專利名稱：：通過基因沉默來產(chǎn)生不育雄花和單性果實的方法、相關(guān)序列和包含所述序列的載體的制作方法通過基因沉JMt產(chǎn)生不育;^f^單性果實的方法、相關(guān)序列和包含所*列的載體發(fā)明目的本發(fā)明7^f了一種產(chǎn)生不育^^和iMf或單性果實的方法。所ii^法基于^J^與來自不同植物樹的Pisti1lata基因同源的基因，i^iliit成包含對于所用物種來iW異的Pisti1lata-同源基因的完整序列或該序列的-~#分的沉默栽體ijUi行。還涉;S^斤迷基因沉默栽體用于產(chǎn)生不育i^和無籽或單性果實的用途。在本發(fā)明中，進一步公開了來自赤霞珠葡萄(K/〃sw'//尸eracv.CabernetSauvignon)的VvPI基因和來自番癡(Z7co/7e"化0/7escw/e/7f咖)的LePI基因的序列，以;5lil些基因用于產(chǎn)生不育i^和無籽或單性果實的用途。jtt外，還公開了包含在所ii^OH載體中所包含的這些序列或其部分的沉默栽體，其分別允許i50f犬赤霞珠葡萄和番癡中的VvPI和LePI基因。來自赤霞珠葡萄的VvPI和來自番癡的LePI是與來自擬南^UraW必/w/;^wh'a朋)的Pistillata基因同源的基因，所述Pistillata基因是>#^擬南芥和，范中的花^f^^統(tǒng)形成的基因。賄鉢iU子品種具有高的商業(yè)價值和改善的感觀游性。無籽品種可以解決某些栽陪中的問題，如授粉。在^t栽培品種例如番癡的生產(chǎn)過程中，授粉是生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟，甚至是限制步驟，因為該步驟^A、濕度和溫度的影響，它們都應(yīng)處于亞最適^ft或^^適^Ht(Nothman等人1975;Romano等人1994)。單性結(jié)實提供了一種可供選擇的途徑，因為果實的發(fā)育獨立于授粉而進行(Lukyanenko等人1991),這樣可以為生產(chǎn)者確保更高的穩(wěn)定性。在大多數(shù)的開;^t物中，一_5>^#(5|^的^*^,^育為種子，同時周圍組織^f匕成果實(Coombe等人1975)。除了果實發(fā)育與4felt無關(guān)的那些單性結(jié)實的植物以外，授精是開始花至果實轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵步驟。單性果實進行發(fā)育而沒有先前的^M&睛，因jtbit些WM^漸衰老，并且子房發(fā)育為iW果實(Gillaspy等人1993)。兩個與無并予(無核(apyrenic))果實的出現(xiàn)有關(guān)的現(xiàn)象是單性結(jié)實(parthenocarpy)和無籽結(jié)實(stenospermocarpy)。單性結(jié)實是在沒有先前4^情況下的果實發(fā)育和生長，而無籽結(jié)實是一^S4^晴已^1生而出現(xiàn)X^予果實或數(shù)目減少的部分成形的種子，it^由于在其形成過程中種子的發(fā)育不全而引起的。用于人工形^it^果實的第一種方法包括向iE^育的果實甚至是花噴灑生長素和赤霉素(GAs)(Nitsch等人1970;Schwabe等人1981;Garcfe-martinez等人1997)。然而，最常用的用于產(chǎn)生^#果實的方法是突變體選擇。通體誘導(dǎo)的誘變已經(jīng)得到了很多這些無籽突變體變體。例如，通過il種方法已^番癡中產(chǎn)生了不同的單寸錯實品系(Lukyanenko等人的綜逸1991)。最重要的*品系;1通過4吏用曱磺脧乙酯(Bianchi等人1969)而得到的突變體，被稱為(parMe/zocarp/.c/!n;/7(卓'/^果《))(Soressi和Salamini，1975;Philouze等人1983;Barg等人1990;George等人1984;Lukyanenko等人，1991)。還曾經(jīng)^^)過多倍體，例如在三棘西瓜(Terada等人1943;Kihara等人1951，1958)^p才禍(Deng等人1996;Chandler等人2000;Guo等人2000)的突變體中。這些突變艦過如下方法產(chǎn)生融合原i^MMl使四棘(4x)母系植物與二徘(2x)授絲雜交，由此產(chǎn)生了三糾(3x)的徘，然后用二^f^t物為其4t粉，從而獲得iU予果實。更新穎的方法包括4^I經(jīng),的花1^^￡^粉。如Watanabe(2001)和Sugiyama(2002)所述的，這個方法允許獲得二糾(2x)的西^4t物，其產(chǎn)生具有少量肚小的種子(被稱為"空種子(emptyseeds)")的果實。絲，已經(jīng)通過4^)類似于外源激素應(yīng)用的近似方法獲得了單性果實。所述過程包M過引入能增加子房、rt^胎座內(nèi)的內(nèi)部激素7jc平的基因，例如/'aa^和ro/及來^植物激素的產(chǎn)生途徑。Szechtman等人(1997)在番癡子房中特異^tk4Ji了來自根瘤i^桿菌"gro&s"eW咖tua/e/"ac/e/w)的基因2'朋雙所錄因編碼n引咮乙隱水麟，其能將萘乙驗(NAM)水解為萘乙酸(NAA)(活性生長素形式)。因此，在lt^用NAM處理子房后誘導(dǎo)了單性結(jié)實。Rotino等人(1996)表達了編碼參與丐1咮-3-乙酸(IAA)生物合成的酶的基因，所述生物合成不需要應(yīng)用任何外源性化合物。所述基因是嵌合的ite/BW朋^基因，其具有來自丁香假單胞菌薩氏致病變種(丹ew/o咖加《sjr/'/^aepv.savastanoi)的/aa^基因的編碼區(qū)J^p來自金魚草(^f/rr力/;3咖鵬j^)的胎座和^Mt異法啟動子區(qū)域/te/^(Rotino等人1996)?；蚓幋a色氨酸單加,，其產(chǎn)生吲哚乙,。吲哚乙m歸,i^Ul化學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)镮AA生長素。具有轉(zhuǎn)基因ite/BWa盧的煙草(Rotino等人1997)、茄子(Donzella等人，2000;Rotino等人，1997;Acciarri等人，2002)、番癡(Ficcadenti等人1999;Pan緒ini等人2002)以及草莓和^Jt子(Mezzetti等人2002;2004)轉(zhuǎn)基因植物^U^:牟勝結(jié)實的。先前已經(jīng)顯示了，牟性結(jié)實蘋果(她/wrfb鵬W/ca)品種RaeIme、SpencerSeedless和WellingtonBloomless,在直向同源PisUllata(PI)基因(Mtf7/(他/md咖e^/'ca/V"/77afa))中具有轉(zhuǎn)座子插入突變。jtW卜，該PI基因需要Sepallata的表達以在擬南芥屬(1ra6/cfo;wh)植物中^/f亍其功能(Ho腿和Goto2000;Pelaz等人2000，2001)。因此，與番癡S印allata同源的基因(例如TM29，Ampomah-Dwamena等人2002;和TM5，Pnueli等人1994)的^Ji缺乏導(dǎo)致單性果實的形成?；虺聊虺罥Kjl一種自然才;L制，其允許在DNA7JC平上(轉(zhuǎn)泉基因沉默)或在信使RM水平上(轉(zhuǎn)^基因;談，PTGS)抑制基因表達。目前，已開發(fā)出多種方法以允^it過PTGS在^ft有棘(包^i物)中抑制基因絲。為了這個目的，^^j產(chǎn)生有義和反義RM鏈的i5Ultt粒載體(例如，Hellsgate)，從而在細胞質(zhì)中形成雙鏈RNA，其誘導(dǎo)與該雙鏈RM具有類似序列的M因的沉默(Vionet，2003)。在本發(fā)明中，這個^M^MiH秀導(dǎo)來自葡萄(W〃sw'"/尸era)和番莊的Pistillata基因的;兄默，所錄因是編碼負責(zé)花中的花l^a雄蕩形成的轉(zhuǎn)錄因子的基因。在本發(fā)明的最接U獻中，可能會彬，j如下內(nèi)容VlietG.，1998(專利申請WO98/24301):這個文獻要求保護一種通過雜交兩個純^#恭植物來產(chǎn)生琉番癡的方法，所ii^^4莊植物對于單性結(jié)實(pk，pk)和功能性不育(fs,fs)特征是隱性的，it^i全不同于本發(fā)明中^Hf的技術(shù)的技術(shù)。在Ito等入2002(美國專利申請US2002/0152495)的文獻中，描迷了包賴碼細胞色素P450的序列的多核苷酸，當(dāng)所錄列^t物中表達時，產(chǎn)生單性結(jié)實表型，并JLj^卜ii^得更大的果實；這個技^所使用的基因的類型^fl:作的機制方面也不同于本發(fā)明。圖1:來自葡萄的VvPI基因的基因組cDNA序列的外顯子-內(nèi)襯結(jié)構(gòu)的示意圖。序列說明SEQ.ID.NO.1:顯示了來自赤霞珠葡萄的Pistillata基因VvPI的基因組序列。SEQ.ID.NO.2:顯示了來自赤霞珠葡萄的VvPIcDNA序列。SEQ.ID.NO.3:顯示了來自赤霞珠葡萄的基因VvPI的3'UTR區(qū)域的序列。SEQ.ID.NO.4:顯示了來自赤霞珠葡萄的基因VvPI的UTR區(qū)域的序列。SEQ.ID.NO.5:顯示了來自赤霞珠葡萄的VvPI蛋白的推斷的^J^列。SEQ.ID,NO.6:顯示了來自番癡的LePI的cDNA序列。SEQ.ID.NO.7:顯示了來自番癡的LePI蛋白的^J^列。發(fā)明描述本發(fā)明z/Hf了一種產(chǎn)生不育iM^單性果實的方法，其基于在革c^中與;ii;itaA閱向5廟W其陽w寞閱敷;憲陽白p;《整序列或其部分的沉默載^4H^t物來產(chǎn)生基因沉默。本發(fā)明進一步7/Hf了來自葡萄的VvPI基因和來自番癡的LePI基因的序列；這些序列可以看作為SEQ.IDNO.1、2、3、4和6?；騐vPI和LePI與騰S-box類型的Pistillata基因(PI,擬南芥)同源。基因PI在擬南芥花中M花瓣和ip^'的形成。本發(fā)明/^f了麥自于這兩^NNt的完整編碼區(qū)域。除了當(dāng)與PIb汲時具有高的^J^同一性i^卜，這些基因還具有MADS基因的四個典型結(jié)構(gòu)域M、I、K和C;和PI基因的結(jié)構(gòu)域特征(Kauf腿nn等v、2005)。本發(fā)明還公開了這些序列用于產(chǎn)生不育雄花的用途，以及包^dt些序列的沉默載體，既可以K整基因序列或者也可以AJi述序列的4分。本發(fā)明還公開了一種允許發(fā)育不育;^和單性果實的方法，伏i^kA例如但不P艮制于番恭和葡萄中發(fā)育出不育#^^單性果實，其通iiiH用基因:5aU^阻斷^狄育的^^的Pisti1lata基因功能;j)Ui行。^ai輩逸因^Ji的方法包4沐增來自^Mt的Pistillata-同源基因的核苷^列，！t^在誘導(dǎo)M因沉厥的栽體中表ii^斤^列。^^種的表型;U^生不育棘，即沒有雄性器官的花，因而是不育植物和琉果實。產(chǎn)生不育^^i^予果實的方法可以綜合成如下的-^:步驟a)W4a^t中獲得Pistillata(PI)-同源基因的編碼序列；b)分析在步驟(a)中獲得的序列的表達以測試其依照對于Pistillata基因所描述的模式的表ii;c)分析在前述階^^fc^種中獲得的PI序列對于^t型PI基因突變^fet物的互^Kt用，以^H古所獲得的序列是否^f亍PI基因的功能；d)制ii^i物^Ji^體中獲得的基因^l^建體，其包含PI的編碼序列區(qū)域；e)將構(gòu)建的并在步驟(d)中獲得的栽體引入才艮瘤i;^桿菌中；f)用^^所i^O^載^(^^ftft^的根瘤i^桿菌;jMH^Nt植物，擇所迷轉(zhuǎn)化的植物；g)評估i;^桿菌污染的不^^在，^t過轉(zhuǎn)基因擴增來確iiE^基因植物。;t上述步驟的^if細的描ii:^下a)^M4e^中獲得Pistillata(PI)-同源基因的編碼序列從獲得自靶物種的花序或未成熟花的cDNA中克隆來自耙物種的Pistillata-同源基因。通狄RNA反轉(zhuǎn)^L合成cDNA。當(dāng)^L^t的PI基因序列未知時，^^]簡并引物對合成的cDNA進行RT-PCR;或者當(dāng)^Wt的PI基因序列已知時，^^特異性的引物，其育誠it^4頁域技權(quán)員熟知的方法輛建。為了獲得完整的基因序列，RACE或TAILPCR技術(shù)。^^HW可^4頁域技術(shù)人員已知的^f樹方法將所獲得的序列克隆入DM克隆載體中，并船進行測序。通過測序4-6個不同的克隆來測定每個獲得的序列。然后，進行所獲得的序列的計算4%(通過使用計算工具)以產(chǎn)生蛋白序列，并將這個蛋白序列與關(guān)于^t^t而描述的MPI序列進行tb^以獲得序列同Ht百分比，其預(yù)期為40-100%?；?qū)儆贛ADS-box基因家族，那么然后分析經(jīng)^^j序列以尋找MIKC-型MADS-box蛋白的典型結(jié)構(gòu)域的存在，即MADS結(jié)構(gòu)域(M)、間插結(jié)構(gòu)域(Intervening)(I)、角蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Keratinlike)(K)和C-絲結(jié)構(gòu)域(C)。此外，還尋找被稱為PISTILLATA的基序，其具有氨基酸序列FxFRLQPSQPNLH，其中x是任意^J^，并且可以存在于或;R^在于PI同源基因中。為了^H古戶W^序列是否相應(yīng)于編碼PI蛋白的基因，絲列Jiii行系統(tǒng)發(fā)生分析，將其與其他先前描述的PI蛋白序列以及與其他MADS-box非Pistillata蛋白i^f亍比較。借助于計#4^1^例如PAUP軟件iM^fi亥分析。通過4^來自^7#的DM的筒并或特異性引物進4沐增可以獲得綠因的基因b)分析在步驟(a)中獲得的序列的表達以測試其依照對于Pistillata基因所描述的才莫式的^Ji為了分析所獲得的PI基因在^i物中的奴，收集不同的組織，例討、莖、根、果實、種子或花，或者收集革ea物的不同發(fā)育階段的;^或花。，^J]諸如Northern印跡法或RT-PCR的技術(shù)來^H/h基因表達。在Northern印跡法的情況下，M^用的組織it^育階拔中提取RNA。在RT-PCR的情況下，將提取的RM用于通it^轉(zhuǎn)WL合成cDNA。Northern雜交膜在40-70。C的溫度下，與大小為200-800bp的關(guān)于已知Pistillata基因的特異性探針雜交。RT-PCR擴增使用48-65'C的調(diào)^^度，以及i^f吏用用于擴增特定的Pistillata基因的特異性引物，其是樣前述階^a^現(xiàn)的來自^ft的Pistitlata基因序列獲得的。對于這兩種技術(shù)，應(yīng)該使用對照基因(例如，肌動蛋白)，其允ifiH古RNA和cDNA的完塾性。c)分析在前述階^a^^t中獲得的Pisti1lata序列對于PI基因突變體的互4Ht用，以^H古所獲得的序列是否執(zhí)行Pisti1lata基因的功能在關(guān)于這個基因的突變^t物(例如擬南芥才莫型,PI突變體)中進行使用所獲得的PI基因的功能互補測定法，以^H古所獲得的序列是否^W亍典型PI基因的功能。在這個實驗中，可以預(yù)料到U突變體表型的逆轉(zhuǎn)；突變^^莫型植物不表ii^斤tt因，因jH^它們的花中沒有花Uf^雄蕩，所以，當(dāng)將步驟(a)中獲得的來自，種的PI基因序列在合適啟動子的控制下引入突變^a物中時，可預(yù)期所i^tfe物顯示出形態(tài)改變，所述形態(tài)改變可以^y^i且織的細胞類型的微小到:^絲花1#^雄貧的發(fā)育的。為此，制備構(gòu)建體以包^b碼所獲得的M種的PI基因的序列(考慮了從趙合ATG密碼子到終止密碼子，或者向該編碼序列添加5'UTR和3'UTR區(qū)域)，其處于調(diào)控啟動子下，所述調(diào)控啟動子序列可以是組織特異的、可誘導(dǎo)的或強纟JL^型的^Ji的序列。將包含處，控啟動子序列下的、來自，ft的PI基因的所獲得構(gòu)建^Mt入載體中，所i^/^f進一步:fc^^^ie^^f入植物中，例如經(jīng)確定的抗生素抗性。這個載體船借助于例如斜p艮于電穿孔而^^多入根瘤i^桿菌中以轉(zhuǎn)4^i物。^f)包含Pi基因突變的植物，例如，擬南芥Pi突變^^t物。轉(zhuǎn)化對于PI突變來說齡的模型植物，并且分析這些植物(Fl)的種子。有^#基因的種子應(yīng)該對^#入載體中的選##^物具有抗性，由此應(yīng)該萌芽。^Eit些植物中，尋找突變體表型的互4Ht用。在該F1代野生型中，將發(fā)現(xiàn)^的和pi突變體的植物。因此，必須確定植物的基因型以鑒定對于pi突變來iXi^合的那些植物，g^ii些植物中借助于使用所述^"基因的特異性引物的PCR來評估所述轉(zhuǎn)基因的存在。使用的轉(zhuǎn)^^支^決于所使用的模型植物。例如，當(dāng)擬南芥是模型植物糾時，可以^WFloraldip"技術(shù)。然后，在為PI突變^^Mt于靶PI基因來i)L^基因的植物中，分析花的結(jié)構(gòu)以尋找突變體表型的逆轉(zhuǎn)；通過肉眼以及^^l放大錄電子掃描顯微^Mi^H亥分析。在轉(zhuǎn)化的植物的花中，存在有在突變^t物的花中不存在的細胞類型或器官，例如，具有花瓣細l^雄蕩細胞形態(tài)的細胞，或者也可以存在完整器官。還可以直接轉(zhuǎn)化突變^t物的營養(yǎng)組織和等待花的發(fā)育以如前所iiii行分析。進行互4Ht用的步^^口下a)v^MWt中獲得Pistillata的編碼序列；b)制備^JJi^體中的包含來自^y^的PI基因的構(gòu)建體，所ii4^體包^it合于植物的啟動子，例如pCAMBIA1302;c)將轉(zhuǎn)化的載體引入才艮瘤i;t桿菌中；d)轉(zhuǎn)^*有PI突變的模型植物(例如，擬南芥生態(tài)型Ler，其對于pi-l突變來i^lJ^的)。轉(zhuǎn)化方法取決于所4M的模型植物。e)在含MS培養(yǎng)基的培^jni中選擇轉(zhuǎn)基因種子，所述MS培養(yǎng)基具有由載體和合^1^##"^所賦予的私性的特異抗生素，所iia物^it合于所選糾的光強下在生長室中生長；f)通過PCR和/或酶消4^^定對于它們的PI基因突變來^i^合的模型植物；g)在標(biāo)準PCR務(wù)降下，使用用于擴增包^#基因的特定載體區(qū)域的特^4生引物，通iWDNA的PCR來"iH古在步驟(f)中鑒定的植物的轉(zhuǎn)基因情況，h)》Ji^用^Nt的PI基因補足的PI突變^t物的花的表型。絲中在肉賄。d)產(chǎn)生^i物^ii^體中的基因沉默構(gòu)建體，其包含PI的編碼序列區(qū)域為了獲得不育絲和單性果實，設(shè)計了基因^^構(gòu)建體，其允許阻斷轉(zhuǎn)基因^i物中的Pistillata基因的功能。為了產(chǎn)生雙鏈RNA樹成導(dǎo)致轉(zhuǎn)絲基因^L默的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該構(gòu)建體表錄步驟(a)中獲得的4^Nt中發(fā)現(xiàn)的PI同源序列的區(qū)g片段，例如，3'UTR區(qū)域、編碼區(qū)g其部分或者5'UTR區(qū)域，包括有義和M兩者。碰狄列添加到待^^1的將在^^載體中被識別的特異序列片段；這些序列或位點將允許包括有義和M片段，以形成^JR發(fā)夾結(jié)構(gòu)。(^兄默構(gòu)建#^卜，載體必須包含肯予植物以特征的基因，所述特征允許區(qū)別轉(zhuǎn)基因的和非轉(zhuǎn)基因的植物，例如抗生素拔性。通過PCR和觀'J序來確證將形成^J^夾結(jié)構(gòu)的序列。e)將構(gòu)建的載體引入根瘤i^桿菌中將包含耙PI基因序列的區(qū)域的用于基因^at的構(gòu)建體并A^于植物的表錄體中；將該載^^多A^于植物轉(zhuǎn)化的感受態(tài)根瘤i^桿菌菌抹中。為此，^JUi^電穿孔的才棘，將包含攜帶^NtPistillata基因的區(qū)域的質(zhì)粒DM的沉絲因轉(zhuǎn)移入根瘤i^桿菌中。如果使用電穿孔，將60-300jil經(jīng)修飾的根瘤Ji^桿菌菌^0.5-3y1純化的沉JW^體"^t置于電穿孔室中。將所述電穿孔室方ii^電穿孑l/義中，并脅1.8-2.3KV的電壓5-7ms。^it^，將600jj1-lml細菌培養(yǎng)JJ^加到電穿孔室中。然后，將細M分收集到一個離心管中，將所述離心管;M^27-30。C和80-150rpm的搖動器中3小時。前述培#^必須在3000-6000rpm的i^l下離心2—12分鐘，并^包含細菌生長培養(yǎng)基的培^中，該培養(yǎng)基補M對于用沉J^因轉(zhuǎn)化了的根瘤土壤桿菌菌林的選棒性抗生素。將培^JDMt^在27-30。C下30-60小時。選棒lt抗生素必須是對于所用的根瘤i^桿菌菌^MMOIl載絲異的，例如，當(dāng)^f^J根瘤Ji^桿菌菌林GV3101^J5L默載體pHELLSGATE2、8或12時，培養(yǎng)基必須補充有下列抗生素慶大霉素、利福平和壯，Jit素(按照生產(chǎn)商的說明書)，其中前兩種抗生素與根瘤土壤桿菌菌林的選擇有關(guān)，而后者與載體選擇有關(guān)。待使用的細菌菌落通過^JU特異l!i引物的PCR;JMi行分析以測定轉(zhuǎn)基因的存在。f)用^D所i^a^載^i^ftf,的根瘤im桿菌來轉(zhuǎn)^f^Nt植物，M終轉(zhuǎn)化的植物i)制備根瘤土壤桿菌M^IIIL中取出攜帶^l^因的根瘤i^桿菌菌林，并在含有才所^11的載體和根瘤i^桿菌菌抹而確定的選棒性抗生素的液體細菌生^"養(yǎng)基中培養(yǎng)，于27-30。C以80-150rpm搖動培養(yǎng)24小時。第二天，將培養(yǎng)物以3000-6000rpm離心6-10分鐘，將細胞重懸浮于用70-200juM乙酰丁香酮修飾的植物特異的液*養(yǎng)基中，并放置于25-30。C以80-150rpm搖動，直到在600nm處的光密度鈔J0.5-0.7。該培養(yǎng)基將依賴于靶物種,例如對于番癡，所述液體培養(yǎng)基將僅包含蔗糖、來自MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog1962)的常*^微量營#^。對于葡萄花的夕卜植體(來自絲的花藥和子房)，待^^J的液^t養(yǎng)基是GSlCA(Franks等人1998)，其包含來自NN培養(yǎng)基(Nitsch和Nitschl969)的常量和微量元素、60g/L蔗糖，用NaOH調(diào)節(jié)至pH5.8并經(jīng)過高壓滅菌。ii)制備待轉(zhuǎn)化的外植體待轉(zhuǎn)化的夕卜植^^im^于^Wt，例如花藥、子房、子葉、胚軸、根、胚、胚K性愈傷組織等等。夕卜植體的制備還#^于#(^1的^#和^1只。iii)外植條化將外植全浸入在先前制備的包^^化的根瘤i^桿菌菌抹的細菌重懸浮液中，并放置在搖動器中于25-30X:以90-100rpm搖動。感染過程中逝去的時間，于待轉(zhuǎn)化的啦浙在15》嘴和24小時之間變化。擬艮瘤i^桿菌感染之后，將外植體用無菌級^M氐干燥,并##入共培養(yǎng)基(用于轉(zhuǎn)化的,的具有50-100/aM乙酰丁香酮的再生培養(yǎng)基)中，在22-30匸于黑暗中培養(yǎng)1-14天。通過使用無菌蒸鎦水'^#化的夕卜植體4^^去除多絲根瘤i^桿菌，所狄菌蒸餾水包樹定抗生素以清除根瘤i^桿菌(例如，1mg/L特美汀)。然后，將外植體轉(zhuǎn)移入用于靶物種的特定培養(yǎng)基中，其中必須添加載體^t物中所賦予的抗性所針對的抗生素(例如，卡那霉素、巴絲素、潮霉素等等)，用這種方法有可能選擇已有效地獲得轉(zhuǎn)基因的組織。此外,，培養(yǎng)基必須包含允許去斜艮瘤i^桿菌的抗生素(例如，特美汀)。這些夕卜植體在這種培養(yǎng)基中絲20-90天。將外植體繼4慎養(yǎng)，各14-40天，并M在具有8-18小時光照的光周期和25-28'C的培養(yǎng)室中。在一段對于^Nt特定的時間例如7-120天之后，將出現(xiàn)芽體(sprout),>^斤述芽體中有效轉(zhuǎn)基因的夕卜植^#能夠生長，因為它們已引入了賦予它們對于植物特異^4#4生抗生素的抗性的轉(zhuǎn)基因。相a，在抗生素存在下非轉(zhuǎn)基因的芽糾不會生長；這些芽體必須樹于Wft特異的培養(yǎng)基中與選##^--^^灘>(慎養(yǎng)。當(dāng)不將抗生素用作選##^彌時，那么對在載體中使用的才斜彌進^^當(dāng)?shù)臏y試《^必要的。g)評估根瘤i^桿菌污染的不存在，M過轉(zhuǎn)基因擴增來確iiE^基因植物將按照在前面步驟中的描ii/斤生長的轉(zhuǎn)基因芽體用iSff古根瘤i^桿菌污染的不存在；為此，必需從轉(zhuǎn)化的植物中提取少量樣品，通it^^頁域技^A員已知的任意技術(shù);JlUi^亍DM提取，并使用PCR來分析細菌特異l"生基因的存在，例如vir基因的存在。當(dāng)不存在細菌污染時，這些細菌特異f生基因應(yīng)當(dāng)不M擴增。一^9^角i^殳有細菌污染，必需在^"7jc平上分4/ftt物中轉(zhuǎn)基因的存在；為此，對于特定轉(zhuǎn)基因區(qū)^ii行PCR擴增，該區(qū)^A^fA^JlW^體中的M因的區(qū)域；^^的引物與在產(chǎn)生;X^載體中所^^的引物相同，其包含重組位點的""^^所用PI基因的序列的-^分。在這個步驟中，絲已獲得了轉(zhuǎn)基因的植物中觀廢到擴增。使^步驟(f)中鑒定的轉(zhuǎn)基因芽體中獲得的并在步驟(g)中才#基因情9Ui4tif估的植物進eit應(yīng)，^轉(zhuǎn)移到溫室條件下并置于M上，所述M^P取決于lfe^t，例如，1:1比例的土;^和^K巖。實施例l.轉(zhuǎn)化葡萄和番莊以獲得不育#^和單性果實a)從赤霞珠葡萄和番薪中獲得Pistillata編碼序列(PI)為了從葡萄(赤霞珠葡萄)和番癡中獲得PI同源基因，^^1MADS-box基因的已知序列來尋找保守結(jié)構(gòu)域，并基于它們產(chǎn)生簡并引物，因為這些基因?qū)儆贛ADS-box家族。然后，克隆兩個Pistillata-型的基因，并分別^Nt赤霞珠葡萄和番i5S^名為VvPI和LePI，其除了與PI具有高^J^同一'f^f還具有MADS-box基因的四個典型結(jié)構(gòu)域M、I、K和C;以及PI基因的特鵬構(gòu)域。從RM獲得來自兩^Nt的PI基因的編碼區(qū)域(cDNA),所述RNA對于VvPI是來自不成熟的花序，對于LePI是來自開花前階段的花。使用簡并引物通過RT-PCR來分離這兩個基因VvPI和LePI,它們的序列M隆到克隆載體(pGEM-TEasy,Promega)中，然后測序。通it^f至少四個獨立的克f^i^t測序來確證每個序列。用于獲得VvPI和LePI的cDNA序列的簡并引物通過^J^VectorNTI軟件ClustalW(版本8.0)來產(chǎn)生。4^1矩陣BL0SIM62，比對來自擬南芥的Pistillata(AAD1995)和屬于以下樹的四個Pistillata直向同源基因蘋果(施/ws必邁eW/ca)、煙草(Wco〃a加"6ac咖)、金魚草和歐洲白樺(5e^/ape/k/"7a)(分別是CAC28022、X67959、CAA48725、AJ488589)。扭個分析中，在聽S-box5'末端鑒定出了一個W高核苷酸同性的高同一'戰(zhàn)，在y末端鑒定出了另一個簇，兩者在C-絲^T在PI基因中非常保守的絲。這兩個簇,MiH殳計簡并引物以鑒別^因；合成的引物如下Pl-5、5、-ATGGGDMGWGGRAARRTHGA-3、；和P2-3、5、-TTWGGCTGMATHGGYTGVAC-3、；其中W=GCT，R=AG，H=ACT，M-AC，V=ACG，IMTG，Y=CT。通過3'RACE;jM^得來自這兩個基因的3'區(qū)域，而通過在來自Liu和Huang(1998)的A^糾下使用TAIL-PCR技術(shù)^_得5'區(qū)域。LePI和VvPI這兩個基因的基因l踏列^it過PCR從赤霞珠葡萄和番癡基因組DM中獲得。^JJCTAB^_絲(Porebski等人1997);Wlt葉中獲得DNA。這兩個基因包含7個外顯子和6個內(nèi)^，對于VvPI基因(赤霞珠葡萄Pistillata)在表l和圖1中詳細描述了相對位置。表l:VvPI基因的外顯子和內(nèi)^"<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>通過"f^JPAUP軟件/tofl/7"'〃〃"./g7to/啦/7/)4.0進行該序列的計算機輔助的系沈&生分析，確定赤霞珠葡萄的該序列應(yīng)當(dāng)屬于Pistillata/Globosa絲，其包括4^所描述的PI同源物。基于"^前的結(jié)果^H^！VectorNTI4.0it件，推導(dǎo)出VvPI^J^f列，包含212個^J^(SEQIDNo.5)。通itj;b寸VvPI和^t^PI同源基因中獲得的^J^^歹寸HM具有alignX應(yīng)用的VectorNTIadvance10軟件iMi行)，表明VvPI具有MADS-box基因的所有典型結(jié)構(gòu)域(MADS結(jié)構(gòu)域、間插結(jié)構(gòu)域、角蛋白樣結(jié)構(gòu)缺C-絲結(jié)構(gòu)域)，以;SJ^具有存在于大部分所描述的PI同源基物中的Pistillata結(jié)構(gòu)域。同樣的分析在LePI序列中發(fā)現(xiàn)了前述的結(jié)構(gòu)域。#^來說，來自擬南芥的已知Pisti1lata蛋白質(zhì)序列與VvPI和LePI蛋白質(zhì)之間的同一性百分比分別是49%和53.3°/。。LePI基因的cDNA序列和推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列(通過計^^LX具獲得的)的詳情顯示在SEQIDNo.6和7中。b)分析VvPI基因狄以測^"^J、對于Pistillata基因所描述的模式的表達在步驟(a)中得到的并在SEQIDNo.2中描述的VvPI基因表iiit過"fMVvPI特異性引物的RT-PCR^Ji行分析PID3ATGGGGAGAGGGAAGATTGAG;和PID4GTTTGGCTGAATTGGCTGCAC。從^1前述簡并？I物獲得的序列中設(shè)計這些可I物。這些引^N^I于在來自旨赤霞珠葡萄的不同組織的cDNA中進行RT-PCR。凈A^析的組織是葉、根、果實、種子和花。為進行^ii分析，通過4M8MLiCl技術(shù)(Vicient和Delseny，1999)獲得RNA，并J/f^l]l5i才幾六^^物(Invitrogen)和"StrataScript"逆轉(zhuǎn)^J^f按照生產(chǎn)商的說明(Stratagene)從該RM合成cDNA。為確證cDNA的完整l"生，擴增iE^型的G3PDH基因。#花組織中觀察到VvPI基因表達，這與文獻中的預(yù)期相一致。通過Northern印跡法評估專一J4M^且織中的VvPI基因表達(GoesdaSilva等人2005);扭匕測定法中使用了228-bp的探針，其使用以下引物合成VvPI3，UTR(F):GCAATGTGAGAGAGGTGGA;和VvPI3，UTR(R):GAGGGTAATGGCTGAAGGAG。絲步驟(a)中發(fā)現(xiàn)的并在SEQIDNO,3中描述的序列來設(shè)計這些引物'作為^L^型基因?qū)φ?，分析G3PDH基因的狄以測^^HM的RNAs是否具有適合用于該表達測定法的品質(zhì)。在這個測定法中，再次評估專一WE^i且織中的VvPI表達。c)分析前面獲得的赤霞珠葡萄Pistillata序列對于PI基因突變體的互補作用，以^H古所獲得的序列是否^y亍PI基因的功能為了確證VvPI不僅與Pistillata同源而JL^向同源的(棘同樣的功能)，在擬南芥PI突變^t物(pi-l)中進行互4Ht用測定法，以尋找突變體表型的逆轉(zhuǎn)。^/!1在SEQIDNo.2中描述的經(jīng)克隆的VvPI基因序列，從它的ATG趙會密碼子到它的TM終止密碼子，錄ii^體pC扁IA1302(CSIR0，Australia)中制備構(gòu)建體,其中編碼序列置于存在于載體中的細威型35S啟動子(CAMV35S)的控制之下。通it^JU以下引物>^^cDNA中擴增VvPI輛建稱為P35S-VvPI的構(gòu)建體PIIn:AAGCTTAGATCTATGGGGAGAGGGAAGA;和PIfin2:CACGTGTTATATCCTCTCCTGTAAGTT;其分別在5'和3'絲引入BglII和PmlI位點。將該片奴隆入^^JBgIII和PmII線性化的載體pCAMBIA1302中，VvPI基因替換gfp基因。所錄體在引入了該栽體的植物中賦予對于抗生素潮霉素的拔f生。^^I對于抗生素利福平具有拔性的根瘤i^桿菌菌抹GV3101。將前面形成的載糾過電穿孑L4^多到根瘤i^桿菌菌林GV3101中。為此，將80yl的根瘤土壤桿菌GV3101菌林和lyl栽體小量制備物(minipr印)(通過使用來自"MarligenBioscience"的栽^^取試劑盒并按照生產(chǎn)商的說明獲得)放置于電穿孔室中(0.2cm電極)。將所述電穿孔室^tA電壓2.18KV的電穿《W義中6.1ms。^it時間過去之后，將lmlLB培養(yǎng)基(IOg/L胰蛋白胨、5g/L酵母,物、10g/LNaCl)添加到電穿孔室中，收集內(nèi)^^并^A離心管中，于"匸和150rpm在搖動器中培養(yǎng)3小時。將構(gòu)建體P35S-VvPI引入擬南芥生態(tài)型Lerpi-l突變雜合檢眛中(Koornneef等人1983);對于該突變來說的純合突變體除萼片發(fā)育"卜顯示出異常的花器官(輪生體(verticils))發(fā)育，第二個輪生器官(花瓣)以小型的萼片而不是花瓣進行發(fā)育，第三個輪生器官(雄獲')沒有發(fā)育，和中央的^^育異常(Bowman等人1989)。這些植物沒有絲PI基因，因為它們具有早的終止密碼子。如所預(yù)期的，我們X!i^到，這些植物在不存44^的情況下發(fā)育出少量無籽果實。將^4在于根瘤i^桿菌菌抹GV3101中的載體pCAMBIA1302中的纟^a^型啟動子35S(35SCaMV)控制之下的VvPI基因cDNA(639bp)通過"Floraldip"才iUl引入擬南芥pi-l植物中(CloughSJ,BentAF.1998)。將*的pi-l擬南芥生態(tài)型Ler突變體的;^A包含根瘤土壤桿菌的蔗糖溶液中，所述根瘤i^桿菌是^^包含VvPI轉(zhuǎn)基因并具有對于抗生素潮霉素的抗性的栽^Mi行轉(zhuǎn)化的。在這一技術(shù)中，轉(zhuǎn)^4在于花中的生殖細胞，從而可以在由經(jīng)轉(zhuǎn)化的花產(chǎn)生的種子中獲得的第一^it物中尋找轉(zhuǎn)基因4M的轉(zhuǎn)化方案，"Floraldip",持續(xù)時間為4天，其中在第一天將用包含來自赤霞珠葡萄的PI基因(SEQIDNo.2)的載^^^化的根瘤i^桿菌菌林GV3101，物(20ju1)在5nil的細菌YBP培養(yǎng)基(10g/L細菌用蛋白胨、10g/L酵母4^^物、5g/LNaCl，pH7)中于28。C搖動培養(yǎng)48小時。第三天，從5ml的前鄉(xiāng)養(yǎng)基中取出1jLi1，并添加200ml的具有合適的細菌和載傾性抗生素(分別是利福平IOmg/L和慶大霉素25mg/L)的營M養(yǎng)基(YEP)。該溶:^28。C搖動^24小時。第四天，通過以3000g離心10^4中iM斤出細菌，然后重懸浮于含有5%蔗#o.05%表面活性劑的水中。將植物:^^X該溶液中10秒,然后M于正常的生長糾下(Gibeaut等人1997的7JO^培養(yǎng)基，在培養(yǎng)室中，在150jamo1邁—2s—'的;^"有效騎下，16/8光應(yīng)-黑暗小時，于24。C)。這些植物產(chǎn)生的種子在含有25mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基中生長以選擇轉(zhuǎn)基因植物，然后被^^多A^M^斤述的7jC^培養(yǎng)基中。在這些植物中通過PCR擴增和酶消化來分析基因型以尋找純合的pi-1突變>^1物。然后，通過PCR來^H古^i^i物中轉(zhuǎn)基因VvPI的存在。這些植物顯示了p卜l突^4型逆轉(zhuǎn)，即花WP雄蓖細胞的出現(xiàn)。jtb^卜，確證了文獻中的數(shù)據(jù)，其表明pi-l突變^t物顯示出在T^v^t的情況下形成無籽果實，其具有與野生型植物的微果實相比更小的尺寸。通ii&學(xué)顯孩M^分析了突變^i物的果實，以測定種子的不存在。i^f亍互4Ht用的it禾呈如下a)從赤霞珠葡萄中獲得Pistillata的編碼序列(PI);b)將構(gòu)建體P35S-VvPI引入pCAMBIA1302表ii^體中；c)將轉(zhuǎn)化的pCAMBIA1302載體引入根瘤i^桿菌菌林GV3101中；d)通過4M"Floraldip"技術(shù)用經(jīng)轉(zhuǎn)化的根瘤i^桿菌菌林GV3101轉(zhuǎn)化擬南芥pi-1雜合突變^L物；e)在含有潮霉素(25mg/ml)、pH5，7的MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中選擇轉(zhuǎn)基因種子。植物于40jumo1s"m—的光強下在生長室中生長；f)通it^基因組DNA中4^1PCR擴增237-bp的片IM^1"定P卜l純合突變^tt物(^R"有才娥步驟(e)的轉(zhuǎn)基因)，所述PCR特異于擬南芥PI基因的引物(F)GPI-15'TACCAGAAGTTATCTGGCAAGAAATCATG和(R)PIntron-Il5，CCAATTTCATGATATCTAGCTCAG，PCR絲為94°C3^4中，然后94X330秒、55'C40秒和72。C1^^中的35個循環(huán)，1^為^在721C10^4中。在于37^C進行4小時的消^^中，用限制酶EcoRV和BspHI切割經(jīng)擴增的片段，其中當(dāng)使用BspHI時突變朱在4%瓊脂糖中呈現(xiàn)出212-bp的條帶；g)通辦于來自推定的轉(zhuǎn)基因植物的DM進行PCR來確ii^"基因情況，其因VvPI的特定區(qū)域的另一個引物(CCCAGAGCCTCTTCCCAGACTGC),PCR糾是94匸3分鐘，以及94TC40秒、56。C1分鐘和72'Cl分30秒的35個循環(huán)，最后在72X:延伸7分鐘；h)，用VvPI轉(zhuǎn)基因補足的pi-l突變^^ti物的花的表型。^ft中在肉眼察:、、運用同樣的it禾l^L確證，LePI具有PI基因的功能。制備包含VvPI和LePI的基因;兄默構(gòu)建體為在稱沖赤霞珠葡萄和番癡中誘導(dǎo)VvPI和LePI基因的基因沉默，分別制備構(gòu)建體IS::VvPI(誘導(dǎo)的沉默赤霞珠葡萄Pistillata基因(InducedSilencingWf/sw'/2i7*eraPistillatagene))和IS::LePI(誘導(dǎo)的^L^番癡Pistillata基因(InducedSilencingZ/卿ers/co/7e鄉(xiāng)/e/^咖Pistillatagene))。對于構(gòu)建體IS::VvPI，從cDM中擴增出250-bp的片段，其M^苷酸390至639,相應(yīng)于VIP基因的編碼區(qū)域(SEQIDNo.2)的y區(qū)域。添;^^皮clonase酶識別的attBl和attB2區(qū)域，其通過重組在特異性沉默栽體pHELLGATE(CSIRO,Australia)中產(chǎn)生有義和M的片段，以形成;m^夾結(jié)構(gòu)。這個載^ii一步在轉(zhuǎn)基因植物中賦予對于抗生素巴絲素的拔性。對于構(gòu)建體IS::LePI，從cDNASEQIDNo.6中擴增出315-bp的片段，其從核苷酸495至809，其包含番癡Pistillata基因的yUTR區(qū)域。添;M皮clonase酶識別的attBl和attB2區(qū)域，其通過重組將有義和反義的片段引入載體Hellsgate2(CSIRO，Australia)中，從而產(chǎn)生沉JI^夾結(jié)構(gòu)。偵月PCR和測序來進^^成im^夾結(jié)構(gòu)的序列的確證。產(chǎn)生的載絲細菌中編碼對于抗生素壯X^素的抗性。e)將構(gòu)建的栽體引入根瘤i^桿菌中使用電穿孑Mf在步驟(d)中形成的沉默栽##^多入根瘤^^桿菌GV3101中。為此，必須將80ju1的根瘤i^桿菌GV3101菌林和1p1沉默載體小量制備物(minipr鄰)(通過使JU來自"MarligenBioscience"的載^^取試劑盒并按照生產(chǎn)商的說明獲得)放置于電穿孔室中(0.2cm電極)。將所述電穿孔室放入電壓2.18KV的電穿孑Lf義中6.1邁s。奴時間過去^，必須將lmlLB培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母^^物、10g/LNaCl)添加到電穿孔室中，收集內(nèi)，并放入離心管中，于28。C和150rpm在搖動器中培養(yǎng)3小時。將前述培養(yǎng)物以6000rpm離心3分鐘，！^;M^包含LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，所述LB培養(yǎng)基富含用于選擇用j:;U^/^^化的Ji^桿菌菌株的抗生素，即，50mg/L慶大霉素和10mg/L利福平用于土壤桿菌菌林GV3101,50mg/L壯，膽素用于選##1體IS::VvPI。將所ii^^jn^ti在28。C中48小時。選擇所形成的菌落^HMPCR進行測試，所述PCR的引物擴增^f入attB位點之間的VvPI基因區(qū)域，如下特異t生《1物attBl-2ACAAAAAAGCAGGCTCCTGGCCTTGCAAGTGTTCGC;和attB2-lACAAGA魔TGGGTGGCTGAATTGGCTGCACCC。這些引物被設(shè)計成用于測試轉(zhuǎn)化的成功，并包含耙序列的特定區(qū)域和對于被clonaseH"i只別所需的attB位點的部分，其通過重^a^載體pHELLGATE2中產(chǎn)生片段。在IS::LePI的情況下，^JU包含同樣的attB位點區(qū)J^a—個對于LePI片賴^U兌的特定區(qū)域的片段LePIattB2ACAAGAAAGCTGGGTGGGAAGAGCCCATAAAATTAGG,和LePIattBlACAAAAAAGCAGGCTCCAAAAGGAGATGGGAGCC。因此，這些引物允許測定在轉(zhuǎn)化的根瘤i^桿菌菌林GV3101中的^h轉(zhuǎn)基因的存在。f)用^^所i^L^載^i^刊,的根瘤i^桿菌^^^^t植物，M擇轉(zhuǎn)化的植物i)制^4艮瘤i^^桿菌^^m^集根瘤i^軒菌菌林GV3101，并在富含選棒性抗生素的LB培養(yǎng)基中于28。C和150rpm生"M:夜24小時對于根瘤i^桿菌菌林GV3101使用50mg/L慶大霉素和10mg/ml利福平，對于載體IS::VvPI或IS::LePI使用50mg/L壯M^素。次日，將細菌培養(yǎng)物以3000rpm離心10分鐘，重懸浮^^L物培養(yǎng)基中；對于番癡，這個培養(yǎng)基僅包含蔗糖、來自MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog1962)的常*#^^量營#。對于赤霞珠葡萄花的夕卜植體(來自;f^的;￡藥和子^)，^^J的液躲養(yǎng)基是GS1CA(Franks等人1998),其包含來自NN培養(yǎng)基(NUsch和Nitsch1969)的常量和微量元素、60g/L蔗糖，用NaOH調(diào)節(jié)至pH5.8并經(jīng)過高壓滅菌。葡萄的轉(zhuǎn)化ii)制^"待2^f匕的^^只^Mj)t自在PontificalCatholicUniversityofChile的田間條降下的實驗收集物的霞多麗葡萄(K/〃sw'/z27"eraL.cv.Chardonnay)中收集未成熟的花序。將所述#^帶入實驗室，妙在4。C48小時并接受體外滅菌處理(20%v/v次亞氯酸鈉,搖動20分鐘，使用無菌去離子水漂洗4次)。然后，在無菌條件下進行每個花的解剖，以iiJ'J隔離花藥和子房的目的，船在體外培養(yǎng)它們。才娥Franks等人(1998)描述的方法，從花藥和子房的體外培養(yǎng)中獲得能產(chǎn)生體細胞胚的胚iL^性愈傷組織，所述體細自具有形成完整植物的潛能。開始，將100個花藥和40個子房在被稱為PIV的胚M性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包舍來自NN培養(yǎng)基(Nitsch和Nitsch1969)的常量^^L量元素、MS維生素(Murashige和Skoog1962)、60g/L蔗糖，^j]NaOH調(diào)節(jié)pH為5.8并添加3g/L脫乙酰吉^l膠(gelrite)(Sig腿-AldrichCo.)，所述培養(yǎng)基經(jīng)過高壓滅菌并添加4，5jiiM2，4-D(2，4-二絲氧乙酸)和8.9BA(千絲噪呤)。將培絲于25匸##在黑暗中三個月，每30^fe新培養(yǎng)基中繼4慎養(yǎng)。然后，將產(chǎn)生的胚^jt性愈傷組織^MMtGS1CA的^f沐增殖培養(yǎng)基(固*養(yǎng)基)中培養(yǎng)。所艦養(yǎng)基包舍來自NN培養(yǎng)基的常量和微量元素、MS維生素、60g/L蔗糖、10yMN0A、lyMBA、20jaMIAA、2.5g/L活性炭(Merck)，使用NaOH調(diào)節(jié)pH為5.8，并添加5g/L脫乙酰吉蘭糖膠(Sig咖-aldrichco.)。將培絲于25'。##在黑暗中二個月，船每30A^新培養(yǎng)基中繼^^養(yǎng)。胚^jl性愈傷組織被^4一年而^M員失它們的胚胎;^能力，每兩個月輪換前面定義的PIV和GS1CA培養(yǎng)基。iii)^^經(jīng)^^的根瘤i^桿菌菌林GV3101轉(zhuǎn)化葡萄胚^A性愈傷纟JL^只。將來源于在固^"養(yǎng)基GS1CA中的兩個月培養(yǎng)的、具有球形狀態(tài)的體細胞胚的胚^jt性愈傷組織(100g)浸入前述的細菌重懸浮液(f-i)中，在28'C、90rpm下15分鐘。在^^)經(jīng)修飾的土壤桿菌菌株GV3101感染之后，■細l^培養(yǎng)物用無菌吸水紙3醒干燥。隨后，將這些胚胎轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基(具有100mM乙酰丁香酮的GSICA)中，于28X:在黑暗中48小時。通it^)包含lmg/ml抗生素特美汀的無菌的經(jīng)修飾的增殖培養(yǎng)基GS1CA(在ii中描述的)漂洗4次胚m生愈傷組織來去BHt量的根瘤嫂桿菌GV3101,所述抗生素特美汀起抑制根瘤i^桿菌的作用。使用lOOm過濾器(3M^網(wǎng)過濾器)AAJ^M^養(yǎng)基中收iys^jt性^r傷組織，并在含有l(wèi)mg/ml特美汀的固，養(yǎng)基GS1CA中于25'C在黑暗中培養(yǎng)。在30天^，將胚^A性愈傷組織在含有25mg/L巴M素的同樣培養(yǎng)基中繼4慎養(yǎng)30天，以允^^傷組織^^棒l"錄養(yǎng)JJi增殖。在從接種開始60天之后，將胚^A性愈傷組織在含有1mg/L特美汀和25mg/L巴龍霉素的無激素的GS1CA培養(yǎng)^Ji繼^^養(yǎng)，所述特美汀和巴素允許區(qū)愈傷組織于25'C在黑暗中保持生長30天。在這之后，體細胞魚雷期胚月沐成熟胚胎扭胎萌芽培養(yǎng)基中培輛外的30天，所鄉(xiāng)胎萌芽培養(yǎng)基包含來自MS培養(yǎng)基的微量元素和一半濃度的常量元素、MS維生素、30g/L蔗糖、2.5g/L活性炭(Merck)，NaOH調(diào)節(jié)pH為5.8并添加5g/L脫乙酰吉^t膠(Sig咖-AldrichCo.)，歸將所*養(yǎng)基高壓滅菌，并添加10nMIAA、1nMGA3(L6pezP6rez等人，2005)。將培絲維持在25匸，^MI16小時的it周期和40jumols—1m-2的光子流量密度。為了將萌芽的胚胎，即具有有著根頂軸(radical-apicalaxe)、胚軸延長和綠色子葉的^W構(gòu)的那些胚胎，轉(zhuǎn)^Ut物，將它們培養(yǎng)在具有20g/L蔗糖的一半鹽濃度的Murashige和Skoog培養(yǎng)基中，用NaOH調(diào)節(jié)pH為5.8，并添加7.0g/L瓊月旨(Merck);將培絲維持于25。C、16小時的;W期和40iamols-1of2的光子流量密度下。每30^i^灘4慎養(yǎng)。番癡的轉(zhuǎn)化iv)番癡植物的轉(zhuǎn)化按照Shaefer等人(2005)記栽的方法進行番癡的轉(zhuǎn)化。為此，使用市售的50%次氯離給番癡種子消毒，并在體外萌芽。在培養(yǎng)一周^，/A^近萌芽的幼苗中去除子葉。這些子葉用包^^體IS::LePI的才艮瘤i^^桿菌菌抹GV3101接種。載體的產(chǎn)生和將該載體引入根瘤i^桿菌菌林GV3101中這兩者均與前面關(guān)于赤霞珠葡萄所描述的一樣，將番癡外植#細菌一^MS培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2天，其;^tl^25t:并具有16小時的光期和40ymols-1m—2的光子流量密度的培養(yǎng)室中，所述MS培養(yǎng)基包含lmg/LBAP、0.1mg/LIAA、30g/L蔗糖、20mg/L乙酰丁香酮，pH為5.8,以及包含10g/L瓊月旨(Merck)。為阻jb^艮瘤i;^桿菌菌林GV3101的生長^H^芽體形成，針葉在添加了25mg/L巴絲素和1mg/ml特美汀辯含乙酰丁香酮的相同MS培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)8-10周。獲得的芽^包含怍為選擇培養(yǎng)。g)^H古i^桿菌污染的不存在，^i過轉(zhuǎn)基因擴增來確ii^基因植物在對于經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中的轉(zhuǎn)基因序列進^^測測定法之前，首先測甜艮瘤i^桿菌菌林GV3101污染的存在。為此，選擇胚胎^A^i且織(對于赤霞珠葡萄)和葉(對于番癡)。Ail些M^只中提取DM，M過擴增VirG基因的序列來測甜艮瘤i^桿菌菌抹GV3101的可能污染，所述VirG基因^(5l4在于細菌中而不存在于植物中。因此，證明了不存擬艮瘤i^桿菌GV3101污染。為了^"測植物組織中VvPI的轉(zhuǎn)基因^J^列的存在，^^特異性引物W增所*列。attB1-2ACAAAAAAGCAGGCTCCTGGCCTTGCAAGTGTTCGC;和attB2-lACAAGAAAGCTGGGTGGCTGAATTGGCTGCACCC，其允許區(qū)分所ii^列與內(nèi)源序歹'J。才Nt在Espinoza等人(2006)中記載的方法來分離用于PCR擴增^的基因組DNA。對于番莊的情況，實施對于赤霞珠葡萄所描述的相同程序，^該情況下4^4t異性引物L(fēng)ePIattB2ACAAGAAAGCTGGGTGGGAAGAGCCCATAAAATTAGG，和LePIattBlACAAAAAAGCAGGCTCCAAAAGGAGATGGGAGCC，其允"i午擴增轉(zhuǎn)基因LePI的序列。這樣，1^r查了在轉(zhuǎn)化的植物中所i^因的存在。最終，使才娥步驟(f)的描述而獲得的并##步驟(g)的描述檢查了轉(zhuǎn)基因情況的植物生根，并l^多AJi^和珍珠巖1:1的^^中，所ii^得的植物在番癡的情況下來自轉(zhuǎn)基因的芽體，或者在葡萄的情況下來自轉(zhuǎn)基因的胚胎,其中所述植物在25'C的生長室中生長。這些幼苗通過^^)塑被明玻璃絲來防ihfL7K。在5天的適應(yīng)之后，將植物轉(zhuǎn)移到溫室中。參考文獻*AcciarriNazzareno，RestainoF.，VitelliG.，PerroneD.，ZottiniM-，PandolfiniT.，SpenaA.andRotinoG.L2002.Geneticallymodifiedparthenocarpiceggplants:improvedfruitproductivityunderbothgreenhouseandopenfieldcultivation跳Biotechnol.;2(1):4*Ampomah-DwamenaC，MorrisBA，SutherlandP，VeitB，Yao幾.2002.Down-regulationofTM29,atomatoSEPALLATAhomolog,causesparthenocarpicfruitdevelopmentandfloralreversion.PlantPhysiol.;130(2):605—17*BargR,MeirE，LapushnerD，F(xiàn)rankelR，SaltsY.1990.Differentialregulationofafruit-specific62kDaproteinindevelopingparthenocarpic(pat-2/pat-2)andseededtomatofruits.PhysiolPlant80:417-424*Bianchi，A.andSoressi，G.P.1969.Mutantidipomodoroartificialmenteindottisuscettibilidiutilizzazionenelmiglioramentogenetico.SementiBletteXV3:2-6*BowmanJ.，SmythD.，MeyerowitzE.1989.GenesdirectingflowerdevelopmentinArabidopsis.ThePlantCell1:37-52*CloughSJ，BentAF.1998.Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofAra6油/w/stAa/Za肌PlantJ.16(6):735-43.*Coombe，B.G.1975.Thedevelopmentoffleshyfruits.Ann.Rev.PlantPhysiol.27，507-528*Chandler,J丄，Z.ViloriaandJ.W.Grosser.2000.Acidcitrusfruitcultivarimprovementviainterploidhybridization.Proc，F(xiàn)la.StateHortic.Soc.113:124~126.*Deng,X.X.，W.W.GuoandX.H.Sun.1996.AdvancesinbreedingandselectionofseedlesstypesofCitrusinChina.ActaHortic.Sin.23:235—240.*Donzella，G，Spena，A，&Rotino，GL.2000.Transgenicparthenocarpiceggplants:superiorgermplasmforincreasedwinterproduction.MolBreed,6:79-86.EspinozaC.，Vega，A.，Medina,C.，Schlauch，K.，Cramer,G.andArce-Johnson，P.2006.Analysisofgeneexpressionassociatedwithcompatibleviraldiseasesingrapevinecultivars(accepted,FunctionalandIntegrativeGenomics).Ficcadenti，N，Sestili，S，Pandolfini，T，Cirillo，C，Rotino，GL，&Spena，A，1999.Geneticengineeringofparthenocarpicfruitdevelopmentintomato.MolBreed,5:463-470.FranksT，HeGangDandThomasM1998.RegenerationoftransgenicP7"sW/327"eraLSultanaplants:genotypicandphenotypicanalysis.MolecularBreeding;4:321-333.*Gamborg0L，MillerRA，Oji咖K.1968.Nutrientrequirementsofsuspensionculturesofsoybeanrootcells.ExpCellRes.50:1515-1518.Garcia~MartinezJL，HeddenP.1997，Gibberellinsandfruitdevelopment.InFATom^s-Barbe由，RJRobins,Eds，PhytochemistryofFruitandVegetables.ClarendonPress,Oxford,pp263-286.GeorgeWL，ScottJW,SplittstoesserWE.1984.Parthenocarpyintomato.HorticRev6:65-84*GillaspyG，etal.1993.Fruits:adevelopmentalperspective.PlantCell5:1439-1451*GibeautDM,HulettJ，CramerGR，See咖nnJR(1997)MaximalbiomassofArabidopsisthalianausingasimple,low-main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opersiconesculentum)的LePI基因；以及這些基因用于產(chǎn)生不育雄花和無籽或單性果實的用途。此外，還公開了包含這些序列或其部分的沉默載體。文檔編號C12N15/82GK101275139SQ20071016915公開日2008年10月1日申請日期2007年11月30日優(yōu)先權(quán)日2006年12月1日發(fā)明者豪爾赫·帕特里西奧·阿爾塞·約翰遜,費爾南·費德里西·諾埃,阿格尼絲·卡達維德·拉夫拉達,馬里亞·何塞菲娜·波平·斯溫伯恩,馬里亞·孔蘇埃洛·梅迪納·阿雷瓦洛申請人:智利天主教教皇大學(xué)