專利名稱：利用特異基因序列鑒別藥用靈芝的檢測方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及的是一種分子生物工程技術(shù)領域的檢測方法，具體地涉及一種利用 特異基因序列鑒別對藥用靈芝的檢測方法。
背景技術(shù)：
對于藥用靈芝的檢測，傳統(tǒng)的鑒定方法主要是依靠形態(tài)學鑒定，主要是靈芝子 實體的形、色、氣、味、質(zhì)地等外觀性狀觀察，該方法簡便、直接，缺點是主觀性 強，其準確性完全取決于檢驗者的經(jīng)驗判斷，且難以鑒定加工炮制后的碎片或粉末 藥材。目前較多的是從生物分類學(基原鑒定)、組織學(顯微鑒定)、化學(理 化鑒定)角度建立了相對比較客觀的檢測標準；同時，隨著科學技術(shù)的發(fā)展，細胞 學、酶學(同工酶分析)、生物化學(蛋白質(zhì)分析及效價評價)、血清學(免疫測 定)等生物技術(shù)亦逐漸應用到靈芝鑒定中來。分子生物學研究發(fā)現(xiàn)，中藥(不含礦 物類)所依賴的生物資源一 "物種"的多樣性是由于其基因(核苷酸序列)多態(tài)性 的結(jié)果，而基因(核苷酸序列)多態(tài)性可在分子水平上檢測，它比在形態(tài)、組織和 化學水平上檢測更能代表中藥的遺傳變異。
以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列的變異為基礎進行個體的鑒別方法稱為分子標 記 (Molecular Genetic Markers) 或分子診斷技術(shù) (DNA-Based Diagnostic Techniques)，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。與其他幾種標記一形態(tài)學標記、 生物化學標記、細胞學標記相比，DNA分子標記具有明顯的優(yōu)越性分子標記揭示 來自DNA的變異；表現(xiàn)為中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無連鎖；檢測 手段簡單、迅速。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在DNA分子標記技術(shù)已有數(shù)十種， 廣泛應用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關系鑒別、基因庫構(gòu)建、 基因克隆等方面。利用特異基因序列進行鑒別是分子標記的一種新的類型，他是基 于PCR和(或)限制性酶切技術(shù)的DNA標記，他能反映生物個體或種群間基因組中 某種差異的特異性?；赑CR技術(shù)的基本原理是利用鑒別物種已知的DNA序列，通 過比對，找出每一個物種特有的DNA序列，設計出一套特異性的PCR引物(19-27bp)，
然后用這一引物擴增出該物種的一段特異的DNA序列，凝膠電泳，染色并對條帶進 行分析。此方法揭示的是特異片段的有和無的信息?；赑CR和限制性酶切技術(shù)的 DNA標記是利用鑒別物種的特征序列(如與此物種功能相關的基因)，設計出一對 特異性的PCR引物(19-27bp)，然后用這些引物擴增該位點上的某一DNA片段，接 著用一或兩種專一性的限制性內(nèi)切酶切割所得擴增產(chǎn)物，凝膠電泳分離酶切片段， 染色并對條帶進行分析。此方法揭示的是特異片段的限制性長度變異的信息。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，蘇春麗、唐傳紅、張勁松、潘迎捷，文章名稱 基于e-微管蛋白基因部分序列探討靈芝屬菌株的親緣關系(菌物學報，2006，25(3): 439 445)，研究者利用e-微管蛋白基因部分序列對靈芝屬菌株的親緣關系進行了 探討，利用特征序列進行物種的鑒別是一種較新的分子標記技術(shù)，在藥用靈芝的鑒 別研究中，利用此特異序列可對樹舌亞屬、紫芝組和靈芝組之間的菌株進行鑒別。 但上述文章涉及的技術(shù)不能區(qū)分靈芝組內(nèi)的菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種利用特異基因序列鑒別藥 用靈芝的檢測方法，本發(fā)明利用PCR擴增、序列測定和(或)限制性內(nèi)切酶酶切技 術(shù)對藥用或食用靈芝菌株、原藥材，精粉，切片、孢子粉以及破壁孢子粉特異基因 序列(真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的編碼區(qū)和非編碼區(qū)序列)進行鑒定，以獲得藥用靈 芝特異的序列特征和電泳檢測圖譜。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
本發(fā)明具體包括如下步驟-
(1) 購回的市售藥用靈芝菌株，保藏和培養(yǎng)；
放在4℃冰箱保藏，每3 5個月更換一次培養(yǎng)基。將斜面菌株放至28℃活化 24h，挑取斜面試管菌種的菌絲接至PDA固體培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng)7d。用 接種鏟將lcm2左右的平板菌種接至YPS液體培養(yǎng)基，并搗碎。28℃， 120rpm震蕩培 養(yǎng)。
(2) 將培養(yǎng)好的藥用靈芝菌絲體經(jīng)洗滌沉淀，研磨成粉末狀； 將培養(yǎng)好的菌絲體10， OOOg離心10min，去上清，加入PBS緩沖液洗滌沉淀三次，用液氮將洗滌好的菌絲體研磨成粉末狀。
(3) 藥用靈芝DNA的提取和純化；
(4) 藥用靈芝特異基因序列的序列測定、PCR產(chǎn)物的電泳檢測和限制性內(nèi)切酶 酶切產(chǎn)物的電泳檢測；
(5) 從藥用靈芝的菌絲中擴增出的336bp和721bp的特異性條帶，通過進一步 的序列測定和酶切電泳，發(fā)現(xiàn)差異，利用差異進行鑒別；
(6) 從藥用靈芝菌絲中可分別擴增出580bp、 495bp和836bp的特異性條帶， 通過電泳檢測，發(fā)現(xiàn)差異，利用差異進行鑒別，判定檢測結(jié)果。
根據(jù)所使用特異引物的不同分三個層面進行結(jié)果判定①選用特異引物(FIPA 和FIP B)從所選藥用靈芝菌絲中均能擴增出大約336bp的特異性條帶，通過序列 比對，發(fā)現(xiàn)差異，利用序列差異進行初步鑒別，判定檢測結(jié)果；②選用特異引物 (FIPGLUF和FIPGLUR、 FIPGSIF和FIPGSIR、 FIPGTSF和FIPGTSR)可分別從藥用靈 芝的不同種中擴增出大小不同的特異性條帶(580bp、 495bp、 836bp)，通過電泳檢 測，發(fā)現(xiàn)差異，利用電泳條帶大小和有無進行鑒別，判定檢測結(jié)果；③選用特異引 物(FIPGF和FIPGF)從所選藥用靈芝菌絲中均能擴增出大約721bp的特異性條帶， 通過限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物的電泳檢測，發(fā)現(xiàn)電泳條帶的差異，利用條帶差異進行 鑒別，判定檢測結(jié)果。
所述的藥用靈芝，包括赤靈芝(G. lucidum)、紫芝(G. sinense)、松杉 靈芝(G. tsuage)。
步驟(3)中所述的藥用靈芝DNA的提取和純化，采用高鹽低pH提取法提取基因 組DNA，包括(并不限于)以下步驟
① 經(jīng)液氮研磨的樣品(大約lg)放入65。C預熱的提取緩沖液，放入65。C水浴保 溫30min,不時緩慢振搖，室溫下10，000Xg離心10min;
② 在上清液中加入2/3體積的KAc高鹽溶液，混勻后置于(TC保持30min以沉淀蛋 白質(zhì)；
③ 在4'C下10，000Xg離心10min，棄蛋白質(zhì)沉淀。上清液加入等體積的氯仿/異 戊醇(24/1)抽提，在6，000Xg離心10min，取出水相轉(zhuǎn)入另一離心管，
如果中間層仍有白色沉淀，則再用氯仿/異戊醇(24/1)抽提一次；
④ 在上清液中加入2/3體積的預冷異丙醇，混勻后置于—2(TC靜置30min，以沉 淀核酸，可以重復一次，用70%乙醇清洗沉淀，在空氣中干燥50min，將DNA沉淀溶 解在合適體積的TE緩沖液中，分裝存放于-2(TC或4'C冰箱中保存。
步驟(3)中藥用靈芝DNA的檢測，采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外光譜法進行檢測， 包括以下步驟
① 取10ul DNA溶液，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠電泳成像系統(tǒng)分析結(jié) 果及攝取圖像。
② 吸光值的測定提取的DNA經(jīng)50倍稀釋后，于紫外可見分光光度計上測定其 濃度和純度。
所述步驟(4)藥用靈芝特異基因序列的序列測定、PCR產(chǎn)物的電泳檢測和限制 性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物的電泳檢測，是通過以下三部分內(nèi)容來實現(xiàn)的 第一部分藥用靈芝特異基因序列的測定，包括以下步驟 所述的藥用靈芝特異基因的序列測定，包括以下步驟-
① 引物的設計
上游引物FIP A: 5， -ATGTCCGACACTGCCTTGATCTTCAGG-3，，
下游引物FIP B: 5， -CTAGTTCCACTGGGCGATGATGAAGTC-3，；
② PCR擴增
PCR擴增的總反應體系如下，總體積25ul，單位(ul):
Tag Ex DNA polymerase (TaKaRa) 0. 25
10XPCR Buffer 2. 5
dNTP Mix (2.5 mM) 2.0
MgCl2 (25mM) 1.5
■ 0.5
FIP A (10 u M) 0. 5
FIP B (10 uM) 0.5
PCR-Grade Water 17. 25
總體積 25
PCR程序95。C變性5min,(95。C變性30sec, 6(TC退火30sec， 72。C延伸 40sec)共進行35個循環(huán)，72°C延伸10min。反應結(jié)束后取5 w L產(chǎn)物電泳檢測。 ③PCR擴增片段的回收、連接
使用膠回收試劑盒回收片段(按膠回收試劑盒的步驟操作)。
采用T-A系統(tǒng)將DNA片段與pMD 18-T載體連接，反應體系如下，總體積10 u 1， 單位(Ul):
pMD18-T VectorDNA 1 回收片斷 1連接溶液I5無菌水3總體積 10
反應條件16°C， 30min以上。連接好的片段可用于轉(zhuǎn)化。
④ PCR擴增片段的轉(zhuǎn)化
感受態(tài)細胞的制備在工作平板上挑取DH5 a單菌落接種到20-30mL無抗生素 的LB培養(yǎng)基中，在240-260rpm搖床中37。C搖菌至OD6。。=0. 5 (約6 8h);取出菌液 與0. 1M CaCl2同時置于冰浴中15~30min;在滅菌的超凈臺上取1.5mL菌液于 1.5mL-EP管中，4。C5000 8000rpm離心5 min收集菌體；用移液器吸去上清，并用 500uL冰冷的0.1M CaCL重懸菌體；離心后用移液器盡可能吸去上清，用200uL 冰冷的0. 1M CaCl2重懸菌體，置冰浴過夜備用。
轉(zhuǎn)化采用常規(guī)的分子生物學方法進行轉(zhuǎn)化。將10u 1連接片段與100y 1感受 態(tài)細胞混合；放置冰上，30min; 42。C水浴放置90sec;放置冰上1-2min;加入800 u 1 LB培養(yǎng)液，在搖床(37°C， 200rpm)中培養(yǎng)lh;取100u 1溶液均勻涂在LB平板 上(含Amp， X-gal， IPTG);培養(yǎng)箱(37°C)中培養(yǎng)過夜。
⑤ 陽性菌落的鑒定
取白色菌落用菌落PCR法或轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的酶切鑒定陽性菌落。
⑥ 序列測定。
第二部分藥用靈芝赤靈芝(G. lucidum)、紫芝(G. sinense)和松杉靈芝 (G. tsuage)特有基因序列PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測。
所述的赤靈芝(G. lucidum)特有基因序列的PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測，包括 以下步驟
① 引物的設計(primer design)
FIPGLUF: 5' - GGGGTTGCATCC-AGGTCCACCTG-3'
FIPGLUR: 5' - CGCTATGCCATACCCGGAGTTG -3'
② PCR擴增(PCR amplification )
PCR擴增的總反應體系如下，總體積25ul，單位(ul):Tag Ex DNA polymerase (TaKaRa)0. 25
10XPCR Buffer2.5
dNTP Mix (2. 5 mM)2. 0
MgCl2 (25mM)1.5
DNA0. 5
FIPGLUF (10 wM)0.5
FIPGLUR (10 pM)0.5
PCR-Grade Water17.25
總體積25
PCR程序:95℃ 變性5min，(95℃ 變性30sec, 60'C退火30sec, 72。C延伸 40sec)共進行35個循環(huán)，72°C延伸10min。反應結(jié)束后取5 u L產(chǎn)物電泳檢測。
③電泳檢測(electrophoresis detection)
取PCR產(chǎn)物lOy l，在1XTAE電泳緩沖液下經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染 色后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶和拍照。
所述的紫芝(G. sinense)特有基因序列的PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測，包括以 下步驟
① 引物的設計(primer design)
FIPGSIF: 5'- GGGGTTGCATCC-AGGTCCACCTG-3' FIPGSIR: 5' - ACCCCMCAGGTTCGTCGACAACG-3'
② PCR擴增(PCR amplification)
PCR擴增的總反應體系如下，總體積25pl，單位(ul):
Tag Ex DNA polymerase (TaKaRa)0.25
10乂PCR Buffer2. 5
dNTP Mix (2. 5 mM)2.0
MgCl2 (25mM)1.5
DNA0.5
FIPGSIF (10 uM)0. 5
FIPGSIR (10 yM)0.5
PCR-Grade Water17.25
總體積25
PCR程序95。C變性5min, (95。C變性30sec， 60。C退火30sec， 72℃ 延伸 40sec)共進行35個循環(huán)，72°C延伸10min。反應結(jié)束后取5 u L產(chǎn)物電泳檢測。
③電泳檢測(electrophoresis detection)
取PCR產(chǎn)物10μl，在1XTAE電泳緩沖液下經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶和拍照。
所述的松杉靈芝(G. tsuage)特有基因序列的PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測，包括以下步驟
① 引物的設計(primer design)
FIPGTSF: 5'- TACGAGGGTTTCACGCCGAGGTTC -3'
FIPGTSR: 5' - AAACTCGGCCGCGATAGAGAAGCA -3'
② PCR擴增(PCR amplification)
PCR擴增的總反應體系如下，總體積25μl，單位(μl):
Tag Ex DNA polymerase (TaKaRa) 0. 25
10XPCR Buffer 2.5
dNTP Mix (2.5 mM) 2.0
MgCl2 (25mM) 1.5
DNA 0.5
FIPGTSF (10 μM) 0. 5
FIPGTSR (10 μM) 0.5
PCR-Grade Water 17.25
總體積25
PCR程序95。C變性5min,(95℃變性30sec, 60℃退火30sec, 72℃延伸 40sec)共進行35個循環(huán)，72℃延伸10min。反應結(jié)束后取5 μ L產(chǎn)物電泳檢測。
③電泳檢測(electrophoresis detection)
取PCR產(chǎn)物10 μl，在1 XTAE電泳緩沖液下經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶和拍照。
第三部分藥用靈芝特異基因序列的PCR擴增產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶酶切的電泳檢測；包括以下步驟
①引物設計(primer design)
FIPGF: 5' -CTGTGGCTTGCAGGGCCTCGCAC-3，
FIPGR: 5，- CTTGTCTCATAATCATGCCCGTG-3，
②PCR擴增(PCR amplification)
PCR擴增的總反應體系如下，總體積25ul，單位(ul):
Tag Ex DNA polymerase (TaKaRa) 0. 25
10XPCR Buffer2. 5
dNTP Mix (2. 5 mM) 2.0
MgCl2 (25mM) 1.5
DNA 0. 5
FIPGF (10 uM)0.5
FIPGR (10 uM)0. 5
PCR-Grade Water 17. 25
總體積25
PCR程序95。C變性5min,(95。C變性30sec, 60。C退火30sec, 72。C延伸 40sec)共進行35個循環(huán)，72°C延伸10min。反應結(jié)束后取5 u L產(chǎn)物電泳檢測。
③ 電泳檢測(electrophoresis detection)
取PCR產(chǎn)物lOix l，在1XTAE電泳緩沖液下經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染 色后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶和拍照。
④ PCR產(chǎn)物的回收(recovering PCR products)
使用膠回收試劑盒回收片段(按膠回收試劑盒的步驟操作)。
⑤ 酷切(enzyme cleaving)
在1. 5mL-EP管中加入下列試劑，總體積25iU，單位(u 1):
膠回收片斷 5
10X buffer 5
100XBSA 1
酶(Acc III or Ava II) 1
ddH20 8
總體積 20
混勻后在37。C (Ava II)或60。C (Acc III)酶切過夜。取酶切產(chǎn)物10ul， 在IXTAE電泳緩沖液下經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后，用凝膠成像系統(tǒng) 觀察電泳條帶和拍照。
步驟(5)中所述的從所選藥用靈芝菌絲中均能擴增出大約336bp的特異性條帶，是指以提取的靈芝菌絲DNA為模板，使用上游引物FIP A和下游引物FIP B，進 行標準程序的PCR擴增，從藥用靈芝(包括赤靈芝G. lucid咖、紫芝G. sinense 和松杉靈芝G. tsugae)菌絲中均能擴增出大約336bp的特異性條帶。
步驟(5)中所述的通過序列比對，發(fā)現(xiàn)差異，利用序列差異進行初步鑒別，是 指在克隆出赤靈芝(G. lucidum)、紫芝(G. sinense)和松杉靈芝(G. tsugae) 336bp特異基因序列基礎上，通過測序后進行序列比對，發(fā)現(xiàn)赤靈芝(G. lucidum) 和松杉靈芝(G. tsugae)這336bp特異基因序列沒有差異，而兩者與紫芝(G. sinense)的336bp特異序列有差異，利用這些差異可以進行赤靈芝(G. lucidum)、 松杉靈芝(G. tsugae)和紫芝(G. sinense)的鑒別。
步驟(5)中所述的利用電泳條帶大小和有無差異進行鑒別，是指通過步驟(3) DNA的提取和純化的實施，應在電泳圖上顯示提取的DNA樣品沒有降解；通過步驟(4) 的實施從電泳圖譜上能觀察到從所選三種藥用靈芝中均能擴增出大小不同的特異性 條帶，通過觀察電泳圖譜上擴增條帶的大小和有無來進行鑒別；引物FIPGLUF和 FIPGLUR是用來擴增赤靈芝(G. lucidum)的特異引物，可擴增得到大約580bp的的 特異性條帶；引物FIPGTSF和FIPGTSR是用來擴增松杉靈芝(G. tsugae)的特異引物， 可擴增得到大約836bp的特異性條帶。引物FIPGSIF和FIPGSIR是用來擴增紫芝(G. sinense)的特異引物，可擴增得到大約495bp的特異性條帶。
步驟(5)中所述的利用條帶差異進行鑒別，是指將從所選藥用靈芝菌絲中擴 增出的大約721bp的特異性條帶分別用限制性內(nèi)切酶Acc III (T*CCGGA)進行酶切， 從赤靈芝(G. lucidum)和松杉靈芝(G. tsugae)種來的721bp的特異性條帶，酶 切產(chǎn)物電泳時顯示出大約442 bp和270 bp兩個條帶，從紫芝(G. sinense)種來的 721bp的特異性條帶，酶切產(chǎn)物電泳時顯示出大約721bp的一個條帶；同時將擴增得 到的這個721bp的特異性條帶分別用限制性內(nèi)切酶Ava11 (G*GWCC)進行酶切，從紫 芝(G. sinense)種來的721bp的特異性條帶，酶切產(chǎn)物電泳時顯示出大約402 bp， 48 bp和262 bp的三個條帶(由48bp條帶太小，不宜被看清，故主要通過判斷402bp 和262bp兩個條帶的有無來進行鑒定)。從赤靈芝(G. lucidum)和松杉靈芝(G. tsugae)種來的721bp的特異性條帶，酶切產(chǎn)物電泳時顯示出大約721bp—個條帶。
本發(fā)明利用特異基因序列對三種靈芝— 一赤靈芝(Ganodermalucidum)、紫芝 (Ganaderma sinensis)和松杉靈芝(Ganoderma tsuage)進行鑒別，能夠有效地
確定藥用靈芝的分類地位，對藥用靈芝產(chǎn)品原料藥的來源鑒定提供了簡單、快速、 準確的鑒別方法，為靈芝藥用產(chǎn)品的研發(fā)和臨床應用使用劑量的確定奠定了基礎， 為中藥加快現(xiàn)代化的步伐。
本發(fā)明所涉及的菌種來源于中國北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心(CGMCC)，其簡稱和保藏編號、保藏單位名稱具體如下
所述的赤靈芝(Ganoderma lucidum)來源于中國普通微生物保藏管理中心 (China General Microbiological Culture Collection Cente英文縮寫CGMCC), 編號AS 5.65;保藏單位廣東省微生物研究所菌種保藏中心(Microbiological Culture and Collection center of Guangdong Institute of Microbiology) 保 藏編號GIM 5.9;
所述的紫芝(Ganaderma sinensis)來源于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心 (Agricultural Culture Collection of China英文縮寫ACCC )編號51332;
所述的松杉靈芝(Ganoderma tsuage)來源于中國普通微生物保藏管理中心 (China General Microbiological Culture Collection Center英文縮寫CGMCC) 菌種編號:5.0542。
具體實施例方式
以下結(jié)合實驗室具體的試驗數(shù)據(jù)對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以 本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發(fā)明的保 護范圍不限于下述的實施例。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建 議的條件。
實施例1
利用特異基因序列進行藥用靈芝菌種的鑒定。 1.菌絲體的培養(yǎng)(culture the mycelia)
靈芝(G.lucidum)菌種，來源于廣東省微生物研究所菌種保藏中心MCCGM (GIM 5.11， GIM 5.250， GIM 5.251， GIM 5.257， GIM 5.259)、中國農(nóng)業(yè)微生物 菌種保藏管理中心(ACCC) (50088)、華中食用菌栽培研究所(南韓靈芝)、上 海農(nóng)科院食用菌研究所(紅靈芝)、黑龍江科學院應用微生物研究所(韓國靈芝)、四川省農(nóng)科院土壤肥料所(靈芝)、山東農(nóng)業(yè)大學(泰山靈芝)。購回的菌株的培 養(yǎng)、保藏具體操作步驟同本發(fā)明步驟(1)的具體內(nèi)容。
2. 菌絲體的準備(preparation the mycelia) 菌絲體的準備的具體操作步驟同本發(fā)明步驟(2)的具體內(nèi)容。
3. 菌絲體基因組DNA提取(extractiontheDNAofmycelia) 選取高鹽低pH提取法提取基因組DNA，具體操作步驟同本發(fā)明步驟(3)的
具體內(nèi)容。
4. DNA的檢測(detection of DNA)
采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外光譜法進行檢測，具體操作步驟同本發(fā)明步驟(4) 的具體內(nèi)容。
5. 弓l物設計(primer design)
根據(jù)我們的實施方案設計五對引物，引物FIP A和FIP B對、引物FIPGLUF和 FIPGLUR對、引物FIPGTSF和FIPGTSR對、引物FIPGSIF和FIPGSIR對、引物FIPGF和FIPGR 對。引物序列同本發(fā)明步驟(5)、 (6)的具體內(nèi)容。
6. PCR擴增(PCR amplification)
反應程序94。C變性5min后，按照94。C變性30sec; 60。C退火30sec; 72°C， 延伸40sec進行35個循環(huán)，最后在72'C延伸10min。
7. PCR產(chǎn)物的電泳檢測(electrophoresis detection)
PCR產(chǎn)物在1XTAE電泳緩沖液下經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后，用凝 膠成像系統(tǒng)拍照。
使用引物FIPA和FIPB對可擴增出赤靈芝(G. lucidum)、紫芝(G. sinense) 和松杉靈芝(G. tsugae)三個藥用靈芝的特異基因序列，在電泳圖上可見大約336bp 的特異性條帶；使用引物FIPGLUF和FIPGLUR對可擴增出赤靈芝(G. lucidum)特 有的基因序列，在電泳圖上可見大約580bp的特異性條帶；使用引物FIPGTSF和 FIPGTSR對可擴增出松杉靈芝(G. tsugae)特有的基因序列，在電泳圖上可見大約 836bp的特異性條帶;使用引物FIPGSIF和FIPGSIR對可擴增出紫芝(G. sinense) 特有的基因序列，在電泳圖上可見大約495bp的特異性條帶；使用引物FIPGF和 FIPGR對可擴增出赤靈芝(G. lucidum)、紫芝(G. sinense)和松杉靈芝(G. tsugae) 三個藥用靈芝的特異基因序列，在電泳圖上可見大約721bp的特異性條帶。
在電泳圖譜上可根據(jù)三對引物的擴增結(jié)果進行鑒定。弓l物FIPGLUF和FIPGLUR 對只能將屬于赤靈芝(G. lucidum)種的基因序列進行擴增，在電泳圖上可見大約 580bp的特異性條帶；而不能將非赤靈芝(G. lucidum)的種進行擴增；引物FIPGTSF 和FIPGTSR對只能將屬于松杉靈芝(G. tsugae)種的基因序列進行擴增，在電泳圖 上可見大約S36bp的特異性條帶；而不能將非松杉靈芝(G. tsugae)種的基因序列 進行擴增；引物FIPGSIF和FIPGSIR對只能將屬于紫芝(G. sinense)種的基因序 列進行擴增，在電泳圖上可見大約495bp的特異性條帶；而不能將非紫芝(G. sinense)種的基因序列進行擴增。
8. 序列測定(sequence determination)
將從赤靈芝(G. lucidum)、紫芝(G. sinense)和松杉靈芝(G. tsugae)三 個藥用靈芝種中擴增到的大約336bp的的特異性條帶，膠回收、連接和克隆后進行 序列測定?？筛鶕?jù)測定出的序列與實施方案中測定的序列是否相同進行鑒別。
9. 酶切產(chǎn)物的電泳檢測(Electrophoresis of enzyme cleaving)
將從赤靈芝(G. lucidum)、紫芝(G. sinense)和松杉靈芝(G. tsugae)三
個藥用靈芝種中擴增到的大約721bp的特異性條帶分別用限制性內(nèi)切酶Acc III (T氺CCGGA)進行酶切，從赤靈芝(G. lucidum)和松杉靈芝(G. tsugae)種來721bp 特異序列，酶切產(chǎn)物電泳時顯示出大約442 bp和270 bp兩個條帶，而從紫芝(G. sinense)種來的721bp特異序列，酶切產(chǎn)物電泳時顯示出大約721bp的一個條帶； 或?qū)U增到的這個721bp的特異性條帶分別用限制性內(nèi)切酶Ava II (6*6\￥(:0進行 酶切，從紫芝(G. sinense)種來的721bp特異序列，酶切產(chǎn)物電泳時顯示出大約 402 bp, 48 bp和262 bp的三個條帶。由48bp條帶太小，不宜被看清，故主要通 過判斷402bp和262bp兩個條帶的有無來進行鑒定。從赤靈芝(G. lucidum)和松 杉靈芝(G. tsugae)種來的721bp特異序列，酶切產(chǎn)物電泳時顯示出大約721bp 一個條帶。根據(jù)酶切條帶的大小進行鑒別。
實施例2
利用特異基因序列進行赤靈芝(G. lucidum)子實體(切片和精粉)、孢子粉 (破壁和未破壁)的鑒定 1.基因組DNA提取
選取高鹽低pH提取法提取基因組DNA，具體操作步驟同本發(fā)明步驟(3)的具體內(nèi)容。
2. DNA的檢測
采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外光譜法進行檢測，具體操作步驟同本發(fā)明步驟(4) 的具體內(nèi)容。
3. 引物設計
根據(jù)我們的實施方案設計五對引物，引物FIP A和FIP B對、引物FIPGLUF和 FIPGLUR對、弓1物FIPGTSF和FIPGTSR對、弓|物FIPGSIF和FIPGSIR對、弓|物FIPGF和FIPGR 對。引物序列同本發(fā)明步驟(5)、 (6)的具體內(nèi)容。。
4. PCR反應
反應程序94℃變性5min后，按照94。C變性30sec; 60℃退火30sec; 72°C， 延伸40sec進行35個循環(huán)，最后在72℃延伸10min。
5. PCR產(chǎn)物的電泳檢測
PCR產(chǎn)物在1XTAE電泳緩沖液下經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后，用凝 膠成像系統(tǒng)拍照。
使用引物FIP A和FIP B對可擴增出以赤靈芝(G. lucidum)子實體(切片和 精粉)、孢子粉(破壁和未破壁)來源的材料的特異基因序列，在電泳圖上可見大 約336bp的特異性條帶；使用引物FIPGLUF和FIPGLUR對可擴增出赤靈芝(G. lucidum)來源的子實體(切片和精粉)、孢子粉(破壁和未破壁)材料的特有基因 序列，在電泳圖上可見大約580bp的特異性條帶；使用引物FIPGTSF和FIPGTSR對 和引物FIPGSIF和FIPGSIR對均不能擴增出以赤靈芝來源的(G. lucidum)子實體 (切片和精粉)、孢子粉(破壁和未破壁)材料的特有基因序列，在電泳圖譜上沒 有特異性條帶出現(xiàn)；使用引物FIPGF和FIPGR對可擴增出以赤靈芝(G. lucidum) 來源的子實體(切片和精粉)、孢子粉(破壁和未破壁)材料的特異基因序列，在 電泳圖譜上可見大約721bp的特異性條帶。在電泳圖譜上可根據(jù)這五對引物的擴增 結(jié)果進行判定。
6. 序列測定
將從以赤靈芝(G. lucidum)來源的子實體(切片和精粉)、孢子粉(破壁和 未破壁)材料的中擴增到的大約336bp的特異性條帶，膠回收、連接和克隆后進行序列測定。可根據(jù)測定出的序列與實施方案中測定的赤靈芝(G. lucidum)序列是 否相同進行鑒別。
7.酶切產(chǎn)物的電泳檢測
將從赤靈芝(G. lucidum)來源的子實體(切片和精粉)、孢子粉(破壁和未 破壁)中擴增得到的大約721bp的特異性條帶用限制性內(nèi)切酶Acc III (T*CCGGA) 進行酶切，酶切產(chǎn)物電泳時顯示出大約442 bp和270 bp兩個條帶，或?qū)U增到的 這個721bp的特異性條帶使用限制性內(nèi)切酶Ava II (G*GWCC)進行酶切，酶切產(chǎn) 物電泳時顯示出大約721bp —個條帶。根據(jù)酶切條帶的大小進行鑒別。
本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下-
(1) 一種編碼赤靈芝(G./W"WWm)免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的核酸，其特征在于具有 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。 SEQ ID NO. 1的信息 (i)序列特征
(A) 長度1078bp
(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓撲結(jié)構(gòu)線性
(i i)分子類型核苷酸
(i i i)序列描述:SEQ ID NO. 1
〈110>上海交通大學
<120>利用特異基因序列鑒別藥用靈芝的檢測方法
〈160〉 3
<170> Patentln version 3.1
<210> 1
〈211〉 1078
<212> DNA
〈213>赤靈芝(G. lucidum)
<400> 1
cgtatgcaccctggtttacatcatcgtgaaacggcgctccggttgccgtataaaaggacg60
gcsaaggcggccagtggacttcagcacctgctcttgtacccacttctagtaagtcgcata120
ccacctctcctgacagcgacaggttcactgactagttcatagtccacagctctttgccta180
caatcaaggtttgccgacaccctctttgagccctcccccttcaataaccc cctaacttct240
gccccgcagcatcatgtccgacactgccttgatcttcaggctcgcctgggacgtgaagaa300
gctctcgttcgactacaccccgaactggggccgcggcaaccccaacaacttcatcgacac360
tgtcaccttcccgaaagtcttgaccgacaaggcgtacacgtaccgcgtcgccgtctccgg420
acggaacctcggcgtgaaaccctcgtacgcggtcgagagcgacggctcgcagaaggtcaa480
cttcctcgagtacaactccgggtatggcatagcggscacgaacaggatccaggtgttcgt540
tgtcgaccccgacaccaacaacgacttcatcatcgcccagtggaactaggaggaggcagt600
gactgacccctggcggtctaatctgcgggccactgtgggggaggggcatcgcccatcagc660
ttccttgtctcataatcatgcccgtgtagcaattgtaaatcgaccttgttgtaacatgca720
tccagcttttgtggtgtgccgtcttatgtttggttgaatgcgtcagcctatcaaagctag780
cttagggctaggtgggtcgccgtcggccgcgttcaagccttcgggcgctcgtgtctttag840
tttgttatctactcaaatacttacttttgtaagagttactataaacccgattaaaatctg900
tttgttatctgatgattccgatctaatgaaaggctaccccttccgagtcactaatgggta960
ctttgagacaacgagcggaccgtcttggtatgagaataagcttcaagttacgactggcac1020
atatctacagcggataagacgattcgcatcacactatggaacattccgtctgatcgat1078
(2) —種編碼紫芝(《W'/76V7W)免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的核酸，其特征在于具有 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO. 2的信息
(i)序列特征
(A) 長度:1072bp
(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓撲結(jié)構(gòu)線性
(i i)分子類型核苷酸 (i i i)序列描述:SEQ ID NO. 2
〈110〉 上海交通大學
<120>利用特異基因序列鑒別藥用靈芝的檢測方法 〈160〉 3
〈170〉 Patentln version 3. 1 〈210〉 2 〈211〉 1072 〈212〉 DNA
〈213〉紫芝(《w'"e/7se) 〈400> 1
<sequence>complex sequence see original document page 19</sequence>
(3) —種編碼松杉靈芝(《"i^ae)免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的核酸，其特征在 于具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO. 3的信息 (i)序列特征
(A) 長度1015bp
(B) 類型核苷酸
(C) 鏈性單鏈
(D) 拓撲結(jié)構(gòu)線性
(i i)分子類型核苷酸
(i i i)序列描述SEQ ID NO. 3
<110>上海交通大學
〈120〉利用特異基因序列鑒別藥用靈芝的檢測方法
<160> 3
<170> Patervtln version 3. 1
<210〉 3
〈211〉 1015 〈212〉腿
〈213〉松杉靈芝(C.""卵e)
<400> 1
atcgccatccataacc犯cgtctcaacccccg卿tggacgtcatctgga ggt已acgacc60
卿gcggtcttccggcaactgtggtctcg3卿cgtgaggcgtttacaaggttggacatc120
tcggggcaattctgccaaactcgc卿gagaatgtaccgccctatcacctccagtggtca180
gc鄉(xiāng)ggttgcattcaggtccacctgcggtgcagttcggttccctgtggcttgcagggcc240
tcgcacgtcgtatgcaccctggtttacatcatcgtgaaacgacgctccggttgtcgtsta300
a卿gscggca^鄉(xiāng)cggccagtgaacttcagcacctgctcttgtacccactcctagtaa360
gtcgcatacc3CCt3CC3CCtcaccctgaaagcgacgagtttactgacta gttcatagtc420
acagctctttgacttacaatcaaggtttgccgacaccctctttgagcgctcccccttcaa480taaccccctaacctctgccgcgcagcatcatgtccgacaccgctctgatcttcaggctcg540
cctgggacgtgaagaagctctcgttcgact3C3CCCCg犯ctggggccgcggcaacccca600
acaacttcatcgacactgtcaccttcccgaaagtcttgaccgac犯ggcgtacacgtacc660
gcgtcgccgtctccggacggaacctcggcgtgaaaccctcgtacgcggtcg卿gcgscg720
gctcgc3gaa^ggtcaacttcctcgagtacaactccgggtatggcatagcggacacgaaca780
cgstccaggtgttcgttgtcgaccccgacacc犯caacgacttcatcatcgcccagtgga840
ggC3gtg3Ctgacccctggcggtctaatctgcgggccactgtgggggagg■
ggcatcgcccatcagcttccttgtctcataatcatgcccgtggcggatgcgtacaatctc960
agcacgtagtgcatcatccttggggacataaactcggccgcgatagagaagc鄉(xiāng)101權(quán)利要求
1、一種利用特異基因序列鑒別藥用靈芝的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟(1)購回的市售藥用靈芝菌株，保藏和培養(yǎng)；(2)將培養(yǎng)好的藥用靈芝菌絲體經(jīng)洗滌沉淀，研磨成粉末狀；(3)藥用靈芝DNA的提取和純化；(4)藥用靈芝特異基因序列的序列測定、PCR產(chǎn)物的電泳檢測和限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物的電泳檢測；(5)從藥用靈芝的菌絲中擴增出的336bp和721bp的特異性條帶，通過進一步的序列測定和酶切電泳，發(fā)現(xiàn)差異，利用差異進行鑒別；(6)從藥用靈芝菌絲中分別擴增出580bp、495bp和836bp的特異性條帶，通過電泳檢測，發(fā)現(xiàn)差異，利用差異進行鑒別，判定檢測結(jié)果。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的利用特異基因序列鑒別藥用靈芝的檢測方法，其特征 是，步驟(3)中所述的藥用靈芝DNA的提取和純化，采用高鹽低pH提取法提取基因 組DNA，包括以下步驟① 經(jīng)液氮研磨的樣品放入65'C預熱的提取緩沖液，放入65'C水浴保溫30min，不 時緩慢振搖，室溫下10,000Xg離心10min;② 在上清液中加入2/3體積的KAc高鹽溶液，混勻后置于0'C保持30min以沉淀蛋 白質(zhì)；③ 在4。C下10，000Xg離心10min,棄蛋白質(zhì)沉淀，上清液加入等體積的氯仿/異 戊醇抽提，在6，000Xg離心10min，取出水相轉(zhuǎn)入另一離心管，如果中間層仍有白色沉淀，則再用氯仿/異戊醇抽提一次； 在上清液中加入2/3體積的預冷異丙醇，混勻后置于一2(TC靜置30min，以沉 淀核酸，可以重復一次，用70%乙醇清洗沉淀，在空氣中干燥50min，將DNA沉淀溶 解在合適體積的TE緩沖液中，分裝存放于—2(TC或4'C冰箱中保存。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用特異基因序列鑒別藥用靈芝的檢測方法，其特 征是，步驟(5)中所述的從所選藥用靈芝的菌絲中擴增出的336bp和721bp的特異 性條帶，設計了兩對引物序列- 第 1對FIP A : 5' -ATGTCCGACACTGCCTTGATCTTCAGG-3， 和FIP B : 5， -CTAGTTCCACTGGGCGATGATGAAGTC-3，；第 2 對FIPGF : 5'-CTGTGGCTTGCAGGGCCTCGCAC-3' 和 FIPGR: 5'-CTTGTCTCATAATCATGCCCGTG-3，。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用特異基因序列鑒別藥用靈芝的檢測方法，其特 征是，步驟(5)中所述的從所選的藥用靈芝菌絲中均能擴增出的336bp和721bp 的特異性條帶，是指以提取的藥用靈芝菌絲DNA為模板，使用引物FIPA和FIPB， 進行標準程序的PCR擴增，從藥用靈芝來源的赤靈芝、紫芝和松杉靈芝菌絲中均能 擴增出336bp大小的特異性條帶；使用引物FIPGF和FIPGR，進行標準程序的PCR 擴增，從赤靈芝、紫芝和松杉靈芝中也均能擴增出721bp大小的特異性條帶。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用特異基因序列鑒別藥用靈芝的檢測方法，其特 征是，步驟(6)中所述的從藥用靈芝菌絲中分別擴增出580bp、 495bp和836bp的 特異性條帶，設計了三對引物序列第1對FIPGLUF: 5' - GGGGTTGCATCC-AGGTCCACCTG-3'和FIPGLUR : 5'-CGCTATGCCATACCCGGAGTTG -3';第2對FIPGSIF : 5， - GGGGTTGCATCC-AGGTCCACCTG-3'和FIPGSIR : 5'-ACCCCAACAGGTTCGTCGACAACG-3';第3對FIPGTSF: 5' - TACGAGGGTTTCACGCCGAGGTTC -3'和FIPGTSR: 5，-AAACTCGGCCGCGATAGAGAAGCA -3'。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用特異基因序列鑒別藥用靈芝的檢測方法，其特 征是，步驟(6)中所述的從藥用靈芝菌絲中分別擴增出580bp、 495bp和836bp的 特異性條帶，是指以提取的藥用靈芝菌絲DNA為模板，使用引物FIPGLUF和FIPGLUR 只能從赤靈芝中擴增得到5S0bp大小的特異性條帶；使用引物FIPGSIF和FIPGSIR 只能從紫芝中擴增出495bp大小的特異性條帶；使用引物FIPGTSF和FIPGTSR只能 從松杉靈芝中擴增出836bp大小的特異性條帶。
全文摘要
本發(fā)明是一種分子生物工程技術(shù)領域的利用特異基因序列鑒別藥用靈芝的檢測方法。包括如下步驟購回的市售藥用靈芝菌株，保藏和培養(yǎng)；將培養(yǎng)好的藥用靈芝菌絲體經(jīng)洗滌沉淀，研磨成粉末狀；藥用靈芝DNA的提取和純化；藥用靈芝特異基因序列的序列測定、PCR產(chǎn)物的電泳檢測和限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物的電泳檢測；從藥用靈芝的菌絲中擴增出的336bp和721bp的特異性條帶，通過進一步的序列測定和酶切電泳，發(fā)現(xiàn)差異，利用差異進行鑒別；從藥用靈芝菌絲中分別擴增出580bp、495bp和836bp的特異性條帶，通過電泳檢測，發(fā)現(xiàn)差異，利用差異進行鑒別，判定檢測結(jié)果。本發(fā)明利用特異基因序列對藥用靈芝進行簡單、快速、準確的鑒別方法，為進一步研發(fā)和使用奠定了基礎。
文檔編號C12Q1/68GK101200769SQ20071017077
公開日2008年6月18日 申請日期2007年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月22日
發(fā)明者周選圍, 唐克軒, 尹燡周, 李琦章, 娟 林 申請人:上海交通大學