專利名稱：奶牛胚胎性別鑒定的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于一種實時熒光PCR檢測奶牛胚胎性別的方法和試劑盒。
背景技術：
自從1985年美國Cetus公司和加利福利亞大學聯合創(chuàng)建的聚合酶鏈反應 (Polymerase Chain Reaction,簡稱PCR)問世以來，這一在模板DNA、引物、 脫氧核糖核苷三磷酸以及DNA聚合酶存在下進行的體外酶促擴增DNA的技 術立即引起了廣泛的興趣和重視，在全球范圍內得到廣泛應用和發(fā)展，迅速進 入分子生物學、法醫(yī)學、考古學、以及遺傳病和傳染性病原體的核酸檢測等各 個領域。目前，在核酸檢測領域傳統的"PCR+電泳"或"PCR+探針雜交"檢 測方法已經廣泛應用，但是該傳統方法由于實際應用中易引起的非特異性擴 增、實驗中易受外源核酸的污染而造成結果假陽性現象、同時操作比較繁冗， 使得該技術在實際應用尤其是臨床檢測受到很大限制。
實時熒光PCR是1996年美國應用生物系統公司在PCR基礎上發(fā)展的新 技術，在核酸檢測中和傳統PCR電泳檢測方法比較具有許多優(yōu)點(1)其采 用的閉管檢測在臨床診斷中的優(yōu)勢尤其明顯，消除了傳統PCR電泳技術擴增 產物的污染問題，提高了檢測準備度；(2) PCR體系中增加了熒光探針，提高 了檢測的特異性和靈敏度；(3)定量范圍極寬，樣本無需做梯度稀釋，可以進 行準確的定量檢測；(4)操作迅速，無需傳統PCR的后處理檢測步驟，自動 化程度高。目前實時熒光PCR已在各種疾病病原體的基因檢測及基因遺傳突 變分析等領域中廣泛應用。
基于TaqMan水解熒光探針的實時熒光PCR技術利用了 Taq酶的5'外切酶活性，合成一個能與PCR產物雜交的探針，該探針的5'端標記一個熒光分
子，3'端標記另一個熒光分子。其中3'端熒光分子能夠吸收5'端熒光分子發(fā)出 的熒光，因此正常情況下該探針檢測不到的5'端熒光分子發(fā)出的熒光，只能檢 測到3'端熒光分子的熒光信號，但當溶液中有PCR產物(模板)時，該探針 與模板結合，激活Taq酶的5'外切酶活性，將探針5'端連接的熒光分子從探針 上切割下來，從而發(fā)出熒光，切割的熒光分子數與PCR產物的數量成比例。 因此根據PCR反應液的熒光強度即可計算出初始模板的數量。
懷孕奶牛中胎牛性別以及待移植胚胎性別鑒定一直是動物繁殖和良種培 育過程中需要關注的問題，蘊含著巨大的經濟利益。位于奶?；蚪MY染色體 上的特異性公牛性別決定基因(S7)的發(fā)現使得奶牛的性別控制和胚胎性別鑒 定技術發(fā)展進入了一個新的階段。最近10年來發(fā)展的利用wy基因和PCR技 術對奶牛早期胚胎進行性別鑒定是一種有效的方法，其中有的己經申請國內專 利(申請?zhí)?00410014222.5)并制成檢測試劑盒。其主要操作步驟是從待檢 測胚胎取部分卵裂球用以提取DNA，再用so;基因的片段作引物，以所取的胚 胎細胞DNA為模板進行PCR或巢式PCR擴增，最后用矽特異探針對擴增的 產物進行檢測。雄性胚胎顯示呈陽性，雌性胚胎為陰性。也可對擴增產物進行 電泳，根據^y擴增條帶的有無判斷胚胎為雄、雌性。隨著這項技術的深入研 究和進展，目前只需幾個卵裂球即可完成檢測的取樣，減少了對胚胎的傷害。 經鑒定的胚胎，移植后產犢性別的準確率可達95%以上。
但是，上述性別鑒定技術及試劑盒存在的主要問題是對實驗室條件和操作 人員技術水平要求較高，否則會有假陽性結果出現、降低檢測準確率；其次， 試劑盒操作繁瑣，所需時間較長；最后，試劑盒只能對待移植的胚胎細胞進行 鑒定，不能應用于懷孕奶牛中的胎牛性別鑒定。由于上述存在的局限性，目前尚不適于作為成熟技術推廣使用。有鑒于此，本發(fā)明提供了一種更方便、更準 確的方法和試劑盒用于奶牛胚胎和胎牛性別鑒定。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種利用實時熒光PCR技術進行奶牛胚胎性別鑒定 的方法和試劑盒，以及所需的引物和探針，從而可以方便快速準確地對懷孕奶 牛中的胎牛性別、移植胚胎性別進行鑒定。本發(fā)明的技術內容如下
1. 實時熒光PCR引物探針的設計與合成
通過對GenBank中奶牛w少基因序列査詢，用美國Invitrogen公司Vector NTI軟件對各種來源的奶牛w少基因序列進行比對后發(fā)現，其序列高度保守并 具有很好的同源性，按照TaqMan熒光PCR設計的原則，設計了一對奶牛特異 性引物擴增"基因上的182 bp的區(qū)域，并用特異性TaqMan水解探針法實時 檢測。引物和探針堿基序列如下
上游弓I物為5 ， ACg CCT TCA TTg TgT ggT 3'
下游引物為5， Cgg gTA TTT gTC TCg gTg TA 3 ，
探針為5 ， FAM-CTA gTA gTC TCT gTg CCT CCT CAA-TAMRA 3'，其中探 針5'端標記FAM (6-羧基熒光素)，3'端標記TAMRA (四甲基-6-羧基羅丹明)。
上述引物探針由商業(yè)序列合成公司(上海生工生物工程技術服務有限公司 等)合成后用無菌雙蒸水溶解至濃度為25)imol/L， 一2(TC保存。
2. 試劑盒主要成分
含有上述引物和探針的熒光PCR試劑盒(20 Test),其主要成分如下
(1) 核酸濃縮液1.5mlX10管，主要成分為13%PEG8000、 1.6 mol/LNaCl。
(2) 核酸提取液1.5 mix 1管，主要成分為50 mmol/LNaOH、 5 mMEDTA、1% Triton X-100 、 1 % NP-40 。
(3) PCR反應緩沖液0.5 ml,主要成分有20 mmol/1 Tris-HCl pH8.3(25°C)、 100 mmol/L KC1, 70 mmol/L MgCl2、 0.04Q/o(W/V)明膠、0.4 mM脫氧核糖核 苷三磷酸dNTP(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、0.4 nmol/L引物、0.2 pmol/L探針。
(4) Taq酶50pl，含Taq DNA聚合酶50 U，尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶) 12 U。
(5) 陰性對照300 ^1，為無菌雙蒸水。
(6) 陽性對照300 ^1，為公牛全血白細胞中提取的DNA溶液，采用上海生工 全血DNA提取試劑盒進行。
3.樣本的處理和實時熒光PCR檢測
上述試劑盒在性別鑒定過程中的使用步驟為
(1) 樣本處理
取懷孕12周以上奶牛血漿750 |il，加入相同體積核酸濃縮液，旋渦振蕩 混勻，8000r/min離心6min棄上清，加入50 |il核酸提取液，旋渦振蕩混勻后 IO(TC保持10 min， 8000 r/min離心6 min取上清作為PCR模板檢測。
如果是胚胎移植性別鑒定，可取1 2個細胞直接加入25 (il核酸提取液， 旋渦振蕩混勻后IO(TC保持10 min， 8000 r/min離心6 min取上清作為PCR模
(2) 擴增檢測
按照待檢測樣品數n+3，取PCR反應緩沖液15X (n+3)、Taq酶2X (n+3) 組分，混勻后每個擴增管分裝17 pl，分別加入試劑盒陰性對照、陽性對照以及上述處理好的n個樣品模板各13pl。每個反應擴增管體積為30 ^，將上述 擴增管放到實時熒光PCR儀器上按照50。C 2min、 94°C 2 min后94°C 5 sec、 60°C 30sec循環(huán)40次的程序運行。運行結束后陰性對照為陰性、陽性對照為 陽性，樣本擴增為陽性者為雄性，否則為雌性。 4.有益效果
本發(fā)明利用所設計的特異性引物探針，通過優(yōu)化反應體系和擴增條件研制 成實時熒光PCR奶牛性別鑒定試劑盒，和目前現有的奶牛胚胎性別鑒定技術 專利比較，其主要特點如下
(1) 采用基于TaqMan水解探針的實時熒光PCR技術，和傳統PCR方法比 較其靈敏度更高，并且操作簡便快速；
(2) 采用奶牛性別決定基因特異性引物和探針，避免人和其它動物來源核酸 污染產生的假陽性；
(3) 試劑盒閉管檢測，以及擴增體系中的dUTP—UNG酶系統更進一步避 免了因擴增產物污染導致的結果假陽性。
本發(fā)明試劑盒根據不同的樣本采用不同的處理方法，通過對熒光PCR擴 增信號的分析來判斷奶牛Y染色體特異性片段的存在，試劑盒操作簡便快速(1 小時以內)，同時擴增體系中的dUTP—UNG酶(脫氧尿嘧啶核苷酸一尿嘧瞎 DNA糖基化酶)系統更進一步避免了因擴增產物污染導致的結果假陽性，準 確率達到100%，可以廣泛應用于生產和科研實踐中懷孕奶牛中胎牛性別、移 植胚胎性別以及科研中奶?；虻目焖勹b定，在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中對加快品種 改良速度、有效降低生產成本、提高牧場和養(yǎng)殖者的收益和經營效益將發(fā)揮重 要的作用。本發(fā)明中所涉及的主要試劑說明
TaqDNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)、dNTPs (dATP、 dUTP、 dCTP、 dGTP)均為上海宏誼公司生產，全血DNA提取試劑盒以及其它化學 試劑購自上海生工生物工程技術服務有限公司。
具體實施例方式
下面詳細介紹本發(fā)明的實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例 僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明 講授的內容之后，本領域技術人員可以通過技術常識對本發(fā)明作各種技術性改 動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
實施例l:懷孕奶牛中胎牛性別的鑒定
(1) 樣品處理
用真空采血管(含EDTA抗凝劑)采集10頭懷孕12周以上奶牛的全血， 于10000 r/min離心6 min后分別吸取血漿750 pl，置于1.5 ml離心管中，10 個樣本共10管，往管中分別加入相同體積核酸濃縮液，旋渦振蕩混勻，8000 r/min離心6 min棄上清，加入50核酸提取液，旋渦振蕩混勻后IO(TC保持 10 min， 8000 r/min離心6 min取上清作為PCR模板檢測。
(2) 擴增檢測
按照待檢測樣品數10+3，取PCR反應緩沖液15X (10+3)、 Taq酶2X (10+3)組分，混勻后每個擴增管分裝17 ^d，分別加入試劑盒陰性對照、陽 性對照以及上述處理好的IO個樣品模板各13 pl。每個反應擴增管體積為30 ^， 將上述擴增管放到ROTORGENE實時熒光PCR儀器(澳大利亞Corbett Research公司)上按照50°C 2 min、 94°C 2 min后94°C 5 sec、 60°C 30 sec循環(huán)40次的程序運行。運行結束后按照儀器軟件自動設定閾值，陰性對照為陰 性、陽性對照為陽性，而10個樣本中3個擴增陽性、7個陰性，表明10頭奶
牛中3頭孕雄胎牛、7頭孕雌胎牛。最后經和分娩結果比較，胎牛的性別和熒 光PCR鑒定結果全部符合。
實施例2:奶牛胚胎移植中胚胎性別的鑒定
(1) 樣本處理
取5個處于桑葚胚期的奶牛胚胎，應用顯微操作技術各吸取1 2個胚胎 細胞，直接加入25 pl核酸提取液，旋渦振蕩混勻后IO(TC保持10 min， 8000r/min 離心6min取上清作為PCR模板檢測。
(2) 擴增檢測
按照待檢測樣品數5+3，取PCR反應緩沖液15X (5+3)、Taq酶2X (5+3) 組分，混勻后每個擴增管分裝17 pl，分別加入試劑盒陰性對照、陽性對照以 及上述處理好的n個樣品模板各13 ^。每個反應擴增管體積為30 W，將上述 擴增管放到ABI 7000實時熒光PCR儀器(美國應用生物系統公司)上按照50 °C 2min、 94°C 2min后93。C 15 sec、 60°C 45 sec循環(huán)40次的程序運行。運 行結束后按照儀器軟件自動設置基線和閾值，陰性對照為陰性、陽性對照為陽 性，而5個胚胎樣本中2個擴增為陽性、3個陰性，表明2個胚胎為雄性奶牛 胚胎、3個為雌性奶牛胚胎。將這5個奶牛胚胎移植到受體母牛中，妊娠分娩 后胎牛的性別和熒光PCR鑒定結果完全相符。
10核苷酸序列表 SEQUENCE LISTING
〈110〉上海復星醫(yī)藥(集團)股份有限公司 上海復星醫(yī)學科技發(fā)展有限公司 吳大治，夏懿
〈120〉奶牛胚胎性別鑒定的方法和試劑盒
<130〉 bovine sexing
〈藩 CN
〈141〉 2007-11-11
〈160〉 3
<170> Patentln version 3.3
<210〉 1
〈211〉 18
〈212〉 DNA
<213〉 Bos taurus
〈220〉
〈221〉 Sry PRM1 <222〉 (1)..(18)
〈400〉 1
acgccttcat tgtgtggt 18
<210〉 2
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〈212〉 DNA
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〈211〉 26
〈212〉 DNA
〈213〉 Bos taurus
〈220〉
〈221〉 Sry Probe
〈222〉 (1)..(26)
〈223〉 n=FAM,y:TAMRA
〈220〉
〈221〉 misc_feature
〈222> (1).. (1)
〈223> n is a, c, g, or t
<400〉 3
nctagtagtc tctgtgcctc ctcaay 2權利要求
1. 一種實時熒光PCR擴增檢測奶牛性別決定基因(sry)上182bp區(qū)域的方法，堿基序列如下上游引物為5’ACg CCT TCA TTg TgT ggT 3’下游引物為5’Cgg gTA TTT gTC TCg gTg TA 3’探針為5’FAM-CTA gTA gTC TCT gTg CCT CCT CAA-TAMRA 3’(5’標記FAM，3’標記TAMRA)。
2. —種濃縮并提取血漿或血清中游離DNA的方法和溶液，濃縮液的主要成分 為聚乙二醇8000和NaCl，其濃度分別為10 15%和1.5 2.0 mol/L。
3. 如權利要求1和2所述方法和引物探針建立的試劑盒，其組分為核酸濃縮 液、核酸提取液、PCR反應緩沖液、Taq酶、空白對照、陽性對照。
4. 如權利要求l所述試劑盒在奶牛胚胎性病鑒定中的應用，包括以下步驟(1) 樣品處理取懷孕12周以上奶牛血漿750 ^il，加入相同體積核酸濃縮液，旋渦振蕩 混勻，8000r/min離心6min棄上清，加入50 核酸提取液，旋渦振蕩混勻后 IO(TC保持10 min， 8000 r/min離心6 min取上清作為PCR模板檢測。如果是胚胎移植性別鑒定，可取1 2個細胞直接加入25 pl核酸提取液， 旋渦振蕩混勻后IO(TC保持10 min， 8000 r/min離心6 min取上清作為PCR模 板檢測。(2) 擴增檢測按照待檢測樣品數n+3，取PCR反應緩沖液15 X (n+3)、Taq酶2X (n+3 ) 組分，混勻后每個擴增管分裝17 pl，分別加入試劑盒陰性對照、陽性對照以 及上述處理好的n個樣品模板各13 ^。每個反應擴增管體積為30 W，將上述 擴增管放到實時熒光PCR儀器上按照50。C 2min、 94°C 2min后94。C 5 sec、60°C 30sec循環(huán)40次的程序運行。運行結束后陰性對照為陰性、陽性對照為 陽性，樣本擴增為陽性者為雄性，否則為雌性。
全文摘要
本發(fā)明為一種利用實時熒光PCR進行奶牛胚胎性別鑒定的方法和試劑盒，它采用一對奶牛特異性引物擴增性別決定基因(sry)上的182bp區(qū)域，并用特異性TaqMan水解探針法實時檢測。試劑盒組分包括核酸濃縮液、核酸提取液、PCR反應緩沖液、Taq酶、陰性對照、陽性對照。試劑盒的使用包括樣本處理和擴增檢測兩個步驟，本發(fā)明通過檢測模板中sry基因片段的存在來判斷樣品個體的性別，試劑盒操作簡便快速(1小時以內)，并可避免因自身擴增產物、人以及其它動物來源核酸污染產生的假陽性，準確率達到100％，可廣泛應用于懷孕奶牛胎牛性別鑒定、奶牛胚胎移植性別鑒定以及科研奶牛sry基因檢測中。
文檔編號C12Q1/68GK101451161SQ20071017124
公開日2009年6月10日 申請日期2007年11月29日 優(yōu)先權日2007年11月29日
發(fā)明者吳大治, 懿 夏 申請人:上海復星醫(yī)藥(集團)股份有限公司;上海復星醫(yī)學科技發(fā)展有限公司