專利名稱：：用于體細胞胚胎發(fā)生的低密度鋪展方法用于體細胞胚胎發(fā)生的低密度鋪展方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及體外生產(chǎn)植物胚胎的方法，以及任選從植物胚胎生產(chǎn)植物的方法。發(fā)明背景為了制造木材制品，對針葉樹，諸如松樹和樅樹的需求持續(xù)增長。對于提供充分供應(yīng)針葉樹的問題，一個建議的解決方案是識別具有所需特征的個體針葉樹，如生長速度快，以及通過體細胞克隆生產(chǎn)優(yōu)異樹的眾多遺傳性相同的無性系。體細胞克隆是從樹的體細胞組織創(chuàng)建遺傳性相同的樹的方法。樹的體細胞組織是不同于雄性和雌性配子的樹組織。在體細胞克隆的一種方法中，樹體細胞組織培養(yǎng)在包括激素，諸如植物生長素和/或細胞分裂素的起始培養(yǎng)基中，所述激素啟動形成能夠發(fā)育成體細胞胚胎的胚胎發(fā)生細胞。然后，胚胎發(fā)生細胞進一步培養(yǎng)在維持培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基促進胚胎發(fā)生細胞的增殖，形成前子葉胚胎(即，不具有子葉的胚胎)。然后增殖的胚胎發(fā)生細胞培養(yǎng)在發(fā)育培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基促進子葉體細胞胚胎的發(fā)育和成熟，該胚胎例如可放置于人工種子內(nèi)并播種于土壤，發(fā)芽生成針葉樹幼苗。幼苗可移植至生長地繼續(xù)生長，并最終收獲生成木材或木材衍生制品?；蛘?，子葉體細胞胚胎也可在發(fā)芽培養(yǎng)基中發(fā)芽，其后轉(zhuǎn)移至土壤進一步生長。體細胞克隆針葉樹胚胎的持續(xù)問題是刺激高效和成本有效地形成能夠發(fā)芽生成植物的體細胞胚胎。優(yōu)選體外形成的針葉樹體細胞胚胎與針葉樹種子中體內(nèi)形成的針葉樹合子胚在物理和生理上類似或相同。因此，對從針葉樹胚胎發(fā)生細胞中生產(chǎn)能生存的針葉樹體細胞胚胎的方法，存在持續(xù)的需求。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供從前子葉胚胎生產(chǎn)針葉樹子葉體細胞胚胎的方法。本發(fā)明的該方面方法包括下列步驟(a)在足以至少浸沒有孔材料表面的體積的無菌稀釋培養(yǎng)基中，將多個前子葉胚胎分配至水平置于無孔表面上的有孔材料上，從而均勻地散布前子葉胚胎；(b)從有孔材料中去除無菌稀釋培養(yǎng)基，從而將均勻散布的前子葉胚胎截獲在有孔材料上；以及(C)將截獲在有孔材料上的前子葉胚胎與發(fā)育培養(yǎng)基接觸足以生成針葉樹子葉體細胞胚胎的時段。另一方面，本發(fā)明提供從針葉樹體細胞生產(chǎn)針葉樹子葉體細胞胚胎的方法。本發(fā)明的該方面方法包括下列步驟(a)將針葉樹體細胞培養(yǎng)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，生成胚胎發(fā)生細胞；(b)將步驟(a)中制備的胚胎發(fā)生細胞培養(yǎng)在液體維持培養(yǎng)基中，形成前子葉針葉樹體細胞胚胎；(c)在足以至少浸沒有孔材料表面的體積的無菌稀釋培養(yǎng)基中，將步驟(b)制備的多個前子葉胚胎分配到水平置于無孔表面上的有孔材料上，從而均勻地散布前子葉胚胎；(d)從有孔材料中去除無菌稀釋培養(yǎng)基，從而將均勻散布的前子葉胚胎截獲在有孔材料上；以及(e)將截獲在有孔材料上的前子葉胚胎與發(fā)育培養(yǎng)基接觸足以生成針葉樹子葉體細胞胚胎的時段。較之前子葉胚胎沒有均勻散布在發(fā)育培養(yǎng)基上的對等方法，本發(fā)明方法產(chǎn)生更高收率的針葉樹體細胞胚胎。在一些實施方案中，以每平方英寸有孔材料小于0.1g細胞濕重的密度，如每平方英寸有孔材料0.005-0.1g細胞濕重，將多個前子葉胚胎分配在無菌稀釋培養(yǎng)基中。在一些實施方案中，以每平方英寸有孔材料小于0.05g細胞濕重的密度，如每平方英寸有孔材料0.001-0.05g細胞濕重的密度，將多個前子葉胚胎分配到無菌稀釋培養(yǎng)基中。本發(fā)明的方法，如果需要的話，可用于例如制備針葉樹體細胞胚胎，所述針葉樹體細胞胚胎可用于后來的成熟步驟和/或可被發(fā)芽生成可長成成熟針葉樹的針葉樹植株。因此，例如，本發(fā)明方法可用于生產(chǎn)個體針葉樹的無性系，該無性系具有一個或多個所需的特征，如生長速度快或木材質(zhì)量改善。例如，利用本發(fā)明方法生產(chǎn)的針葉樹體細胞胚胎群可用于生產(chǎn)具有一個或多個所需特征(如生長速度快或木材質(zhì)量改善)的針葉樹群或樹林。這些樹又可用于生產(chǎn)木材制品。附圖簡述本發(fā)明前述方面和許多相伴的優(yōu)點，通過參照下文的詳細說明，在結(jié)合附圖時變得更易體會，同時變得更好理解，其中圖1說明了包含置于支撐框上的有孔材料的示例性平板接種框，用于本發(fā)明方法的實施方案；和圖2A-H提供的攝影圖像證明，根據(jù)本發(fā)明方法平板接種的子葉胚胎的生長與標準平板接種方法比較得到改進，如實施例3所述。圖2A-D分別顯示液滴平板接種(dropplating)方法對基因型A、E、F和B的控制。圖2E-H分別顯示液體散布匯合鋪展平板接種方法(liquiddispersionconfluentspreadplatingmethod)X寸基因型A、E、F禾口B的結(jié)果。優(yōu)選實施方案詳述除非本文另有明確定義，本文用的所有術(shù)語的含義與本發(fā)明領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該了解的含義相同。本文用的術(shù)語"胚胎細胞"是指任何細胞，包括可被組織形成組織或器官、衍生自松柏目的植物的細胞，當以本發(fā)明方法處理時，其能夠產(chǎn)生一個或多個針葉樹體細胞胚胎。因此，術(shù)語"胚胎發(fā)生細胞"包括，例如針葉樹胚性胚柄團。本文用的術(shù)語"前子葉胚胎"是指尚未具有任何子葉的胚胎。200710161841.0說明書第4/24頁本文用的術(shù)語"子葉胚胎"是指具有至少一個子葉的胚胎。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，較之前子葉胚胎沒有均勻散布在發(fā)育培養(yǎng)基上的對等方法，本發(fā)明的方法產(chǎn)生更高收率的針葉樹體細胞胚胎。本發(fā)明人進一步觀察到，按照本發(fā)明的方法，以每平方英寸有孔材料小于O.lg細胞濕重的密度，如每平方英寸有孔材料0.001-0.1g細胞濕重的密度，平板接種前子葉胚胎，與以更高密度平板接種和/或利用傳統(tǒng)滴管點滴方法平板接種的前子葉胚胎相比，產(chǎn)生每單位面積子葉胚胎收率增加，如實施例2和3進一步所述。根據(jù)前述內(nèi)容，一方面，本發(fā)明提供從前子葉胚胎產(chǎn)生針葉樹子葉體細胞胚胎的方法。本發(fā)明該方面方法包括下列步驟(a)在足以至少浸沒有孔材料表面的體積的無菌稀釋培養(yǎng)基中，將多個前子葉胚胎分配至水平置于無孔表面上的有孔材料上，由此均勻地散布前子葉胚胎；(b)從有孔材料中去除無菌稀釋培養(yǎng)基，從而將均勻散布的前子葉胚胎截獲在有孔材料上；以及(c)將截獲在有孔材料上的前子葉胚胎與發(fā)育培養(yǎng)基接觸足以生成針葉樹子葉體細胞胚胎的時段。本發(fā)明的方法可用于從任何針葉樹，諸如松(Pinus)屬成員，如火炬松(LoblollyPine)(Pinustaeda)和輻射松(Radiatapine)，生產(chǎn)子葉體細胞胚胎。此外，作為實施例，本發(fā)明方法可生產(chǎn)花旗松子葉體細胞胚胎。根據(jù)本發(fā)明方法，將要平板接種的多個前子葉針葉樹體細胞胚胎懸浮于一定體積的無菌稀釋培養(yǎng)基中，所述體積足以至少浸沒置于無孔基質(zhì)上的有孔材料表面。利用在此所述方法，可生成多個前子葉胚胎。例如，不成熟體細胞胚胎(前子葉胚胎)的懸浮培養(yǎng)物可培養(yǎng)在液體維持培養(yǎng)基中，而讓細胞沉淀。然后利用任何合適的方法，如實施例2所示的方法，測量沉淀細胞的體積(SCV)。接著所需量的SCV用無菌稀釋培養(yǎng)基稀釋，用于按所需密度平板接種。在一些實施方案中，為了足以至少浸沒與平板接種框連接的有孔材料的表面，用于稀釋SCV的稀釋培養(yǎng)基的量基于該框的表面積選擇。例如，SCV可以用至少約3-4倍或更多的SCV體積的無菌稀釋培養(yǎng)基的量稀釋。無菌稀釋培養(yǎng)基可以是維持胚胎生存能力和維持其發(fā)育狀態(tài)的任何合適的液體培養(yǎng)基，例如，下表2所示的維持培養(yǎng)基或示例性稀釋在本方法的一些實施方案中，前子葉胚胎以低密度平板接種，如每平方英寸有孔材料涂布面積小于約0.1g細胞濕重，假設(shè)平均濕重約0.1g/mlSCV。SCV的平均濕重可如實施例2所述確定。例如，胚胎可以用每平方英寸有孔材料平板接種面積小于0.05g，或小于0.025g細胞濕重來平板接種。在一些實施方案中，前子葉胚胎以每平方英寸有孔材料平板接種面積約0.001g至約O.lg細胞濕重范圍(例如每平方英寸有孔材料平板接種面積1mlSCV至0.01mlSCV)的低密度平板接種。在一個實施方案中，前子葉胚胎以每平方英寸有孔材料平板接種面積約O.Olg至約0.08g細胞濕重范圍的密度平板接種，例如每平方英寸有孔材料平板接種面積約0.02g至約0.05g細胞濕重。用于實施本發(fā)明的有孔材料的孔徑范圍從約5微米至約1200微米，如從約50微米至約500微米，如從約70至約150微米，如約100微米。有孔材料通常是平面的，并且可以是任何所需的形狀和尺寸。有孔材料的形狀和尺寸的選擇便于操作和在生長基質(zhì)如發(fā)育培養(yǎng)基上放置。合適的形狀包括方形，矩形或圓形。示例性的尺寸是表面積從約14平方英寸至28平方英寸或更大，如50平方英寸，IOO平方英寸，直到500平方英寸或更大。優(yōu)選的有孔材料是可消毒的，并有足夠的強度抵抗提升該材料時的撕扯，所述提升是為了將涂布后的體細胞胚胎轉(zhuǎn)移至體細胞胚胎生產(chǎn)方法的后續(xù)階段。有用的有孔材料的例子包括膜，尼龍纖維，織網(wǎng)(例如，尼龍，不銹鋼或塑料)和聚合纖維。在一些實施方案中，有孔材料是非吸附的。在一些實施方案中，有孔材料是織網(wǎng)，諸如不銹鋼或尼龍網(wǎng)。根據(jù)本發(fā)明方法的實施方案，有孔材料，諸如織網(wǎng)，在植物體細胞胚胎生產(chǎn)的發(fā)育階段用于平板接種和支撐植物組織。前子葉體細胞胚胎最初分配至水平置于無孔表面上的平面有孔材料上。無孔表面可以是任何合適的無菌表面，例如，固體或半固體培養(yǎng)基表面，諸如含有發(fā)育培養(yǎng)基的佩氏培養(yǎng)皿，或其他任何能保留液體的無菌或可消毒表面，諸如塑料、橡膠或玻璃表面。在一些實施方案中，無孔表面是如cambro盒的盒中所含的半固體發(fā)育培養(yǎng)基。在一些實施方案中，無孔表面包含于生物反應(yīng)器容器內(nèi)，其中所述生物反應(yīng)器容器是可排空的。在本方法的一個實施方案中，有孔材料連接至平板接種框。平板接種框10的代表性例子示于圖1。如圖1所示，平板接種框IO包括與環(huán)繞有孔材料20的支撐框30相連的平面有孔材料20。任選提供與支撐框30相連的把手40A、40B。平板接種框優(yōu)選以可消毒材料制成。例如，支撐框30可以由金屬或塑料材料制成。把手40A、40B可以由任何合適的可消毒材料制成，如耐高壓加熱管。構(gòu)造涂布框10的示例性方法描述于實施例2中。在一個實施方案中，支撐框30是金屬，而有孔材料是尼龍網(wǎng)，該網(wǎng)在高壓加熱之前與上述框相連，并在高壓加熱之后適度收縮，產(chǎn)生與框的連接拉緊和基本水平的平板接種表面。根據(jù)本發(fā)明方法，在足以至少浸沒有孔材料表面的體積的無菌稀釋培養(yǎng)基中，將多個前子葉胚胎分配至置于無孔表面上的有孔材料上。由此，前子葉胚胎均勻散布遍及有孔材料的浸沒表面。在一些實施方案中，輕輕地混合或攪動分配的胚胎，以促進胚胎在無菌稀釋培養(yǎng)基中的散布。輕輕攪動可通過任何合適的方式來實現(xiàn)，例如通過采用接觸胚胎的儀器，或通過有孔材料和/或無孔基質(zhì)的振動。一旦分配的前子葉胚胎基本均勻地散布在有孔材料上，則從有孔材料移出無菌稀釋培養(yǎng)基。在一個實施方案中，通過將有孔材料垂直提離無孔基質(zhì)，從有孔材料移出無菌稀釋培養(yǎng)基，由此截獲有孔材料表面上均勻散布的前子葉胚胎。例如，與包含把手40A、40B的平板接種框IO相連的有孔材料可采用任何合適的方式由把手垂直提起，如手動或通過自動機械裝置。在替代的實施方案中，一旦分配的前子葉胚胎基本均勻散布在有孔材料上，則通過將無菌稀釋培養(yǎng)基的體積減少至有孔材料表面的下方，而移出無菌稀釋培養(yǎng)基，由此在有孔材料表面上截獲均勻散布的前子葉胚胎。減少無菌稀釋培養(yǎng)基體積可采用避免妨礙平板接種細胞的分布的任何方法，例如抽吸，排空，傾到，或吸干無菌稀釋培養(yǎng)基。然后，在有孔材料表面上截獲的均勻散布的前子葉胚胎與發(fā)育培養(yǎng)基接觸足以產(chǎn)生針葉樹子葉體細胞胚胎的時段。在一個實施方案中，有孔材料或持續(xù)或間歇地與液體發(fā)育培養(yǎng)基接觸。例如，有孔材料可置于浸泡于發(fā)育培養(yǎng)基中的吸收墊上，使得發(fā)育培養(yǎng)基通過有孔材料并接觸胚胎。有孔材料，諸如攜帶胚胎細胞的尼龍網(wǎng)，通常裝入封閉空間，所述空間含有濕氣以確保胚胎保持潮濕。在另一實施方案中，有孔材料置于包含固體或半固體發(fā)育培養(yǎng)基的生長基質(zhì)上。用于本發(fā)明方法中的發(fā)育培養(yǎng)基含有維持體細胞胚胎的養(yǎng)分。麥芽糖和葡萄糖可包括在發(fā)育培養(yǎng)基中，作為體細胞胚胎用的主要的或唯一的糖源。有用的麥芽糖和葡萄糖濃度范圍從約1%至約2.5%。合適的發(fā)育培養(yǎng)基一般不包括生長促進激素，諸如植物生長素和細胞分裂素，但可包括激素脫落酸。脫落酸用于發(fā)育培養(yǎng)基時，其通常利用的濃度范圍為約1mg/L至約200mg/L。發(fā)育培養(yǎng)基可含有結(jié)冷膠(gellangum)，濃度一般高達約0.40%。發(fā)育培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度利用滲透劑(osmoticant)如PEG8000分子量，可調(diào)節(jié)至落入所需范圍內(nèi)的值，如約250mM/Kg至約450mM/Kg。一般而言，300-350mM或更高的摩爾滲透壓濃度是有益的。合適的液體或固體發(fā)育培養(yǎng)基的例子提供在實施例l和2中。作為實施例，前子葉針葉樹體細胞胚胎可培養(yǎng)在有孔材料，諸如尼龍網(wǎng)或膜上，該材料至少間歇地與發(fā)育培養(yǎng)基在10-3(TC的溫度下，如15-25"C，或如20-23。C下，接觸4周-14周，如8-12周，或如約12周。在一個實施方案中，前子葉針葉樹體細胞胚胎培養(yǎng)在與液體發(fā)育培養(yǎng)基接觸的有孔材料上，所述發(fā)育培養(yǎng)基施加至吸收基質(zhì)，諸如由纖維素制成的基質(zhì)(例如纖維素纖維)，如一層或多層濾紙，或某些其他吸收材料?；|(zhì)吸收液體發(fā)育培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基通過置于基質(zhì)上的有孔材料，并接觸置于有孔材料上的針葉樹前子葉體細胞胚胎。發(fā)育培養(yǎng)基促進針葉樹前子葉體細胞胚胎的發(fā)育，形成子葉體細胞胚胎。在另一實施方案中，前子葉針葉樹體細胞胚胎培養(yǎng)有孔材料上，所述有孔材料利用霧化器與液體發(fā)育培養(yǎng)基接觸，該霧化器用發(fā)育培養(yǎng)基噴霧有孔材料。體細胞胚胎置于有孔材料的上表面，而有孔材料的對面下表面用液體發(fā)育培養(yǎng)基噴霧。作為進一步的實施例，攜帶體細胞胚胎的有孔材料可置于液體發(fā)育培養(yǎng)基上，該發(fā)育培養(yǎng)基包括旋轉(zhuǎn)攪拌棒，該攪拌棒旋轉(zhuǎn)足夠快，以將液體發(fā)育培養(yǎng)基向上噴霧至有孔材料的下表面。在另一方面，本發(fā)明提供從針葉樹體細胞生產(chǎn)針葉樹子葉體細胞胚胎的方法。本發(fā)明的這方面方法包括下列步驟(a)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)針葉樹體細胞，生成胚胎發(fā)生細胞；(b)將步驟(a)中制備的胚胎發(fā)生細胞培養(yǎng)在液體維持培養(yǎng)基中，形成前子葉針葉樹體細胞胚胎；(c)在足以至少浸沒有孔材料表面的體積的無菌稀釋培養(yǎng)基中，將步驟(b)制備的多個前子葉胚胎分配至置于無孔表面上的有孔材料上，由此均勻地散布前子葉胚胎；(d)從有孔材料去除無菌稀釋培養(yǎng)基，從而將均勻散布的前子葉胚胎截獲在有孔材料上；以及(e)將截獲在有孔材料上的前子葉胚胎與發(fā)育培養(yǎng)基接觸足以生成針葉樹子葉體細胞胚胎的時段。因此，在一些實施方案中，針葉樹體細胞培養(yǎng)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基之中或之上，生成胚胎發(fā)生細胞。胚胎發(fā)生細胞能夠產(chǎn)生一個或多個子葉針葉樹體細胞胚胎。胚胎發(fā)生細胞的例子是胚性胚柄團(ESMs)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基通常包括無機鹽和有機養(yǎng)分材料。誘導(dǎo)培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度一般為約160mM/kg或更低，但也可高至170mM/kg。誘導(dǎo)培養(yǎng)基通常包括生長激素?？砂ㄔ谡T導(dǎo)培養(yǎng)基中的激素的例子有植物生長素(例如，2,4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D))和細胞分裂素(例如，6-芐基氨基嘌呤(BAP))。植物生長素的可用濃度例如為lmg/L至200mg/L。細胞分裂素的可用濃度例如為0.1mg/L至10mg/L。誘導(dǎo)培養(yǎng)基可包含吸收組分，尤其使用很高水平的生長激素時。吸收組分可以是實施本發(fā)明方法時所用濃度對胚胎發(fā)生細胞無毒、能夠吸收促進生長的激素以及胚胎發(fā)育過程中由植物細胞產(chǎn)生并且存在于培養(yǎng)基中的有毒化合物的任何組分。有用的吸收組分的非限制例子包括活性炭、可溶性聚(乙烯吡咯垸酮)、不溶性聚(乙烯吡咯垸酮)、活性氧化鋁、和硅膠。吸收組分的存在量例如為約0.1g/L至約5g/L。誘導(dǎo)培養(yǎng)基通常是固體，并可導(dǎo)入膠凝劑而固化。本發(fā)明實施有用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的例子闡述于實施例1。針葉樹體細胞通常在誘導(dǎo)培養(yǎng)基之中或之上，在10-30。C溫度下，如15-25。C，或如20-23。C，培養(yǎng)3-12周，如8-10周，或如約8周。維持培養(yǎng)基可以是固體培養(yǎng)基，或者可以是液體培養(yǎng)基，所述液體培養(yǎng)基可以攪動以促進胚胎發(fā)生組織的生長和增殖。維持培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度通常高于誘導(dǎo)培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度，一般在180-400mM/kg范圍內(nèi)。維持培養(yǎng)基可包含維持胚胎發(fā)生組織的養(yǎng)分，并可包含促進胚胎發(fā)生組織的細胞分裂和生長的激素，諸如一種或多種植物生長素和/或細胞分裂素。通常，激素在維持培養(yǎng)基中的濃度低于其在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的濃度。盡管不是必需，但一般希望維持培養(yǎng)基中包括麥芽糖作為唯一的或主要的可代謝糖源。有用的麥芽糖濃度范圍的例子為約1%至約2.5%。合適的維持培養(yǎng)基的例子闡述在本文的實施例1中。針葉樹胚胎發(fā)生細胞通常在維持培養(yǎng)基之中或之上，在10-3(TC溫度下，如15-25。C，或如20-23。C，培養(yǎng)最多6個月，每周進行次培養(yǎng)。針葉樹胚胎發(fā)生細胞通常每周一次或當生長耗盡培養(yǎng)基組分時轉(zhuǎn)移至新鮮維持培養(yǎng)基。有用的發(fā)育培養(yǎng)基在前描述。在與發(fā)育培養(yǎng)基連續(xù)或周期性接觸培養(yǎng)之后，子葉體細胞胚胎可任選轉(zhuǎn)移至成熟培養(yǎng)基，然后轉(zhuǎn)移至分層培養(yǎng)基(stratificationmedia)，歷經(jīng)進一步培養(yǎng)期。本發(fā)明方法可用于，例如，生產(chǎn)具有一種或多種所需特征(如生長速度快)的個體針葉樹的無性系。因此，在一個方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)遺傳性相同的針葉樹子葉體細胞胚胎群的方法。本發(fā)明的該方面方法各包括一個步驟將遺傳性相同的針葉樹前子葉體細胞胚胎在與發(fā)育培養(yǎng)基連續(xù)或周期性接觸的有孔材料(例如，有孔尼龍網(wǎng))上培養(yǎng)足以從前子葉體細胞胚胎生產(chǎn)遺傳性相同的針葉樹子葉體細胞胚胎的時段，其中發(fā)育培養(yǎng)基通過有孔材料并接觸體細胞胚胎。需要的話，利用本發(fā)明方法生產(chǎn)的針葉樹體細胞胚胎可任選發(fā)芽，形成可長成針葉樹的針葉樹植株。子葉胚胎還可置于人工種子內(nèi)，用于隨后發(fā)芽。針葉樹子葉體細胞胚胎可在，例如，固體發(fā)芽培養(yǎng)基上發(fā)芽，如本發(fā)明實施例2中所述的發(fā)芽培養(yǎng)基。發(fā)芽的植株可轉(zhuǎn)移至土壤，進一步生長。例如，發(fā)芽的植株可種植在溫室的土壤中，并在移植至室外地點之前讓其生長。通常，照明針葉樹子葉體細胞胚胎刺激發(fā)芽。通常，本發(fā)明方法的所有步驟，除發(fā)芽之外，皆在黑暗中進行。與胚胎發(fā)生細胞以更高密度和/或在過量液體存在下平板接種的等同方法比較，本發(fā)明方法產(chǎn)生每平板接種表面積更高收率的針葉樹體細胞胚胎，如在前實施例2和3進一步描述。本發(fā)明方法可用于，例如，生產(chǎn)具有一種或多種所需特征如生長速度快的個體針葉樹的無性系。在此所述的方法可用于生產(chǎn)遺傳性相同的成熟體細胞針葉樹胚胎群。下列實施例僅舉例說明實施本發(fā)明目前認為的最佳方式，不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明。實施例1該實施例顯示從火炬松生產(chǎn)體細胞松樹胚胎的本發(fā)明的代表性方法。含有合子胚的雌配子體在受精后4-5周從種子中取出。去除種子皮，但胚胎除切除珠心端之外并不進一步從周圍的配子體中切出。球果儲存于4'C，直至使用。在去除不成熟胚胎之前即刻，利用初次洗滌和洗滌劑處理，接著以15%&02消毒10分鐘，而對種子進行消毒。外植體在每次處理后以無菌蒸餾水充分洗滌。表1和2列出了生產(chǎn)松樹體細胞胚胎有用的培養(yǎng)基的示例性組分。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>+表示如果需要固體培養(yǎng)基則使用<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>誘導(dǎo)將帶有完整胚胎的無菌配子體置于固體BM,培養(yǎng)基上，并在22-25r下，以24小時暗光周期維持在環(huán)境中3-5周。時間長度取決于被培養(yǎng)的具體基因型。時間結(jié)束時，形成與原外植體相連的白色粘液團。顯微鏡檢査通常揭示眾多早期胚胎與團相連。這些一般表征為長的薄壁柄與帶有致密胞質(zhì)和大核的小頭相連。誘導(dǎo)培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度有些情形下可高至150mM/kg。正常情形下其為約120mM/kg，甚至更低(如110mM/kg)。前子葉胚胎的維持和增殖將從誘導(dǎo)期生成的團中取出的早期胚胎首先置于BM2膠凝維持和增殖培養(yǎng)基上。這區(qū)別于誘導(dǎo)培養(yǎng)基在于，生長激素(植物生長素和細胞分裂素)被降低至少一個完整的數(shù)量級。該培養(yǎng)基的摩爾滲透壓濃度是130mM/kg或更高(對火炬松而言，通常在約120-150mM/kg范圍內(nèi))。溫度在黑暗中還是22-25"。胚胎在轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基進一步次培養(yǎng)之前，在BM2固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12-14天。該液體培養(yǎng)基的組成與BM2相同，但缺乏膠凝劑。固體維持期結(jié)束時的胚胎通常在外表上與誘導(dǎo)期的那些胚胎相似。在液體維持培養(yǎng)基上次培養(yǎng)5-6周之后，已形成高級早期胚胎。這些胚胎的特征在于帶有多柄的光滑胚頭，估計一般有100以上個體細胞。胚胎發(fā)育胚胎發(fā)育按照下述實施例2和3所述進行。該發(fā)育培養(yǎng)基的滲透力實際上可升高至超過維持培養(yǎng)基的滲透力。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)摩爾滲透壓濃度高達300mM/kg甚至更高是有利的。發(fā)育優(yōu)選在22-25。C、完全黑暗下實施，直到子葉胚胎已經(jīng)發(fā)育。發(fā)育時間一般幾周，如7-12周。分層子葉胚胎分株(singulated)并轉(zhuǎn)移至分層培養(yǎng)基BM5。該培養(yǎng)基類似于發(fā)育培養(yǎng)基，但缺乏脫落酸、PEG-8000和結(jié)冷膠。胚胎在分層培養(yǎng)基上、約rC-約10。C之間、黑暗下培育3-6周。用水調(diào)理從生長基質(zhì)上提起仍然在有孔材料上的成熟胚胎，并置于H20相對濕度為97%的封閉容器中，為期約3周。發(fā)芽調(diào)理的成熟胚胎置于固體BM6培養(yǎng)基上發(fā)芽。該培養(yǎng)基是缺乏生產(chǎn)激素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過減少蔗糖、肌醇和有機氮而修改。在23-25。C的環(huán)境條件下，將胚胎溫育在BM6培養(yǎng)基上足夠時間，直到產(chǎn)生的苗具有充分發(fā)育的幼根、下胚軸、綠色子葉結(jié)構(gòu)和上胚軸。由于降低了碳水化合物濃度，發(fā)芽培養(yǎng)基的滲透力進一步降低，低于發(fā)育培養(yǎng)基之下。其通常約150mM/kg之下(如約100mM/kg)。實施例2該實施例描述本發(fā)明方法的實施方案的示例性平板接種框的結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用。平板接種框的結(jié)構(gòu):金屬平板接種框的構(gòu)造是用硅酮粘合100微米尼龍織網(wǎng)。平板接種框(10)示于圖1。在圖1所示的平板接種框(IO)的實施方案中，尼龍織網(wǎng)(20)的形狀為矩形，長7英尺，寬4英寸，外露表面積28平方英寸。管把手(40A，40B)與金屬框(30)連接，以便于平板接種框(10)的移動。沿著框邊和越過框的中部添加硅珠，以創(chuàng)建2個大小相同的分開的平板接種區(qū)(未示)。然后平板接種框(10)高壓加熱，在高壓加熱過程中由于尼龍織網(wǎng)(20)收縮至金屬框(30)上，產(chǎn)生拉緊的平板接種表面。在平板接種框上平板接種細胞平板接種用SCV的制備讓長在1升Ehrlemeyer燒瓶的繁殖培養(yǎng)基(如表4所示制備)中的基因型A的針葉樹體細胞胚胎細胞沉淀。通過在燒瓶上劃線測量沉淀的細胞體積(SCV)，沉淀細胞之上的上清液經(jīng)燒結(jié)的玻璃棒以抽吸除去。然后，沉淀的細胞重懸浮于3XSCV補充量的按實施例1所述制備的無菌稀釋培養(yǎng)基中。測定SCV的濕重為了測定SCV的濕重，如上所述測量SCV。然后，利用Buchnar漏斗(13英寸高)去除上清液，將lmlSCV樣品置于預(yù)先稱重的預(yù)先潤濕的VWR級417濾紙上。在固定的時間(30秒)于4-點天平上進行測重。每mlSCV的4種代表性基因型的濕重測量示于下表3中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>從表3所示的結(jié)果可見，測試的4種基因型的平均濕重為103.5mg/mlSCV。因此，測試的4種基因型的1mlSCV的平均濕重為約0.1mg/mLSCV。提供如上所述制備的平板接種框(10)，并置于半固體發(fā)育培養(yǎng)基(如表5所示制備)的表面。然后測量漂洗的沉淀細胞的體積，并以3mlSCV的密度(0.3g/14平方英寸=0.02g/平方英寸)平板接種到平板接種框的前半部，并以12mlSCV的密度(1.2g/14平方英寸=0.08g/平方英寸)平板接種到平板接種框的后半部，各自的總體積分別為9ml禾B36ml。在平板接種框上進行細胞平板接種，所述平板接種框置于盒中所含的半固體發(fā)育培養(yǎng)基的表面上。這使得細胞和培養(yǎng)基均勻地散布于尼龍網(wǎng)，旨在使細胞密度和初始細胞深度的變化最小化。一旦平板接種的細胞均勻地散布在浸沒的尼龍網(wǎng)上，將平板接種框(10)垂直提離半固體發(fā)育培養(yǎng)基，由此截獲均勻散布的胚胎，并使得留在第一盒中的過量培養(yǎng)基散開。然后在新盒中，將含有均勻散布的胚胎的平板接種框置于與第一盒配方相同的半固體發(fā)育培養(yǎng)基的表面上。接著，讓平板接種框上的平板接種細胞生長12周，并監(jiān)控總生物量、胚性胚柄團、以及胚胎結(jié)構(gòu)形成，如下表6所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>結(jié)果培養(yǎng)12周之后，檢査平板接種框內(nèi)以不同密度平板接種的培養(yǎng)物的總生物量、胚性胚柄團(ESM)、以及胚胎結(jié)構(gòu)形成。精選的胚胎是指存在至少4個子葉并且沒有大比例的殘缺。結(jié)果示于下表6中。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如上表6所示，當胚胎以較低密度(例如，3mlSCV/14英寸(約0.3g/14平方英寸0.02g/平方英寸))平板接種時，胚性胚柄團的隨后增殖與以較高密度12mlSCV/14平方英寸(約1.2§/14平方英寸=0.08g/平方英寸)平板接種的細胞產(chǎn)出同樣多的總生物量。如表6進一步所示，以每面積計所產(chǎn)生的胚胎總量在低密度和高密度之間差不多相同。正如干重差異所示，通過大大提高胚性胚柄團(ESM)的生長，這是有可能實現(xiàn)的，例如，低密度的干ESM為235mg，而高密度平板接種的框的干ESM只有138.7mg。因此，與高密度平板接種(64.25胚胎/mlSCV)相比，在低密度平板接種(240胚胎/mlSCV)中精選的胚胎形成(目的終產(chǎn)物)/ml平板接種的SCV顯然更好。實施例3該實施例描述，利用四種不同基因型的火炬松，通過標準吸管液滴平板接種方法和本發(fā)明實施方案的液體散布匯合鋪展平板接種方法，進行胚胎收率之間的比較。方法直接比較利用相同生物量的四種不同基因型火炬松A、B、E和F，同時改變平板接種SCV的平板接種密度，進行在平板接種框(10)上平板接種細胞的方法的直接比較實驗。測量胚胎收率和發(fā)芽結(jié)果?；蛐虯、B、E禾DF的胚胎體細胞(ESM)生長在1升Erlenmeyer燒瓶的增殖培養(yǎng)基(如實施例2所述制備)中。如實施例2所述，使ESM細胞沉淀，并測量沉淀的細胞體積(SCV)。對各基因型而言，作為代表標準液滴平板接種方法的對照，將6mlSCV作12滴(每滴0.5mlSCV)，直接平板接種至整個平板接種框(7"乂4"總面積=28平方英寸)，該框置于淺平板接種盒中的半固體發(fā)育培養(yǎng)基上。在該實施例中，利用裝有兩個平板接種框(10)的cambro盒(CambroManufacturingCo.，HuntingtonBeach，CA)。為了測試鋪展平板接種方法，各個基因型的第二等份6mlSCV用3X(18ml)發(fā)育培養(yǎng)基漂洗。然后，24mlSCV加上漂洗培養(yǎng)基平板接種至整個平板接種框(28平方英寸)上，所述框置于cambro盒中的第一半固體發(fā)育培養(yǎng)基上方，致使ESM細胞漂浮在培養(yǎng)基并均勻地散布在平板接種框的浸沒表面。輕輕攪動平板接種框有助于均勻散布。然后，利用連接柄同時保持平板接種表面在水平方向，將平板接種框垂直提離cambro盒中的第一半固體培養(yǎng)基，由此截獲均勻散布的ESM細胞，同時使培養(yǎng)基流過有孔網(wǎng)。接著，將含有平板接種細胞的平板接種框移至含有半固體發(fā)育培養(yǎng)基(如實施例2所述)的新鮮cambro盒，并發(fā)育12周。12周結(jié)束時，胚胎經(jīng)受晚期發(fā)育處理誘導(dǎo)發(fā)芽，計數(shù)，樣品發(fā)芽。正常發(fā)芽記分為存在lmm白根，存在大約5個長度約5mm的上胚軸葉片，沒有大比例的下胚軸破裂，以及沒有彎曲大于90度的下胚軸。12周發(fā)育期之后，對發(fā)育胚胎的總收率進行計數(shù)。結(jié)果示于下表7。發(fā)育期結(jié)束時拍照，如圖2所示。圖2A-D分別顯示基因型A，E，F(xiàn)和B的對照。圖2E-H分別顯示基因型A，E，F(xiàn)和B的液體散布匯合鋪展平板接種方法的結(jié)果。12周結(jié)束時，利用分層培養(yǎng)基(實施例1中所述)將胚胎分層4周。分層4周之后，胚胎噴霧分開，并用水調(diào)理10天。對各個基因型而言，選擇25個胚胎用于發(fā)芽評價。為發(fā)芽選擇的胚胎基于存在至少4個子葉和沒有總體缺陷或下胚軸開裂。結(jié)果表7<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>如表7所示，所有測試的4種基因型顯示，與傳統(tǒng)吸管液滴平板接種法相比，低密度匯合鋪展平板接種法的胚胎收率增加至少1.3倍或更高。發(fā)芽研究的結(jié)果表明，在利用液滴法和鋪展法平板接種的樣品發(fā)芽成功率之間沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。當表7所示的4種基因型的結(jié)果組合時，利用液滴法產(chǎn)生的胚胎總平均對照值為2166.7，而利用液體散布匯合鋪展方法產(chǎn)生的胚胎總平均值為3692，胚胎收率高1.7倍，p值為0.0708。這在胚胎收率中是非常顯著的改進，使得基因型平板接種在單一cambro單元，以實現(xiàn)發(fā)芽收率的平均收率目標，并且將操作單個無性系所需的單元數(shù)降低至只有一個，相比之下，利用傳統(tǒng)吸管液滴平板接種法需要至少30個單獨的單元(培養(yǎng)皿)。測試的4種基因型記載的組合結(jié)果提供在下表8中。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>上表8所示的數(shù)據(jù)顯示，雖然根長有些差異跡象，但胚胎收率上統(tǒng)計學(xué)顯著性(0.10p值截止)增加70%，而且發(fā)芽率沒有明顯損失沒有。雖不希望受理論的束縛，但觀察到根大小的差異可能是由于與生長量更大有關(guān)的營養(yǎng)問題。營養(yǎng)問題的解決可通過一段時間后將平板接種的胚胎移至新鮮生長基質(zhì)，或通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基組成至更大的濃度，和/或基于具體細胞系的生長率調(diào)節(jié)平板接種密度。如表8所示，本發(fā)明的鋪展平板接種法與液滴平板接種法相比，導(dǎo)致芽的收率120%，提示以每盒單元和表面積為基礎(chǔ)，在以胚胎生成和發(fā)芽二者所測量的培養(yǎng)生產(chǎn)率方面，有非常大的改進。與之前在培養(yǎng)皿中生長的液滴法相反，胚胎收率中觀察到的這種改進允許對平板接種表面的大小沒有限制，按比例增大，。這種按比例增大提高了每平板接種單位形成的胚胎量，并且通過減少所需的操作量而降低每單位成本。雖然該實施例描述了利用Cambro盒作為平板接種容器，但在平板接種之后用于發(fā)育步驟的平板接種容器可以是任何合適的平板接種表面，諸如任何盒型容器，諸如可以使用可商購的食品制備容器，該容器是熱穩(wěn)定的，并帶有蓋子。液體散布匯合鋪展平板接種方法還可以這樣成功實施用放置在除半固體培養(yǎng)基之外的多種無孔無菌表面上的平板接種框，所述表面比如無菌塑料蓋、或者置于能夠保留液體的容器內(nèi)的硅片或橡膠墊，接著將平板接種胚胎與發(fā)育培養(yǎng)基接觸。液體散布匯合鋪展平板接種方法還可以這樣成功實施首先鋪板足以浸沒平板接種表面的量的無菌稀釋培養(yǎng)基，所述表面包含置于固體(無孔)基質(zhì)上的有孔材料。然后，將所需體積的scv添加至稀釋培養(yǎng)基，并以吸管輕輕混合。接著任選借助于吸管和/或輕輕攪動第一平板接種表面，使得漂浮細胞散開。拿起平板接種框，并置于包含發(fā)育培養(yǎng)基的第二生長基質(zhì)上，并如上所述溫育。最后，利用平板接種至置于半固體發(fā)育培養(yǎng)基上的整個平板接種框(7"X4")上的l-12mlSCV的等份，匯合鋪展方法也已成功地用于從多種火炬松基因型生成胚胎。盡管本發(fā)明優(yōu)選的實施方案已得以說明和描述，但可以理解在不背離本發(fā)明的實質(zhì)和范疇的情形下可進行各種變化。權(quán)利要求1.生產(chǎn)針葉樹子葉體細胞胚胎的方法，所述方法包括a)在足以至少浸沒有孔材料表面的體積的無菌稀釋培養(yǎng)基中，將多個前子葉胚胎分配至水平置于無孔表面上的有孔材料上，由此均勻地散布前子葉胚胎；b)從有孔材料去除無菌稀釋培養(yǎng)基，從而在有孔材料上截獲均勻散布的前子葉胚胎；以及c)將截獲在有孔材料上的前子葉胚胎與發(fā)育培養(yǎng)基接觸足以生成針葉樹子葉體細胞胚胎的時段。2.權(quán)利要求l的方法，其中多個前子葉胚胎以每平方英寸有孔材料小于O.lg細胞濕重的密度分配在步驟(a)的無菌稀釋培養(yǎng)基中。3.權(quán)利要求l的方法，其中多個前子葉胚胎以每平方英寸有孔材料小于0.05g細胞濕重的密度分配在步驟(a)的無菌稀釋培養(yǎng)基中。4.權(quán)利要求1的方法，其中多個前子葉胚胎以每平方英寸有孔材料0.1g至0.001g細胞濕重的密度分配在步驟(a)的無菌稀釋培養(yǎng)基中。5.權(quán)利要求l的方法，其中有孔材料包含平均孔徑范圍在5微米至1200微米的孔。6.權(quán)利要求l的方法，其中有孔材料是非吸收性的。7.權(quán)利要求5的方法，其中有孔材料是織網(wǎng)。8.權(quán)利要求l的方法，其中有孔材料與有柄的支撐框連接。9.權(quán)利要求8的方法，其中通過將支撐框垂直提離無孔基質(zhì)而從步驟(b)的有孔材料去除無菌稀釋培養(yǎng)基。10.權(quán)利要求1的方法，其中通過將無菌稀釋培養(yǎng)基減少至有孔材料表面之下的水平而從步驟(b)的有孔材料去除無菌稀釋培養(yǎng)基。11.權(quán)利要求l的方法，其中步驟(c)的發(fā)育培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基。12.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)的發(fā)育培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基。13.生產(chǎn)針葉樹子葉體細胞胚胎的方法，包括(a)將針葉樹體細胞培養(yǎng)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，生成胚胎發(fā)生細胞；(b)將步驟(a)中制備的胚胎發(fā)生細胞培養(yǎng)在液體維持培養(yǎng)基中，形成前子葉針葉樹體細胞胚胎；(c)在足以至少浸沒有孔材料表面的體積的無菌稀釋培養(yǎng)基中，將步驟(b)制備的多個前子葉胚胎分配至水平置于無孔表面上的有孔材料上，由此均勻地散布前子葉胚胎；(d)從有孔材料去除無菌稀釋培養(yǎng)基，從而將均勻散布的前子葉胚胎截獲在有孔材料上；以及(e)將截獲在有孔材料上的前子葉胚胎與發(fā)育培養(yǎng)基接觸足以生成針葉樹子葉體細胞胚胎的時段。全文摘要本發(fā)明涉及用于體細胞胚胎發(fā)生的低密度鋪展方法。具體而言，本發(fā)明提供從前子葉胚胎生產(chǎn)針葉樹子葉體細胞胚胎的方法，該方法包括下列步驟(a)在足以至少浸沒有孔材料表面的體積的無菌稀釋培養(yǎng)基中，將多個前子葉胚胎分配至水平置于無孔表面上的有孔材料上，由此均勻地散布前子葉胚胎；(b)從有孔材料去除無菌稀釋培養(yǎng)基，從而將均勻散布的前子葉胚胎截獲在有孔材料上；以及(c)將截獲在有孔材料上的前子葉胚胎與發(fā)育培養(yǎng)基接觸足以生成針葉樹子葉體細胞胚胎的時段。文檔編號C12N5/04GK101240260SQ20071016184公開日2008年8月13日申請日期2007年9月24日優(yōu)先權(quán)日2006年9月28日發(fā)明者斯特凡妮·A·布魯西格,詹姆斯·A·格羅布申請人:韋爾豪澤公司