專利名稱：一種重組桿狀病毒載體骨架質(zhì)粒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組桿狀病毒載體骨架質(zhì)粒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
桿狀病毒載體是目前應(yīng)用十分廣泛的病毒載體之一，廣泛應(yīng)用于基因治療、基因功能研 究、疫苗開發(fā)等領(lǐng)域。桿狀病毒是昆蟲病毒中最大的一個(gè)科，其宿主范圍主要集中在昆蟲綱 鱗翅目。目前，用于外源基因表達(dá)的昆蟲桿狀病毒僅限于核多角體病毒屬，其中苜蓿銀紋蛾 多粒包埋體核多角型病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrosis virus, AcMNPV) 和草地貪夜蛾細(xì)胞系統(tǒng)是國(guó)際上普遍采用的桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)研究模型。1983年Smith 等首次報(bào)道利用AcMNPV在草地貪夜蛾細(xì)胞成功地表達(dá)了人P-2干擾素，1993年Luckow 等成功的將桿狀病毒體統(tǒng)改造成bac-to-bac系統(tǒng)(Luckowetal， 1993)，主要用于在昆蟲細(xì)胞 中大量表達(dá)外源基因。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)作為一種真核表達(dá)系統(tǒng)，在外源基因表達(dá)方面具有 糖基化、磷酸化和蛋白切割加工修飾過(guò)程，表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)特性與天然產(chǎn)物相似，且表達(dá) 效率高，據(jù)報(bào)道，在感染細(xì)胞中重組蛋白的表達(dá)水平最高可達(dá)到細(xì)胞總蛋白的50% (Luckow and Summers, 1989)。長(zhǎng)期以來(lái)，由于其宿主特異性，這種高表達(dá)的載體僅限用于介導(dǎo)外源基因在其受納昆蟲細(xì) 胞內(nèi)表達(dá)。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，桿狀病毒可進(jìn)入某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞，但其進(jìn)入細(xì)胞后并不發(fā) 生復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄。因此在桿狀病毒載體中引入可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中作用的啟動(dòng)子如RSV、 CMV等，可通過(guò)桿狀病毒將外源基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。1995年,Hofmann等首 次報(bào)道了將由巨細(xì)胞病毒極早期啟動(dòng)子(CMV-IE)驅(qū)動(dòng)的螢光素酶基因重組至AcMNPV基因 組，并用此重組AcMNPV感染幾種不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，結(jié)果表明此重組AcMNPV能感染 原代人肝細(xì)胞且高效地表達(dá)了報(bào)告基因，其介導(dǎo)的報(bào)告基因的表達(dá)效率高于用磷酸鈣沉淀法 和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。目前以桿狀病毒作為載體，利用不同啟動(dòng)子己經(jīng)實(shí)現(xiàn)了不同物種，不同組 織來(lái)源的很多細(xì)胞系的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)。桿狀病毒成為繼脂質(zhì)體、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒 等傳統(tǒng)方法外又一個(gè)對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的工具。構(gòu)建桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)有多種方法，主要包括NPV DNA線性化技術(shù)，bac-to-bac表達(dá)系 統(tǒng)，酵母內(nèi)重組法，桿狀病毒-S2系統(tǒng)等，其中由GIBCO公司開發(fā)的bac-to-bac表達(dá)系統(tǒng)是 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的桿狀病毒重組系統(tǒng)，它是目前應(yīng)用最為廣泛的桿狀病毒重組系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要 由供體質(zhì)粒pFastBac和原核細(xì)胞(DH10Bac)組成。在DH10Bac中含有被修飾的AcMNPV 被稱之為Bacmid， Bacmid既可感染鱗翅目昆蟲細(xì)胞，又可以在大腸桿菌中復(fù)制。Bacmid的 構(gòu)建策略為在AcMNPV多角體蛋白基因的相應(yīng)位點(diǎn)克隆進(jìn)卡那霉素抗性基因，Tn7細(xì)菌轉(zhuǎn) 座子靶位點(diǎn)attTn7，來(lái)源于pUC質(zhì)粒的LacZ肽段編碼基因及能夠保證基因組自主復(fù)制和以 穩(wěn)定的低拷貝數(shù)存在于細(xì)菌中的mini-F復(fù)制子。pFastBac為供體質(zhì)粒，在其T117左右序列之間是多角體蛋白啟動(dòng)子。供體質(zhì)粒中的外源基因在輔助質(zhì)粒編碼的轉(zhuǎn)座酶作用下插入到 Bacmid中，從而干擾LacZ的表達(dá)，這樣就可以通過(guò)細(xì)菌菌落藍(lán)白篩選直接小量提取重組 Bacmid質(zhì)粒DNA，再用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染即可獲得重組病毒。該系統(tǒng)重組率幾乎為100 % ，且 重組迅速。甲病毒是單股、正鏈的RNA病毒，其成員包括辛德畢斯病毒、Semliki森林病毒、委內(nèi) 瑞拉馬腦炎病毒等，現(xiàn)均已開發(fā)成復(fù)制子而成為受廣泛關(guān)注的真核表達(dá)載體。復(fù)制子載體利 用復(fù)制子特有的RNA復(fù)制酶提高翻譯模板mRNA的量來(lái)實(shí)現(xiàn)外源基因高水平表達(dá)(Kohno etal, 1998)。SFV復(fù)制子載體是基于Semliki森林病毒的真核表達(dá)載體，主要包括基于RNA的SFV復(fù) 制子系統(tǒng)和基于DNA的SFV復(fù)制子系統(tǒng)，后者由于其更高的安全性和穩(wěn)定性而被更廣泛的采 用?；贒NA的SFV復(fù)制子載體系統(tǒng)構(gòu)建策略為將SFV的cDNA置于真核表達(dá)載體啟動(dòng)子下游 (如人巨細(xì)胞病毒(CMV))的早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)，用外源基因代替結(jié)構(gòu)蛋白基因， 一旦由強(qiáng) 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的甲病毒非結(jié)構(gòu)蛋白編碼的復(fù)制酶復(fù)合物合成，便可介導(dǎo)細(xì)胞漿內(nèi)重組RNA的 大量復(fù)制，從而導(dǎo)致外源基因編碼的mRNAs的高水平表達(dá)(Hsueta1,2004)，同時(shí)，甲病毒復(fù) 制子不僅具有自主復(fù)制功能，而且具有與完整甲病毒相同的誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的特性，使被 轉(zhuǎn)染細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生凋亡。由于這些顯著的優(yōu)點(diǎn)，SFV復(fù)制子己被廣泛用于表達(dá)外源基 因和構(gòu)建復(fù)制子疫苗以及基因治療導(dǎo)向載體制備等領(lǐng)域，尤其是在疫苗研究方面，已有病毒 和腫瘤復(fù)制子候選疫苗進(jìn)入臨床前期及臨床試驗(yàn)，顯示了其良好的應(yīng)用前景。桿狀病毒介導(dǎo)的哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)移及表達(dá)受多方面條件的影響，為獲得外源基因的高效 表達(dá)，研究者已嘗試采用多種啟動(dòng)子來(lái)改造桿狀病毒載體。如RSV啟動(dòng)子，CMV-IE啟動(dòng)子， 雞(3-actin啟動(dòng)子等被廣泛的應(yīng)用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因，本發(fā)明利用SFV的亞 啟動(dòng)子來(lái)構(gòu)建桿狀病毒，旨在構(gòu)建一個(gè)既能實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)，又能誘導(dǎo)凋亡的載體， 為基因治療提供一個(gè)安全，高效的表達(dá)載體。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種新型的桿狀病毒載體骨架質(zhì)粒pFB-G-SFV，利用該骨架質(zhì)粒， 可以和含有Bacmid的大腸桿菌(DH10Bac)以及昆蟲細(xì)胞(sf-9細(xì)胞)共同組成的一種新型 的桿狀病毒包裝系統(tǒng)。該質(zhì)粒pFB-G-SFV提供兩個(gè)酶切位點(diǎn)BamH I和Smal I供外源基因插入。 將外源基因克隆入該載體后，轉(zhuǎn)化含有Bacmid的大腸桿菌(DH10Bac)，通過(guò)藍(lán)白斑篩選可獲 得轉(zhuǎn)入外源基因的重組Bacmid，提取該Bacmid，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞(sf-9細(xì)胞)，即可獲得含有 外源基因的重組桿狀病毒。本發(fā)明所述載體的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明所述的重組桿狀 病毒骨架質(zhì)粒所構(gòu)成的包裝系統(tǒng)具備Bac-to-bac系統(tǒng)出毒快，穩(wěn)定性好，產(chǎn)率高的特點(diǎn)。包裝 出的重組桿狀病毒能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中自主復(fù)制，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的高量表達(dá)。(2)本 發(fā)明所述的重組桿狀病毒骨架質(zhì)粒所構(gòu)成的包裝系統(tǒng)包裝出的重組桿狀病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞 中自主復(fù)制的過(guò)程中，能夠產(chǎn)生dsRNA， dsRNA的產(chǎn)生，能夠促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞活性因子的產(chǎn)生。(3)本發(fā)明所述的重組桿狀病毒骨架質(zhì)粒所構(gòu)成的包裝系統(tǒng)包裝出的重組桿狀病毒 能夠誘導(dǎo)被轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)免疫反應(yīng)，減少DNA整合到宿主染色體風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明所述的骨架質(zhì)粒是以pFastBac-Dual (購(gòu)自于Invitrogen公司)，pSFVl (購(gòu)自于 Invitrogen公司)和pCI-neo (購(gòu)自于Invitrogen公司)為材料，通過(guò)下述方法獲得以Sphl 和Spel酶切pSFVl ，回收包含SFV非結(jié)構(gòu)蛋白的8.7Kb的片段，置換pFastBac-Dual的Pp,o 和PpH啟動(dòng)子，得到中間質(zhì)粒pFB-G-SFVl。以pCI-neo為模板分別擴(kuò)增HCMV IE Enhancer/Promoter元件和SV40晚期poly(A)終止信號(hào)序歹iJ，分別插入SFV片段中Sp6啟動(dòng)子 上游單一酶切位點(diǎn)Sphl和SFV片段中A69下游單一酶切位點(diǎn)Spel。最終獲得質(zhì)粒 pFB-G-SFV，(攜帶該質(zhì)粒的大腸桿菌(&cteWcWa co//)DH5a/pFB-G-SFV于2007年5月16 日保藏于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M207070)。因此在pFB-G-SFV質(zhì)粒上，在Tn7之間含有由CMV-SFV組成的表達(dá)盒和 慶大青霉素抗性基因。SFV上保留有BamHI和Small兩個(gè)酶切位點(diǎn)供外源基因的插入。本發(fā) 明所述的重組桿狀病毒骨架質(zhì)粒所構(gòu)成的包裝系統(tǒng)保留了 Bac-to-Bac系統(tǒng)出毒快，穩(wěn)定性好， 產(chǎn)率高的特點(diǎn)，包裝出的重組桿狀病毒整合了SFV載體的外源基因高表達(dá)效率，產(chǎn)生dsRNA中間體，誘導(dǎo)凋亡等優(yōu)良特性。為疫苗開發(fā)提供了一個(gè)新工具。


圖l:是本發(fā)明公開的骨架質(zhì)粒構(gòu)建流程圖2:是本發(fā)明公開的骨架質(zhì)粒與pFastBac-Dual骨架質(zhì)粒相比，Sphl和Spel兩個(gè)酶切位點(diǎn) 間序列的示意中2A顯示的是本發(fā)明公開的骨架質(zhì)粒Sphl和Spel兩個(gè)酶切位點(diǎn)間序列的示意圖，在 兩個(gè)酶切位點(diǎn)間包含了 HCMV IE Enhancer/Promoter元件、SFV的非結(jié)構(gòu)蛋白nsPl、 nsP2、 nsP3和nsP4，以及SV40晚期poly(A)終止信號(hào)序列。圖2B顯示的是未經(jīng)過(guò)改造的Bac-to-Bac 系統(tǒng)pFastBac-Dual骨架質(zhì)粒Sphl和Spel兩個(gè)酶切位點(diǎn)間序列的示意圖，在兩個(gè)酶切位點(diǎn)間， 包含兩個(gè)啟動(dòng)子PplO和Pph，以及多個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。 圖3 :重組質(zhì)粒pFB-G-SFV-EGFP與重組質(zhì)粒pFB-G-CMV-EGFP的比較示意圖。其中圖3A為重組質(zhì)粒pFB-G-SFV-EGFP，主要含有HCMV IE Enhancer/Promoter元件、 SFV的非結(jié)構(gòu)蛋白nsPl、 nsP2、 nsP3和nsP4，以及SV40晚期poly(A)終止信號(hào)序列，以及 外源基因EGFP。圖3B為重組質(zhì)粒pFB-G-CMV-EGFP，僅含有HCMV IE Enhancer/Promoter 元件和外源基因EGFP。圖4是本發(fā)明公開的骨架質(zhì)粒與DH10Bac大腸桿菌，以及昆蟲細(xì)胞SF-9包裝重組桿狀病毒 的示意圖。該大腸桿菌含有穿梭質(zhì)粒Bacmid，該穿梭質(zhì)粒上含有Tn7轉(zhuǎn)座子的靶序列attTn7，將本 發(fā)明公開的骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過(guò)轉(zhuǎn)座獲得重組穿梭質(zhì)粒，然后將該重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)5染昆蟲細(xì)胞，即可包裝出重組桿狀病毒。圖5是利用本發(fā)明中的骨架質(zhì)粒構(gòu)建獲得的表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)的重組桿狀病毒接種 HEK-293細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞后熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀的分析結(jié)果。 其中圖5A為在熒光顯微鏡上光學(xué)條件下接種重組桿狀病毒的HEK-293細(xì)胞的觀察結(jié)果， 圖5B為熒光顯微鏡下接種表達(dá)EGFP的重組桿狀病毒的BHK-21細(xì)胞的熒光觀察結(jié)果，圖 5C為利用流式細(xì)胞儀分析表達(dá)外源基因EGFP的BHK-21陽(yáng)性細(xì)胞比例，圖5D為流式細(xì)胞 儀分析表達(dá)外源基因EGFP的平均熒光強(qiáng)度。圖6是由本發(fā)明中的骨架質(zhì)粒構(gòu)建獲得的重組桿狀病毒Bac-G-SFV-EGFP接種BHK-21細(xì)胞 后的凋亡檢測(cè)。其中圖6A為DNA-Ladder的凝膠電泳圖片，圖6B為caspase-3的活性檢測(cè)。結(jié)果表明 接種重組桿狀病毒的BHK-21細(xì)胞發(fā)生顯著的凋亡現(xiàn)象。圖7本發(fā)明所獲得的重組桿狀病毒Bac-G-SFV-EGFP與對(duì)照重組桿狀病毒Bac-G-CMV-EGFP 分別免疫小鼠后的酶聯(lián)免疫吸附抗體(ELISA)水平比較。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。實(shí)施例l:本發(fā)明中的pFB-G-SFV骨架質(zhì)粒的構(gòu)建以圖1所示的pFastBac-Dual (購(gòu)自于Invi加gen公司)和pSFV 1 (購(gòu)自于Invitrogen公司)為材料，按圖1所示的流程，構(gòu)建本發(fā)明所說(shuō)的質(zhì)粒，具體步驟如下1、 將pFastBac-Dual和pSFVl質(zhì)粒分別以Sphl和Spel雙酶切，分別回收含桿狀病毒轉(zhuǎn)移載 體骨架和包含SFV的非結(jié)構(gòu)蛋白nsPsl-4的大片段和線性化的pFastBac-Dual，將這兩個(gè)片段 連接構(gòu)建獲得中間質(zhì)粒I即pFB-G-SFVl;2、 以pCI-neo為模板擴(kuò)增兩端帶有Sphl酶切位點(diǎn)的HCMV IE Enhancer/Promoter元件，如 圖1所示中間片段I ;3、 將步驟2所得的HCMV正Enhancer/Promoter元件插入中間質(zhì)粒I的Sphl位點(diǎn)，獲得中 間質(zhì)粒II即pFB-G-SFV2;4、 以pCI-neo為模板擴(kuò)增兩端帶有Spel酶切位點(diǎn)的SV40晚期poly(A)終止信號(hào)序列，得到 如圖1所示中間片段II;5、 將步驟4所得SV40晚期poly(A)終止信號(hào)序列插入步驟3所示的中間質(zhì)粒II的Spel位 點(diǎn)，得到本發(fā)明所述的質(zhì)粒pFB-G-SFV。該質(zhì)粒于2007年5月16日保藏于湖北省武漢市 武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCCNO: M207070。實(shí)施例2:利用本發(fā)明所述之骨架質(zhì)粒包裝出帶有外源基因綠色熒光蛋白(EGFP)的重組 桿狀病毒61、 pFB-G-SFV-EGFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建本實(shí)施例中，熒光報(bào)告基因EGFP (Genebank序列號(hào)1377915)將被用于直接、客觀評(píng) 價(jià)本發(fā)明得到的改造載體能否正確表達(dá)外源基因，同時(shí)比較改造質(zhì)粒與目前常用的桿狀病毒 骨架質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染效率以及表達(dá)水平上的差異。以質(zhì)粒pEGFP-Cl (購(gòu)自于ClonTech公司)為 模板擴(kuò)增兩端帶有BamHI和Small酶切位點(diǎn)的EGFP序列(Genebank序列號(hào)1377915)，插 入實(shí)施例1中所獲質(zhì)粒pFB-G-SFV的BamHI和Small酶切位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒 pFB-G-SFV-EGFP。結(jié)果如附圖3A所示。2、 包含pFB-G-SFV-EGFP重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座2.1取出DHlOBac 感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自于Invitrogen公司)冰上融解，用移液槍吸取100nl DH10BaJM感受態(tài)細(xì)胞于預(yù)冷的1.5mlEP管中；2.2輕輕加入約lng的重組質(zhì)粒pFB-G-SFV-EGFP于感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕敲打管壁使之混勻； 2.3冰上放置30min。 42"循環(huán)水浴靜止45秒，快速放置冰上2min;2.4在上述EP管中加入90(^1 S.O.C.培養(yǎng)基(購(gòu)自于武漢武大天源生物科技股份有限公司)，將 EP管置于37。C搖床(225r/min)振搖培養(yǎng)4h;2.5用S.O.C.培養(yǎng)基稀釋上述細(xì)胞至10—1、 10-2、 10-3;2.6在每塊LB培養(yǎng)基(卡那霉素50ng/ml，慶大霉素7路/ml，四環(huán)素10照/ml， Bluo-gal 100|ig/ml，異丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 40嗎/ml)中加入步驟2.5所述稀釋液IOOW， 涂布均勻；2.7 37。C培養(yǎng)24—48h。挑取白斑在LB平板上純化，純化至第三代。3、 重組Bacmid DNA的分離提取3.1挑取白色克隆于2ml LB液體培養(yǎng)基(含50嗎/ml卡那霉素、7嗎/ml慶大霉素、10嗎/ml 四環(huán)素)，37。C搖床250—300r/min培養(yǎng)24h以上；3.2取1.5ml步驟3.1所述的培養(yǎng)物于1.5mlEP管中，14000xg離心lmin。倒去上清液，倒立 于吸水紙上。然后加入0.3ml的溶液I (Tris-HCl(15Mm) ， EDTA (10Mm) ， RNA酶 (lOOpg/ml))用槍頭輕輕吹打重懸細(xì)胞；3.3加入0.3ml溶液II (NaOH 0.2N，十二烷基磺酸鈉1%)，輕輕混勻，室溫放置5min (溶 液變清)；3.4緩緩加入0.3ml溶液III (KAc (3M))，輕輕混勻，形成蛋白及DNA沉淀，冰上放置5 — 10min;3.5 14000xg， 25。C離心10min，期間另取一支2ml離心管，加入800(^1異丙醇；3.6輕輕把上清液轉(zhuǎn)入上述含異丙醇的離心管，避免把白色沉淀帶入。輕輕倒轉(zhuǎn)離心管數(shù)次。 冰上放置5min (該過(guò)程可放在一20。C過(guò)夜)。25。C離心15min;3.7去上清，倒置離心管于吸水紙上，然后加入70%乙醇洗滌沉淀數(shù)次，14000xg， 25。C離心 5min。棄上清；3.8使步驟3.7所述沉淀在空氣中自然干燥5 — 10min。加40n!TE溶液，輕敲管底，使溶液位 于管底部。4重組Bacmid轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞4.1復(fù)蘇編號(hào)為GDC008昆蟲細(xì)胞系SF-9 (購(gòu)于中國(guó)武漢大學(xué)內(nèi)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的 商業(yè)細(xì)胞材料，見http:〃www.bio-equip.com/showlequip.asp equipid=14757&division=2604)。4.1.1取凍存于液氮中的sf-9細(xì)胞一支，迅速于35-42'C溫水中融化，將細(xì)胞在25°C， 1000r/min 下離心5min;4丄2棄上清，加入lml含有10%胎牛血清的Grace's培養(yǎng)基(購(gòu)自于Sigama公司)，輕輕吹打 重懸細(xì)胞；4丄3將重懸的細(xì)胞加入裝有5ml含有10%胎牛血清的Grace's培養(yǎng)基的25cm4音養(yǎng)瓶中， 27'C培養(yǎng)過(guò)夜。4.2轉(zhuǎn)染4.2.1在六孔板中以9xl()S個(gè)細(xì)胞/2ml/孔的密度接種sf-9細(xì)胞，27°。培養(yǎng)lh，使細(xì)胞貼壁；4.2.2用獲得的重組bacmid轉(zhuǎn)染sf-9細(xì)胞(梁昌鏞，不同桿狀病毒誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞抗病毒 效果比較分析，中國(guó)科學(xué)C輯生命科學(xué)2006， 36 (3)， 261-266);4.2.3將六孔板內(nèi)的細(xì)胞孵育5h， 27°C，換上新鮮的Grace's培養(yǎng)基。在27'C培養(yǎng)箱中孵育 72h或直到細(xì)胞出現(xiàn)輕微的細(xì)胞病變跡象。培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液中即含有攜帶外源基因EGFP 的重組桿狀病毒(Bac-G-SFV-EGFP)。實(shí)施例3 (應(yīng)用實(shí)施例l)用利用實(shí)施例2所述的方法包裝出的Bac-G-SFV-EGFP重組桿狀病毒感染乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞 (BHK-21)。1、 在六孔板中以9xl05個(gè)細(xì)胞/2ml/孔的密度接種編號(hào)為GDC010敘利亞倉(cāng)鼠腎細(xì)胞系 BHK-21 (購(gòu)自于中國(guó)武漢大學(xué)內(nèi)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的商業(yè)細(xì)胞材料，見 http:〃www.bio-equip.com/showlequip.asp equipid=14757&division=2604)細(xì)胞，37。C培養(yǎng)lh，使細(xì)胞貼壁。2、 用含有Ca2+， Mgh的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，購(gòu)自于Sigama公司)洗細(xì)胞三次，以50個(gè)感染 復(fù)數(shù)的劑量(MOI=50)將桿狀病毒Bac-G-SFV-EGFP接入六孔板細(xì)胞中，27。C感染4小時(shí)后， 棄掉上清，添加新鮮的含有10%新生牛血清的DMEM (購(gòu)自于Gibico公司)。3、 將六孔板置于37。C的C02培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時(shí)，以熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)外源 基因EGFP的表達(dá)。實(shí)施例4 (應(yīng)用實(shí)施例2)用實(shí)施例2所述的方法包裝出的Bac-G-SFV-EGFP重組桿狀病毒感染HEK-293細(xì)胞。1、在六孔板中以9xl()S個(gè)細(xì)胞/2ml/孔的密度接種編號(hào)為GDC067人源胚腎細(xì)胞系HEK-293(購(gòu)自于中國(guó)武漢大學(xué)內(nèi)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的商業(yè)細(xì)胞材料，見http:〃www.bio-equip.com/showleq.uip.asp equipid=14757&division-2604)， 37。C培養(yǎng)lh， 使細(xì)胞貼壁。2、用含有Ca2+， Mg^的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，購(gòu)自于Sigama公司)洗細(xì)胞三次，以50個(gè)感染 復(fù)數(shù)的劑量(MOI=50)將桿狀病毒Bac-G-SFV-EGFP接入六孔板細(xì)胞中，27。C感染4h后， 棄掉上清，添加新鮮的含有10%胎牛血清的DMEM。3、將六孔板置于37'C 5%0)2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h，以熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP 的表達(dá)。實(shí)施例5 (應(yīng)用實(shí)施例3)利用實(shí)施例3中獲得的Bac-G-SFV-EGFP重組桿狀病毒接種BHK-21細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢 測(cè)。1、 DNA梯度碎片檢測(cè)(DNA-ladder，方法參照參考文獻(xiàn)8)1.1將實(shí)施例3中接種桿狀病毒Bac-G-SFV-EGFP的BHK-21細(xì)胞用磷酸鹽緩沖溶液(PBS，購(gòu) 自于Sigama公司))洗滌三次后，加入含有l(wèi)OmM Tris-HCl(pH8.0)、 lOmM EDTA及0.5% Triton X-100的細(xì)胞裂解液使細(xì)胞裂解。1.2將步驟1.1收集到的細(xì)胞裂解物中加入O.l mg/mlRNA酶后置于37'C溫箱中，lh后取出。 1.3 12000xg離心25min，使染色體DNA沉淀。1.4轉(zhuǎn)移上清，加入1%的十二垸基磺酸鈉，用蛋白酶K (購(gòu)自于Takara公司)在50'C消化 lh后，用酚仿抽提上清中的DNA，無(wú)水乙醇沉淀，然后用含10mMTris(pH8.0)和lmMEDTA的緩沖液重溶。1.5再用1.5。/。的瓊脂糖凝膠作DNA片段化的形態(tài)分析。如附圖5A所示，接種重組桿狀病毒 Bac-G-SFV-EGFP的BHK細(xì)胞染色體DNA出現(xiàn)明顯的片段化，而接種桿狀病毒野生型的BHK 細(xì)胞染色體DNA仍然保持完整。這表明重組的桿狀病毒Bac-G-SFV-EGFP能夠引起B(yǎng)HK細(xì) 胞的凋亡。2、 比色測(cè)定法測(cè)定caspase-3的活性(檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，具 體操作按產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行)2.1利用細(xì)胞刮鏟將實(shí)施例3中接種桿狀病毒的BHK-21細(xì)胞收集，1500g離心5min棄去上 請(qǐng)，保留細(xì)胞；2.2在收集的沉淀細(xì)胞中加入5(HiL預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液(購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，試劑盒附帶)，吹打均勻；2.3置冰上裂解30min，其間渦旋振蕩3 4次，每次10s;或凍融2 3次，之后用4°C 10000r/min 離心lmin;2.4小心吸取上清(含裂解的蛋白質(zhì))轉(zhuǎn)移至新的管中，并放置冰上待用；2.5取少量上清(1 2)LiL)，常規(guī)方法(Braford法，張鐵雨等，重組人白介素-11蛋白濃度兩 種測(cè)定方法比較，天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005， 17: 150-151)測(cè)定其中的蛋白濃度； 2.6吸取50nL含100 200ng蛋白的細(xì)胞裂解上清；如體積不足50pL，用裂解緩沖液(購(gòu)自 南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，試劑盒附帶)補(bǔ)足至總體積50nL; 2.7加入50)^L的2xreaction buffer (購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，試劑盒附帶)；2.8加入5pL caspase-3 substrate (購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，試劑盒附帶)，并于 37。C避光孵育4h;2.9底物反應(yīng)結(jié)束后用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)UOO(aL的比色皿)在X=405nm或400nm測(cè)定其 吸光值。通過(guò)計(jì)算OD縣劑/OD陰性對(duì)照的倍數(shù)來(lái)確定凋亡誘導(dǎo)劑組caspase-3活化程度。如圖5B 所示，接種重組桿狀病毒Bac-G-SFV-EGFP的細(xì)胞內(nèi)的caspase-3活性較其他未處理的細(xì)胞有 顯著的增高，由于Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中caspase-3 為關(guān)鍵的執(zhí)行分子。與DNA斷裂、染色體凝聚和凋亡小體形成有關(guān)。因此caspase-3的蛋白 水解酶活性的提高可作為細(xì)胞凋亡信號(hào)。這一結(jié)果表明接種重組桿狀病毒Bac-G-SFV-EGFP 的細(xì)胞發(fā)生了顯著的凋亡作用。 實(shí)施例6 (應(yīng)用實(shí)施例4)利用傳統(tǒng)商用骨架質(zhì)粒pFastBac-Dual (購(gòu)自于Invitrogen公司)包裝出的重組桿狀病毒與 實(shí)施例3中獲得的Bac-G-SFV-EGFP重組桿狀病毒免疫效果的比較。1、 普通重組桿狀病毒Bac-G-CMV-EGFP的獲得1.1參照程通等(Tong Cheng, et al， A rapid and efficient method to express target genes in mammalian cells by baculovirus, World J Gastroenterol 2004;10(1I):1612-1618)提供的技術(shù)路線， 以質(zhì)粒pFastBac-Dual (購(gòu)于Invi加gen公司)，質(zhì)粒pCI-neo (購(gòu)于Invitrogen公司)，質(zhì)粒 pEGFP-Cl (購(gòu)于ClonTech公司)構(gòu)建出插入外源基因EGFP的重組骨架質(zhì)粒pFB-G-CMV-EGFP ， 如附圖3B所示。1.2參照實(shí)施例2的步驟，利用步驟l.l所獲得的重組骨架質(zhì)粒pFB-G-CMV-EGFP，包裝出能表 達(dá)外源基因EGFP的普通型桿狀病毒Bac-G-CMV-EGFP。2、 免疫小鼠的酶聯(lián)免疫吸附抗體(ELISA)水平比較 將本發(fā)明所獲得的重組桿狀病毒Bac-G-SFV-EGFP與作為對(duì)照的桿狀病毒Bac-G-CMV-EGFP 分別以10 fu/mL的劑量免疫4-6周齡的Balb/c小鼠(購(gòu)自武漢疾病預(yù)防控制中心)，每組6只， 100^1/只，于后腿肌肉注射，共免疫2次，每次間隔3周，并設(shè)磷酸緩沖液(PBS)免疫組作為陰性對(duì)照組。于二免后3周采集小鼠血液，檢測(cè)血清中EGFP特異性的酶聯(lián)免疫吸附抗體水平。 結(jié)果如圖7所示，在首次免疫后第6周，兩種桿狀病毒免疫組抗體水平升高迅速，其中，本發(fā) 明所獲得的重組桿狀病毒Bac-G-SFV-EGFP免疫組平均抗體滴度水平達(dá)到l: 8250，而對(duì)照 Bac-G-CMV-EGFP免疫組抗體滴度水平只為l: 5000，磷酸緩沖液(PBS)免疫組未檢測(cè)至ljEGFP 特異性的酶聯(lián)免疫吸附抗體。該結(jié)果表明由本發(fā)明所獲得的桿狀病毒骨架質(zhì)粒所包裝出的桿 狀病毒，在表達(dá)外源基因，促進(jìn)免疫反應(yīng)等多方面要顯著優(yōu)于普通桿狀病毒骨架質(zhì)粒。參考文獻(xiàn)1 Smith GE ， Summers MD , Fraser MJ . Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol Cell Biol ,1983 ,3 (12) :2156-2165.2 Luckow VA， Baculovirus systems for the expression of human gene products. C鮮.C*p/". 所o化c/mo/. 1993， 4(5): 564 - 57213 Luckow V A ,Summers M D. High level expression of nonfused foreign genes with y4咖gra; /^ Ca爭(zhēng)m/a nuclear polyhedrosis virus expression vector [J] . Vioriogy ，1989 ，170(1) :31 39.4 Hofmann C, Sandig V, Jennings G, et al. Efficient gene transfer into human hepatocytes by baculovirus vectors. Proc Natl Acad Sci USA， 1995, 2 (22) :10099-101035 Y.C. Hu, Baculovirus as a highly efficient expression vector in insect and mammalian cells. Acta. Pharmacologica, Sinica, 26 (2005) 405416.6 A. Kohno, N. Emi, M. Kasai, M. Tanimoto, H. Saito, Semliki Forest virus-based DNA expression vector: transient protein production followed by cell death, Gene Ther 5(1998) 415^418.7 C.S. Hsu， Y.C. Ho， K.C. Wang, Y.C. Hu, Investigation of Optimal Transduction Conditions for Baculovirus-Mediated Gene Delivery Into Mammalian Cells, Biotechnology andBioengineering， 88 (2004) 42-51.8 A. Kohno, N. Emi, M. Kasai, M. Tanimoto, H. Saito.Semliki Forest virus-based DNA expression vector加nsient protein production followed by cell death, Gene Ther. 1998 ,5(13)415~418.
權(quán)利要求
1、一種重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體骨架質(zhì)粒pFB-G-SFV，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNOM207070)。
2、 權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒在重組桿狀病毒包裝上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組桿狀病毒載體骨架質(zhì)粒的構(gòu)建及應(yīng)用。本發(fā)明克隆得到一種重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體骨架質(zhì)粒pFB-G-SFV，該質(zhì)粒保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCC NOM207070。本發(fā)明還公開了質(zhì)粒pFB-G-SFV在重組桿狀病毒包裝上的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/866GK101260411SQ200710168929
公開日2008年9月10日 申請(qǐng)日期2007年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月17日
發(fā)明者方六榮, 江云波, 潘永飛, 肖少波, 騫 趙 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)