專利名稱：用于催化檸檬醛生成香茅醛的基因工程菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基因工程菌及其構(gòu)建方法，更具體 地說，涉及一種用于生物催化檸檬醛生成香茅醛的基因工程菌及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
香茅醛是一種重要的單離香料，廣泛用于飲料、糖果、食品等的加香和其它香精的配 帝lj,還是合成其它香料的原料。工業(yè)上主要由香茅油、桉樹油等精油中分離得到。也可以 通過檸檬醛催化加氫或以e -香茅醇加氫制得。
微生物催化檸檬醛加氫生成香茅醛的反應(yīng)式如下
其機(jī)理是利用微生物代謝中產(chǎn)生的氧化還原酶選擇性的催化加氫。反應(yīng)過程中需要輔酶 NADH (還原型輔酶I )的參與，生成NAD+ (氧化型輔酶I )。利用生物轉(zhuǎn)化法催化檸 檬醛加氫生成香茅醛與其他方法相比具有專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、底物利用率高、轉(zhuǎn)化 率高、生產(chǎn)工藝簡單和副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。
雖然國外有關(guān)于利用微生物催化檸檬醛加氫生成香茅醛的文獻(xiàn)，但國內(nèi)沒有相關(guān)的文 獻(xiàn)和專利報(bào)道，而且現(xiàn)有的微生物催化檸檬醛加氫生成香茅醛中所使用的微生物均為野生 菌，尚無利用基因工程菌催化檸檬醛加氫生成香茅醛的報(bào)道，因此，有必要對(duì)此進(jìn)行研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種NADH氧化酶的重組表達(dá)質(zhì)粒，能夠轉(zhuǎn)化基因工程 菌以表達(dá)NADH氧化酶。
本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供所述重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種基因工程菌，能夠表達(dá)NADH氧化酶。 本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供所述基因工程菌的構(gòu)建方法。 本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供一種生物催化檸檬醛生成香茅醛的方法。 本發(fā)明的重組表達(dá)質(zhì)粒是在合適的表達(dá)載體上克隆有NADH氧化酶基因gye。 根據(jù)本發(fā)明，所述NADH氧化酶基因gye可以來源于以下菌中的任一種大腸桿菌 (&c/2m,c/H'flfco/Z)、志賀菌(幼扭〃a)、沙門氏菌(S"/mowe〃a)、酉昔桿菌"c咖6a"er)、
克雷伯氏菌(G/wco朋6a"e。；優(yōu)選的，所述NADH氧化酶基因gye來源于氧化葡萄糖酸
桿菌(G/wcowo^acte/- oxj^my)。
根據(jù)本發(fā)明，所述NADH氧化酶基因g^具有SEQ ID NO.l所示的序列。
根據(jù)本發(fā)明，所述表達(dá)載體為pET系列表達(dá)載體，優(yōu)選的，所述表達(dá)載體為采用pET28。
本發(fā)明的重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法包括以下步驟
A、 擴(kuò)增編碼NADH氧化酶的基因g^的序列；
B、 將擴(kuò)增獲得的NADH氧化酶基因gye序列經(jīng)酶切后，連入經(jīng)相同酶切的pET系列表 達(dá)載體中，獲得NADH氧化酶的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明的基因工程菌株轉(zhuǎn)化有上述克隆有NADH氧化酶基因gye的重組表達(dá)質(zhì)粒。 本發(fā)明的基因工程菌株的構(gòu)建方法包括將上述克隆有NADH氧化酶基因gye的重組表 達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌，獲得表達(dá)NADH氧化酶的基因工程菌。
根據(jù)本發(fā)明，所述基因工程菌為大腸桿菌，優(yōu)選的，所述基因工程菌為大腸桿菌BL21。 本發(fā)明的生物催化檸檬醛生成香茅醛的方法，包括以下步驟
A、 發(fā)酵所述基因工程菌以表達(dá)NADH氧化酶；
B、 向發(fā)酵液中加入底物檸檬醛，通過NADH氧化酶催化加氫獲得香茅醛。 將獲得的基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵，向發(fā)酵液中加入底物檸檬醛，溶液，獲得香茅醛。 本發(fā)明開辟了利用基因工程菌生產(chǎn)香茅醛的先例，使得普通大腸桿菌具備了催化檸檬
醛生成香茅醛的功能，這為今后構(gòu)建生產(chǎn)香茅醛的基因工程菌提供了新的思路，也為進(jìn)一 步獲得更為優(yōu)化的工程菌奠定了基礎(chǔ)。


圖1為基因工程菌BL21/gye的發(fā)酵表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后的SDS-PAGE電泳圖，其中泳 道l為經(jīng)過His-Tag柱純化后的GYE蛋白；泳道2為表達(dá)后沒有純化的破壁上清液；泳 道3為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道4為沒有重組的BL21的破壁上清液。
圖2顯示了基因工程菌BL21/gye表達(dá)的NADH氧化酶催化檸檬醛后的產(chǎn)物質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā) 明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)
室手冊(cè)》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件或者制造 商建議的條件進(jìn)行或配置。
本發(fā)明的實(shí)施例中使用的大腸桿菌BL21及pET系列表達(dá)載體pET28均購自Novagen公司。
本發(fā)明的實(shí)施例中使用的細(xì)菌DNA抽提試劑盒購自北京博大泰克生物技術(shù)有限公司。
實(shí)施例1、基因工程菌的構(gòu)建
1.1、 引物設(shè)計(jì)
根據(jù)NCBI Genbank中NADH氧化酶的基因gye的序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增gye基因的PCR 引物Pgye-1和Pgye-2序列如下
Pgye-1: 5，- CGACATATGCCAACCCTGTTCGATC -3'; Pgye-2: 5，- TTAGAATTCTCAGTTGGGGCCGGAGGTG -3，。
為了便于與表達(dá)載體的酶切連接，弓l物Pgye-1上引入I酶切位點(diǎn)，弓l物Pgye-2 上引入5coRI酶切位點(diǎn)，所述酶切位點(diǎn)分別如序列中下劃線所示。
1.2、 基因gye的克隆
用細(xì)菌DNA抽提試劑盒獲得氧化葡萄糖酸桿菌(DSM2003)總DNA，并以其為模 板，Pgye-1和Pgye-2作為引物，PCR擴(kuò)增^Z/ 基因，具體條件如下
反應(yīng)體系氧化葡萄糖酸桿菌總DNA (0.02mg/nl) 1^1 ，引物Pgye-1 (20nmol/L) 和Pgye-2 (20pmol/L)各lpl， dNTP (1.6腿ol/L) 4pl,Taq酶l.Ounits， 10XTaq buffer (2.0mmol/L) 5pl,加雙蒸水至50pl。
反應(yīng)條件95°C 5min; 95°C 45s， 55°C 45s， 72°C 80s完成30個(gè)循環(huán)；最后72。C延 伸10min。
PCR產(chǎn)物經(jīng)1X的瓊脂糖電泳檢測(cè)，回收得到大小約為l.lkb的片斷，經(jīng)測(cè)序，確定 為NADH氧化酶基因gye的DNA序列。 1.3、 表達(dá)載體的構(gòu)建
將回收的片段以Mfc I、 ￡coR I酶切，然后與同樣經(jīng)Msfe I、 ￡coR I酶切的pET28載體 連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒，命名為pET-gye。
得到的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-gye經(jīng)酶切鑒定，符合預(yù)期結(jié)果。
最后對(duì)鑒定為正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-gye進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，克隆入表達(dá)載 體的NADH氧化酶基因gye的序列如SEQ ID NO:l所示。
1.4、 基因工程菌的構(gòu)建
使用常規(guī)方法將以上獲得的重組質(zhì)粒pET-gye轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL2I,獲得基因工程菌 BL21/gye，通過測(cè)序驗(yàn)證該重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。
實(shí)施例2、基因工程菌發(fā)酵表達(dá)及產(chǎn)物檢測(cè)
2.1、 基因工程菌BL21/gye的發(fā)酵表達(dá)與純化
將實(shí)施例1獲得的基因工程菌BL21/gye接種入LB培養(yǎng)基中，于37"C培養(yǎng)至對(duì)數(shù) 生長期，加入IPTG至終濃度lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。
離心收集菌體，超聲破菌，離心收集上清，用His-Tag親和柱純化，得到的純化產(chǎn)物 進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖l所示，可見在40kDa處得到清晰條帶，與預(yù)期NADH 氧化酶條帶大小相符，證明構(gòu)建的基因工程菌BL21/gye能夠發(fā)酵表達(dá)NADH氧化酶。
2.2、 發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)
將以上獲得的純化的NADH氧化酶蛋白加入反應(yīng)液(5Ommol/L磷酸緩沖液1.4mL、 乙腈0.3ml、 100mmol/LNADH溶液0.3ml、檸檬醛2.5nL)中催化反應(yīng)，于37t:， 100rpm 下反應(yīng)4h，產(chǎn)物經(jīng)液質(zhì)方法鑒定，結(jié)果如圖2所示，可見獲得的產(chǎn)物為香茅醛，表明本 發(fā)明的基因工程菌BL21/gye表達(dá)獲得的NADH氧化酶能夠催化檸檬醛加氫生成香茅醛。
實(shí)施例3、利用基因工程菌BL21/gye生產(chǎn)香茅醛 本實(shí)施例中使用的菌種為實(shí)施例1獲得的基因工程菌BL21/gye。 本實(shí)施例中使用的培養(yǎng)基配方為蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉10g/L，卡那
霉素0.05g/L, pH7.0。
將基因工程菌BL21/gye接入裝有200mL培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，于37°C 、 250 rpm
培養(yǎng)，定時(shí)取樣檢測(cè)OD65o值，當(dāng)0065()為0.4日寸，添加IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘
導(dǎo)培養(yǎng)14小時(shí)。
向搖瓶中加入檸檬醛至終濃度為重量體積比10%，加入乙腈至終濃度為10% (重量 體積比)，于35。C、 250rpm反應(yīng)4h。
取反應(yīng)液，用氯仿萃取分離純化獲得香茅醛，測(cè)定采用氣相色譜(GC)分析方法， 色譜儀的操作條件如下
色譜型號(hào)安捷倫6820
色譜柱DB-WAX (30mX0.53mmXl.0pm)
色譜工作站Sepu3000 (杭州普惠科學(xué)儀器有限公司)
載氣氮?dú)?br> 流速1 ml/min 進(jìn)樣量0.5 |ll 分流比10:1
檢測(cè)器氫火焰檢測(cè)器(FID)
柱溫100。C保持2分鐘，然后以2(TC/min梯度升溫至22(TC 進(jìn)樣口溫度25CTC 檢測(cè)器溫度280°C
以l， 4-丁二醇為內(nèi)標(biāo)，用內(nèi)標(biāo)法定量。
根據(jù)GC圖譜峰面積法，計(jì)算得到擰檬醛轉(zhuǎn)化率達(dá)到75% 。
雖然以上實(shí)施例僅以來源于氧化葡萄糖酸桿菌(G/wco"o6ac^"o;c^tora)的NADH氧 化酶基因序列為例進(jìn)行了說明，但本發(fā)明的重組表達(dá)質(zhì)粒以及構(gòu)建的基因工程菌 pET-gye中的NADH氧化酶基因gye并不局限于氧化葡萄糖酸桿菌(G/wco"o6ac敏 ox少6fam)來源的NADH氧化酶基因，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)，本技術(shù)領(lǐng)域的 技術(shù)人員可以使用來源于其它菌種，如大腸桿菌(&c/^Wc/^co//)、志賀菌(幼/ge〃a)、 沙門氏菌(&/wo"e//a)、醋桿菌"cetoZ)a"w)、克雷伯氏菌(G/wco"oZ^"")等的NADH 氧化酶基因構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)而構(gòu)建能夠表達(dá)具有NADH氧化酶活性的蛋白，這是 顯而易見的，因此同樣應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明的范圍。
綜上所述，本發(fā)明提供了一種全新的基因工程菌用于生產(chǎn)香茅醛，利用NADH氧化 酶基因表達(dá)產(chǎn)物NADH氧化酶選擇性催化檸檬醛加氫生成香茅醛，不僅生產(chǎn)工藝簡 單，而且轉(zhuǎn)化率較高。同時(shí)，本發(fā)明也開辟了利用基因工程菌生產(chǎn)香茅醛的先例，使得普 通大腸桿菌具備了催化檸檬醛加氫生成香茅醛的功能，這為今后構(gòu)建生產(chǎn)香茅醛的基因工 程菌提供了新的思路，也為進(jìn)一步獲得更為優(yōu)化的工程菌奠定了基礎(chǔ)。序列表
〈110〉華東理工大學(xué)
〈120〉用于催化檸檬醛生成香茅醛的基因工程菌及其構(gòu)建方法
〈130〉 P5071094 〈160〉 1
〈170> Patentln version 3.1
〈210〉 1 〈211〉 1086 〈212〉 DNA
〈213〉 G/wcowZ a"w ox^am* 〈400〉 1
atgccaaccc tgttcgstcc cattgatttc ggtcccattc acgcg犯a^a ccggatcgtg 60
atgtccccgc tgacgcgcgg acgtgctgac aaggaggccg ttccgacccc catcatggcg 120
gaatactacg cccagcgcgc cagtgccggg ctgatcatca cggaagccac gggtatctcc 180
cgcgaaggtc tgggctggcc gttcgcaccg ggaatctggt ccgatgcgca ggtcgaagcc 240
tggaagccga tcgtggccgg tgtgcatgca aagggcggaa agatcgtctg ccagctctgg 300
cacatgggcc gcatggtcca ctcgtccgtg accggaacgc agcccgtctc gtcctccgcc 360
accacggccc ccggcgaggt ccatacctat gaaggcaaga agccgttcga gcaggcccgc 420
gcaatcgatg ccgcggatat cagccgtatt ctgaacgact atgagaacgc cgcccgcaat 480
gcgatccgcg ccggcttcga cggggtgcag atccacgccg ccaatggcta cctcatcgac 540
gagttcctgc gaaacggtac g幼tcaccgc acagatgaat acggcggcgt ccccgaaaac 600
cgcatccgtt tcctgaagga agtcaccgag cgcgtgatcg ctgccatcgg tgccgaccgc 660
acaggcgtgc gcctgtcccc caacggcgat acgcagggct gcatcgacag cgcacctgag 720
acggtctttg tcccggcggc aaagctgctt caggatctgg gcgtggcctg gctcgaactg 780
cgcgaacccg gcccg已已cgg caccttcggc
aagscgg3cc 8
agcccaaact gtccccgcag 840
atccgcaagg tgttcctgcg cccgctggtg c卿ccgcgc tggc卿agg g卿gctgat aaccccgacc tgccggagcg cttcgcccgc acctggtaca gtcagggccc cgaaggatac aactga
ctc犯tcagg actatacgtt cgaggcagca 900 gcgatcgcct tcggtcgcaa gttcatctcg 960 ggcatcgccc tgcagccgga tgatatgaaa 1020 acggactacc cgtccgccac ctccggcccc 1080
108權(quán)利要求
1、一種NADH氧化酶的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述重組表達(dá)質(zhì)粒是在一合適的載體上克隆有NADH氧化酶基因gye。
2、 如權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述NADH氧化酶基因gye來 源于以下菌中的任一種氧化葡萄糖酸桿菌(G/wco"oZ)""er ox>Y/mw)、大腸桿菌(Esc/zen.c/z/a co//)、志賀菌(5%/ge〃a0、沙門氏菌(Sa/mcwe〃a)、醋桿菌(^ceto6fl"er)、 克雷伯氏菌(G7wco"o6""er)。
3、 如權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述NADH氧化酶基因g^具 有SEQ ID NO:l所示的序列。
4、 如權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于，所述載體為pET系列表達(dá)載體。
5、 如權(quán)利要求1一4中任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下 步驟A、 擴(kuò)增編碼NADH氧化酶的基因gye的序列；B、 將擴(kuò)增獲得的NADH氧化酶基因gye序列經(jīng)酶切后，連入經(jīng)相同酶切的pET系列 表達(dá)載體中，獲得NADH氧化酶的重組表達(dá)載體。
6、 一種基因工程菌，其特征在于，該基因工程菌轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求1一5中任一項(xiàng)所述 的重組表達(dá)質(zhì)粒。
7、 如權(quán)利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌為大腸桿菌BL21。
8、 如權(quán)利要求6—7中任一項(xiàng)所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括將權(quán) 利要求l一5中任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌，獲得表達(dá)NADH氧化酶的基因工 程菌。
9、 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述宿主菌為大腸桿菌BL21。
10、 一種生物催化檸檬醛生成香茅醛的方法，其特征在于包括以下步驟A、 對(duì)權(quán)利要求12—14中任一項(xiàng)所述的基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵以表達(dá)NADH氧化酶；B、 向發(fā)酵液中加入底物檸檬醛，通過NADH氧化酶催化加氫獲得香茅醛。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于催化檸檬醛生成香茅醛的基因工程菌及其構(gòu)建方法。本發(fā)明提供的重組表達(dá)質(zhì)粒是在一合適的載體上克隆有NADH氧化酶基因gye，本發(fā)明提供的基因工程菌是在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化有該重組表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明提供了一種全新的基因工程菌用于生產(chǎn)香茅醛，利用NADH氧化酶基因gye表達(dá)產(chǎn)物NADH氧化酶選擇性催化檸檬醛加氫生成香茅醛，簡化了生產(chǎn)工藝，提高了生產(chǎn)效率。本發(fā)明開辟了利用基因工程菌生產(chǎn)香茅醛的先例，使得普通大腸桿菌具備了催化檸檬醛生成香茅醛的功能，這為今后構(gòu)建生產(chǎn)香茅醛的基因工程菌提供了新的思路，也為進(jìn)一步獲得更為優(yōu)化的工程菌奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101186924SQ200710171560
公開日2008年5月28日 申請(qǐng)日期2007年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者楊雪鵬, 波 殷, 馬昱澍, 魏東芝, 魏國棟 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)