見鮮果的報道。鑒于五味子的功 能性成分木質(zhì)素和多糖，不同的部位中，含量具有重要的差異，五味子多糖多 集中于果肉中，木質(zhì)素90%都集中在種子中，利用整果提取多糖，不僅不利于 活性成分的分離，而且容易浪費資源。另外，以上報道都是利用熱水浸提方法 提取多糖，對脫除蛋白的方法也很少有報道，有采用三氯乙酸脫除蛋白的，由 于其酸性強，容易破壞多糖結(jié)構(gòu)，不利于保護多糖的生理活性。本發(fā)明采用籽 果分離技術(shù)將果肉和果核進行分離后，并采用生物酶解技術(shù)提取五味子多糖，提高提取率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種依據(jù)其不同部位提取不同活性物質(zhì)的方法，將五 味子的果肉和果核分離，利用生物酶解方法提取五味子多糖，利用超聲波等方 法提取和純化木脂素，使五味子的藥用成分得到合理的利用開發(fā)。
技術(shù)方案如下
一、 原料處理
1. 五味子鮮果清洗，噴淋，除去雜質(zhì)和發(fā)霉果等，加熱到60°C 80°C，多 道打漿機打漿，將果漿、種子分離開來，果漿備用，種子用于提取木脂素類活 性物質(zhì)。
2. 五味子干果揀選，清洗，按干果重5 10倍水浸泡3 12h，加熱到60 80°C，多道打漿機打漿，將果漿、種子分離開來，果漿備用，種子用于提取木 脂素類活性物質(zhì)。
所述五味子為北五味子、南五味子均可用。
二、 多糖提取
1. 單酶提取和水提相結(jié)合
① 纖維素酶提取將果漿在30 50℃條件下，加入果漿固形物總量1.5 3.0%的纖維素酶(5萬單位/g)，酶解l 5h;升溫至90℃滅酶10min，冷卻至室 溫，離心分離，得上清液和沉淀；沉淀加水使料液比1: 5 15，溫度70 100℃， 提取2 5h，冷卻至室溫，離心，得上清液和沉淀；沉淀再用水提1 3次，離 心，合并提取液。
② 或用果膠酶提取將果槳在30 50℃條件下，加入果漿固形物總量1.5 3.0%的果膠酶(5萬單位/g)，酶解1 5h;升溫至90℃滅酶10min，冷卻至室溫， 離心分離，得上清液和沉淀；沉淀加水使料液比l: 5 15，溫度70℃ 100℃， 提取2 5h，冷卻至室溫，離心，得上清液和沉淀；沉淀再用水提1 3次，離 心，合并提取液。
2. 雙酶提取和水提相結(jié)合
將果漿在30 50℃條件下，加入果漿固形物總量1.0 2.0%的纖維素酶(5 萬單位/g)和1.0 2.0%的果膠酶(5萬單位/g)，酶解l 5h;升溫至9(TC滅酶 10min，冷卻至室溫，離心分離，得上清液和沉淀；沉淀加水使料液比l: 5 15，溫度70 10(TC，提取2 5h，冷卻至室溫，離心，得上清液和沉淀；沉淀再用
水提1 3次，離心，合并提取液。
三、 乙醇分級
將提取液濃縮至體積的1/5 1/4冷卻，將濃縮液加入到濃縮液體積3 5倍 的95%乙醇溶液中，4。C下，醇沉12 16h;離心，收集沉淀。
四、 脫除蛋白
將沉淀用5 20倍的水溶解，離心，反復溶解3 5次，收集上清液，合并。 用檸檬酸調(diào)pH為4.5 5.0，加入溶液重0.05-0.15%的酸性蛋白酶(2萬單位/g)， 50 55"酶解1 4h脫蛋白，90。C滅酶10分鐘后，冷卻至室溫，離心，上清液 再用Sevag法脫除蛋白3 6次后(多糖液脫蛋白液=5: 1，脫蛋白液為氯仿 和正丁醇的混合物，氯仿正丁醇=5: 1)，得到脫蛋白后的多糖液。
五、 醇沉
將脫蛋白后的多糖液濃縮到1/4 1/3體積左右，加入到3 5倍體積95%乙 醇溶液中，4。C下靜置過夜，離心，沉淀分別用無水乙醇、丙酮、無水乙醇洗滌， 得到多糖沉淀。
六、 干燥
將多糖沉淀置于真空干燥設(shè)備中，真空干燥得到五味子多糖。 本發(fā)明所具有的優(yōu)點是
(1) 工藝合理，注重合理利用原料，采用不同的部位提取成分不同，節(jié)約 提取劑和酶制劑等輔料，使五味子的開發(fā)更為經(jīng)濟。
(2) 本發(fā)明還發(fā)明了利用鮮果直接提取制備五味子活性成分的方法，節(jié)約 了將鮮果烘干成干果的能源。
(3) 本發(fā)明在提取五味子多糖過程中，利用酶解技術(shù)，溫和條件下除去大 量纖維素和果膠，大大地提高了提取率，使多糖的得率超過10% (干基比)。
(4) 在純化多糖的過程中，采用將多糖濃縮液加入到乙醇溶液中的方法， 使多糖盡可能的沉淀下來，比通常采用的向乙醇溶液中添加多糖溶液沉淀效果 好，提高得率。
(5) 發(fā)明了利用酸性蛋白酶與Sevag法相結(jié)合脫除五味子多糖中的蛋白質(zhì) 的方法，脫除次數(shù)減少，操作過程簡化。
具體實施例方式
實例1
將北五味子鮮果500g，清洗，噴淋，除去雜質(zhì)和發(fā)霉果，加熱到60。C，多 道打漿機打漿，得到果漿380g。加入0.4g (固形物總量的1.5%)的纖維素酶(5 萬單位/g)， 30。C時，酶解5h;升溫至90。C滅酶10min，冷卻至室溫，4000r/min 離心10min，得上清液和沉淀；沉淀80g加水1200g，溫度70'C，提取5小時， 冷卻至室溫，4000r/min離心10min，得上清液和沉淀；沉淀50g，加水250g， 溫度100。C，提取2小時，4000r/min離心10min，沉淀再加水250g提1次， 合并提取液共1500g。濃縮至體積為300ml (原體積的1/5)，緩慢將濃縮液加入 到900ml的95%的乙醇溶液中，4。C下，醇沉12h;離心，得到沉淀32g。將沉 淀溶于640g水中溶解，離心，得上清液和沉淀。沉淀再溶于320g水中，溶解， 離心，沉淀溶于160g水中，離心，合并上清液共1045g。用檸檬酸調(diào)pH為4.5， 加入0.53g (0.05%)的酸性蛋白酶(2萬單位/g)， 50℃酶解4h脫蛋白，90。C滅 酶10mni后，離心，上清液1020g，用氯仿和正丁醇脫蛋白液200ml，脫除蛋白 3次后，得到脫蛋白后的多糖液960g。濃縮至320g，加入到1600ml的95%乙醇 溶液中，4。C下靜置過夜，離心，沉淀分別用無水乙醇、丙酮、無水乙醇洗滌， 得到多糖沉淀，真空干燥，得到多糖粉12.8g，采用苯酚硫酸法檢測多糖含量為 37.3%。
實例2
將北五味子100g干果揀選，清洗，加入500g水浸泡12h后，加熱到80℃， 多道打漿機打漿，得到果漿480g。加入1.008g (固形物總量的3.0%)的纖維素 酶(5萬單位/g)，50。C時，酶解lh;升溫至9(TC滅酶10min，冷卻至室溫，4000r/min 離心10min，得上清液和沉淀；沉淀90g加水1000g，溫度90。C，提取3h，冷 卻至室溫，4000r/min離心10min，得上清液和沉淀；沉淀60g，加水600g，溫 度100℃，提取2h， 4000r/min離心10min，并提取液共1800g。濃縮至體積為 400ml (原體積的2/9)，緩慢將濃縮液加入到1600ml的95。/。的乙醇溶液中，4°C 下，醇沉12h;離心，得到沉淀38g。將沉淀溶于600g水中溶解，離心，得上 清液和沉淀。沉淀再溶于500g水中，溶解，離心，沉淀溶于200g水中，離心， 再溶解1次,合并上清液共1430g。用檸檬酸調(diào)pH為4.8，加入1.43g (0.1%)的 酸性蛋白酶(2萬單位/g)， 53。C酶解2.5h脫蛋白，90。C滅酶10min后，離心，
上清液1400g，用氯仿和正丁醇脫蛋白液280ml，脫除蛋白5次后，得到脫蛋白 后的多糖液1300g。濃縮至325g，加入到1300ml的95%乙醇溶液中，4。C下靜 置過夜，離心，沉淀分別用無水乙醇、丙酮、無水乙醇洗滌，得到多糖沉淀， 真空干燥，得到多糖粉11.6g，采用苯酚硫酸法檢測多糖含量為32.9%。
實例3
將南五味子鮮果500g，清洗，噴淋，除去雜質(zhì)和發(fā)霉果，加熱到60'C，多 道打漿機打漿，得到果漿360g。加入0.58g (固形物總量的2.0%)的纖維素酶 (5萬單位/g)， 4(TC時，酶解3h;升溫至90。C滅酶10min，冷卻至室溫，4000r/min 離心10min，得上清液和沉淀；沉淀70g加水1000g，溫度100°C，提取3h，冷 卻至室溫，4000r/min離心10min，得上清液和沉淀；沉淀48g，加水720g，溫 度100。C，提取3h， 4000r/min離心10min，合并提取液共1750g。濃縮至體積 為440ml左右(1/4)，緩慢將濃縮液加入到2200ml的95%的乙醇溶液中，4°C 下，醇沉12h;離心，得到沉淀34克g，將沉淀溶于500g水中溶解，離心，得上 清液和沉淀。沉淀加入170g水，溶解，如實例l，反復溶解5次，離心，合并 上清液共1180g。用檸檬酸調(diào)pH為5，加入1.77g (0.15%)的酸性蛋白酶(2 萬單位/g)， 55。C酶解lh脫蛋白，90。C滅酶10min后，離心，上清液1120g，用 氯仿和正丁醇脫蛋白液220ml，脫除蛋白6次后，得到脫蛋白后的多糖液1000g。 余下操作如實例l，得到多糖粉12.6克，采用苯酚硫酸法檢測多糖含量為38.2%。
實例4
將南五味子100g干果揀選，清洗，加入1000g水浸泡3h后，加熱到70℃， 多道打漿機打漿，得到果漿880g。加入1.05g (固形物總量的3.0%)的果膠酶 (5萬單位/g)， 5(TC時，酶解lh;余下操作如實例l，得到多糖粉10.8g，采用 苯酚硫酸法檢測多糖含量為33.7%。 實例5
將北五味子100g干果揀選，清洗，加入800g水浸泡8h后，加熱到70℃， 多道打漿機打漿，得到果漿690g。加入0.675g (固形物總量的1.5%)的果膠酶 (5萬單位/克)，4(TC時，酶解5h;余下操作如實例2，得到多糖粉11.2g，采 用苯酚硫酸法檢測多糖含量為32.4%。
實例6
將北五味子鮮果500g，清洗，噴淋，除去雜質(zhì)和發(fā)霉果，加熱到80℃，多 道打漿機打漿，得到果漿390g。加入0.31g (固形物總量的1.0%)纖維素酶(5 萬單位/g)和0.62g (固形物總量的2.0%)果膠酶(5萬單位/g)， 50℃，酶解lh; 余下操作如實例3，得到多糖粉12.9克，采用苯酚硫酸法檢測多糖含量為38.5%。
實例7
將南五味子100g干果揀選，清洗，加入1000g水浸泡3h后，加熱到70℃， 多道打漿機打漿，得到果漿880g。加入1.05g (固形物總量的3.0%)的果膠酶 (5萬單位/g)， 50℃時，酶解lh;余下操作如實例l，得到多糖粉10.8g，采用 苯酚硫酸法檢測多糖含量為32.7%。
實例8
將北五味子鮮果500g，清洗，噴淋，除去雜質(zhì)和發(fā)霉果，加熱到70℃，多 道打漿機打漿，得到果漿380g。加入0.61g (固形物總量的2.0%)纖維素酶(5 萬單位/g)和0.31g (固形物總量的1.0%)果膠酶(5萬單位/g)， 40℃，酶解3h; 余下操作如實例3，得到多糖粉12.5g，采用苯酚硫酸法檢測多糖含量為38.9%。
實例9
將南五味子鮮果500g，清洗，噴淋，除去雜質(zhì)和發(fā)霉果，加熱到70℃，多 道打槳機打漿，得到果漿380g。加入0.31g (固形物總量的1.0%)纖維素酶(5 萬單位/g)和0.61g (固形物總量的2.0%)果膠酶(5萬單位/g)， 40℃，酶解3h; 余下操作如實例3，得到多糖粉12.4g，采用苯酚硫酸法檢測多糖含量為38.1%。
實例10
將南五味子100g干果揀選，清洗，加入1000g水浸泡3h后，加熱到70℃， 多道打漿機打漿，得到果漿880g。加入0.53g (固形物總量的1.5%)纖維素酶 (5萬單位/g)和0.53g (固形物總量的2.0%)果膠酶(5萬單位/g)， 45℃，酶 解3h;余下操作如實例2，得到多糖粉11.3g，采用苯酚硫酸法檢測多糖含量為 38.0%。
權(quán)利要求
1、五味子活性成分多糖的制備方法，其特征在于制備工藝為原料果實打漿分除種子得果實漿；果實漿經(jīng)纖維素酶或/和果膠酶酶解、離心、沉淀水提得多糖提取液；多糖提取液濃縮后用乙醇分級、離心得沉淀；沉淀用水溶解、離心取清液，調(diào)pH4.5～5.0后用酸性蛋白酶酶解、Sevag法脫蛋白得多糖液；再用乙醇進行醇沉得多糖沉淀；將其真空干燥得產(chǎn)品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的五味子活性成分的制備方法，其特征在于制備工 藝的步驟為(1) 原料處理果實清洗、去雜后60 8(TC打漿，分除種子；(2) 多糖提取果漿于30 5(TC與果漿固形物總量1.5 3.0%的纖維素酶或果 膠酶酶解1 5h，滅酶，室溫下離心，沉淀加5 15倍水，70 10(TC提取2 5h，沉淀用同方法重復水提取1 3次，提取液合并；(3) 乙醇分級濃縮提取液至原體積的1/5 1/4后冷卻，將濃縮液加入到濃 縮液體積3 5倍的95%乙醇溶液中，4。C醇沉12 16h;離心，收集沉淀；(4) 脫除蛋白沉淀用5 20倍的水溶解，離心，反復溶解、離心3 5次， 上清液合并；用檸檬酸調(diào)pH為4.5 5.0，加入溶液重0.05-0.15%的酸性蛋白酶， 50。C 55。C酶解1 4h脫蛋白，滅酶，室溫下離心，上清液再用Sevag法脫除 蛋白3 6次后得到脫蛋白后的多糖液；(5) 醇沉脫蛋白后的多糖液濃縮到原體積1/4 1/3，加入到3 5倍體積95% 乙醇溶液中，4。C下靜置過夜，離心，沉淀分別用無水乙醇、丙酮、無水乙醇洗 滌，得到多糖沉淀；(6) 干燥將多糖沉淀置于真空干燥設(shè)備中，真空干燥得到五味子多糖。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的五味子活性成分的制備方法，其特征在于五 味子果實為干果，在原料處理中按干果重5-10倍水浸泡3 12h后再打漿。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的五味子活性成分的制備方法，其特征在于在多 糖提取工藝中，酶解是用纖維素酶和果膠酶共同進行酶解，其步驟是果漿于30 5(TC與果漿固形物總量1.5 3.0%的纖維素酶和果漿固形物總量1.5 3.0%的果 膠酶共同進行酶解。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的五味子活性成分的制備方法，其特征在于五味子 為北五味子和南五味子。
全文摘要
一種五味子活性成分的制備方法，包括原料處理、多糖提取、乙醇分級、脫除蛋白、醇沉、干燥的制備步驟。其中所述原料處理是利用鮮五味子或者干五味子浸泡后多道打漿，將果漿和種子分開；所述多糖提取是利用纖維素酶、果膠酶的一或兩種進行酶解后，再用水浸提；所述乙醇分級是將多糖溶液加入到乙醇溶液中；所述脫除蛋白方法是利用酸性蛋白酶和Sevag方法相結(jié)合。本發(fā)明提供了一條從五味子中提取活性成分多糖的方法，特別是開辟了一條利用鮮果提取，以及采用籽果分離方法提取活性成分，不僅節(jié)約資源和能源、降低提取成本，為五味子的合理開發(fā)提供技術(shù)支撐。
文檔編號C12P19/04GK101200749SQ20071015904
公開日2008年6月18日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者于運海, 朱蓓薇, 李冬梅, 毛豐美, 王麗輝, 董秀萍, 雪 閻 申請人:大連工業(yè)大學;鳳城市大梨樹科技有限公司