專利名稱：人促紅細(xì)胞生長素的基因工程生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了一種重組人促紅細(xì) 胞生長素的編碼序列以及生產(chǎn)該重組人促紅細(xì)胞生長素的方法，包括有關(guān)的 工程菌的構(gòu)建、重組人促紅細(xì)胞生長素的表達(dá)和純化工藝。
背景技術(shù)：
人類促紅細(xì)胞生成素(Human Erythropoietin ， huEP0)是一種糖蛋白， 是人體內(nèi)調(diào)節(jié)紅系造血的一種主要激素，。對(duì)體內(nèi)紅細(xì)胞的生成起著不可或缺 的調(diào)控作用。天然EPO來源極為有限，遠(yuǎn)不能滿足需要。
胎兒肝臟是胎兒EPO的主要來源，出生后EPO合成器官由肝臟轉(zhuǎn)變?yōu)槟I 臟。成年機(jī)體EPO主要來源于腎臟，由腎小管及管旁毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及間 質(zhì)細(xì)胞合成分泌。大約機(jī)體EP0總量的10 15X來自于腎外，主要合成器官 為肝臟，由肝中央靜脈周圍肝細(xì)胞及肝枯否細(xì)胞產(chǎn)生，骨髓中的巨噬細(xì)胞和 中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞可能以旁分泌方式也可合成EPO。另外研究 發(fā)現(xiàn)EPO亦可經(jīng)一些腎臟和肝臟腫瘤，腦血管瘤，子宮肌瘤及卵巢囊腫等合 成。
促進(jìn)EPO合成的主要剌激因素為血中可利用氧下降引起的組織缺氧。在 缺氧情況下，EP0合成增多，見于各種貧血，心肺功能紊亂等引起的動(dòng)脈血 氧分壓降低。EPO的合成亦受到多種體液因素及一些具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì) 胞因子的影響。
人EP0基因位于第七對(duì)染色體的q21 — q22區(qū)，至少含有5個(gè)外顯子和4個(gè) 內(nèi)含子。與鼠EP0基因序列存在82X的同源性。EPO轉(zhuǎn)基因小鼠研究顯示，位 于EPO基因兩側(cè)的不同DNA序列(即側(cè)翼序列)控制著腎、肝臟EPO基因的表
達(dá)，大約50個(gè)核苷酸組成的3'端側(cè)翼序列能傳遞對(duì)缺氧產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)， 作為增強(qiáng)子發(fā)揮作用。
人EPO是一種對(duì)熱和酸穩(wěn)定的酸性糖蛋白，其前體由193個(gè)氨基酸組成。 成熟的人EP0分子由166個(gè)氨基酸殘基組成，含有2個(gè)二硫鍵，理論相對(duì)分子 量為18kDa。
EPO分子中有三個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)，分別位于24、 26、 83位的Asn和126 位的Ser。成熟的EPO分子在這幾個(gè)位點(diǎn)均可被糖基化。糖基化在體內(nèi)的作用 是很復(fù)雜的，機(jī)體可合成多種不同類型的糖基化EPO，糖基化類型不同作用 亦不相同。近來研究顯示，僅能進(jìn)行N-連接而不能進(jìn)行0 —連接的糖類對(duì)EPO 功能的產(chǎn)生具有重要意義。
EPO能刺激紅系祖細(xì)胞分化發(fā)育成成熟的紅細(xì)胞。早期EPO主要從尿中 提取，用于治療腎功能衰竭引起的貧血。EPO以其重要的生理作用和極高的 臨床應(yīng)用價(jià)值而成為最有利可圖的基因工程藥。隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn) 展，國外已經(jīng)研制出了重組人紅細(xì)胞生成素(rhEPO)應(yīng)用于臨床，對(duì)慢性 腎功能衰竭等原因引起的并發(fā)貧血的患者，具有極好的療效。而在國內(nèi)，有 關(guān)反面的研究并不多。
因此，迫切需要開發(fā)新的高效生產(chǎn)重組人EPO方法，本發(fā)明采用了酵母 表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)EPO，通過對(duì)人EPO基因的優(yōu)化，構(gòu)建含有優(yōu)化的人EPO基因的 表達(dá)載體，并獲得了高水平的表達(dá)菌株；通過控制發(fā)酵條件，達(dá)到了較高蛋 白表達(dá)率；得到可供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的EPO蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高效和/或簡便的生產(chǎn)重組重組人紅細(xì)胞生 成素(rhEPO)的方法。
本發(fā)明的另一目的就是提供優(yōu)化的重組人紅細(xì)胞生成素(rhEPO)的編 碼序列和用于該方法的表達(dá)載體，工程菌株以及宿主細(xì)胞的培養(yǎng)和純化工
藝。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種優(yōu)化的編碼重組人紅細(xì)胞生成素 (rhEP0)的核苷酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種表達(dá)載體，含有權(quán)利要求l所述的核苷 酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是pPIC9/EP0和pPIC9k/EP0。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種工程細(xì)胞，其特征在于，含有權(quán)利要 求2所述的表達(dá)載體。在另一優(yōu)選例中，所述的工程細(xì)胞是Pichia酵母GS115(His—， Mut+)菌 株，是Invitrogen公司開發(fā)的高效酵母表達(dá)系統(tǒng)。非常適合外源基因的高效表 達(dá)。載體pPIC9是一個(gè)有8023bp的可溶性載體，比pPIC9k少一個(gè)Kanamycin基 因，pPIC9k是一個(gè)有9276bp的可溶性載體，含有最常用的啟動(dòng)子AOXl,具有 很強(qiáng)的甲醇誘導(dǎo)性，使得在它控制下的基因得到較高表達(dá)。其分泌表達(dá)的信 號(hào)肽序列來自釀酒酵母的89個(gè)氨基酸的一端前導(dǎo)肽，在a因子分泌信號(hào)后有一 個(gè)多克隆位點(diǎn)，含有常用限制性酶切位點(diǎn)，外源基因可以通過這些位點(diǎn)插入 載體pPIC9k中，下游帶有一個(gè)A0X1轉(zhuǎn)錄終止子、組氨酸脫氫酶基因(HIS4)、 3' — A0X1區(qū)和大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因。因此轉(zhuǎn)化子可以通過組氨酸 缺陷型的MD平板篩選重組轉(zhuǎn)化子，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后可以在宿主菌中高效表達(dá) 外源基因。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)重組人紅細(xì)胞生成素(rhEP0)的 方法，該方法包括步驟a) 在適合的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，從而表 達(dá)出重組人紅細(xì)胞生成素(rhEP0)蛋白；較佳地，所述的宿主細(xì)胞 是Pichia酵母GS115(His—， Mut+)菌株。b) 分離純化出表達(dá)的重組人紅細(xì)胞生成素(rhEPO)蛋白。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的步驟(a)的培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)分為培養(yǎng)階段和誘導(dǎo)階段，培養(yǎng)階段培養(yǎng)菌液濃度達(dá)到0D600為 6-10左右，誘導(dǎo)時(shí)間為48-96hr，發(fā)酵及誘導(dǎo)溫度保持在30'C ，微量元素的 量為O. l-2ml/L，誘導(dǎo)期的pH值為7. 0，誘導(dǎo)期甲醇濃度在O. 5—2% 。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，誘導(dǎo)過程還可以添加酪蛋白水解物(CA)、 蛋白胨(p印tone)、奶粉、精氨酸等作為保護(hù)劑。


圖l. EPO理論序列與人紅細(xì)胞生成素EPO優(yōu)化序列的同源性比較。Query:天然人紅細(xì)胞生成素基因序列；SbjCt:優(yōu)化的人紅細(xì)胞生成素基因序列。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明人通過深入而廣泛的研究，通過優(yōu)化設(shè)計(jì)人紅細(xì)胞生成素基因編 碼序列，將優(yōu)化后的人紅細(xì)胞生成素編碼序列構(gòu)建入合適表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿 主細(xì)胞，獲得高表達(dá)菌株，并通過優(yōu)化發(fā)酵、純化工藝，實(shí)現(xiàn)了人紅細(xì)胞生 成素高效表達(dá)，并且表達(dá)出的人紅細(xì)胞生成素保持生物學(xué)活性。在此基礎(chǔ)上 完成了本發(fā)明。本發(fā)明根據(jù)人紅細(xì)胞生成素天然氨基酸序列，按密碼子偏愛性，在不改 變氨基酸序列的條件下，優(yōu)化其核苷酸序列，全基因合成經(jīng)優(yōu)化的重組人紅細(xì)胞生成素蛋白的目的基因序列，將該基因克隆到pPIC9k中測(cè)序驗(yàn)證后，用 分子克隆的常規(guī)方法，構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，通過氨基酸缺陷平板 和施加抗生素篩選出表達(dá)工程細(xì)胞。篩選獲得高表達(dá)工程細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)選用的是Pichia酵母GS115(His—， Mut+)菌株宿主細(xì)胞，通過施加
抗生素篩選出多拷貝轉(zhuǎn)化細(xì)胞，進(jìn)而篩選出高表達(dá)工程細(xì)胞。(2)優(yōu)化后的重組人紅細(xì)胞生成素蛋白基因非常適合在Pichia酵母 GS115(His—， Mut+)菌株宿主細(xì)胞中表達(dá)，具有高表達(dá)、高穩(wěn)定的特點(diǎn)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述木發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于 說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí) 驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè) (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例l表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和高表達(dá)工程菌株的獲得根據(jù)重組人紅細(xì)胞生成素天然氨基酸序列，按密碼子偏愛性，在不改變 氨基酸序列的條件下，全基因合成重組人紅細(xì)胞生成素蛋白的目的基因序 列，該優(yōu)化的人紅細(xì)胞生成素蛋白基因序列與天然的人紅細(xì)胞生成素蛋白基 因序列同源性為94% (見圖l)。將該基因克隆到Ppic9中并測(cè)序驗(yàn)證。表達(dá)載體構(gòu)建方法見圖2。通過PCR擴(kuò)增得到目的人紅細(xì)胞生成素蛋白基 因，用XAo I和feoW I雙酶切分別處理基因EP0的PCR回收產(chǎn)物和質(zhì)粒pPIC9， 酶切后回收相應(yīng)的片段用T4 DNA連接酶在16'C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸 桿菌DH5a ，在含有卡那霉素的LB平板上挑選抗性陽性的克隆，抽提質(zhì)粒DNA， 并進(jìn)行質(zhì)粒酶切鑒定。得到在pPIC9中插入了EP0基因的重組質(zhì)粒pPIC9/EP0。并將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒pPIC9/EP0轉(zhuǎn)化進(jìn)入Pichia酵母GS115(His—，Mut + )菌株感受態(tài)細(xì)胞，涂布組氨酸缺陷型MD平板，然后在轉(zhuǎn)化平板上挑取單克 隆，抽提基因組通過PCR進(jìn)行驗(yàn)證。將/pPIC9/EP0制作感受態(tài)，將pPIC9k/EP0質(zhì)粒轉(zhuǎn)入GS115/pPIC9/EP0菌 中，通過G418板篩選高拷貝的菌，并小搖菌，吸取上清，通過SDS-PAGE電泳 和western blot分析，將確證含有表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k/EP0并高表達(dá)EP0的單克 隆保存甘油菌。
實(shí)施例2重組人白細(xì)胞介素一4的表達(dá)及表達(dá)形式的確定挑選一株確證好的表達(dá)工程菌GS115/pPIC9/pPIC9k/EP0，用YDP培養(yǎng)基 進(jìn)行培養(yǎng)及用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，由于pPIC9及pPIC9k質(zhì)粒是分泌型的載體，因 此取上清做SDS-PAGE電泳檢測(cè)是否有目的條帶的出現(xiàn)，并分析其表達(dá)量。
序列表<110>上海新生源醫(yī)藥研究有限公司<120>人促紅細(xì)胞生長素的基因工程生產(chǎn)方法<160> 2<210> 1<211〉 561〈212〉 DNA〈213〉 人工序列<221> misc—feature <222>(25).. (586)<223〉優(yōu)化的重組人紅細(xì)胞生成素(rhEP0)基因 1 GAATTCCCAA GCTGGCTAGC CACCATGGAG ACAGACACAC TCCTGCTATG51 GGTACTGCTG CTCTGGGTTC CAGGTTCCAC TGGTGACGCT CCACCACGCC 101 TCATCTGTGA CAGCAGAGTC CTGGAGAGGT ACCTCCTGGA GGCTAAGGAG 151 GCTGAGAATA TCACGACGGG ATGTGCTGAA CACTGCAGCC TGAATGAGAA 201 TATCACTGTC CCAGACACCA AAGTTAATTT CTATGCTTGG AAGAGGATGG 251 AGGTCGGGCA GCAGGCTGTC GAAGTCTGGC AGGGACTGGC TCTGCTGTCT 301 GAAGCTGTCC TGCGGGGACA GGCTCTGCTG GTCAACTCTT CTCAGCCGTG 351 GGAGCCCCTG CAGCTGCATG TGGATAAAGC TGTCAGTGGA CTTCGCAGCC 401 TCACCACTCT GCTTCGGGCT CTGAGAGCTC AGAAGGAAGC TATCTCTCCT 451 CCAGATGCTG CTTCAGCTGC TCCACTCAGA ACAATCACTG CTGACACTTT 501 CCGCAAACTC TTCAGAGTCT ACTCTAATTT CCTCCGGGGA AAGCTGAAGC 551 TGTACACAGG GGAGGCTTGC AGGACAGGGG ACAGATGATA AGCGGCCGC<210> 2〈211> 187<212> PRT<213〉 智人〈400〉 2MET DTL IXW V1X UVV PGS TGD APP RLI CDS RVL ERY LLE AKE AEN ITT GCA EHC SLN ENI TVP DTK VNF YAW KRM EVG QQA VEV WQG LSE AVL RGQ ALL VNS SQP WEP LQL HVD KAV SGL RSL m LRA LRA QKE AIS PPD AAS AAP LRT ITA DTF肌FRV YSN FLR GKL KLY TGE ACR TGD R
權(quán)利要求
1.一種編碼重組人促紅細(xì)胞生長素的DNA序列，其特征在于，其編碼如SEQID NO2所示的氨基酸序列。較佳地，其序列如SEQ ID NO1所示。
2. —種表達(dá)載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA序列。較佳 地，所述的表達(dá)載體是pPIC9K/EP0。
3. —種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含,權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體或權(quán)利 要求1所述的編碼重組人促紅細(xì)胞生長素DNA序列。較佳地，所述的宿 主細(xì)胞是畢赤酵母。
4. 一種生產(chǎn)重組人促紅細(xì)胞生長素的方法，其特征在于，它包括步驟a) 在適合的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，從而 表達(dá)出重組人促紅細(xì)胞生長素蛋白；b) 分離純化出表達(dá)的重組人促紅細(xì)胞生長素蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組人促紅細(xì)胞生長素的編碼序列、生產(chǎn)該重組人促紅細(xì)胞生長素的方法，以及用于該方法的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。采用pPIC9和pPIC9k系統(tǒng)表達(dá)EPO，獲得了高水平的表達(dá)菌株；通過控制發(fā)酵條件，達(dá)到了較高蛋白表達(dá)率；在此基礎(chǔ)上對(duì)分泌表達(dá)的重組人促紅細(xì)胞生長素的純化進(jìn)行了大量的摸索和研究后，得到了一套重組人促紅細(xì)胞生長素純化方法。用本法，可得到高得率、高純度的重組人促紅細(xì)胞生長素蛋白，并能滿足臨床需要。本發(fā)明可高效、簡便、低成本地獲得重組人促紅細(xì)胞生長素純品。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101165184SQ20071016297
公開日2008年4月23日 申請(qǐng)日期2007年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月29日
發(fā)明者軍 任, 朱飛云, 黃陽濱 申請(qǐng)人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司