專利名稱：：一種復(fù)合微生物的發(fā)酵料及制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種復(fù)合微生物的發(fā)酵料及制作方法，采用益生菌共生配伍設(shè)計和多級復(fù)合發(fā)酵技術(shù)，每級發(fā)酵均有各自不同的目標(biāo)產(chǎn)物，使產(chǎn)品中富含大量有益活菌、多糖、多肽、活性酶、有機酸、植物甾醇、三帖皂甙等活性代謝產(chǎn)物，更易被畜禽采食、消化、吸收，屬于農(nóng)業(yè)生物制品
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：全價飼料也稱全日糧配合詞料。它是指含有動物一定時期生長所需的蛋白質(zhì)、能量、微量元素、礦物質(zhì)等成分，能全面滿足飼喂對象的營養(yǎng)需要。這些飼料原料主要由植物原料和動物油脂組成，含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子和大分子物質(zhì)，不易被動物腸道黏膜及消化系統(tǒng)直接吸收。所以，如何充分吸收和利用全價飼料中各種主要的營養(yǎng)成分成為養(yǎng)殖業(yè)中首要解決的一個難題，關(guān)于這方面的研究起步很早,除開發(fā)新的飼料資源外，提高現(xiàn)有飼料資源的利用率也是解決問題最有效途徑之一。目前消除抗?fàn)I養(yǎng)因子和分解大分子營養(yǎng)物質(zhì)的方法主要有以下幾種1、物理法，如加熱法、膨化法、機械加工法；2、化學(xué)法；3、生物技術(shù)法如酶制劑法、育種法、控制用量法，除酶制劑法外，其余方法的效果并不明顯且某種程度上限制了飼料營養(yǎng)作用對飼養(yǎng)動物的生長，而由于酶制劑是專一性很強的催化劑，所以對原料眾多的抗?fàn)I養(yǎng)因子難以以某幾種酶制劑添加來消除其作用，同時酶制劑作用需要嚴(yán)格的溫度、ph等催化條件。通過在中國知識產(chǎn)權(quán)局專利檢索網(wǎng)站查詢，類似的公告的一項專利申請，申請?zhí)枮?3101357.0，題為"高效生物飼料"，其主要內(nèi)容為提供一高效的生物雞詞料，該詞料中添加有微生物發(fā)酵詞料、不飽和脂肪酸，以及人體必備金屬離子的氨基酸螯合物。蛋雞食用該詞料后，對飼料中營養(yǎng)成分吸收更快，所產(chǎn)的雞蛋較普通雞蛋的營養(yǎng)成分含量有較大的提高。該技術(shù)中菌種沒有經(jīng)過任何選育與誘導(dǎo)，產(chǎn)酶效果和活菌總數(shù)很低，同時添加簡單的氨基酸配方，沒有任何化學(xué)或生物反應(yīng)過程發(fā)生，其工藝過程簡單，無法保證其"提高采食量和采食速度，大幅提升消化道內(nèi)源酶的總活性，減少應(yīng)激性腹瀉"的使用效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種提高養(yǎng)殖動物采食量和伺料利用率，同時提高養(yǎng)殖動物免疫力的復(fù)合微生物的發(fā)酵料及制作方法。為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種復(fù)合微生物的發(fā)酵料，其特征在于，由以下重量百分比原料組成枯草芽孢桿菌20%_24%、干酪乳桿菌22%—27%、啤酒酵母菌30%—35%、沼澤紅假單胞菌14%—28%。一種復(fù)合微生物發(fā)酵料的制備方法，其特征在于，生產(chǎn)菌種通過射線誘導(dǎo)和生產(chǎn)性能試驗相結(jié)合，篩選產(chǎn)量高、產(chǎn)酶量大的生產(chǎn)菌種，生產(chǎn)工藝采用益生菌共生配伍設(shè)計和多級復(fù)合發(fā)酵技術(shù)，培養(yǎng)基中添加產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，在包裝上采用單項生物透氣閥，其制作程序和生產(chǎn)工藝為第一步發(fā)酵菌株選育a.傳代培養(yǎng)采用農(nóng)業(yè)部菌種保存中心提供的枯草芽孢桿菌菌株、干酪乳桿菌、啤酒酵母菌通過營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，沼澤紅假單胞菌(光合細(xì)菌)通過馬鈴薯培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基在18。C一22"光照條件下培養(yǎng)，選育生長速度快、菌落特征明顯的菌種，在(TC一4t:溫度下保存菌種；b.誘導(dǎo)選育將枯草芽孢桿菌菌株、干酪乳桿菌和啤酒酵母菌分別在紫外線的照射下進行誘導(dǎo)，將保存的菌種制作菌懸液，稀釋至10—7，在30cm處用功率為15W的紫外燈，波長為250nm，處理18—20s，處理后的菌懸液在營養(yǎng)瓊脂平板中溫度為3(TC—34'C，倒置培養(yǎng)45小時一50小時，選出生長速度快的菌落進行搖瓶實驗，觀察菌種生長速度快，特征明顯即活菌總數(shù)大于50億/ml，干酪乳桿菌菌落直徑大于3ml，啤酒酵母菌大于7ml，枯草芽孢桿菌大于5ml的菌株在(TC一4'C溫度加以保存；c.性能試驗將步驟b中三種菌種分別接種在液體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為3(TC—34。C，在轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分一250轉(zhuǎn)/分的恒溫?fù)u床中進行恒溫培養(yǎng)，24小時一28小時后取樣，利用平板計數(shù)法進行菌落總數(shù)測定，菌落總數(shù)大于40億/ml的菌種可用于生產(chǎn)制種；d.制作生產(chǎn)用菌種將篩選出的枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、啤酒酵母菌、分別轉(zhuǎn)接入裝有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄子瓶中在35t:—4(rc溫度下培養(yǎng)45小時一50小時，沼澤紅假單胞菌接入裝有馬鈴薯培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基的茄子瓶中，2(TC溫度下培養(yǎng)5—9天，待茄子瓶表面菌苔布滿，并白中帶黃時即可取出，然后放入2—6'C的冰箱中保存；第二步復(fù)合菌種的液體高速培養(yǎng)a.按以下比例稱取各菌種枯草芽孢桿菌20%—24%、干酪乳桿菌22%—27%、啤酒酵母菌30%—35%、沼澤紅假單胞菌(光合細(xì)菌)14%—28%;b.干酪乳桿菌和啤酒酵母菌的液體培養(yǎng)將按步驟a的比例稱取的干酪乳桿菌和啤酒酵母菌，用無菌生理鹽水沖洗，制成復(fù)合菌種液，混合后在一起進行復(fù)合培養(yǎng)將混合菌苔按l:20的比例接種于12(TC—128'C、30—45min高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐中攪拌25min—35min，其轉(zhuǎn)速為200—220r/min，攪拌均勻后放入消毒后的塑料桶中靜置5—7天，靜置過程中每天測定Ph值并釋,放產(chǎn)出的氣體；發(fā)酵過程中抽樣3次，顯微鏡下檢測菌體生長情況和測定Ph值，當(dāng)活菌總數(shù)達到40億/ml濃度和Ph值達到3.0-4.5時停止發(fā)酵；c.枯草芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌的液體培養(yǎng)將枯草芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌菌苔用無菌生理鹽水沖洗，制成復(fù)合菌種液，按l:20—25的比例接種于120。C一128。C、30min—45min高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵時通氣量維持在l:1.0-1.2，發(fā)酵時間24—35小時；第三步菌種的固體復(fù)合發(fā)酵a.將步驟2復(fù)合培養(yǎng)的菌液混合后按1:20的比例接入12(TC—128。C、30min—45min高溫滅菌的固體擴大培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中添加O.08%—0.1%的二乙胺四乙酸作產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，攪拌30—45min至均勻，倒入消毒密封罐中密封發(fā)酵，溫度32—35'C，時間8—10天；b、發(fā)酵過程中取樣三次，測定水分和Ph值，發(fā)酵結(jié)束后取樣，測定水分為35%-40%、Ph值為4.5—5.5;第四步添加氨基酸鋅和鐵a.根據(jù)發(fā)酵料的用途不同進行添加如果用于豆粕、玉米的發(fā)酵則添加氨基酸鐵和氨基酸鋅，具體做法是市場購買利用蛋白生物合成技術(shù)生產(chǎn)的氨基酸鐵和氨基酸鋅制品按l:l混合；b.將混合后的氨基酸鋅和鐵按2—3:100的比例添加到第三歩的發(fā)酵產(chǎn)品中，混合均勻；c.如果用于全價飼料則不添加；第五歩粉碎與包裝將歩驟3發(fā)酵完全的產(chǎn)品混合均勻，裝入帶有單項透氣閥的包裝袋中，扎緊袋口，系好標(biāo)識牌，轉(zhuǎn)入成品庫有序堆放；取樣檢測，主要參數(shù)水份35%—40%、活菌數(shù)S50億/g、總蛋白量》19%，賴氨酸》1.2%;物理性狀深黃色粉末狀固體。所述的步驟2中乳酸菌和啤酒酵母菌的液體培養(yǎng)基組成及重量百分比為玉米衆(zhòng)3%—5%、糖蜜12%—15%、酵母膏O.2%-0.4%、硫酸鎂O.2%—0.5%、硫酸銨0.5%-0.7%、磷酸氫二鈉O.2%-0.5%、無菌水77.8。/。-83.9%。所述的歩驟2中枯草芽孢桿菌及沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)基組成及重量百分比可溶性淀粉2°/。一5%、豆粕粉O.6%—1.2%、玉米漿1%-6%、磷酸二氫鉀O.2%-0.6%、草酸1.4%-1.8%、硫酸鎂O.4%-1%、消泡劑O.5%-1%、.無菌水86%-93%。所述的步驟3中固體擴大培養(yǎng)基為無菌水再加清糠、豆粕粉、糖蜜、玉米粉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鎂、尿素、二乙胺四乙酸中的至少四種混合物組成，其重量百分配比為清糠12%—14%、麩皮30%—33%、大豆粉8%—11%、糖蜜8%一10%、玉米粉8%—10%、磷酸二氫鉀O.5%—1%、氯化鉀1%—1.5%、硫酸鎂O.4%一0,7%、0.08%—0.1%的二乙胺四乙酸、無菌水18.7%—32.02%。本發(fā)明利用生物工程技術(shù)進行篩選優(yōu)化多個菌種，在全價飼料中或飼料原料中添加，能將營養(yǎng)物質(zhì)分解或轉(zhuǎn)化為更易吸收的小分子物質(zhì)，并消除普通全價飼料或飼料原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，使飼料營養(yǎng)養(yǎng)分更高，更易被畜禽采食、消化、吸收，采用創(chuàng)新的益生菌共生配伍設(shè)計和多級復(fù)合發(fā)酵技術(shù)，每級發(fā)酵均有各自不同的目標(biāo)產(chǎn)物，使產(chǎn)品中富含大量有益活菌、多糖、多肽、活性酶、有機酸、植物甾醇、三帖皂甙等活性代謝產(chǎn)物。全價詞料中各種營養(yǎng)成分齊全，但是主要營養(yǎng)成分為大分子物質(zhì)，難以直接被動物消化道吸收利用。其中蛋白質(zhì)原料中用量最大，功能最重要的豆類及其餅粕、高粱和某些塊根塊莖類中就存在蛋白酶抑制因子，可導(dǎo)致飼料中蛋白質(zhì)的消化率下降，因其能和胰蛋白酶、胃蛋白酶和糜蛋白酶結(jié)合而生成無活性的復(fù)合物，降低這些酶的活性；可引起養(yǎng)殖動物體內(nèi)蛋白質(zhì)內(nèi)源性消耗，抗?fàn)I養(yǎng)因子不但影響了飼料的營養(yǎng)價值和適口性，能量飼料中纖維素含量占15%，其中纖維素、半纖維素和果腔質(zhì)被木質(zhì)素膠合在一起，木質(zhì)素和硅酸鹽組成細(xì)胞壁外殼，堅硬光滑。由于纖維素材料中的木質(zhì)素和結(jié)晶性，使牲畜消化道內(nèi)的細(xì)菌和酶不能分解和利用，另外，動物性油脂可提供脂肪來源，但是其分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，養(yǎng)殖動物分解吸收困難，利用微生物發(fā)酵料在秸稈飼料中應(yīng)用較廣，主要是分解利用秸稈中的纖維素，降低養(yǎng)殖成本，但實際上飼料原料中營養(yǎng)成分最大和最重要的是蛋白質(zhì)和動物性油脂，如何分解和利用這兩種物質(zhì)是一大難題，而本發(fā)明中的菌種即是針對這三種難分解的營養(yǎng)成分選取。本發(fā)明的技術(shù)路線是采用農(nóng)業(yè)部658公告中允許添加的有益菌種，利用射線誘導(dǎo)技術(shù)篩選及改良菌種，使其產(chǎn)酶量和反應(yīng)速度最大，同時多個菌種密切配合，協(xié)同作用，采用液體高速培養(yǎng)和固體擴大培養(yǎng)技術(shù)，發(fā)酵過程中產(chǎn)生并積累大量營養(yǎng)富的菌體，即乳酸桿菌、芽孢桿菌、酵母和有用的代謝產(chǎn)物，如抗生素、維生素、有機酸、激素及賴氨酸等，本發(fā)明技術(shù)兼有酶制劑法和發(fā)酵法的優(yōu)點，能顯著消除飼料原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子作用，提高養(yǎng)殖動物采食量和飼料利用率，同時提高養(yǎng)殖動物的免疫力。本發(fā)明中的各個菌種在飼養(yǎng)原料分解及發(fā)酵中各自發(fā)揮獨立的作用，同時相互配合，其中芽孢桿菌是一類耐高溫、高壓及低pH值的有益微生物，用作飼料添加劑不論是在顆粒還是在液體飼料中都較穩(wěn)定。芽孢桿菌以孢子狀態(tài)進入畜禽腸道生長繁殖，消耗腸內(nèi)氧氣，造成厭氧環(huán)境，使乳酸菌、雙歧桿菌增加，大腸桿菌減少，本發(fā)明中采用的枯草芽孢桿菌還能在發(fā)酵過程中產(chǎn)生安全的內(nèi)源性免疫物質(zhì)——桿菌肽，桿菌肽是由地衣型芽孢桿菌產(chǎn)生的多肽類抗生素，對革藍氏陽性菌有很強的抑制作用。桿菌肽鋅飼料添加劑適用于各種畜禽，如牛、羊、豬、雞、鴨等。具有明顯的促進生長效果，提高飼料轉(zhuǎn)化率及防治豬、雞細(xì)菌性腹瀉和慢性呼吸道疾病的功效。增加畜禽抗病能力，提高健康水平，促進生長，增加微量元素，提高飼料利用率。Kacmmerer等用的小公雞做小規(guī)模熱應(yīng)激試驗，認(rèn)為在詞料中添加顆粒包膜型桿菌肽鋅，可消除持續(xù)高溫應(yīng)激因素所產(chǎn)生的負(fù)作用。Bronsch(1984)指出,桿菌肽鋅可能是將能量用于增重、產(chǎn)蛋而使體內(nèi)熱的產(chǎn)生減少。Manner等(1989)在34'C高溫條件下,在詞料中添加100mg/kg顆粒包膜型桿菌肽鋅,33周試驗表明,試驗組生產(chǎn)性能大大高于對照組，蛋雞增重、日采食量、總蛋數(shù)和總蛋重分別提高66.2%、9.9%、15.3%和17%，明顯地提高蛋殼強度。本發(fā)明中桿菌肽的產(chǎn)生是內(nèi)源性產(chǎn)生，不同于外援性添加，具有成本低、活性高、無藥物殘留等優(yōu)點。酵母菌是單細(xì)胞真核生物，具有生長快、易于遺傳操作、能對外源蛋白進行翻譯后加工和修飾、不產(chǎn)生有毒產(chǎn)物等特點，被認(rèn)為是表達外源蛋白的合適宿主，本復(fù)合菌種中采用的啤酒酵母具有生長速度快，產(chǎn)量高的特點，其中本身的蛋白含量達50%以上，在酵母菌的代謝產(chǎn)物中，含有激素、維生素、核酸等具有促進作物生長發(fā)育功能的生理活性物質(zhì)。乳酸菌對人和動物都有保健和治療功效，這一點，國內(nèi)外均有大量飼養(yǎng)和臨床試驗證明。Baird(1977)用乳桿菌飼喂斷奶仔豬和生長育肥豬，試驗證明均能增加日增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率；Lidbeck等(1992)證實乳酸桿菌能預(yù)防放療引起的腹瀉。蔡輝益等(1993)對益生素使用效果進行統(tǒng)計，其中乳酸菌類益生素飼喂豬的報道，7例證明能提高日增重，平均提高7.67%，6例證明提高飼料轉(zhuǎn)化率,平均提高5.4%,乳酸菌則以光合細(xì)菌產(chǎn)生的糖類為基質(zhì)，分泌出乳酸，乳酸具有極強的殺菌力，并具有抑制有害微生物的活動和有機物急速腐敗分解的功能。此外，乳酸菌還可以將木質(zhì)素、纖維素等動物難于消化利用的有機物分解成小分子的動物易于吸收、利用的營養(yǎng)物質(zhì)，提高了詞料利用率。光合細(xì)菌是以光和熱為能源，以乳酸等為基質(zhì)，在厭氧條件下能進行光合作用的細(xì)菌總稱。它具有促進糖類、氨基酸類、維生素以及生理活性物質(zhì)生物合成的功能。并能分解空氣中的有害氣體，對污水有很強的凈化能力。它和固氮菌、放線菌、乳酸菌等有益微生物之間有協(xié)同作用。另外，光合細(xì)菌本身的蛋白質(zhì)含量高達60%以上。本發(fā)明的復(fù)合菌種在營養(yǎng)豐富的全價飼料發(fā)酵過程中還能產(chǎn)生大量的消化酶和活性代謝產(chǎn)物，如如植酸酶、淀粉酶、蛋白酶、、纖維素酶、脂肪酶等；這些酶可有效分解飼料原料中難以分解和被動物吸收的蛋白質(zhì)、纖維素、動物性油脂。同時產(chǎn)生動物機體必需的營養(yǎng)成分，如賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸、維生素等；這些物質(zhì)在使用本發(fā)明產(chǎn)品后不再需要添加，大大降低了飼料及養(yǎng)殖成本。由于枯草桿菌是產(chǎn)芽孢菌，后期發(fā)酵液體呈堿性，而兩種乳酸菌是典型的酸性培養(yǎng)細(xì)菌，直接復(fù)合培養(yǎng)有很大的難度，所以本發(fā)明產(chǎn)品采用了液體單獨培養(yǎng)，再進行固體馴化復(fù)合培養(yǎng)的辦法，既保證了菌種活菌數(shù)量，又將代謝產(chǎn)物的保留最大化，保證了產(chǎn)品的應(yīng)用效果。同時在最終產(chǎn)品中添加載體，保證了菌種在運輸和保存過程中的存活時間。本發(fā)明在酶制劑發(fā)酵過程中，加入某些誘導(dǎo)物、表面活性劑及其他一些產(chǎn)酶促進劑，可以大大增加菌體的產(chǎn)酶量。本發(fā)明通過試驗，選用了一種表面活性劑二乙胺四乙酸，作為酶制劑的誘導(dǎo)劑，通過試驗對比，可提供酶產(chǎn)量2—5%，促進劑能促進產(chǎn)量增加的原因主要是改進了細(xì)胞的滲透性，增強了氧的傳遞速度，改善了菌體對氧的有效利用。'產(chǎn)品發(fā)酵完成后，由于大量的有益活菌存在和活性代謝物質(zhì)存在，所以不能采用常規(guī)的真空干燥包裝，本產(chǎn)品采用了一種新型的單項生物透氣閥，包裝發(fā)酵產(chǎn)品的氣體可以及時排出包裝外，而外界含有雜菌的空間不能進入，這就保證產(chǎn)品處于最佳活性狀態(tài)，在保質(zhì)期內(nèi)能發(fā)揮最大的功效。和現(xiàn)階段的其他消除抗?fàn)I養(yǎng)因子的方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點為1.菌種選育過程中采用誘導(dǎo)技術(shù)改良菌種，同時結(jié)合菌種生產(chǎn)性能測定，保證了各個菌種在培養(yǎng)基中高效的產(chǎn)酶量和生長速度；2.采用益生菌共生配伍設(shè)計和多級復(fù)合發(fā)酵技術(shù)，每級發(fā)酵均有各自不同的目標(biāo)產(chǎn)物，同時在發(fā)酵過程中添加特殊的產(chǎn)物誘導(dǎo)劑，使產(chǎn)品中富含大量有益活菌和酶、肽、多糖及氨基酸等活性代謝產(chǎn)物；3.通過產(chǎn)生大量內(nèi)源性活性酶、抗氧化劑和抗生素，改善飼料適口性，提高采食量，增強養(yǎng)殖動物的抗應(yīng)激及免疫力，提高群體整齊度，并改善生長速度和詞料利用率，降低養(yǎng)殖成本；4.包裝采用獨有的生物單項透氣閥，保障產(chǎn)品內(nèi)活菌和代謝產(chǎn)物保證產(chǎn)品處于最佳活性狀態(tài)，在保質(zhì)期內(nèi)能發(fā)揮最大的功效；5.本發(fā)明產(chǎn)品既可添加在全價飼料中，又可發(fā)酵原料，發(fā)酵后可溶性蛋白含量提高12%以上，中性洗滌纖維下降15%以上，有益活菌總數(shù)大于50億/ml;6.本發(fā)明的產(chǎn)品采用農(nóng)業(yè)部658公告允許添加的微生物菌種，在養(yǎng)殖動物體內(nèi)無有害殘留，同時減少了抗生素在養(yǎng)殖中的使用量，是一種安全、綠色的微生物7te口/口口o具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例l一種復(fù)合微生物發(fā)酵料的制備方法為本發(fā)明采用菌種及編號為丄a"oZ)"c/〃^ca"/「ACCC10640)干酪乳桿菌、5^cc/wra附戸scereWw'ae(IFO0203)啤酒酵母菌、5scj77wsJ7c/e/7i/ior肌's(ACCC10619)枯草芽孢桿菌，/^0^^wz/^wo"^/7a/w^^(ACCC10649)沼澤紅假單胞菌,所有菌種由農(nóng)業(yè)部菌種保存中心提供。第一步發(fā)酵菌株選育a.傳代培養(yǎng)采用農(nóng)業(yè)部菌種保存中心提供的枯草芽孢桿菌菌株、干酪乳桿菌、啤酒酵母菌、沼澤紅假單胞菌(光合細(xì)菌)，通過營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，沼澤紅假單胞菌(光合細(xì)菌)通過PDA培養(yǎng)基在20'C光照條件下培養(yǎng)，選育生長速度快、菌落特征明顯的菌種，在4'C溫度下保存菌種；b.誘導(dǎo)選育將枯草芽孢桿菌菌株、干酪乳桿菌和啤酒酵母菌分別在紫外線的照射下進行誘導(dǎo)，將保存的菌種制作菌懸液，稀釋至10—7，在30cm處用功率為15W的紫外燈，波長為250nm，處理18s，處理后的菌懸液在營養(yǎng)瓊脂平板中溫度為34i:，倒置培養(yǎng)45小時，選出生長速度快的菌落進行搖瓶實驗，觀察菌種生長速度快，特征明顯(活菌總數(shù)大于50億/ml，干酪乳桿菌菌落直徑大于3ml，啤酒酵母菌大于7ml，枯草芽孢桿菌大于5ml)的菌株在4'C溫度加以保存；C.性能試驗將歩驟b中三種菌種分別接種在液體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30。C，在轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分的恒溫?fù)u床中進行恒溫培養(yǎng)，24小時一28小時后取樣，利用平板計數(shù)法進行菌落總數(shù)測定，菌落總數(shù)大于40億/ml的菌種可用于生產(chǎn)制種；d.制作生產(chǎn)用菌種將篩選出的枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、啤酒酵母菌、分別轉(zhuǎn)接入裝有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄子瓶中在35r溫度下培養(yǎng)45小時一50小時，沼澤紅假單胞菌接入裝有PDA培養(yǎng)基的茄子瓶中，2(TC溫度下培養(yǎng)7天，待茄子瓶表面菌苔布滿，并白中帶黃時即可取出，然后放入2—6'C的冰箱中保存；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基..牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、瓊脂15—20g、水1000ml、pH7.0-7.2，12rC滅菌20min;馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200g、蔗糖或葡萄糖20g、瓊脂15—20g、水1000ml、pH自然；第二步復(fù)合菌種的液體高速培養(yǎng)a.按以下比例稱取各菌種枯草芽孢4菌20%、干酪乳桿菌22%、啤酒酵母菌30%、沼澤紅假單胞菌(光合細(xì)菌)28%。b.干酪乳桿菌和啤酒酵母菌的液體培養(yǎng)將按歩驟a的比例稱取的干酪乳桿菌和啤酒酵母菌，用無菌生理鹽水沖洗，制成復(fù)合菌種液，混合后在一起進行復(fù)合培養(yǎng)將混合菌苔按l:20的比例接種于12rC、30min高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐中攪拌25min—35min，其轉(zhuǎn)速為200r/min，攪拌均勻后放入消毒后的塑料桶中靜置5—7天，靜置過程中每天測定Ph值并釋放產(chǎn)出的氣體；發(fā)酵過程中抽樣3次，顯微鏡下檢測菌體生長情況和測定Ph值，當(dāng)活菌總數(shù)達到40億/ml濃度和Ph值達到3.0-4.5時停止發(fā)酵；乳酸菌和啤酒酵母菌的液體培養(yǎng)基組成及重量百分比為玉米漿3%、糖蜜12%、酵母膏O.2%、硫酸鎂0.2%、硫酸銨0.5%、磷酸氫二鈉0.2%、無菌水83.9%。c.枯草芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌的液體培養(yǎng)將枯草芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌菌苔用用無菌生理鹽水沖洗，制成復(fù)合菌種液，按l:20—25的比例接種于121'C、30min高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵時通氣量維持在l:1，發(fā)酵時間28小時；枯草芽孢桿菌及沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)基組成及重量百分比可溶性淀粉3%、豆粕粉l.2%、玉米漿4%、磷酸二氫鉀0.4。/。、草酸1.6%、硫酸鎂0.8%、消泡劑0.5%、.無菌水88.5%。第三歩菌種的固體復(fù)合發(fā)酵a.將步驟2復(fù)合培養(yǎng)的菌液混合后按1:20的比例接入12rC、30min高溫滅菌的固體擴大培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中添加O.08%的二乙胺四乙酸作產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，攪拌30—45min至均勻，倒入消毒密封罐中密封發(fā)酵，溫度32。C，時間8天；b、發(fā)酵過程中取樣三次，測定水分和Ph值，發(fā)酵結(jié)束后取樣，測定水分為35%-40%、Ph值為4.5—5.5;固體擴大培養(yǎng)基重量百分配比為清糠12%、麩皮30%、大豆粉8%、糖蜜8%、玉米粉8%、磷酸二氫鉀O.5%、氯化鉀1%、硫酸鎂O.4%、0.08%的二乙胺四乙酸、無菌水31.3%;第四步添加氨基酸鋅和鐵將市場購買利用蛋白生物合成技術(shù)生產(chǎn)的氨基酸鐵和氨基酸鋅制品按l:l混合，將混合后的氨基酸鋅和鐵按l;50的比例添加到第三步的發(fā)酵產(chǎn)品中，混合均勻；第五步粉碎與包裝將步驟3發(fā)醛完全的產(chǎn)品混合均勻，裝入帶有單項透氣閥的包裝袋中，扎緊袋口，系好標(biāo)識牌，轉(zhuǎn)入成品庫有序堆放；取樣檢測，主要參數(shù)水份35%—40%、活菌數(shù)》50億/g、總蛋白量》19%，賴氨酸》1.2%;物理性狀深黃色粉末狀固體實施例2:第一步發(fā)酵菌株選育同實施例l第二步復(fù)合菌種的液體高速培養(yǎng)a.按以下比例稱取各菌種枯草芽孢桿菌24%、干酪乳桿菌27%、啤酒酵母菌35%、沼澤紅假單胞菌(光合細(xì)菌)14%。b.乳酸菌和啤酒酵母菌的液體培養(yǎng)將按步驟a的比例稱取的干酪乳桿菌和啤酒酵母菌，用無菌生理鹽水沖洗，制成復(fù)合菌種液，混合后在一起進行復(fù)合培養(yǎng)將混合菌苔按l:25的比例接種于125'C、45min高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐中攪拌35min，其轉(zhuǎn)速為220r/min，攪拌均勻后放入消毒后的塑料桶中靜置5—7天，靜置過程中每天測定Ph值并釋放產(chǎn)出的氣體；發(fā)酵過程中抽樣3次，顯微鏡下檢測菌體生長情況和測定Ph值，當(dāng)活菌總數(shù)達到40億/ml濃度和Ph值達到3.0-4.5時停止發(fā)酵；乳酸菌和啤酒酵母菌的液體培養(yǎng)基組成及重量百分比為玉米漿5%、糖蜜15%、酵母膏O.4%、硫酸鎂O.5%、硫酸銨O.7%、磷酸氫二鈉O.5%、無菌水77.9%。c.枯草芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌的液,體培養(yǎng)將枯草芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌菌苔用用無菌生理鹽水沖洗，制成復(fù)合菌種液，按l:25的比例接種于125°C、45min高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵時通氣量維持在l:1.0_1.2，發(fā)酵時間30小時；液體培養(yǎng)基重量比百分比同實施例l。第三步菌種的固體復(fù)合發(fā)酵a.將步驟2復(fù)合培養(yǎng)的菌液混合后按1:25的比例接入125'C、45min高溫滅菌的固體擴大培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中添加O.1%的二乙胺四乙酸作產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，攪拌45min至均勻，倒入消毒密封罐中密封發(fā)酵，溫度335i:，時間8天；b、同實施例l。固體復(fù)合發(fā)酵的培養(yǎng)基組成及百分配比為清糠14%、麩皮33%、大豆粉ll%、糖蜜10%、玉米粉10%、磷酸二氫鉀1%、氯化鉀1.5%、硫酸鎂O.7%、0.1%的二乙胺四乙酸、無菌水18.7%。第四步添加氨基酸鋅和鐵a.同實施例l。b、將混合后的氨基酸鋅和鐵按3:100的比例添加到第三歩的發(fā)酵產(chǎn)品中，混合均勻。c.同實施例l。第五歩粉碎與包裝同實施例l。使用時按本制劑的10%與全價飼料或飼料原料的90%比例充分?jǐn)嚢?，均勻后即可飼喂。注意本品需存放于密封千燥處，避免與農(nóng)藥、強刺激物品等混合堆放，開封后三日內(nèi)盡快使用，本產(chǎn)品在研發(fā)過程中經(jīng)2006年9月上海市農(nóng)科院畜牧研究所的對比試驗表明，使用本產(chǎn)品后提高保育仔豬日增重9.30%，改善保育仔豬詞料利用率7.54%，提高生長豬日增重23%，改善生長豬詞料利用率3.66%。2007年3月在上海金山種豬養(yǎng)殖基地進行的應(yīng)用試驗數(shù)據(jù)為<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>以上數(shù)字表明，本專利技術(shù)產(chǎn)品的有關(guān)數(shù)據(jù)表明，本專利技術(shù)產(chǎn)品能明顯降低多種抗?fàn)I養(yǎng)因子對飼料營養(yǎng)的影響，顯著提高詞料利用率，提高動物的適口性和采食量，達到增產(chǎn)、增效，降低成本的養(yǎng)殖效果。權(quán)利要求1.一種復(fù)合微生物的發(fā)酵料，其特征在于，由以下重量百分比原料組成枯草芽孢桿菌20％-24％、干酪乳桿菌22％-27％、啤酒酵母菌30％-35％、沼澤紅假單胞菌14％-28％。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種復(fù)合微生物發(fā)酵料的制備方法，其特征在于，生產(chǎn)菌種通過射線誘導(dǎo)和生產(chǎn)性能試驗相結(jié)合，篩選產(chǎn)量高、產(chǎn)酶量大的生產(chǎn)菌種，生產(chǎn)工藝采用益生菌共生配伍設(shè)計和多級復(fù)合發(fā)酵技術(shù)，培養(yǎng)基中添加產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，在包裝上采用單項生物透氣閥，其制作程序和生產(chǎn)工藝為第一歩發(fā)酵菌株選育a.傳代培養(yǎng)采用農(nóng)業(yè)部菌種保存中心提供的枯草芽孢桿菌菌株、干酪乳桿菌、啤酒酵母菌通過營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，沼澤紅假單胞菌通過馬鈴薯培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基在18'C—22。C光照條件下培養(yǎng)，選育生長速度快、菌落特征明M的菌種，在(TC一4。C溫度下保存菌種；b.誘導(dǎo)選育將枯草芽孢桿菌菌株、干酪乳桿菌和啤酒酵母菌分別在紫外線的照射下進行誘導(dǎo)，將保存的菌種制作菌懸液，稀釋至10—7，在30cm處用功率為15W的紫外燈，波長為250nm，處理18—20s，處理后的菌懸液在營養(yǎng)瓊脂平板中溫度為3(TC—34°C，倒置培養(yǎng)45小時一50小時，選出生長速度快的菌落進行搖瓶實驗，觀察菌種生長速度快，特征明顯即活菌總數(shù)大于50億/ml，干酪乳桿菌菌落直徑大于3ml，啤酒酵母菌大于7ml，枯草芽孢桿菌大于5ml的菌株在(TC一4'C溫度加以保存；c.性能試驗將步驟b中三種菌種分別接種在液體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30。C一34。C，在轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分一250轉(zhuǎn)/分的恒溫?fù)u床中進行恒溫培養(yǎng)，24小時一28小時后取樣，利用平板計數(shù)法進行菌落總數(shù)測定，菌落總數(shù)大于40億/ml的菌種可用于生產(chǎn)制種；d.制作生產(chǎn)用菌種將篩選出的枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、啤酒酵母菌、分別轉(zhuǎn)接入裝有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄子瓶中在35'C—4(TC溫度下培養(yǎng)45小時一50小時，沼澤紅假單胞菌接入裝有馬鈴薯培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基的茄子瓶中，20'C溫度下培養(yǎng)5—9天，待茄子瓶表面菌苔布滿，并白中帶黃時即可取出，然后放入2—6。C的冰箱中保存；第二歩復(fù)合菌種的液體高速培養(yǎng)a.按以下比例稱取各菌種枯草芽孢桿菌20%—24%、千酪乳桿菌22%—27%、啤酒酵母菌30%—35%、沼澤紅假單胞菌14%—28%;b.干酪乳桿菌和啤酒酵母菌的液體培養(yǎng)將按步驟a的比例稱取的干酪乳桿菌和啤酒酵母菌，用無菌生理鹽水沖洗，制成復(fù)合菌種液，混合后在一起進行復(fù)合培養(yǎng)將混合菌苔按l:20的比例接種于12(TC—128i:、30—45min高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐中攪拌25min—35min，其轉(zhuǎn)速為200—220r/min，攪拌均勻后放入消毒后的塑料桶中靜置5—7天，靜置過程中每天測定Ph值并釋放產(chǎn)出的氣體；發(fā)酵過程中抽樣3次，顯微鏡下檢測菌體生長情況和測定Ph值，當(dāng)活菌總數(shù)達到40億/ml濃度和Ph值達到3.0-4.5時停止發(fā)酵；c.枯草芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌的^體培養(yǎng)將枯草芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌菌苔用無菌生理鹽水沖洗，制成復(fù)合菌種液，按l:20—25的比例接種于12(TC—128。C、30min—45min高溫滅菌的液體培養(yǎng)基中，發(fā)酵時通氣量維持在l:1.0-1.2，發(fā)酵時間24—35小時；第三歩菌種的固體復(fù)合發(fā)酵a.將步驟2復(fù)合培養(yǎng)的菌液混合后按1:20的比例接入12(TC—128。C、30min—45min高溫滅菌的固體擴大培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中添加O.08%—0.1%的二乙胺四乙酸作產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，攪拌30—45min至均勻，倒入消毒密封罐中密封發(fā)酵，溫度32—35'C，時間8—IO天；b.發(fā)酵過程中取樣三次，測定水分和Ph值，發(fā)酵結(jié)束后取樣，測定水分為35%-40%、Ph值為4.5—5.5;第四步添加氨基酸鋅和鐵a.根據(jù)發(fā)酵料的用途不同進行添加如果用于豆粕、玉米的發(fā)酵則添加氨基酸鐵和氨基酸鋅，具體做法是市場購買利用蛋白生物合成技術(shù)生產(chǎn)的氨基酸鐵和氨基酸鋅制品按l:l混合；b.將混合后的氨基酸鋅和鐵按2—3:i00的比例添加到第三歩的發(fā)酵產(chǎn)品中，混合均勻；c.如果用于全價飼料則不添加；第五歩粉碎與包裝將歩驟3發(fā)酵完全的產(chǎn)品混合均勻，裝入帶有單項透氣閥的包裝袋中，扎緊袋口，系好標(biāo)識牌，轉(zhuǎn)入成品庫有序堆放；取樣檢測，主要參數(shù)水份35%—40%、活菌數(shù)》50億/g、總蛋白量》19%，賴氨酸》1.2%;物理性狀深黃色粉末狀固體。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種復(fù)合微生物發(fā)酵料的制備方法，其特征在于，所述的步驟2中乳酸菌和啤酒酵母菌的液體培養(yǎng)基組成及重量百分比為玉米漿3%—5%、糖蜜12%—15%、酵母膏O.2%-0.4%、硫酸鎂O.2%—0.5%、硫酸銨O.5%-0.7%、磷酸氫二鈉O.2%-0.5%、無菌水77.8%-83.9%。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種復(fù)合微生物發(fā)酵料的制備方法，其特征在于，所述的步驟2中枯草芽孢桿菌及沼澤紅假單胞菌培養(yǎng)基組成及重量百分比可溶性淀粉2%—5%、豆粕粉O.6%—1.2%、玉米漿1%-6%、磷酸二氫鉀O.2%-0.6%、草酸1.4%-1.8%、硫酸鎂O.4%-1%、消泡劑O.5%-1%、.無菌水86%-93%。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種復(fù)合微生物發(fā)酵料的制備方法，其特征在于，所述的歩驟3中的固體擴大培養(yǎng)基為無菌水再加清糠、豆粕粉、糖蜜、玉米粉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鎂、尿素、二乙胺四乙酸中的至少四種混合物組成，其重量百分配比為清糠12%—14%、麩皮30%—33%、大豆粉8%—11%、糖蜜8%—10%、玉米粉8%—10%、磷酸二氫鉀O.5%—1%、氯化鉀1%—1.5%、硫酸鎂O.4%—0.7%、0.08%—0.1%的二乙胺四乙酸、無菌水18.7%一32.02%。全文摘要本發(fā)明涉及一種復(fù)合微生物發(fā)酵料，其特征在于，生產(chǎn)菌種通過射線誘導(dǎo)和生產(chǎn)性能檢測結(jié)合，篩選生長速度快、產(chǎn)酶量大的生產(chǎn)菌種，生產(chǎn)工藝采用創(chuàng)新的益生菌共生配伍設(shè)計和多級復(fù)合發(fā)酵技術(shù)，產(chǎn)品中有益活菌數(shù)達到50億/g，同時含有多糖、多肽、活性酶、有機酸、植物甾醇、三帖皂甙等活性代謝產(chǎn)物。培養(yǎng)基中添加特殊的產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑，在包裝上采用最新的單項生物透氣閥，既可在畜禽全價飼料中添加，又可直接添加到飼料原料中，可有效促進大分子營養(yǎng)物質(zhì)在畜禽腸道的分解和吸收，消除飼養(yǎng)原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子作用，顯著提高飼料利用率，降低飼養(yǎng)成本。文檔編號C12N1/20GK101186896SQ20071017144公開日2008年5月28日申請日期2007年11月30日優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日發(fā)明者瀚江申請人:上海創(chuàng)博生態(tài)工程有限公司