專利名稱：1,3-丙二醇氧化還原酶同工酶變體基因Gln202Ala及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物化工中的基因工程菌生產(chǎn)l， 3-丙二醇化工原料的技術領域，具體涉及l(fā), 3-丙二醇氧化還原酶同工酶變體基因Gln202Ala及其用途。
背景技術：
1，3-丙二醇是重要的溶劑和化工原料，以其作為單體可用來合成性能優(yōu)良的聚酯、聚氨 酯等縮聚物。近來，由于以l，3-丙二醇和對苯二甲酸為單體合成的聚對苯二甲酸丙二酯(PTT) 具有非常獨特的性質(zhì)，所以受到國外許多研究機構的重視。目前，化學法合成l，3-丙二醇專利 由荷蘭殼牌(Shell)化學公司和德國Degussa擁有。而生物轉(zhuǎn)化合成l,3-丙二醇專利則由美國 杜邦(DuPont)公司和德國國家生物技術中心獲得。如1999年杜邦公司與世界第二大工業(yè)酶 生產(chǎn)商Genencor公司聯(lián)合申請了以葡萄糖為底物用基因工程菌直接生產(chǎn)l,3-丙二醇的專利。生 物轉(zhuǎn)化法具有耗能低，可利用可再生資源、清潔生產(chǎn)、成本低等優(yōu)點，但由于在微生物代謝 途徑中與合成l，3-丙二醇相關的酶的催化效率低下，迄今為止，生物合成l，3-丙二醇的產(chǎn)量仍 無法與化學合成法的產(chǎn)量相比。在生物轉(zhuǎn)化甘油合成l，3-丙二醇的代謝途徑中，需要甘油脫水 酶和l，3-丙二醇氧化還原酶，其中甘油脫水酶負責將甘油轉(zhuǎn)化成中間產(chǎn)物3-輕基丙醛，而1,3-丙二醇氧化還原酶則負責將3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化為l， 3-丙二醇。由于l， 3-丙二醇氧化還原酶在催化 過程中催化活性很差，嚴重制約了生物轉(zhuǎn)化合成l，3-丙二醇的大規(guī)模生產(chǎn)。最近發(fā)現(xiàn)在大腸桿 菌K12體內(nèi)存在一個1， 3-丙二醇氧化還原酶的同工酶(其對應基因為yqhD)，是甘油代謝途徑 中可代替l, 3-丙二醇氧化還原酶催化中間產(chǎn)物3-羥基丙醛生成1, 3-丙二醇另一關鍵酶，由其代 替l,3-丙二醇氧化還原酶的催化效率明顯高于l,3-丙二醇氧化還原酶的催化效率。但目前1,3-丙二醇氧化還原酶同工酶的催化能力還不夠高，大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生物合成l, 3-丙二醇還有一定困 難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種l， 3-丙二醇氧化還原酶同工酶變體基因Gln202Ala及其用途，克 服現(xiàn)有l(wèi), 3-丙二醇氧化還原酶在催化過程中催化活性差，嚴重制約了生物轉(zhuǎn)化合成l, 3-丙二醇 大規(guī)模生產(chǎn)的缺點。1, 3-丙二醇氧化還原酶同工酶變體基因Gln202Ala及其用途，其特征在于利用易錯PCR 技術介導的隨機突變，通過一定的篩選獲得l， 3-丙二醇氧化還原酶同工酶變體基因，該l, 3-丙二醇氧化還原酶同工酶基因中編碼第202位的谷氨酰胺的密碼子CAG突變?yōu)楸彼岬拿艽a 子GCG，得到l， 3-丙二醇氧化還原酶同工酶變體基因Gln202Ala.該變體基因核苷酸序列為 SEQIDNo.l,可編碼l， 3-丙二醇氧化還原酶同工變體酶。
所述的l， 3-丙二醇氧化還原酶同工酶變體基因Gln202Ala通過基因工程技術重組表達l， 3-丙二醇氧化還原酶同工變體酶，可用于催化3-羥基丙醛生成l， 3-丙二醇。
本發(fā)明采用易錯PCR定向進化技術進化1， 3-丙二醇還原酶同工酶，根據(jù)l, 3-丙二醇還原 酶同工酶的基因設計一對引物，通過降低傳統(tǒng)PCR中一種或者兩種dATPdGTPdCTPdTTP的 濃度并且加入一定量的MnCl2，同時采用低保真度的r"gDNA聚合酶，使基因在擴增時在一定 程度上隨機錯誤引入獲得突變基因文庫，并通過一定的篩選方法獲得一種變體基因，按此設 計思想，以pET28a(+)yqhD作為模板DNA,采用易錯PCR定向進化技術獲得易錯PCR擴增產(chǎn) 物，經(jīng)NheI-BamHI雙酶切易錯PCR擴增產(chǎn)物后，提取大小約為1164bp的基因產(chǎn)物并與同樣的 酶雙酶切后的大小大約為5300bp的線性質(zhì)粒pET28a進行連接反應，連接完畢后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化E.Coli Novablue中，涂布到到含有40叫/ml卡那霉素LB瓊脂平板上，37。C過夜培養(yǎng)得到相 應的突變體庫。從突變體庫中挑取克隆接種到300 nL含有40 pg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng) 基的96微孔板中，37。C過夜培養(yǎng)，取40 nL該過夜培養(yǎng)液加入到一個新的800 ^L含有30 pg/mL 卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基的l. 2 mL容積的96微孔板中，在37。C培養(yǎng)至OD6oo為0. 5 0. 7 時，加入IPTG (終濃度O. 5 mmol/L)誘導并在30"C繼續(xù)培養(yǎng)28h， 4000 r/min離心半個小時 收獲細胞，用300nL的pH7.5磷酸鹽裂解緩沖液重懸細胞，在37"培育30min后，立即置于-8(TC冷凍30min，室溫解凍，4000 r/min離心30 min，吸取300 pL上清液到一個新的96微孔分 析板中，加入2 ^L200 mmol/L 3-羥基丙醛底物(3-羥基丙醛溶解在DMS0中)，在室溫下培 育10 min，然后加20 pL 2 mg/mL的NADPH啟動反應，在34nm處在線監(jiān)控吸收值的變化5 min，篩選出酶活力高于原酶的菌株并提取質(zhì)粒進行全自動DNA測序，發(fā)現(xiàn)突變位點為 Gln202Ala。
本發(fā)明的優(yōu)點是創(chuàng)造了一種對3-羥基丙醛具有更高催化活力的1， 3-丙二醇氧化還原酶同 工酶變體基因，其突變位點為Gln202Ala，與1， 3-丙二醇還原酶同工酶基因相比較，在測定 的一例中活性提高了 1.5-2倍。該變體基因的獲得為生物合成化工原料1， 3-丙二醇的生物生
產(chǎn)提供了廣闊的應用前景。
具體實施方式
下面是
具體實施例方式
1. 易錯PCR引物的設計和PCR擴增產(chǎn)物的獲得
根據(jù)l, 3-丙二醇還原酶同工酶的基因設計的，為了方便以后的操作，在引物的5'端 分別引入BamHI和NheI位點。
上游引物5，誦gtagctagc TAAGGAGG CCATAACTATGAA-3， "1"" Nhel酶切位點 BamHI酶切位點
下游引物5,-catg』atcctgtcatgattttcgcccagttgg-3，
向500nl的eppendorf管中加入lOOpmol的dNTPs，上游引物，下游引物各20pmo1，大 約lngpET28a(+)yqhD作為模板DNA，以及最終濃度為0. 05mMMnCl2， 2. 5uTaqDNA聚 合酶，5p的PCR緩沖液，12. 5p25mM的MgCl2，然后加無菌的蒸餾水至總體積50)al。反 應參數(shù)是通過95。C變性5分鐘后，在95°C lmin ， 54°C 2min, 72°C 1 min，經(jīng)過35個循環(huán)，然 后72°C延伸2min，得到PCR擴增產(chǎn)物。
2. 突變文庫的構建
易錯PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)Nhel-BamHI雙酶切后提取大小約為1164bp的基因產(chǎn)物，并與同樣 的酶雙酶切后的大小約為5300bp的線性質(zhì)粒pET28a(+)進行連接反應，連接完畢后將連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.Coli Novablue中，涂布到到含有40pg/ml卡那霉素LB瓊脂平板上，37。C過夜培 養(yǎng)得到相應的突變體庫。
酶切時質(zhì)粒pET28a(+)和質(zhì)粒pET28a(+)yqhD以及限制酶的用量比
質(zhì)粒pET28a(+)yqhD/質(zhì)粒pET28a(+) 5|il
toHI(10u/pl) 1^1 Buffer (卿 5nl
無菌水_
總體積 20nl 質(zhì)粒pET28a(十)一yqhD連接時連接酶和質(zhì)粒的配比 質(zhì)粒DNApET28a(+)片斷 2(^1 基因yqhD片斷 4pl T4DNA連接酶
T4DNA連接酶Buffer(10X) 2|il
無菌水__
總體積
3. —種對3-羥基丙醛具有高催化活性的變體基因的篩選
從突變體庫中挑取克隆接種到300 )iL含有40 ng/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基的96微 孔板中，37t過夜培養(yǎng)，取40 nL該過夜培養(yǎng)液加入到一個新的800 [iL含有30 pg/mL卡那霉 素的LB液體培養(yǎng)基的1. 2 mL容積的％微孔板中，在37'C培養(yǎng)至OD6{K)為0. 5 0. 7時， 加入IPTG(終濃度O. 5mmol/L)誘導并在3(TC繼續(xù)培養(yǎng)28h， 4000 r/min離心半個小時收獲 細胞,用300 pL的pH7.5磷酸鹽裂解緩沖液重懸細胞，在37。C培育30 min后，立即置于-80°C 冷凍30min，室溫解凍，4000 r/min離心30 min,吸取300 nL的含有l(wèi)， 3-丙二醇氧化還原酶 同工酶的上清液到一個新的96微孔分析板中，加入2nL200mmol/L3-羥基丙醛底物(3-羥基 丙醛溶解在DMSO中)，在室溫下培育10 min，然后加20 pL 2 mg/mL的NADPH啟動反應， 在340nm處在線監(jiān)控吸收值的變化5 min，篩選出酶活力高于原酶的菌株并提取質(zhì)粒進行全自 動DNA測序，發(fā)現(xiàn)突變位點為Gln202Ala。
通過酶動力學曲線的測定，與l， 3-丙二醇還原酶同工酶基因相比較，在測定的一例中活 性提高了 1. 5-2倍。
4. 重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)l,3-丙二醇
a) 挑取含有該l， 3-丙二醇還原酶同工酶變體基因Gln202Ala的陽性克隆接入到含有 30Hg/ml卡那霉素的種子培養(yǎng)基中，180r/min， 37'C搖床過夜培養(yǎng)12h。將種子液按2 %(v/v) 的接種量接入到含有40ng/mL卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，180r/min， 37'C搖床培養(yǎng)至菌 體OD6oo約為0. 7-0. 9，加IPTG至終濃度0.4mmol/L，并添加25g/L濃度底物3-羥基丙酸， 于25t:， 120 r/min發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)10小時。
b) 收集發(fā)酵液，在3000-5000 r/min離心15-30分鐘，收集上清液.加入等體積的有機溶劑 氯仿，提取l,3-丙二醇，然后用旋轉(zhuǎn)增發(fā)濃縮提取液用于氣相色譜分析。
c) 1，3-丙二醇產(chǎn)量采用氣相色譜法測定。氣相色譜條件為FID檢測器，2mx03m不銹鋼 填充柱，填料為國產(chǎn)高分子微球GDX2401 (110目)，載氣為N2，進樣口溫度25(TC，
柱溫22(TC，檢測器溫度250'C。使用外標法定量發(fā)酵液中產(chǎn)物，進樣量為2nl。實驗結 果顯示，當添加底物3-羥基丙醛的初始濃度為25g/L時，用含有l(wèi)， 3-丙二醇還原酶同 工酶變體基因Gln202Ala重組大腸桿菌進行發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇，1， 3-丙二醇產(chǎn)量可達 到15.7 g/L,證明了用含有該l， 3-丙二醇還原酶同工酶變體基因Gln202Ala重組大腸桿 菌的確能高效表達1,3-丙二醇氧化還原酶同工變體酶，并用來發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇。
SEQUENCE LISTING
<110>上海理工大學 <120> 1， 3-丙二醇氧化還原酶同工酶變體基因Gln202Ala及其用途 <160> 1
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1
<211〉 1164
<212> DM
<213> 大腸桿菌K12
<220>
<223>編碼第202位的谷氨酰胺的密碼子CAG突變?yōu)楸彼岬拿艽a子GCG <400> 1
1 atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 61 ggtttacgcg aacaaattcc tcacgatgct cgcgtattga ttacctacgg cggcggcagc 121 gtgaaaaaaa ccggcgttct cgatcaagtt ctggatgccc tgaaaggcat ggacgtgctg 181 gaatttggcg gtattgaacc aaacccggct tatgaaacgc tgatgaacgc cgtgaaactg 241 gttcgcgaac aaaaagtgac ttttctgctg gcggttggcg gcggttctgt actggacggc 301 accaaattta tcgctgcagc ggctaactat ccggaaaata tcgatccgtg gcacattctg 361 caaacgggcg gcaaagagat taaaagcgcc atcccgatgg gctgtgtgct gacgctgcca 421 gcaaccggtt cagaatccaa cgcaggcgcg gtgatctccc gtaaaaccac aggcgacaag 481 caggcgttcc attctgccca tgttcagccc gtatttgccg tgctcgatcc ggtttatacc 541 tacaccctgc cgtcgcgtca ggtggctaac ggcgtagtgg acgcctttgt acacaccgtg 601 gaagcgtatg ttaccaaacc ggttgatgcc朋aattcagg accgtttcgc agaaggcatt 661 ttgctgacgc tgatcgaaga tggtccgaaa gccctgaaag agccagaaaa ctacgatgtg 721 cgcgccaacg tcatgtgggc ggcgactcag gcgctgaacg gtttgatcgg cgctggcgta
781 CCgC3gg3Ct gggC33CgC3 t3tgCtgggC C3Cg33Ctg3 CtgCg3tgC3 CggtCtggat
841 cacgcgcaaa cactggctat cgtcctgcct gcactgtgga atgaaaaacg cgataccaag 901 cgcgctaagc tgctgcaata tgctgaacgc gtctggaaca tcactgaagg ttcagacgat961 gagcgtattg acgccgcgat tgccgcaacc
1021 acccacctct ccgactacgg tctggacggc
1081 gaagagcacg gcatgaccca actgggcgaa
1141 cgtatatacg aagccgcccg ctaa
cgcaatttct ttgagcaatt aggcgtgccg agctccatcc cggctttgct gaaaaaactg aatcatgaca ttacgctgga tgtcagccgc
權利要求
1.1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶變體基因Gln202Ala及其用途，其特征在于利用易錯PCR技術介導的隨機突變，通過一定的篩選獲得1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶變體基因，該1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶基因中編碼第202位的谷氨酰胺的密碼子CAG突變?yōu)楸彼岬拿艽a子GCG，得到1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶變體基因Gln202Ala.該變體基因核苷酸序列為SEQID No.1，可編碼1，3-丙二醇氧化還原酶同工變體酶。
全文摘要
1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶變體基因Gln202Ala及其用途，利用易錯PCR技術介導的隨機突變，篩選獲得1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶變體基因，該基因中編碼第202位的谷氨酰胺的密碼子CAG突變?yōu)楸彼岬拿艽a子GCG，得到1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶變體基因Gln202Ala。該變體基因核苷酸序列為SEQID No.1，可編碼1，3-丙二醇氧化還原酶同工變體酶。將該變體基因Gln202Ala通過基因工程技術重組表達1，3-丙二醇氧化還原酶同工變體酶，用于催化3-羥基丙醛生成1，3-丙二醇，在測定的一例中活性提高了1.5-2倍，為生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)化工原料1，3-丙二醇提供了廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/53GK101173292SQ200710171759
公開日2008年5月7日 申請日期2007年12月4日 優(yōu)先權日2007年12月4日
發(fā)明者琳 李, 李紅梅, 佳 陳 申請人:上海理工大學