專利名稱：采用轉(zhuǎn)ls基因提高銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的方法，特別是一種采用轉(zhuǎn)化鯊烯合成酶基 因ls提高銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量的方法。
背景技術(shù)：
銀杏(Ginkgo biloba L.)是侏羅紀(jì)的孑遺植物，基本保持了l. 5億年前的生態(tài)特 征，因而成為一科一屬一種的特殊植物，被達(dá)爾文稱為"活化石"。銀杏標(biāo)準(zhǔn)提取 物是廣泛用于治療早期阿爾茨海默病、血管性癡呆等疾病的植物藥。銀杏葉提取物 中具有藥理作用和治療效力成分主要為黃酮類和內(nèi)酯類化合物，后者包括銀杏內(nèi)酯
和白果內(nèi)酯。目前從銀杏中分離得到的二內(nèi)酯有5個(gè)，即銀杏內(nèi)酯A、 B、 C、 J、 M。 銀杏內(nèi)酯具有獨(dú)特的二十碳骨架結(jié)構(gòu)，嵌有一個(gè)叔丁基和六個(gè)五元環(huán)，包括一個(gè)螺 [4， 4]壬垸， 一個(gè)四氫呋喃環(huán)和三個(gè)內(nèi)酯環(huán)，是一類罕見的天然化合物，至今尚 未發(fā)現(xiàn)存在于其他植物中。銀杏內(nèi)酯是在銀杏中含量很低的一類組分， 一般在千分 之幾左右，且提取分離手續(xù)復(fù)雜。由于銀杏內(nèi)酯的分子立體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成途 徑的技術(shù)難度很大，因此，它們主要是從天然銀杏植株中提取，但天然植物體內(nèi)含 量極其微少，使得銀杏內(nèi)酯來源困難。銀杏中內(nèi)酯的含量還受到植株發(fā)育階段、細(xì) 胞分區(qū)、組織分化和環(huán)境的影響，僅從天然植物中提取銀杏內(nèi)酯遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng) 需求。愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)為生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯帶來了希望。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家嘗試了采用各種方法，包括優(yōu)化 培養(yǎng)條件(Boonkaew， Boonkaew T. In vitro culture of Ginkgo biloba L， PhD Thesis, 2001， UMI 3031078， ETH， Ann Arber， USA)、加入前體物質(zhì)和使用化學(xué)或 生物誘導(dǎo)子(戴均貴，朱蔚華，吳蘊(yùn)祺，胡秋，張大勇.前體及真菌誘導(dǎo)子對(duì)銀杏懸浮 培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生銀杏內(nèi)酯B的影響.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2000， 35:151-155)來提高銀杏組織培 養(yǎng)物中銀杏內(nèi)酯的含量。如Boonkaew對(duì)銀杏組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基條件進(jìn)行了研究，比
較了不同的激素配比和培養(yǎng)基類型，選擇了MS培養(yǎng)基和l. 0mg/La -萘乙酸和l. Omg/L 激動(dòng)素作為最優(yōu)培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)使用O. 8%植物凝膠作為凝結(jié)劑培養(yǎng)愈傷組織能提高 根衍生愈傷中的葉綠素、銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯，根衍生的愈傷組織比葉衍生的愈傷 組織中的含量高，葉衍生愈傷中總銀杏內(nèi)酯的含量為25嗎/g干重，根衍生愈傷中為 34^g/g干重，而使用其他凝結(jié)劑如瓊脂等幾乎檢測(cè)不到銀杏內(nèi)酯的存在。
雖然嘗試了多種辦法來提高銀杏愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)物中的銀杏內(nèi)酯含量，但 到目前為止，通過愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來產(chǎn)生銀杏內(nèi)酯，其含量依然太低不具 商業(yè)前景。代謝工程為改變植物細(xì)胞或愈傷組織的組成成份和增加植物細(xì)胞或愈傷 組織銀杏內(nèi)酯產(chǎn)量提供了一條誘人的方法。為了更有效地生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯，開展銀杏 內(nèi)酯生物合成途徑及其催化酶基因的表達(dá)與調(diào)控研究，以及開展銀杏內(nèi)酯代謝工程 研究將是提高銀杏內(nèi)酯含量并最終解決銀杏內(nèi)酯產(chǎn)品稀缺的有效方法。
鯊烯合成酶(lev叩imaradiene synthase, LS)是銀杏內(nèi)酯生物合成途徑中的關(guān) 鍵酶，是銀杏內(nèi)酯代謝工程的重要靶點(diǎn)。采用基因工程手段，將鯊烯合成酶編碼基 因ls轉(zhuǎn)化銀杏，打破銀杏內(nèi)酯生物合成限速瓶頸，獲得銀杏內(nèi)酯高產(chǎn)的銀杏愈傷組 織。目前尚未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化ls基因提高銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種采用轉(zhuǎn)ls基因提高銀杏愈 傷組織內(nèi)酯含量的方法。本發(fā)明涉及的關(guān)鍵酶基因克隆、載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、分 子檢測(cè)、內(nèi)酯提取及含量測(cè)定、半定量RT-PCR分析用于本發(fā)明，建立了提高銀杏愈 傷組織內(nèi)酯含量的方法，為銀杏愈傷組織大規(guī)模工廠化生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明從銀杏中克隆ls基因，構(gòu)建含ls基
因的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將ls基因?qū)脬y杏細(xì)胞并再生出愈傷組織；
PCR和半定量RT-PCR檢測(cè)外源目的基因ls的整合和表達(dá)情況，高效液相色譜-蒸發(fā)光 散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)測(cè)定銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量，篩選銀杏內(nèi)酯含量提 高的轉(zhuǎn)基因銀杏愈傷組織。 本發(fā)明包括如下具體步驟
(1) 采用基因克隆方法獲得銀杏關(guān)鍵酶基因1S;
(2) 把ls基因可操作性地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成含ls基因的植物表達(dá)載體；
(3) 將含ls基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化銀杏的含ls基 因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；
(4) 利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化銀杏細(xì)胞，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因愈傷 組織；
(5) 半定量RT-PCR測(cè)定銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯生物合成相關(guān)基因的表達(dá)；
(6) 對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量進(jìn)行HPLC-ELSD測(cè)定，篩選銀杏內(nèi) 酯含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因銀杏愈傷組織。
所述的經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因愈傷組織是指，分別設(shè)計(jì)合成ls基因的檢測(cè)引物，進(jìn) 行DNA擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性組織即為轉(zhuǎn)基因銀杏愈傷組織。
所述的對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量進(jìn)行HPLC-ELSD測(cè)定，方法為 色譜柱為C-18反相硅膠柱，流動(dòng)相為乙腈甲醇水，乙腈甲醇水的體積比為 8:69:23，柱溫3(TC,流速l. 0 mL/min，進(jìn)樣量2C^L，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫 度為5(TC，放大系數(shù)(gain)為9，空氣氣壓4. 5PSI。銀杏內(nèi)酯含量根據(jù)峰面積由標(biāo)準(zhǔn) 品曲線換算。
所述的半定量RT-PCR測(cè)定銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯生物合成相關(guān)基因的表達(dá)， 方法為設(shè)計(jì)合成ls基因和看家基因18S rRNA的引物，進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增，用 相對(duì)定量法分析基因相對(duì)表達(dá)量。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的采用轉(zhuǎn)ls基因提高銀杏愈傷組織內(nèi)酯含量的方法， 采用基因工程方法，將關(guān)鍵酶基因ls導(dǎo)入銀杏愈傷組織中，獲得了銀杏內(nèi)酯含量顯 著提高的銀杏愈傷組織，其中，轉(zhuǎn)基因愈傷組織中銀杏內(nèi)酯的含量最高是非轉(zhuǎn)化對(duì) 照愈傷組織的4. 8倍，對(duì)解決銀杏內(nèi)酯藥源匱乏、滿足醫(yī)藥工業(yè)大規(guī)模工廠化生產(chǎn)需 要具有重要意義。
所述的根癌農(nóng)桿菌的公開方式為市場(chǎng)有公開出售的生物材料，可以從多家公 司如澳大利亞CAMBIA公司(CAMBIA， GPO Box 3200, Canberra, ACT 2601， Australia。 商品名稱根癌農(nóng)桿菌菌株如EHA105，商品編號(hào)Gambar 1)購(gòu)得。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn) 行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下
述的實(shí)施例。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例l
銀杏ls基因的克隆1. 組織分離
將銀杏種子用75。/。乙醇浸泡lmin，再用2% NaC10浸泡10 min，無菌水沖洗3-4次， 用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS (Murashige and Skoog， 1962)固 體培養(yǎng)基中，25°C、 12h/12h光照培養(yǎng)，即可獲得銀杏無菌苗，待苗長(zhǎng)至5cm左右后， 切取葉片和莖段用于RNA提取。
2. RNA的分離
稱取0.5g所述的銀杏無菌試管苗，用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，加入盛有 1 mL CTAB緩沖液[3% CTAB (W/V) ， 3% PVP (W/V) (Mw 40000), 25 mM EDTA, 2.0 M NaCl， 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 g/L spermidine和O. 1% DEPC (V/V)]的 1.5 mL E卯endorf管中，充分振蕩后，于室溫下放置5 min，力卩20(VL氯仿，用力振 蕩15 sec，室溫放置2-3 min后，于4。C、 12， 000g離心15 min;將上清液(約60(VL) 吸入干凈的l. 5mL Eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置 10 min后，于4。C、 12， 000g離心10 min;棄上清，力Q1 mL 75%乙醇清洗，振蕩后， 于4。C、 7，500g離心5 min;室溫干燥15-20 min后溶于適量(5(VL) RNAase-free水 中；用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量。
3. 基因克隆
將所獲的銀杏總RNA通過反轉(zhuǎn)錄酶XL (AMV)反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA,根據(jù)所述銀 杏ls基因的編碼序列(序列表中的序列l(wèi))，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼框的上下游引物， 并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以 便構(gòu)建表達(dá)載體。以所述的第一鏈cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序。DNA序列測(cè) 定由上海英駿生物技術(shù)服務(wù)有限公司采用3730自動(dòng)測(cè)序儀完成。測(cè)序結(jié)果表明，所 克隆的序列與GenBank中所報(bào)道的銀杏ls基因的編碼序列(序列表中的序列l(wèi)) 一致。
本實(shí)施例采用基因克隆方法從銀杏中獲得序列正確的銀杏內(nèi)酯生物合成關(guān)鍵酶 基因ls，為通過轉(zhuǎn)ls基因提高銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量提供了一個(gè)重要關(guān)鍵酶 基因。
實(shí)施例2
含ls基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1304: :p35S-ls-nos的構(gòu)建
以pCAMBIA1304為表達(dá)載體，用實(shí)施例l中l(wèi)s基因替換其上的gfp+gus基因。具體 地，Bgl II/BstEII雙酶切pMDT-simple + ls和pCAMBIA1304，回收ls和pCAMBIA1304 大片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做PCR檢測(cè)和酶切驗(yàn)證。結(jié)果表明，ls 基因已被成功構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1304中，從而獲得含ls基因的植物表達(dá)載 體pCAMBIA1304::p35S-ls-nos。
本實(shí)施例將銀杏內(nèi)酯生物合成途徑關(guān)鍵酶基因ls可操作性地連于表達(dá)調(diào)控序 列，形成含ls基因的植物表達(dá)載體，該表達(dá)載體可用于通過代謝工程策略來提高銀 杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯的含量。
實(shí)施例3
含ls基因植物表達(dá)載體根癌農(nóng)桿菌工程菌的獲得
將實(shí)施例2中含ls基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(如EHA105，為市場(chǎng)有公 開出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購(gòu)得，菌株編號(hào)為Gambar 1)，并 進(jìn)行PCR驗(yàn)證。具體地，首先制備感受態(tài)根癌農(nóng)桿菌(如EHA105):搖根癌農(nóng)桿菌至 菌液O. D6。。=0. 5，將菌液冰浴30min后，取菌于l. 5ml Eppendorf管中，于4。C 5000rpm 離心5rain，去上清；用抽濾滅菌的O. 1M CaCl2(預(yù)冷)400nl懸浮菌體(用移液槍輕輕 打勻)后于冰上放置30min， 5000rpm離心5min，去上清，用lOOpl預(yù)冷的O. 1M CaCl2 懸浮菌體后于4'C保存10h備用。然后，采用以下方法獲得含ls基因的植物表達(dá)載體
(pCAMBIA1304: :p35S-ls-nos)的根癌農(nóng)桿菌工程菌株取一管100nl的感受態(tài)， 加10nl質(zhì)粒DNA (pCAMBIA1304: :p35S-ls-nos)，輕輕混勻后，于冰上放置5min和液 氮中放置8min后，放入37。C水浴中熱激5min;加入800nl無抗生素的YEB液體培養(yǎng) 基，輕輕混勻；振蕩培養(yǎng)活化(28。C， 200rpm)4h后，于室溫離心(4000 rpm) 10min,
去上清，余下20(V1菌液重懸菌體混勻；將混勻的200)Lll重懸活化菌液均勻涂布到加
相應(yīng)抗生素[卡那霉素(Kan) 100嗎/ml+鏈霉素(Str) 25ng/ml+利福平(Rif) 40ng/ml]的YEB固體培養(yǎng)基平板上，于28'C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2天后，挑選抗性單菌落在含相 應(yīng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。菌液達(dá)到一定濃度后做目的基因ls的PCR檢測(cè)。 結(jié)果表明，含ls基因植物表達(dá)載體已成功構(gòu)建到根癌農(nóng)桿菌菌株中。 實(shí)施例4
1. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)ls基因轉(zhuǎn)化銀杏
1.1. 外植體的預(yù)培養(yǎng)
剝?nèi)グ坠闹蟹N皮(硬殼)，在超凈臺(tái)內(nèi)用75X(V/V)酒精消毒1分鐘，再用15 X(V/V)次氯酸鈉溶液浸泡消毒8分鐘，剝開胚乳用鑷子取出幼胚置于預(yù)培養(yǎng)基 (MS+3。/。蔗糖+4g/L植物凝膠)上，25'C暗培養(yǎng)1 d。
1.2. 農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)
挑取含所述的含ls基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌單菌落于培養(yǎng)基[YEB 液體培養(yǎng)基+2(VM乙酰丁香酮+10mM MES(pH=5. 8)+卡那霉素(Kan) 100pg/ml+利福平 (Rif)4(^g/ml]中在28。C搖床上180rpm搖過夜，第二天當(dāng)菌液濃度達(dá)到0D60(M). 5 時(shí)，5000rpm離心10分鐘后倒掉上層培養(yǎng)液，重懸沉淀在底部的農(nóng)桿菌，在28'C搖床 (180rpm)上活化30分鐘，把在預(yù)培養(yǎng)24h的銀杏幼胚從根部剪成兩半，把每一半再 橫剪成兩半，把剪好的外植體放進(jìn)上述菌液中侵染15分鐘，把菌液倒掉，用無菌吸 水紙洗干胚上多余的菌液，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS + 3。/。蔗糖+瓊脂10g/L)上于25'C 暗培養(yǎng)3天，使農(nóng)桿菌充分侵染銀杏幼胚。以浸泡在不帶有根癌農(nóng)桿菌的幼胚外植體 為對(duì)照。
1.3. 愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)
共培養(yǎng)后，把胚外植體轉(zhuǎn)接到恢復(fù)培養(yǎng)基(MS +蔗糖3X +1. Omg/L NAA+0. 2mg/L 6-BA+4g/L植物凝膠+ 250mg/L羧芐霉素)上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和脫菌培養(yǎng)，于25 。C暗培養(yǎng)4周后轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基(MS +蔗糖3X + 1.0mg/L NAA+0. 2mg/L 6-BA+ 4g/L植物凝膠+250mg/L羧芐霉素+ 10mg/L潮霉素)上進(jìn)行抗性愈傷組織的篩選培 養(yǎng)，將起源于不同細(xì)胞的每個(gè)愈傷組織作為一個(gè)無性系，接種于繼代培養(yǎng)基(MS + 蔗糖3% + 1. Omg/L NAA+0. 2mg/L 6-BA+4g/L植物凝膠+ 10mg/L潮霉素)上繼代篩 選，每三周繼代培養(yǎng)一次。
2. 轉(zhuǎn)基因銀杏愈傷組織的PCR檢測(cè) 首先采用常規(guī)CTAB (Cetyltrimethyl Ammonium bromide,十六烷基三甲基溴 化胺)方法提取轉(zhuǎn)基因銀杏潮霉素抗性愈傷組織的DNA，然后，根據(jù)目的基因所在 表達(dá)盒pCAMBIA1304::p35S-ls-nos序列p35s和ls分別設(shè)計(jì)正向弓|物T35SF和反向引 物TLSR，用PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因銀杏抗性愈傷組織中的目的基因ls進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng) 條件為94。C變性5min—30循環(huán)(94。C 45sec—58°C 45sec—72°C lmin)—72°C 6min。結(jié)果表明，利用所設(shè)計(jì)的PCR特異引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因銀杏愈傷組織DNA，能擴(kuò)增 出與預(yù)期結(jié)果一致的特異目的片段(0. 5kb)，而以非轉(zhuǎn)化銀杏基因組DNA為模板時(shí)， 沒有擴(kuò)增出任何片段。說明ls基因己經(jīng)整合到銀杏基因組中。
本實(shí)施例將所述的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化銀杏的含ls基 因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株，利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化銀杏細(xì)胞， 獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。轉(zhuǎn)基因銀杏愈傷組織的獲得為篩選獲得銀杏內(nèi)酯 含量提高的銀杏愈傷組織提供了直接素材。
實(shí)施例5
半定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因銀杏愈傷組織中l(wèi)s基因的表達(dá)
1. 引物的設(shè)計(jì)和合成
設(shè)計(jì)合成ls基因和看家基因18SrRNA的引物，進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物 凝膠電泳后與對(duì)照愈傷組織對(duì)比其表達(dá)量。
2. RNA的提取
參照實(shí)施例l中所述方法，從銀杏愈傷組織中提取RNA，用DNaseI除去RNA中基因 組DNA，用反轉(zhuǎn)錄酶XL (AMV)進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，再以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行半 定量RT-PCR。
3. 半定量RT-PCR檢測(cè)看家基因18S rRNA基因的表達(dá)
為調(diào)整各樣品間在RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄過程中反應(yīng)效率的差異，檢測(cè)目的基因表達(dá) 量的同時(shí)需檢測(cè)看家基因18S rRNA基因的表達(dá)。
4. 半定量RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因銀杏愈傷組織中l(wèi)s基因的表達(dá) 用非轉(zhuǎn)化普通愈傷作對(duì)照，用半定量RT-PCR測(cè)定ls基因的表達(dá)量。半定量RT-PCR
反應(yīng)條件為50°C 30min—94°C 2min—30個(gè)循環(huán)(94°C 45sec—58°C 30sec—72°C 30sec)。結(jié)果表明，在相同的總RNA量和18srRNA基因表達(dá)水平下，相比未轉(zhuǎn)化的愈
傷組織，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因愈傷組織中的ls基因轉(zhuǎn)錄水平有明顯升高，表明目的基因ls 的轉(zhuǎn)入顯著提高了銀杏愈傷中的ls的表達(dá)量。 實(shí)施例6
利用HPLC-ELSD測(cè)定轉(zhuǎn)基因銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量
1. HPLC-ELSD條件及系統(tǒng)適用性以及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
HPLC:采用water alliance 2695系統(tǒng)，色譜柱為C-18反相硅膠柱 (SymraetryShieldTM C18， 5 )nm， 250口4. 6 mm, Waters),流動(dòng)相為乙腈甲醇水， 乙腈甲醇水的體積比為8 : 69 : 23，柱溫30。C，流速l. 0 mL/min，進(jìn)樣量20 ^L， 靈敏度(AUFS=1.0)。
ELSD:采用water alliance 2420系統(tǒng)，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度50。C,空 氣氣壓4. 5PSI，放大系數(shù)(gain)為9。
. 分別精密稱取銀杏內(nèi)酯A、 B、 C標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)20 mg用甲醇溶解并定溶于 20 ml，得到濃度為l mg/mL的銀杏內(nèi)酯A、 B、 C標(biāo)準(zhǔn)品溶液，保存于-20'C備用。
本發(fā)明中流動(dòng)相為乙腈甲醇水，比例為8 : 69 : 23時(shí)，銀杏內(nèi)酯a、 b、 c的
保留時(shí)間分別為15. 757 min、 17. 642 min、 7. 735 min，峰型良好，可保證三種內(nèi)酯 的良好分離。
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
將所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別稀釋l、 2、 5、 IO倍，在相應(yīng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄圖譜 及色譜參數(shù)，分別以峰面積(Y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X, mg/L)進(jìn)行回歸分析。銀杏內(nèi)酯A、 B、 C對(duì)照品的log-log線性回歸方程分別為
YGA=1. 38e+000X+8. 68e_001r=0. 9993
YGB=3. 67e-001X+3. 44e+000r=0. 9991
YGC=1. 18e+000X+l. 18e+000r=0.9995
3. 樣品的制備和銀杏內(nèi)酯含量的測(cè)定
將愈傷組織置于烘箱中6(TC干燥至恒重。每次稱取研碎的愈傷組織0. 5 g進(jìn)行 定量分析。用20ml甲醇超聲l個(gè)小時(shí)后，布氏漏斗過濾，提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干， 再用lml體積比為40:60的甲醇水復(fù)溶，上100mg的ds小柱(SUPELCO, USA)， 依 次2ml水、0.5ml體積比為20:80的甲醇水沖洗，再用0.4ml體積比為60:40的甲
醇水洗脫后收集，過0.45pm微孔濾膜，取20nl上樣，用HPLC-ELSD法測(cè)量銀杏內(nèi) 酯的含量。
分別吸取所述對(duì)照品溶液和供試樣品溶液各2(VL，注入高效液相色譜儀，記錄 各組分峰面積，代入線性回歸方程，計(jì)算即得樣品中銀杏內(nèi)酯含量。
在本發(fā)明中轉(zhuǎn)ls基因顯著提高銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因 愈傷組織中總銀杏內(nèi)酯含量在不同程度上比對(duì)照有所增加，轉(zhuǎn)基因愈傷組織和非轉(zhuǎn) 基因?qū)φ沼鷤M織中均檢測(cè)不到銀杏內(nèi)酯A、 B，是由于愈傷中這兩種內(nèi)酯含量太低， 達(dá)不到最低檢測(cè)范圍；而轉(zhuǎn)ls基因的轉(zhuǎn)基因愈傷組織中銀杏內(nèi)酯C的平均含量為 0. 136mg/gDW，而對(duì)照中為O. 038mg/gDW，其中銀杏內(nèi)酯C含量最高的轉(zhuǎn)基因愈傷組織 系L1中的銀杏內(nèi)酯C含量達(dá)到O. 182mg/gDW，其總銀杏內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯C含量是非轉(zhuǎn)基 因?qū)φ盏?. 8倍。
本實(shí)施例采用HPLC-ELSD法測(cè)定了轉(zhuǎn)基因銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量。采用轉(zhuǎn) ls基因的代謝工程策略獲得了銀杏內(nèi)酯含量提高的銀杏愈傷組織，為規(guī)?；a(chǎn)銀 杏內(nèi)酯并最終解決內(nèi)酯匱乏提供了一種方法。
本發(fā)明涉及的序列表-〈110〉上海交通大學(xué)
〈120>轉(zhuǎn)ls基因提高銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量的方法
〈160〉 1
〈170〉 Patentln version 3.4
〈210〉 1 〈211〉 2622 <212〉 ■
〈213〉 銀杏(Ginkgo biloba) 〈400〉 1
atggctgggg tgctctttgc犯atctgcct ttccggcaat ccactaatat tcttattcct gcacagcact gcgtccgttc tcacttaagg tcagctgcag agactcgtcc agatcagctt aatgcggatt atcatccagc tgtctggaag aattcccacg cgacatcgaa atcaagcgtc ttggtgaagg aaatccagtg ca/tgtttcag gcatatgata cagcttgggt ggcaagaatt tttccccaaa cgcttcaatg gattctgaac gagtgcattt ttctggcgta tgacagagtt aaaatatgga ataagggcga cattcaagtg atgg犯g犯a tgaaggacga agctgacaat cctgcaatgt tagatgaagc aaaaagcttg atctcccaaa tccaccetaaa gcgccagaaa
tgctcactgc aactctctcc aaaagttccc 60
tttcacaaga gatcctcatt tggatttaat 120
ctgagatgga attgtgtcgg gattcatgcc 180
ccacaggagg aacgctttgt gtcgagactt 240
gacgatttca tcgactctct aacatcccct 300
gatgagacaa tcaataaaag aatcceigaca 360
tccatgggcg acggtgaaac gaatccatct 420
ccgtcaattg acggctctgg tgcaccccaa 480
aatcaactgc cagatggctc gtggggtgag 540
ttaaacactc tcgcctgcct cctcactctc 600
cagaaagggg ttgagtttgt gagaaaacac 660
cacaggccaa gtggattcga ggtcgtgttt 720
ggattggatc ttccttatca cctccctttc 780
aagcttcaaa agattcccct caatgttctt 840cataaccatc agacggcgtt gctctactct ctggagggtt tgcaagatgt ggtggactgg 900
caagagatca caaatcttca atcaagagac ggatcatttt taagctcccc tgcatctact 960
gcttgtgtct tcatgcacac tcaaaacaaa cgatgcctcc actttctcaa cttcgtgctc 1020
agcaaatttg gcgactacgt tccttgccat tacccacttg atctatttga acgcctctgg 1080
gctgtcgata cagttgaacg cttgggaatc gatcgctatt tcaagaaaga aatcaaagaa 1140
tctctggatt acgtttatag gtactgggac gccgaaagag gcgtgggatg ggcaagatgc 1200
aatcctattc ctgatgtcga tgacactgcc atgggtctta gaatcctgag acttcatgga 1260
tacaatgtat cttcagatgt tctggagaat ttcagagacg agaaaggaga cttcttttgc 1320
tttgccggtc aaacgcaaat tggtgtgacc gataatctta acctttatag atgttcacaa 1380
gtatgttttc cgggagaaaa gataatggaa gaagctaaga ccttcactac aaatcatctc 1440
caaaatgctc ttgccaaaaa caacgcattt gataagtggg ctgtcaagaa ggatcttcct 1500
ggagaggtgg agtatgctat aaagtatccg tggcatagaa gtatgccaag attggaggca 1560
agaagttaca tagagcaatt tggatcaaat gatgtctggc tggggaagac tgtgtataag 1620
atgctatatg tgagcaacga aaaatatttg gagctggcca aattggactt caatatggtg 1680
caggccttac accaaaagga gactcaacac attgtcagct ggtggagaga atcgggattc 1740
aatgatctta cattcacccg ccagcggcct gtggaaatgt atttctcagt ggcggttagt 1800
atgtttgagc cagaattcgc tgcttgtaga attgcctatg ccaagacttc ttgcctcgca 1860
gttattctag acgatcttta cgacacccac ggatctctgg atgatcttaa attgttctct 1920
gaagcggtcc gaagatggga tatctctgtg ctggatagcg ttcgggataa tcagttgaaa 1980
gtttgcttcc tagggctgta caacacagtg aatggatttg gaaaagatgg actcaaggaa 2040
caaggccgtg atgtgctggg ctatcttcga aaagtatggg agggcttgct cgcatcgtat 2100
accaaagaag ccgaatggtc ggcagcaaag tatgtgccga cattcaacga atatgtggaa 2160
aatgccaaag tgtccatagc acttgcgaca gtcgtactaa actcaatctt tttcactgga 2220
gaattacttc ctgattacat tttacagcaa gtagaccttc ggtccaaatt tctgcatctt 2280
gtgtctttga ctggacgact aatcaatgac accaagactt accaggccga gagaaaccgt 2340
ggtgaattgg tttccagcgt acagtgctac atgagggaaa atccggagtg cacagaggaa 2400
gaagctctaa gtcatgttta tggtatcatc gacaacgcac tgaaggaatt gaattgggag 2460
ttggccaacc cagcgagcaa tgccccattg tgtgtgagaa gactgctgtt caacactgca 2520
agagtgatgc agctgtttta tatgtacaga gatggctttg gtatctctga caaagagatg 2580
aaagaccatg tcagccgaac tcttttcgat cctgtggcgt ag 262權(quán)利要求
1.一種采用轉(zhuǎn)ls基因提高銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量的方法，其特征在于，從銀杏中克隆鯊烯合成酶LS基因，構(gòu)建含ls基因的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將ls基因?qū)脬y杏幼胚并誘導(dǎo)出愈傷組織，PCR和半定量RT-PCR檢測(cè)外源目的基因ls的整合和表達(dá)情況，高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯的含量，篩選銀杏內(nèi)酯含量提高的轉(zhuǎn)基因銀杏愈傷組織。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的采用轉(zhuǎn)ls基因提高銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量的方 法，其特征是，包括如下具體步驟-(1) 采用基因克隆方法獲得銀杏關(guān)鍵酶基因ls;(2) 把ls基因可操作性地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成含ls基因的植物表達(dá)載體；(3) 將含ls基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化銀杏的含ls基 因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；(4) 利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化銀杏幼胚，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因愈傷 組織；(5) 半定量RT-PCR測(cè)定銀杏愈傷組織中l(wèi)s基因的表達(dá)；(6) 對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因愈傷組織中內(nèi)酯含量進(jìn)行高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢 測(cè)器測(cè)定，篩選銀杏內(nèi)酯含量提高的轉(zhuǎn)基因銀杏愈傷組織。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的采用轉(zhuǎn)ls基因提高銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量的方 法，其特征是，所述的經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因愈傷組織，設(shè)計(jì)合成ls基因的引物，進(jìn)行 DNA擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶的陽性愈傷組織即為轉(zhuǎn)基因銀杏愈傷組織。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的采用轉(zhuǎn)ls基因提高銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量的方 法，其特征是，所述的對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因愈傷組織中內(nèi)酯含量進(jìn)行高效液相色譜法及 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定，方法為色譜柱為C-18反相硅膠柱，流動(dòng)相為乙腈甲醇: 水，乙腈甲醇水的體積比為8:69:23，柱溫30。C，流速l. 0 mL/min，進(jìn)樣量2(VL， 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度為5(TC，放大系數(shù)為9，空氣氣壓4.5PSI，銀杏內(nèi)酯含 量根據(jù)峰面積由標(biāo)準(zhǔn)品曲線換算。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的采用轉(zhuǎn)ls基因提高銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量的方 法，其特征是，所述的半定量RT-PCR測(cè)定銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯生物合成相關(guān)基 因的表達(dá)，方法為設(shè)計(jì)合成ls基因和看家基因18SrRNA的引物，進(jìn)行半定量RT-PCR 擴(kuò)增，用相對(duì)定量法分析基因相對(duì)表達(dá)量。
全文摘要
本發(fā)明是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的采用轉(zhuǎn)ls基因提高銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量的方法。本發(fā)明從銀杏中克隆ls基因，構(gòu)建含ls基因的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將ls基因?qū)脬y杏細(xì)胞并再生出愈傷組織；PCR和半定量RT-PCR檢測(cè)外源目的基因ls的整合和表達(dá)情況，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯含量，篩選銀杏內(nèi)酯含量提高的轉(zhuǎn)基因銀杏愈傷組織。本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因銀杏愈傷組織中銀杏內(nèi)酯的含量顯著提高，從而提供了一種提高銀杏細(xì)胞培養(yǎng)物中銀杏內(nèi)酯含量的方法，也為生產(chǎn)具重要臨床需求的銀杏內(nèi)酯提供了一種方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101186913SQ200710171218
公開日2008年5月28日 申請(qǐng)日期2007年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月29日
發(fā)明者唐克軒, 孫小芬, 潔 陸 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)