專(zhuān)利名稱(chēng)：：鱗翅目轉(zhuǎn)座子基因tpa及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于昆蟲(chóng)基因工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)涉及鱗翅目害蟲(chóng)轉(zhuǎn)座子(transposase，tpa)基因片段分離，還涉及tpa基因在鱗翅目害蟲(chóng)抗藥性檢測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：鱗翅目害蟲(chóng)危害后常造成茶葉減產(chǎn)和品質(zhì)下降，因此它們是主要茶園蟲(chóng)害防治對(duì)象，而擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)是普遍應(yīng)用于防治鱗翅目害蟲(chóng)的農(nóng)藥種類(lèi)。但是由于多年連續(xù)使用，鱗翅目害蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥耐受性越來(lái)越強(qiáng)，部分甚至出現(xiàn)了抗藥性。害蟲(chóng)的農(nóng)藥抗性評(píng)價(jià)指標(biāo)尚不明確，害蟲(chóng)抗藥性遺傳機(jī)制也有待研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種鱗翅目轉(zhuǎn)座子基因片段tpa，該基因片段tpa可用于評(píng)價(jià)和測(cè)定鱗翅目害蟲(chóng)對(duì)農(nóng)藥的抗藥性。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種鱗翅目轉(zhuǎn)座子基因片段tpa，其具有SEQIDNo:l所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了上述基因片段tpa的用途，用于評(píng)價(jià)和測(cè)定鱗翅目害蟲(chóng)對(duì)農(nóng)藥的抗藥性。作為本發(fā)明的基因片段tpa的用途的改進(jìn)農(nóng)藥為擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥。本發(fā)明主要針對(duì)生產(chǎn)中鱗翅目茶樹(shù)害蟲(chóng)的抗藥性問(wèn)題，通過(guò)分子生物學(xué)手段分析鱗翅目害蟲(chóng)抗藥性原因，并提出鱗翅目害蟲(chóng)抗藥性程度檢測(cè)新技術(shù)。本發(fā)明是采用cDNA-AFLP技術(shù)分離與鱗翅目害蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)抗藥性有關(guān)的基因；并提供了鱗翅目害蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)移有關(guān)的轉(zhuǎn)座酶tps3，端基因序列，具體如SEQIDNo:l所示。本發(fā)明還提供了該基因在具有不同抗藥性的茶樹(shù)鱗翅目中的表達(dá)，證明該基因表達(dá)對(duì)鱗翅目抗藥性表現(xiàn)有非常重要的影響，該基因可能通過(guò)其轉(zhuǎn)座行為影響其下游結(jié)構(gòu)基因活性，從而影響害蟲(chóng)的抗藥性。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下一、茶樹(shù)鱗翅目害蟲(chóng)tap基因片段分離和分析取對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯有不同抗性的茶尺蠖幼蟲(chóng)各若干頭，適當(dāng)稀釋后進(jìn)行噴霧。0.2-6小時(shí)之內(nèi)，在不同抗藥性群體中各選取2-3頭幼蟲(chóng)。上述幼蟲(chóng)樣品分別置于不同研缽中液氮研磨，以TRIZOL(Invitrogen公司)試劑提取總RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司)分離mRNA。分別取l-5|igmRNA進(jìn)行cDNA合成，雙鏈cDNA合成采用TakaRaMMLVRTasecDNASynthesisKit(寶生物工程[大連]有限公司)進(jìn)行。雙鏈cDNA經(jīng)異丙醇沉淀純化后，以TakaRaBamHI/HhaI(寶生物工程[大連]有限公司)組合酶切消化。消化后的片段與事先設(shè)計(jì)的2個(gè)接頭SEQIDNo:2禾HSEQIDNo:3，以T4DNA連接酶(上海生工生物工程有限公司)連接。以連接完成的cDNA片段為模板，以預(yù)擴(kuò)增引物SEQIDNo:4和SEQIDNo:5進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，PCR程序如表第1列所示，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物適當(dāng)稀釋后，以選擇性擴(kuò)增引物組合SEQIDNo:6和SEQIDNo:7，以及SEQIDNo:8禾nSEQIDNo:9，分別進(jìn)行PCR選擇性擴(kuò)增，PCR程序如表第2列所示。擴(kuò)增產(chǎn)物以6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分析，以核酸銀染試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行顯帶。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>注本發(fā)明中未做特別說(shuō)明的PCR或PCR擴(kuò)增均指PCR常規(guī)擴(kuò)增從凝膠上割取與脅迫規(guī)律相吻合的差異條帶，即抗藥性強(qiáng)條帶也強(qiáng)，以純水浸提過(guò)夜后，取適量浸提液作為模板，以選擇性引物組合進(jìn)行PCR，產(chǎn)物進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后割取目標(biāo)條帶，以UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行片段回收，并插入pUCm-T載體(上海生工生物工程有限公司)，陽(yáng)性克隆委托Invitrogen公司進(jìn)行序列分析，確定了其中一個(gè)436bp的顯著差異序列與茶尺蠖抗藥性有關(guān)，其核苷酸順序見(jiàn)SEQIDNo:1，經(jīng)與美國(guó)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov比對(duì)，證實(shí)該序列與家蠶等Bmmar轉(zhuǎn)座子具有80%左右的同源性。因此定名為茶尺蠖tpa。二、茶樹(shù)鱗翅目害蟲(chóng)tpa基因表達(dá)與抗藥性的關(guān)系取對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯有不同抗性的鱗翅目幼蟲(chóng)2-3種，將農(nóng)藥適當(dāng)稀釋后進(jìn)行噴霧。0.2-6小時(shí)后，在非抗群體幼蟲(chóng)中選取出現(xiàn)明顯中毒癥狀的1-2頭，同時(shí)在抗性群體中選取1-2頭表現(xiàn)正常的幼蟲(chóng)。以TRIZOL(Invitrogen公司)法提取RNA，以MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工生物工程有限公司)合成cDNA。采用引物SEQIDNo:10(由于本發(fā)明的tpa基因中具有反向重復(fù)序列，以該重復(fù)序列作為引物時(shí)，只需1條引物，該引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為434bp)進(jìn)行PCR。結(jié)果顯示，對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯敏感的鱗翅目害蟲(chóng)，經(jīng)過(guò)殺蟲(chóng)劑處理后中毒癥狀明顯，同時(shí)tpa不表達(dá)或者表達(dá)很弱；而抗藥性茶尺蠖幼蟲(chóng)在噴施殺蟲(chóng)劑后并不表現(xiàn)出中毒癥狀，而且tpa基因表達(dá)比較強(qiáng)烈。說(shuō)明tpa基因的表達(dá)與鱗翅目害蟲(chóng)的抗藥性有很強(qiáng)的相關(guān)性。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖1是實(shí)施例1中的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析后，以核酸銀染試劑盒進(jìn)行顯帶所得的圖；注M為DNA分子量標(biāo)記，l為非抗藥性茶尺蠖幼蟲(chóng)，2為中等抗藥性茶尺蠖幼蟲(chóng)，3為強(qiáng)抗藥性茶尺蠖幼蟲(chóng)；圖2是實(shí)施例2中，不同抗藥性的害蟲(chóng)經(jīng)農(nóng)藥處理后的tpa基因表達(dá)差異圖；注M為分子量標(biāo)記，l為抗性茶尺蠖幼蟲(chóng)，2為敏感型茶尺蠖幼蟲(chóng)，3為抗藥性茶毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)，4為敏感型茶毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)。具體實(shí)施方式實(shí)施例1取對(duì)功夫菊酯有中等抗性和強(qiáng)抗藥性的3齡茶尺蠖幼蟲(chóng)各30頭，另取無(wú)抗藥性的3齡茶尺蠖30頭，分別飼養(yǎng)在3個(gè)2L的燒杯中，正常飼喂茶葉新梢(5-8個(gè)/杯)后，將市售濃度為2.5%的功夫菊酯乳劑以水稀釋5000倍后進(jìn)行噴霧處理。于噴藥后20分鐘，在不同抗藥性幼蟲(chóng)中各選取2-3頭幼蟲(chóng)。上述幼蟲(chóng)樣品分別置于不同研缽中液氮研磨，以TRIZOL(Invi加gen公司)試劑提取總RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司)分離mRNA。分別取l嗎mRNA進(jìn)行cDNA合成，雙鏈cDNA合成采用TakaRaMMLVRTasecDNASynthesisKit(寶生物工程[大連]有限公司)進(jìn)行。雙鏈cDNA經(jīng)異丙醇沉淀純化后，以TakaRaBamHI/HhaI(寶生物工程[大連]有限公司)組合酶切消化。消化后的片段與事先設(shè)計(jì)的2個(gè)接頭SEQIDNo:2禾QSEQIDNo:3，以T4DNA連接酶(上海生工生物工程有限公司)連接。以連接完成的cDNA片段為模板，以預(yù)擴(kuò)增引物SEQIDNo:4禾卩SEQIDNo:5進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋15倍后，以選擇性擴(kuò)增引物組合SEQIDNo:6和SEQIDNo:7進(jìn)行PCR選擇性擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物以6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分析，以核酸銀染試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行顯帶，結(jié)果見(jiàn)圖1。由于抗性強(qiáng)的個(gè)體在較高農(nóng)藥劑量時(shí)，仍能正常生長(zhǎng)，說(shuō)明抗性個(gè)體在某些基因表達(dá)上存在強(qiáng)勢(shì)，即條帶選擇的標(biāo)準(zhǔn)是隨著個(gè)體抗性增強(qiáng)而條帶亮度增加的條帶。從凝膠上割取與脅迫規(guī)律相吻合的差異條帶，以純水浸提過(guò)夜后，取3PL浸提液作為模板，以選擇性引物組合SEQIDNo:6和SEQIDNo:7進(jìn)行PCR，產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。電泳結(jié)束后割取與篩選條帶大小一致的目標(biāo)條帶，以UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進(jìn)行片段回收，并插入pUCm-T載體(上海生工生物工程有限公司)，陽(yáng)性克隆委托Iiwitrogen公司進(jìn)行序列分析，獲得了其中一個(gè)445bp的產(chǎn)物，其核苷酸順序見(jiàn)SEQIDNo:1。該序列隨著個(gè)體抗藥性增強(qiáng)，其表達(dá)強(qiáng)度增加，即該序列與茶尺蠖抗藥性相關(guān)。經(jīng)與美國(guó)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)http:/Avww.ncbi.nlm.nih.gov比對(duì)，證實(shí)該序列與家蠶等Bmmar轉(zhuǎn)座子具有80。/。左右的同源性。定名為茶尺蠖tpa。進(jìn)一步分析顯示，該序列中包含有多個(gè)重復(fù)單元，具體的說(shuō)包含一個(gè)具有20bp的反向重復(fù)序列"5，-GTCGCCTTTTGCAGCCAATG"，以及多個(gè)5-7bp的重復(fù)單元"5，-TCAAACT"，"5，-TAATAT"，"5，-TTTAAA"，"5，-AAGTT"禾卩"5，-ATTTA"。這些重復(fù)與該基因的功能有關(guān)。因?yàn)橐延械难芯坷ハx(chóng)以及其它生物轉(zhuǎn)座子基因的3'端常具有多個(gè)長(zhǎng)短不等重復(fù)序列，這些重復(fù)單元與轉(zhuǎn)座識(shí)別和轉(zhuǎn)座行為有密切的關(guān)系。從這一點(diǎn)可以證明，本發(fā)明分離到的是茶尺蠖轉(zhuǎn)座子基因的3'端序列。實(shí)施例2取對(duì)功夫菊酯有不同抗性的茶尺蠖和茶毛蟲(chóng)3齡幼蟲(chóng)各40頭，每種害蟲(chóng)按照抗藥性不同分成2組，即敏感組和抗藥組。將市售濃度2.5%功夫菊酯乳劑用水稀釋10000倍后進(jìn)行噴霧。2小時(shí)后，在敏感和抗性組中各選取1-2頭幼蟲(chóng)用于tpa表達(dá)研究。以TRIZOL(Invitrogen公司)法提取RNA，以MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工生物工程有限公司)合成cDNA。以liaLcDNA為模板，采用引物SEQIDNo:10(由于目標(biāo)序列為反向重復(fù)序列，所以只需1條引物，產(chǎn)物長(zhǎng)度為434bp)進(jìn)行PCR。PCR結(jié)束后以1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行恒壓電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行照相，如圖2。從圖2中可以看出，對(duì)功夫菊酯敏感的茶尺蠖和茶毛蟲(chóng)在殺蟲(chóng)劑處理后出現(xiàn)明顯中毒癥狀，同時(shí)tpa表達(dá)量非常低，條帶吸光度幾乎為0;而對(duì)殺蟲(chóng)劑具有抗性的茶尺蠖和茶毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)，農(nóng)藥處理后不表現(xiàn)出中毒癥狀，tpa基因表達(dá)強(qiáng)烈，條帶吸光度超過(guò)0.90-0.95。說(shuō)明tpa基因活躍表達(dá)與鱗翅目害蟲(chóng)的抗藥性增強(qiáng)是相關(guān)的。因此，我們可以得知將擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥經(jīng)稀釋5000-10000倍后，按照等同于實(shí)施例2的方法處理后；tpa條帶強(qiáng)度為>=0.5的為抗藥性害蟲(chóng)，且該值越大，表明抗性越強(qiáng)；tpa條帶強(qiáng)度0.5的為對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥敏感的害蟲(chóng)。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表SEQIDNo:1cgtacgttgtcgccttttgcagccaatggaaattgttatat已tttatgtatgtsctaaacagtagataaaaaaaatgttttttctatattaaactggaccagtaagatattagtggccagtgctgttggcttgtaatattttaaatgcgattgctcaatcacgtcggaacgtctgaacgggtctatgtgttccaaacttc犯ttaatctaatcattggctgcaaaaggcgacgcg445gaccacctcgaataagctttacatactttt60t3已a(bǔ)agt^tt犯tgttttei120acaatat11atggc犯gactttatttactc180gcgcatgttacettcctacta240朋gtttgaatgtt已g3tgtttggttgtttg300attgggttgaaatttggaacacatacctgc360atttatagtctggaataacacagacttttc420SEQIDNo:2(BamHI接頭)SEQIDNo:3(Hhal接頭)5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3'3'-CATCTGACGCATGGCATG-5'5-CGATGAG丁CCTGAGCG-3'3'-TACGCTACTCAGGACTC-5'SEQIDNo:4(預(yù)擴(kuò)增上游引物)5'-GTAGACTGCGTACCGATCC-3，SEQIDNo:5(預(yù)擴(kuò)增下游引物)5，-GATGAGTCCTGAGCGC-3，SEQIDNo:6(選擇性擴(kuò)增上游引物)5，-GACTGCGTACCGATCCAC-3'SEQIDNo:7(選擇性擴(kuò)增下游引物)5，-GATGAGTCCTGACGCGCGG-3，SEQIDNo:8(選擇性擴(kuò)增上游引物)5，-GACTGCGTACCGATCCAT-3，SEQIDNo:9(選擇性擴(kuò)增下游引物)5'-GATGAGTCCTGACGCGCGT-3，SEQIDNo:10(基因特異性引物)5，-GTCGCCTTTTGCAGCCAATG-3，權(quán)利要求1、一種鱗翅目轉(zhuǎn)座子基因片段tpa，其特征是具有SEQIDNo1所示的核苷酸序列。2、如權(quán)利要求l所述的基因片段tpa的用途，其特征是用于評(píng)價(jià)和測(cè)定鱗翅目害蟲(chóng)對(duì)農(nóng)藥的抗藥性。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因片段tpa的用途，其特征是所述農(nóng)藥為擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種鱗翅目轉(zhuǎn)座子基因片段tpa，其具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還公開(kāi)了上述基因片段tpa的用途用于評(píng)價(jià)和測(cè)定鱗翅目害蟲(chóng)對(duì)農(nóng)藥的抗藥性。文檔編號(hào)C12N15/12GK101210245SQ200710164809公開(kāi)日2008年7月2日申請(qǐng)日期2007年12月24日優(yōu)先權(quán)日2007年12月24日發(fā)明者晨林,梁月榮,董俊杰,董占波,鄭新強(qiáng),陸建良申請(qǐng)人:浙江大學(xué)