專利名稱：N-糖基化基因工程改造畢赤酵母的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了一種對畢赤酵母的 糖基化旁路進行基因工程改造的方法，包括有關(guān)的工程菌的構(gòu)建。
背景技術(shù)：
畢赤酵母表達系統(tǒng)引起了廣泛重視，并逐漸應(yīng)用于藥用蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。 但是，影響畢赤酵母表達系統(tǒng)在藥用蛋白質(zhì)領(lǐng)域的進一步廣泛應(yīng)用的主要限 制因素是畢赤酵母表達的糖蛋白質(zhì)的糖苷鏈的結(jié)構(gòu)與哺乳動物的不同，不能 用于人體。迄今為止，所有用于人體的基因重組糖蛋白都是用哺乳動物細胞或昆蟲 細胞表達的。由于這兩個系統(tǒng)本身的原因，使得重組糖蛋白藥物的產(chǎn)量受限， 價格昂貴。如果畢赤酵母表達的糖蛋白具有人的糖苷鏈結(jié)構(gòu)，將會有很大的 經(jīng)濟和社會意義。畢赤酵母的N —糖基化通路在起始階段與哺乳動物的相同，在 oligosaccharyltransf erase作用下使(Glc) 3- (Man) 9- (GlcNAc) 2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中 轉(zhuǎn)移到新合成的蛋白上，接著在glucosidase I和II以及a-1, 2-mannosidase 作用下，成為帶有Man8GlcNAc2的糖蛋白，此時糖蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入到早期高 爾基體。在哺乳動物中，Man8GlcNAc2糖苷降解成Man5GlcNAc2，然后在 (3-N-acetylglucosaminyltransferase I (GnTI)酶的作用下力口上GlcNAc，在 mannosidase 1I作用下除去2個甘露糖殘基，在GlcNAc transferase作用下加 上GlcNAc ， 在galactosyltransferase作用下加上半乳糖，在 sialyltransferase作用下唾液酸化。在酵母中，Man8GlcNAc2在 a—1， 6—mannosyltransf erase (Ochlp)白勺作用下^恭力口甘露、糖。a—1， 6—mannose 在mannosyltransferase禾口phosphomanosyltransferase作用下，繼續(xù)延長， 形成高甘露糖糖苷結(jié)構(gòu)。國外研究人員對畢赤酵母蛋白糖基化修飾途徑和人源化改造情況進行了 研究。認為首先要去除酵母內(nèi)源性糖基化反應(yīng)的機制，然后在酵母的內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 和高爾基體中導(dǎo)入人的糖基化反應(yīng)因子，可達到酵母人源化糖基改造的目的。
Choi等用同源重組的方法，將畢赤酵母的a 1，6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(0chlp)活 性的消除。將霉菌來源的a-1， 2-mannosidase C末端加上ER定位序列HDEL轉(zhuǎn)入 到該細胞株。接著構(gòu)建了三個文庫第一個由定位于酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體 的膜蛋白的N —端穿膜序列DNA的前導(dǎo)文庫；第二個為含人、鼠、霉菌、線蟲、 果蠅a-1，2-mannosidase催化區(qū)域DNA的文庫；第三個為含人、蛙、線蟲GnTI 催化區(qū)域DNA的文庫。第一個前導(dǎo)文庫如果與第二個或第三個聯(lián)合應(yīng)用時前導(dǎo) 結(jié)構(gòu)即與催化區(qū)域結(jié)合產(chǎn)生一個編碼嵌合蛋白的基因。作者以人纖溶酶原K3 片段為報告基因，用這三個文庫轉(zhuǎn)染上述基因改造過的細胞，進行聯(lián)合篩選， 得到釀酒酵母顧N9前導(dǎo)序列與人GnTI催化區(qū)域組成的嵌合蛋白可以在酵母內(nèi) 合成人源化糖苷鏈。以上研究表明，通過對酵母N-糖基化路徑進行基因工程改造，即可產(chǎn)生 出人源化寡糖修飾的重組蛋白。同時，對畢赤酵母用基因工程的方法進行改 造不影響細胞的存活。該技術(shù)可以廣泛應(yīng)用到藥用蛋白質(zhì)的生產(chǎn)及蛋白質(zhì)功 能的研究領(lǐng)域。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種對酵母N-糖基化路徑進行基因工程改造的方法。本發(fā)明的另一目的就是提供經(jīng)過糖基化基因工程改造，用于糖基化蛋白 表達的表達載體及工程菌株。在本發(fā)明的第一方面，就是提供了一種對畢赤酵母的糖基化旁路進行基因 工程改造的方法，其特征在于，其改構(gòu)后的細胞株表達的糖基鏈更短，和人 的糖基之間的同源性更高，且不會影響宿主菌的生存活性。在本發(fā)明的第二方面，就是提供了一種通過權(quán)利要求書2所述方案獲得的 酵母細胞株，其可以表達含有完整人源化糖苷鏈的糖蛋白。


圖l: M5/pPIC9/HCGP-oLHa的誘導(dǎo)后SDS-PAGE鑒定結(jié)果。1-3:1號克隆 依次48， 72， 96hr的電泳；4-6: 2號克隆依次48， 72， 96hr的電泳；7-9: 4 號克隆依次48， 72， 96hr的電泳圖2: M5/pPIC9/HCGP-oLHa酵母小搖上清的Western blot鑒定結(jié)果。M: Marker (97. 4KD， 66. 2KD， 42. 7 KD， 31. 0 KD， 20. 1 KD， 14. 4 KD) ; 1-3:分別
為l號克隆48h、 72h、 96h發(fā)酵上清的Western blot鑒定結(jié)果；4-6:分別為2 號克隆48h、 72h、 96h發(fā)酵上清的Western blot鑒定結(jié)果；7-9:分別為4號克 隆48h、 72h、 96h發(fā)酵上清的Western blot鑒定結(jié)果。
具體實施方式
本發(fā)明人通過深入而廣泛的研究，首先，根據(jù)GeneBank中的信息，設(shè)計 0CH1引物，用PCR方法，獲得畢赤酵母的0CH1序列，在OCHl序列ORF靠近5'端 引入2個終止子，重組到pPICZB質(zhì)粒中，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到GS115細胞內(nèi)，獲得0CH1 基因失活的重組子。用PCR方法，獲得T. reesei 1， 2-mannosidase序列和酵 母HDEL序列，并將此二序列按ORF保持不變的方式拼接后，重組到pGAPZaA質(zhì) 粒內(nèi)，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到上述重組子，獲得二級重組子M5。用PCR方法，從人細 胞中獲得GnTI序列，從釀酒酵母中獲得a-mannosyltransferase Kre2p序列， 將Kre2p的N-端穿膜序列與GnTI催化區(qū)域序列拼接后裝入到pPIC9中，再轉(zhuǎn)染 M5，獲得糖基人源化的畢赤酵母細胞株，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。在本發(fā)明的一個實例中，獲得了糖基人源化的畢赤酵母細胞株。在本發(fā)明的另一個實例中，構(gòu)建并鑒定了工程菌M5/pPIC9/hCGP-oLHa ， Western blot鑒定證明蛋白降解現(xiàn)象較少。本發(fā)明的優(yōu)點在于(1) 將pichia pastoris (畢赤酵母)的糖基化旁路進行基因工 程改造，獲得改構(gòu)后的細胞株M5，改構(gòu)后的細胞株表達的糖 基鏈更短，和人的糖基之間的同源性更高，而且不會影響宿 主菌的生存活性。因此更有利于表達用于治療的蛋白。(2) 將畢赤酵母M5用于蛋白表達，由于糖基較短，因此不僅可以 使蛋白在SDS-PAGE電泳上的條帶比較清晰，而且使純化更易 于進行。由于畢赤酵母M5的糖基經(jīng)過改構(gòu)，該菌的糖基為酵 母和人共有的基礎(chǔ)糖苷鏈，因此純化后用于人體可能引起的 潛在免疫反應(yīng)會減弱，更有利于臨床應(yīng)用。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于 說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實 驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按 照制造廠商所建議的條件。
實施例l改構(gòu)細胞株的獲得首先，根據(jù)Gene Bank中的信息，設(shè)計0CH1引物，用PCR方法，獲得畢赤 酵母的0CH1序列，在0CH1序列0RF靠近5'端引入2個終止子，重組到pPICZB質(zhì) 粒中，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到GS115細胞內(nèi)，獲得0CH1基因失活的重組子。用PCR方法， 獲得T. reesei 1， 2-mannosidase序列和酵母HDEL序列，并將此二序列按ORF 保持不變的方式拼接后，重組到pGAPZaA質(zhì)粒內(nèi)，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到上述重組 子，獲得二級重組子M5。用PCR方法，從人細胞中獲得GnTI序列，從釀酒酵母 中獲得a-mannosyltransferase Kre2p序列，將Kre2p的N-端穿膜序列與GnTI 催化區(qū)域序列拼接后裝入到pPIC9中，再轉(zhuǎn)染M5，獲得糖基人源化的畢赤酵母 細胞株。實施例2工程菌M5/pPIC9/hCGP -oLHa的構(gòu)建和鑒定首先構(gòu)建pPIC9/HCGP -oLHa質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)M5感受態(tài)得到的M5/pPIC9/HCGP -oLHa，選擇表達量較高的克隆株作為宿主菌制備感受態(tài)細胞，再把構(gòu)建好 的pPIC9K/HCG P -oLH a質(zhì)粒轉(zhuǎn)入M5/pPIC9/HCG P -oLH a中，通過G418篩選含 有pPIC9K/HCG P -oLH a質(zhì)粒的高拷貝工程菌M5/pPIC9/HCG e -oLH a /pPIC9K/HCGP -oLHa 。由于GS115的糖基化很復(fù)雜，導(dǎo)致SDS-PAGE電泳的HCG電泳的條帶很模 糊，不能確定其條帶大小。而改構(gòu)的M5菌.糖基鏈比較短，因此在SDS-PAGE電泳上表現(xiàn)為一條比較單 一的帶，也能為下游的蛋白純化帶來方便(見說明書附圖l， 2)。由圖l，圖2顯示在1、 2、 4號克隆的72h、 96h發(fā)酵上清的Westernblot鑒 定中，在43KD附近有一條很明顯的條帶，蛋白降解現(xiàn)象較少。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文 獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣 落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>上海新生源醫(yī)藥研究有限公司<120> N-糖基化基因工程改造畢赤酵母<160> 5〈210〉 1〈211〉 1134<212> 醒<213> 畢赤氏酵母(Pichia stipitis)<221> CDS〈222> (1). (1134)〈223〉 0CH1基因序列〈400〉 11atgatt肌ca卿gggtgaggtt郷3ttgatagcagtgct￡Lgtcttgta_tttattgtac61ggctttttccgcacgttttccgtgccgggatcgtcacacagaacagaMcttcttcttct121aagttgcaatactcgagatacattccaattgggcta卿ctggactcaat181ttccagcccaac3肌aaggc朋gattacctctgtg3gax3gcaattatca241tttcagttcccatacgagtcg3gt犯gCCtatatctggcagacatggaaa301gtcgctttsgatgatgattcgtttccattgctt3cca^gt3Cttggg3t361gacaagaatcgtggc,tgatgtgtgcgaagagttgalc4213gCC3gttgtatctgacagttcctgacgttgctagagcttacaatatcatgcccaag兆c4813tCttg33ggccgacttcttcagatacctacc卿gg叫g(shù)541C3gt3ggtttg肌gCCg3t3gat卿tgggcactactttg601tacgacaaacCC3tC33CCCtggcttggttgtggg肌tcgaagctgacccagatagaccc661gactgggctg敏ggtacgccagacgtattcagttctgcctcaagccaaa721aaaggacatccaatgttgcgtgaattgatcgctgagatc3caga肌agactcttacaaga781gacagttg肌犯ggaggtgatatcatgaac841tggactggtcC3ggtalttggaccgalgccatttttaactacatgaacaacgttcttcaa901tcacccgaaaacttccagaatcacctggaagatcttcaca961ggcatgg咖tggccatagctatcgacgatgtattggttcttccaatcacttcgttcagt1021cccgatgtgggcca組gggagccaagaacatgaatgatccgatggcatacgctaagcat1081algtttctgggtagttgg肌acatgacgagatcacg犯accaaatgttaatt兆<210> 2〈211> 1572〈212〉 CDS<213〉 里氏木霉(Hypocrea jecorina)<223> T. reesei 1， 2-mannosidase基因序列<400> 2
atgagattccctagcagctccgtccttgcc61cc肌agccgggcgccacaaaacgtggatct121gccgcattcc卿cgtcgtg181cacccggtcagcaacagctttg￡ltg3tg3g241ggcttgg織cggctatcctC3tggggg3t301gtaccgcagatcaacttcaccacgactgcg361accaacattcggtacctcggtggcctgctt421agctccttgggaccctggta481gccaacggcctcaaggttgcgttcaxxact541ttcaaccctactgtccggag肌gtggtgca601ctggtgctcg兆tgg3C3Cggttgagcgac661gcgc卿sgggcgagtcgtatctcctgaat721ctgattggaacgtttgtc兆cacgagcaac781tccggcctcatggacagcttcta_cg3gta_c841gcgtttgcacactacaaggatcgctgggtc901ggctctcaccCgtCg3CgCgcaBggax:ttg961acgtcgccaaactcaggacatttggccagt1021attctcctgaacgagcaaaagtacattgac1081ggcacgtacacccagacggcttctggaatc1141gtgscgggcgccggcggctcgccgccctcg1201ttctgggtgscggcaccgtattacatcctg1261gcataccgcgtcacgggcgactccaagtgg1321attgagg3cgcatgccgcgccggcagcgcg1381肌cggcgggggtgcctctga1441gcgtacctgatctttgcggaggagtcggat1501tttgtcttta3C3Cgg郷Cgcaccccttt1561caccttgcttctcgggctca tcggacctgc gctggcgtat cccaacccta cgagggcggc agcagtcaag caccattttg cctttcccca tgacgacctc agaaacggct ggggctcgtc ggcaatcgat gccgacattg tgaacacgat ccttcagtat gttgccaacc aaggatcctc cgtgttcgag tctgcctatg acctgttgcg aggtcctttc aacagccttc tgaggcaggc tcaaacactg cccagcggtg tcccggaccc taccgtcttc tctagcaaca acgtcgctget aattggaagc ctgacgggaa acccgcagta tgcccagctt ccaaagggaa gcccggaggc atggcctggc ggtacctttc aggatagcag cggcagctgg ctgatcaaga tgtacctgta cgacccggtt cttggtgccg actcgaccat tgggcatctc acctttttgt cttcgtecaa cggacagtct tttggcggtg gcaacttcat cttgggaggc tttggaatca agcttgccag ctcgtacttt ggccccgaag gcttcgcgtg ggtggacagc tcccagtccg ggttctactc gtcggcagga cggccggaga cgctggagag cttgtactac caggacctgg cgtggg卿c gttgagtgcc tactcgtcca tcaacgacgt gacgcaggcc agcttctggt ttgccgaggc gctcaagtat gtgcaggtgc aggccaccgg cgggaacaaa agcatxcgtt catcatcacg acggggcggc〈210〉 3<211〉 12〈212〉 CDS〈213〉 酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)〈223〉 HDEL編碼序列〈400〉 31 esc gsc gsg ttg 12<210〉 4〈211〉 1338〈212〉 CDS〈213〉 智人(Homo sapiens)<223〉 GnTI基因序列〈400〉 4<formula>formula see original document page 9</formula>
961 agaagtgaga aatacattag atttttcgag tacttggatt caaagggcgg tttttactat 1021 gaaaggtggg gagatgcacc agttcattcg attgctgcct cacttctttt gaaaaaagac 1081 gaaatcatcc attttgatga attaggctat aagcatatgc cttttggcac gtgtccatct 1141 gcatactacc tgagacttca acaaagatgt ctttgtgata gcaatcaccc agacaatatt1201 gatctcaatg tcatcagctg cctgagemga tggtggaagg acggcagcgg taaatacttc1261 c"tcaaacacg attcatag
權(quán)利要求
1. 一種對畢赤酵母的糖基化旁路進行基因工程改造的方法，其特征在于，它包括步驟a. 設(shè)計OCH1引物，用PCR方法，獲得畢赤酵母的OCH1基因序列，在OCH1序列ORF靠近5’端引入2個終止子，重組到pPICZB質(zhì)粒中，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到GS115細胞內(nèi)，獲得OCH1基因失活的重組子。b. 用PCR方法，獲得T.reesei 1，2-mannosidase的基因序列和酵母HDEL基因序列，并將此二序列按開放閱讀框保持不變的方式拼接后，重組到pGAPZαA質(zhì)粒內(nèi)，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到上述重組子，獲得二級重組子M5。c. 用PCR方法，從人細胞中獲得GnTI序列，從釀酒酵母中獲得α-mannosyltransferase Kre2p序列，將Kre2p的N-端穿膜序列與GnTI催化區(qū)域序列拼接后裝入到pPIC9中，再轉(zhuǎn)染畢赤酵母細胞株。
2. 如權(quán)利要求l所述的對畢赤酵母的糖基化旁路進行基因工程改造的方法，其特 征在于，步驟(a)中所述的0CH1基因為SEQ ID NO: 1所示的DNA序列。
3. 如權(quán)利要求l所述的對畢赤酵母的糖基化旁路進行基因工程改造的方法，其 特征在于，步驟(b)中所述的T. reesei 1, 2-ma皿osidase基因為SEQ IDN0:2所示的 DNA序列。
4. 如權(quán)利要求l所述的對畢赤酵母的糖基化旁路進行基因工程改造的方法，其 特征在于，步驟(b)中所述的HDEL基因為SEQ ID NO:3所示的DNA序列。
5. 如權(quán)利要求l所述的對畢赤酵母的糖基化旁路進行基因工程改造的方法，其 特征在于，步驟(c)中所述的GnTI基因為SEQ ID NO:4所示的DNA序列。
6. 如權(quán)利要求l所述的對畢赤酵母的糖基化旁路進行基因工程改造的方法，其 特征在于，步驟(c)中所述的oc-mannosyltransferase Kre2p基因為SEQ ID N0:5所 示的DNA序列。 .
全文摘要
本發(fā)明提供了一種將畢赤酵母的糖基化旁路進行基因工程改造的方法，除去酵母本身的糖基化旁路，同時將人源化糖基通路的基因?qū)氲皆摷毎?，使其表達的糖蛋白具有哺乳動物細胞來源的特性，可直接用于人體。本發(fā)明可高效、簡便、低成本地獲得能表達完整人源化糖苷鏈的酵母細胞株，對一些具有潛在臨床價值的糖蛋白進行表達和純化的研究以及產(chǎn)業(yè)化研究。
文檔編號C12N1/19GK101397561SQ20071016297
公開日2009年4月1日 申請日期2007年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日
發(fā)明者軍 任, 孫九如, 翊 張, 梁光軍, 娟 王, 黃陽濱 申請人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司