專(zhuān)利名稱(chēng)：人腫瘤壞死因子—α的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了一種高效生產(chǎn)重組人重組人腫瘤壞死因子一 a的方法，以及有關(guān)的重組人腫瘤壞死因子一 a的核苷酸 序列、工程細(xì)胞的構(gòu)建、重組人腫瘤壞死因子一a的表達(dá)和純化工藝。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor alpha, TNF-a )是一類(lèi)具有廣泛生 物學(xué)作用的細(xì)胞因子。它是由157個(gè)氨基酸殘基組成，SDS-PAGE分子量為17， 000道爾頓的蛋白質(zhì)。天然TNF-a主要由激活巨噬細(xì)胞和一些細(xì)胞系如HL-60、 U937等細(xì)胞所分泌。八十年代后許多實(shí)驗(yàn)室已成功地克隆了 TNF-a的基因，促 進(jìn)了 TNF- a分子結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，并為T(mén)NF- a應(yīng)用于臨床治療的研究提 供了充足的來(lái)源。TNF-a的主要生物學(xué)功能有1.抑瘤作用。大量實(shí)驗(yàn)研究和臨床I和II期應(yīng)用的資料初步證實(shí)了 TNF-a對(duì)某些腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒和抑制生長(zhǎng)的作用。但并不是對(duì)全部腫瘤細(xì)胞都具 有抑制效應(yīng)。例如人上皮癌細(xì)胞中三分之一是對(duì)TNF-a有明顯細(xì)胞毒反應(yīng)，另 外三分之一則表現(xiàn)為生長(zhǎng)受抑制，其余三分之一對(duì)TNF-a不敏感。在人白血病 細(xì)胞中對(duì)TNF-a反應(yīng)最敏感的是T淋巴系白血病細(xì)胞，其次為髓系和粒系白血 病細(xì)胞，對(duì)TNF-a敏感性最差的則是B淋巴系白血病細(xì)胞。 一些卵巢癌、乳腺 癌、骨髓瘤、肺癌、肝癌和成纖維細(xì)胞瘤等各類(lèi)腫瘤細(xì)胞中對(duì)TNF-a的敏感度 也有所差異。由此而知，TNF-a對(duì)腫瘤的抑瘤作用不是光譜的，而是有選擇性的。 2. TNF- a具有抑制病毒或?qū)Σ《靖腥镜募?xì)胞具有殺傷作用。TNF- a可產(chǎn)生劑 量依賴(lài)性的抑制病毒復(fù)制作用，它可抑制DNA類(lèi)病毒如腺病毒一2型(Ad-2)， 單純皰疹型病毒II型(HSV-2)等，還抑制RNA病毒如腦心肌炎病(EMCV)， 皰疹性口炎病毒(VSV)等。TNF-a還可以對(duì)病毒感染的細(xì)胞選擇性殺傷，這可 能是因?yàn)槭懿《靖腥竞蟮募?xì)胞對(duì)TNF- a敏感性增強(qiáng)。如TNF- a對(duì)EB病毒感染后 的B細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒作用。TNF-a還具有抑制牛百姓白血病病毒(BLV) 的作用。3. TNF-a對(duì)多核中性粒細(xì)胞有激活作用。TNF-a可以促進(jìn)多核中性粒細(xì)胞的 吞噬功能，同時(shí)使多核中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴(lài)補(bǔ)體細(xì)胞毒(ADCC)作用明顯 增強(qiáng)，致使對(duì)腫瘤細(xì)胞或者病毒感染細(xì)胞的殺傷效應(yīng)增強(qiáng)。4. TNF- a參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)。由于TNF- a本身是一類(lèi)具有廣泛生物學(xué)效應(yīng) 的細(xì)胞因子，它的產(chǎn)生和釋放及水平的變化直接或間接地影響著其它細(xì)胞因子和 效應(yīng)因子的狀態(tài)和功能。對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒或抑制作用的TNF-a劑量足以導(dǎo) 致GM—CSF、 IL一1、 IL-2和各類(lèi)激素及小分子炎癥物質(zhì)的分泌，從而引起一系 列復(fù)雜的連鎖生物學(xué)效應(yīng)。TNF- a在免疫系統(tǒng)中具有增強(qiáng)抗原誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的 作用，刺激T細(xì)胞克隆的生長(zhǎng)，增強(qiáng)HLA-DR抗原的表達(dá)，同時(shí)也可以是激活T 細(xì)胞表面IL-2受體表達(dá)水平增加。有人還認(rèn)為T(mén)NF-a與器官移植中的移植物抗 宿主病(GVHD)有著密切的關(guān)系，用抗TNF-a的抗體預(yù)防器官移植中的GVHD的 發(fā)生將有益的。在TNF- a的眾多生物學(xué)功能中，它的抑瘤作用倍受人們的關(guān)注。1984年,TNF 的cDNA克隆成功，其基因工程產(chǎn)品已試用于臨床。但一個(gè)突出的問(wèn)題是TNF-a 在體內(nèi)的半衰期短，低劑量注射抗瘤效果不顯著。要達(dá)到療效水平，需持續(xù)大劑 量注射，又遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了人的耐受劑量，這往往會(huì)引起發(fā)熱、寒戰(zhàn)、疲勞、頭痛、 休克等全身癥狀，臨床應(yīng)用效果不理想，因而限制了臨床上的廣泛應(yīng)用。為提高 TNF-a的抗腫瘤活性，消除或降低其毒副作用，盡快將TNF-a應(yīng)用于臨床，國(guó) 內(nèi)外科學(xué)家進(jìn)行了不懈的努力。目前制備新型TNF-a的研究， 一方面是在對(duì) hTNF2 a結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究基礎(chǔ)上，對(duì)TNF- a分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，獲得 TNF-cr的衍生物；另一方面是將TNF-a同另一個(gè)能與靶細(xì)胞專(zhuān)一性結(jié)合的蛋白
質(zhì)或肽融合，構(gòu)建融合蛋白，以增加其在靶細(xì)胞部位的濃度，從而起到增加療效、 減少毒副作用的效果。具有生物活性的TNF- a其空間結(jié)構(gòu)是3個(gè)TNF- a單體以邊對(duì)面形式形成的 近似三角錐形的三聚體，結(jié)構(gòu)與功能研究表明，刪去N端前7個(gè)氨基酸殘基不影 響TNF-a三聚體空間結(jié)構(gòu)。在刪去N端7個(gè)氨基酸殘基的同時(shí)增加N端的堿性 氨基酸，可以增強(qiáng)形成活性三聚體的能力，從而提高TNF-a的抗腫瘤活性。另 外，研究表明增加C端的疏水性氨基酸可以提高TNF- a的抗瘤活性?；赥NF- a 結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)TNF-a的N端、C端的結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行了各 種定點(diǎn)突變，并獲得了許多新型有效的TNF-a衍生物?；赥NF-a在體內(nèi)半衰期較短、穩(wěn)定性較差、對(duì)靶細(xì)胞的專(zhuān)一性不強(qiáng)等特 點(diǎn)，許多研究者將編碼TNF-a與具有靶細(xì)胞專(zhuān)一性的蛋白基因通過(guò)中間接頭或 柔性手臂連接成編碼單一蛋白質(zhì)的基因，構(gòu)建的融合蛋白表達(dá)載體并在大腸桿菌 中表達(dá)，活性檢測(cè)證實(shí)這些融合蛋白既具有TNF-a活性，又具有導(dǎo)向殺傷作用。本發(fā)明系統(tǒng)提供了一種高效生產(chǎn)重組人TNF-a的方法。通過(guò)優(yōu)化編碼重組 人TNF-a的核苷酸序列，采用糖基人源化改造的新型畢赤酵母表達(dá)體系分泌表 達(dá)人TNF-a，優(yōu)化表達(dá)載體/宿主菌組合，獲得高表達(dá)、高得率、極具產(chǎn)業(yè)化價(jià) 值的一種重組人TNF- a生產(chǎn)方法。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種高效和/或簡(jiǎn)便的生產(chǎn)重組人TNF- a的方法。本發(fā)明的另一目的就是提供重組人TNF-a蛋白的編碼序列和用于該方法 的表達(dá)載體及工程細(xì)胞。在本發(fā)明的第一方面，就是提供了一種優(yōu)化的編碼重組人TNF-a蛋白的核 苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列編碼SEQIDN0:2所示的氨基酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸序列含有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種表達(dá)載體，含有權(quán)利要求1所述的核苷酸 序列。在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是pPIC9K/TNF-a 。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種工程細(xì)胞，其特征在于，整合有權(quán)利要求 3所述的表達(dá)載體。在另一優(yōu)選例中，所述的工程細(xì)胞是經(jīng)過(guò)糖基人源化改造的畢赤酵母在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母宿主細(xì)胞的基因組中整合有2-30 拷貝的人TNF-a編碼序列。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)重組人TNF-a蛋白的方法，該方法 包括步驟在適合的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá) 出人TNF-a蛋白；較佳地，所述的宿主細(xì)胞是畢赤酵母。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的步驟的培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)分為培養(yǎng)階段和誘導(dǎo)階段，培養(yǎng)階段培養(yǎng)菌液濃度達(dá)到0D600為 40-200，誘導(dǎo)時(shí)間為24-100hr，發(fā)酵及誘導(dǎo)溫度保持在28_30°C，微量元素的量 為0. l-2ml/L，誘導(dǎo)期的pH值為3-9，誘導(dǎo)期甲醇濃度控制在0. 5-5%。


圖1. TNF-a理論序列與TNF-a優(yōu)化序列的同源性比較。Query:天然TNF-a基因序列；Sbjct:優(yōu)化的TNF-a基因序列。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明人通過(guò)深入而廣泛的研究，通過(guò)基因編碼序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)，將優(yōu)化 后的人TNF-a編碼序列(SEQ ID NO: 1)轉(zhuǎn)入經(jīng)糖基人源化改造的甲醇利用型畢 赤酵母(尸.pa"or&)，從而實(shí)現(xiàn)了人TNF- a高效分泌表達(dá)，并且表達(dá)出的人TNF-a保持很高的生物學(xué)活性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明根據(jù)人TNF-a天然氨基酸序列，按密碼子偏愛(ài)性，在不改變氨基酸 序列的條件下，全基因合成重組人TNF-a蛋白的目的基因序列，將該基因克隆 到pUC19中測(cè)序驗(yàn)證后，用分子克隆的常規(guī)方法，克隆入表達(dá)載體pPIC9K，轉(zhuǎn) 化、整合入尸.pa"or^宿主細(xì)胞染色體，通過(guò)施加抗生素篩選出多拷貝整合的 轉(zhuǎn)化細(xì)胞，進(jìn)而篩選出高表達(dá)工程細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，構(gòu)建了生產(chǎn)重組人TNF-a的尸.ps"or^酵母表達(dá) 工程細(xì)胞，甲醇誘導(dǎo)，高水平分泌表達(dá)，不需復(fù)性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1) 選用的是經(jīng)過(guò)糖基人源化改造的畢赤酵母宿主細(xì)胞，很好地保持了人 TNF-a的生物學(xué)活性。(2) 優(yōu)化后的重組人TNF-a蛋白基因非常適合在畢赤酵母中表達(dá)，具有高
表達(dá)、高穩(wěn)定的特點(diǎn)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō) 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商 所建議的條件。實(shí)施例1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和高表達(dá)工程菌株的獲得根據(jù)人TNF-a天然氨基酸序列，按密碼子偏愛(ài)性，在不改變氨基酸序列的 條件下，PCR擴(kuò)增得到重組人TNF-a蛋白的目的基因序列，PCR引物上引入經(jīng)優(yōu) 化的密碼子序列。通過(guò)PCR擴(kuò)增得到目的人干擾素e基因，用XhoI+EcoRI雙酶切(MBI， 2*Tango , 37°C) PCR產(chǎn)物及pPIC9質(zhì)粒(購(gòu)自Invitrogen公司)。將兩個(gè)片段用 T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5a (購(gòu)自Promega公司)， 在含有氨芐青霉素的LB平板上挑選克隆，小量制備質(zhì)粒，通過(guò)雙酶切/PCR鑒定 篩選出陽(yáng)性克隆，測(cè)序驗(yàn)證。大量擴(kuò)增確證的pPIC9/TNF-a質(zhì)粒，用BamH I + EcoR I (MBI， 2*Tango ， 37°C )雙酶切，回收小片段；質(zhì)粒pPIC9K(購(gòu)自Invitrogen 公司)用相同的酶處理，回收大片段。將兩個(gè)片段用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5a ，在含有氨芐青霉素的LB平板上挑選陽(yáng)性克 隆并進(jìn)行質(zhì)粒酶切鑒定，小量制備質(zhì)粒，通過(guò)雙酶切/PCR鑒定篩選出陽(yáng)性克隆。 獲得含有TNF- a的重組質(zhì)粒pPIC9K/ TNF- a 。表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/TNF-a經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，用Sal I酶切線性化，電穿孔法 轉(zhuǎn)化進(jìn)入畢赤酵母GS115(購(gòu)自Promega公司)，涂于MD平板上于3(TC培養(yǎng)至有 轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出，篩選高表達(dá)菌株。將pPIC9K/TNF-a質(zhì)粒(先測(cè)序驗(yàn)證)轉(zhuǎn)化已篩 選的高表達(dá)菌株，篩選G418抗性菌株。用點(diǎn)種法鑒定酵母轉(zhuǎn)化子的fNF- a抗性。 依次用含G418濃度為0.5、 1、 2、 3、 4 rag/mL的YPD平板篩選高抗性轉(zhuǎn)化子，
并進(jìn)行小搖表達(dá)篩選得到TNF- a高表達(dá)的工程酵母菌株。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn) 被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于木申請(qǐng) 所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表<110>上海新生源醫(yī)藥研究有限公司<120>人腫瘤壞死因子-a的生產(chǎn)方法<160> 2<210> 1<211> 456<212> DNA <213>人工序列<221> misc—feature<222>(1)…(456)<223>優(yōu)化的重組人TNF-a基因<400>atgagcaaaagaaagcctgtagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctccagtggctgaaccgccgggccaatgccctcc tggccaatggcgtggagctgagagataaccagctggtggtgccatcagagggcctgtacctcatctactcccaggtcctcttcaagggccagagcccctgccagagggagaccccagagggggctgaggccaagccctggtatgagcccatctatctgggaggggtcttccagctggaga agggtgaccgactcagcgctgagatcaatcggcccgactatctcgactttgccgagtctgggcaggtctactttggtatcattgccttctga<210> 2<211> 151<212> PRT <213>智人<400> 21MSKRKPVAHV VANPQAEGQL QWLNRRANAL LANGVELRDN 41 QLWPSEGLY LIYSQVLFKG QGCPSTHVLL THTISRIAVS 81 YQTKVNLLSA IKSPCQRETP EGAEAKPWYE PIYLGGVFQL 121 EKGDRLSAEI NRPDYLDFAE SGQVYFGIIA F.
權(quán)利要求
1. 一種高表達(dá)人腫瘤壞死因子—α蛋白的方法，其特征在于，它包括步驟(a)獲得優(yōu)化的腫瘤壞死因子—α的DNA序列；(b)構(gòu)建合適表達(dá)載體；(c)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，篩選獲得高表達(dá)的工程細(xì)胞。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟U)中所述的優(yōu)化的腫瘤壞死因子一a的DNA序列編碼如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，較佳地，其 為SEQ ID N0:1所示的DNA序列。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(a)中所述的優(yōu)化的腫瘤壞死因子一a的DNA序列被克隆入合適的表達(dá)載體。較佳地，步驟(b)中所 述的表達(dá)載體是pPIC9K/TNFa 。
4. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(c)中所述的工程細(xì)胞，含 有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體或權(quán)利要求2所述的編碼重組人腫瘤壞死因子一ci的DNA序列。較佳地，所述的工程細(xì)胞是畢赤酵母。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組人腫瘤壞死因子-α的核苷酸序列、高效生產(chǎn)重組人腫瘤壞死因子-α的生產(chǎn)方法，以及有關(guān)的工程細(xì)胞構(gòu)建、表達(dá)和純化的工藝。優(yōu)化后的重組人腫瘤壞死因子-α蛋白基因，非常適合在酵母中表達(dá)，同時(shí)通過(guò)發(fā)酵與純化工藝優(yōu)化，提高了產(chǎn)量，具有高表達(dá)、高穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明可高效、簡(jiǎn)便、低成本地獲得重組人腫瘤壞死因子-α純品。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101397560SQ20071016297
公開(kāi)日2009年4月1日 申請(qǐng)日期2007年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日
發(fā)明者軍 任, 朱飛云, 黃陽(yáng)濱 申請(qǐng)人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司