專利名稱:以毛囊干細(xì)胞為種子細(xì)胞的復(fù)合皮及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)創(chuàng)面修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域,特別是一種能修復(fù)全層皮膚缺 損創(chuàng)面的以毛囊干細(xì)胞為種子細(xì)胞的復(fù)合皮及其構(gòu)建方法,該毛囊干細(xì) 胞轉(zhuǎn)染突變型0 -連環(huán)蛋白基因。
背景技術(shù):
為解決大面積深度燒傷患者皮源不足的問(wèn)題,體外構(gòu)建含自體表皮 細(xì)胞的復(fù)合皮用于移植已成為創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。目前常規(guī)的
制備復(fù)合皮的方法是取小塊皮膚標(biāo)本(2cm^4cm2),分離自體表皮細(xì)胞, 體外培養(yǎng)、擴(kuò)增,然后按一定密度接種于真皮替代物(如脫細(xì)胞真皮、 海綿狀膠原膜、透明質(zhì)酸膜、聚乳酸/聚羥基乙酸膜等)表面,繼續(xù)培養(yǎng) 后形成含單層或復(fù)層表皮細(xì)胞的復(fù)合皮,將復(fù)合皮移植于經(jīng)手術(shù)處理的 深度燒傷創(chuàng)面,即可形成新的皮膚組織,從而修復(fù)創(chuàng)面。
在復(fù)合皮的體外構(gòu)建和移植中,研究者經(jīng)長(zhǎng)期的實(shí)踐發(fā)現(xiàn),體外培 養(yǎng)、擴(kuò)增表皮細(xì)胞存在以下難以克服的缺陷①培養(yǎng)條件苛刻,培養(yǎng)周期 長(zhǎng),擴(kuò)增倍數(shù)不穩(wěn)定。②盡管在培養(yǎng)早期,表皮細(xì)胞中的一部分細(xì)胞仍 具有表皮干細(xì)胞特性,但經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)和傳代后,表皮細(xì)胞逐漸失去增 殖潛能,成為終未分化細(xì)胞,移植后因過(guò)度角化而脫落、存活率低。③ 對(duì)于特大面積燒傷患者,皮源嚴(yán)重不足,表皮細(xì)胞的來(lái)源受到極大限制。 因此,含自體表皮細(xì)胞的復(fù)合皮的臨床應(yīng)用受到了較大的限制。
最近研究表明,毛囊干細(xì)胞可望成為復(fù)合皮構(gòu)建中新的種子細(xì)胞(參 見(jiàn)張群,叢笑倩,張文杰等.利用中性蛋白酶消化法擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞的實(shí) 驗(yàn)研究.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào),2007,27(4):387-391 )。毛囊干細(xì)胞主要位于毛
囊外根鞘的隆突部,是更原始的干細(xì)胞群,具有永久的增殖潛能。毛囊 干細(xì)胞具有雙向分化潛能,不僅能夠再生出毛囊,而且可向表皮干細(xì)胞、 表皮細(xì)胞分化。因此,利用毛囊干細(xì)胞無(wú)限增殖和雙向分化的特點(diǎn),可 提供表皮細(xì)胞來(lái)源。但毛囊干細(xì)胞的顯著特點(diǎn)是慢增殖周期,而作為種
子細(xì)胞需要一定的增殖速度和數(shù)量。因此如何在體外擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞,數(shù) 量,并防止分化是需要解決的難題。 '
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種不是以自體表皮細(xì)胞直接構(gòu)建的復(fù)合 皮,而是以毛囊干細(xì)胞作為種子細(xì)胞構(gòu)建的復(fù)合皮,并且該毛囊干細(xì) 胞轉(zhuǎn)染了突變型e-連環(huán)蛋白基因,可在體外保持一定的增殖速度和數(shù)
本發(fā)明是對(duì)目前構(gòu)建的復(fù)合皮進(jìn)行了明顯的改進(jìn)。即將毛囊干細(xì)胞 分離培養(yǎng)后,經(jīng)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染突變型P-連環(huán)蛋白基因,然后將這種轉(zhuǎn)基 因的毛囊干細(xì)胞接種在真皮替代物表面,經(jīng)體外培養(yǎng)后形成復(fù)合皮。將 突變型的P -連環(huán)蛋白基因轉(zhuǎn)染到毛囊干細(xì)胞,可使毛囊干細(xì)胞內(nèi)游離的
p —連環(huán)蛋白逐漸在胞質(zhì)內(nèi)積聚,這些積聚起來(lái)的P —連環(huán)蛋白與T細(xì) 胞因子/淋巴樣增強(qiáng)因子(Tcf/Lef)結(jié)合形成復(fù)合體,進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞增殖相 關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄,使毛囊干細(xì)胞大量增殖,從而縮短毛囊干細(xì)胞體外培養(yǎng)、 擴(kuò)增時(shí)間,提高復(fù)合皮應(yīng)用的靈活性。
本發(fā)明提供了一種以毛囊干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的復(fù)合皮的構(gòu)建方 法,包括如下步驟
A) 分離、培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞該步驟采用文獻(xiàn)記載之常規(guī)方法,如 張群,叢笑倩,張文杰等.利用中性蛋白酶消化法擴(kuò)增毛囊干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn) 研究.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào),2007,27(4):387-391 。
B) 構(gòu)建突變型P-連環(huán)蛋白基因質(zhì)粒表達(dá)載體該步驟采用文獻(xiàn)記 載之常規(guī)方法,如張瑞,鄢和新,陳磊等.連環(huán)蛋白基因功能區(qū)截短突變 體的構(gòu)建及其功能.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志2004,20(4)385-389。
C) 將質(zhì)粒表達(dá)載體與毛囊干細(xì)胞共培養(yǎng),轉(zhuǎn)染毛囊干細(xì)胞;
D) 將轉(zhuǎn)染了突變型e-連環(huán)蛋白基因的毛囊干細(xì)胞按1-5乂105個(gè) /cr^的密度接種于真皮替代物表面,體外培養(yǎng)l-2周,形成含單層或復(fù) 層細(xì)胞膜片的復(fù)合皮。
本發(fā)明的以毛囊干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的復(fù)合皮的構(gòu)建方法,其具體 步驟如下
A) 分離、培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞
切取小塊頭皮(如2-4cm2),采用酶消化法分離毛囊外根鞘細(xì)胞群, 制備成單個(gè)毛囊干細(xì)胞懸液,按2.5-5 X10S個(gè)/cn^細(xì)胞密度接種于培養(yǎng) 瓶中,置于37'C培養(yǎng)箱中以完全型DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞達(dá) 70% 80%融合時(shí)進(jìn)行傳代、擴(kuò)增;
B) 構(gòu)建突變型P-連環(huán)蛋白基因質(zhì)粒表達(dá)載體
采用反轉(zhuǎn)錄PCR克隆全長(zhǎng)野生型e-連環(huán)蛋白基因(參見(jiàn)Frank T, Kolligs, Gang Hu, et al. Neoplastic Transformation of RK3E by Mutant P -Catenin Requires Deregulation of Tcf/Lef Transcription but Not Activation of c-myc Expression. Molecular and Cellular Biology, 1999,19(8): 5696-5706),以此為模板,采用PCR技術(shù),擴(kuò)增編碼140 781位氨基 酸的N端功能區(qū)截短突變體基因,以質(zhì)粒為載體,插入突變型P-連環(huán)
蛋白基因構(gòu)建成表達(dá)載體;
C) 毛囊干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染
將1 P g質(zhì)粒表達(dá)載體與毛囊干細(xì)胞共培養(yǎng),轉(zhuǎn)染毛囊干細(xì)胞,采用 Westemblot檢測(cè)細(xì)胞漿內(nèi)P -連環(huán)蛋白表達(dá)水平;
D) 復(fù)合皮的構(gòu)建
將轉(zhuǎn)染了突變型P-連環(huán)蛋白基因的毛囊干細(xì)胞按l-5X105個(gè)/cm2 的密度接種于真皮替代物表面,加入完全型DMEM培養(yǎng)液經(jīng)體外培養(yǎng) 1-2周,每2 3天換液一次,形成含單層或復(fù)層細(xì)胞膜片的復(fù)合皮。
臨床上常用的真皮替代物有脫細(xì)胞真皮、海綿狀膠原膜、透明質(zhì)酸 膜和聚乳酸/聚羥基乙酸膜等。
本發(fā)明還提供了根據(jù)上述方法構(gòu)建的復(fù)合皮作為創(chuàng)面修復(fù)移植材 料的應(yīng)用。
本發(fā)明復(fù)合皮與目前臨床上常用的含自體表皮細(xì)胞或毛囊干細(xì)胞的 復(fù)合皮比較,具有顯著的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的復(fù)合皮中的毛囊干細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染 突變型P-連環(huán)蛋白基因,從而能控制毛囊干細(xì)胞的分化,并促進(jìn)毛囊干 細(xì)胞增殖,使毛囊干細(xì)胞能在較短的時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增較多的數(shù)量,滿足應(yīng)用 的需要。另一方面,毛囊干細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖性,能提高復(fù)合皮移植 后的抗感染能力。
本發(fā)明含轉(zhuǎn)染突變型e-連環(huán)蛋白基因的毛囊干細(xì)胞的復(fù)合皮,主要
用途是修復(fù)全層皮膚缺損創(chuàng)面,為嚴(yán)重的大面積深度燒傷患者提供皮源。 另一方面,也可應(yīng)用于慢性深度皮膚潰瘍、皮膚撕脫傷等皮膚缺損創(chuàng)面 的修復(fù)。經(jīng)大量動(dòng)物(裸鼠)實(shí)驗(yàn)表明,將轉(zhuǎn)染突變型P-連環(huán)蛋白基因 的人毛囊干細(xì)胞接種于海綿狀膠原膜真皮替代物表面培養(yǎng)后形成復(fù)合
皮,然后以真皮替代物一面朝下,植入全層皮膚缺損創(chuàng)面,存活率達(dá)85%。 復(fù)合皮移植后,毛囊干細(xì)胞增殖分化,轉(zhuǎn)化為表皮細(xì)胞,最終封閉創(chuàng)面。 新生皮膚可見(jiàn)基底層、基底上層和角化層,表皮與真皮連接結(jié)構(gòu)正常, 真皮中膠原纖維排列規(guī)則有序。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的實(shí)施并不僅限于此。
實(shí)施例l本發(fā)明的復(fù)合皮的構(gòu)建
毛囊干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)取小塊頭皮(2cm2)經(jīng)PBS(含青霉素 50 U / ml、鏈霉素50 u g / ml)清洗,小心刮除皮下脂肪組織,剪成0.5 cm X 1.0 cm大小,置于5 mg / ml Dispase II (Gibco公司),4°C消化過(guò)夜(14 16 h),無(wú)血清DMEM清洗,小心拔出毛發(fā),剪除毛球部,加入0.125% 胰酶(Gibco公司)37。C消化10 min,上下吹打,加含10%的小牛血清 DMEM終止消化,過(guò)濾,以800轉(zhuǎn)/分鐘離心8 min, DMEM洗滌2次, 以完全型DMEM培養(yǎng)液稀釋后計(jì)數(shù),按2. 5 X 105個(gè)/^112細(xì)胞密度接種于培 養(yǎng)瓶中,置于37"C培養(yǎng)箱中以完全型DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞達(dá) 70% 80%融合時(shí)進(jìn)行傳代、擴(kuò)增。 .
P -連環(huán)蛋白基因的克隆及突變型P -連環(huán)蛋白基因質(zhì)粒表達(dá)載體的 構(gòu)建用0. 125%的胰酶消化、離心、收集1X107個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人 SW480結(jié)腸癌細(xì)胞,用TRIZOL提取細(xì)胞總RNA,以引物 P2(CGGGACCTACATCGTATCAAACC)反轉(zhuǎn)錄P-連環(huán)蛋白cDNA第1鏈。然 后,以引物P1(CGGGATCCATGGCTACTCAAGCTGATTTG)和P2進(jìn)行PCR,將 擴(kuò)增片段經(jīng)BamH I和Kpn I雙酶切后,克隆入pUC19的相應(yīng)位點(diǎn),并 轉(zhuǎn)化E.coliDH5a菌種。挑取陽(yáng)性菌落,經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序,命名為pUO P。以pUC-e為模板,以引物P3(CGCGTCGACTGGACMTGGCTACTCMG)和
p4 (CGGGATCCTTACAGGTCAGTATCMACC)進(jìn)行PCR,擴(kuò)增編碼140 781位 氨基酸的N端功能區(qū)截短突變體基因。經(jīng)Sal I和BaraH I雙酶切后, 連入pCMV—myc(Clontech公司)中的相應(yīng)位點(diǎn),構(gòu)建成含突變型P-連 環(huán)蛋白基因的質(zhì)粒表達(dá)載體。
毛囊干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24h用胰酶消化生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的毛囊 干細(xì)胞,以2X105接種于24孔板。待細(xì)胞達(dá)80%融合率時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 轉(zhuǎn)染細(xì)胞換用200 uL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)。將1 u g質(zhì)粒DNA禾n 2 p L LipofectAmine 2000,分別加于25 y L無(wú)血清DMEM中,混勻,室溫靜 置30min。將轉(zhuǎn)染液加入24孔板中,輕輕混勻后,于37oC孵育4h。棄去 轉(zhuǎn)染液,加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。采用Westernblot 檢測(cè)細(xì)胞漿內(nèi)3 -連環(huán)蛋白表達(dá)水平。
復(fù)合皮的構(gòu)建將真皮替代物海綿狀膠原膜以DMEM培養(yǎng)液漂洗2 小時(shí),然后將轉(zhuǎn)染了突變型P-連環(huán)蛋白基因的毛囊干細(xì)胞按1X10S個(gè) /cn^密度接種于海綿狀膠原膜真皮替代物表面,加入完全型DMEM培 養(yǎng)液經(jīng)體外培養(yǎng)l周,每2 3天換液一次,形成含單層細(xì)胞膜片的復(fù)合 皮。
實(shí)施例2本發(fā)明的復(fù)合皮的構(gòu)建
制備復(fù)合皮時(shí),將經(jīng)基因轉(zhuǎn)染的毛囊干細(xì)胞按lX10S個(gè)/cii^密度接 種于脫細(xì)胞真皮替代物表面,在完全型DMEM培養(yǎng)液中37X:下培養(yǎng)1 周,每2天換液1次,即形成含單層毛囊細(xì)胞的復(fù)合皮。其余同實(shí)施例 1。
實(shí)施例3本發(fā)明的復(fù)合皮的構(gòu)建
制備復(fù)合皮時(shí),將經(jīng)基因轉(zhuǎn)染的毛囊干細(xì)胞按lX10S個(gè)/cr^密度接 種于海綿狀膠原膜真皮替代物表面,在完全型DMEM培養(yǎng)液中37t:下 培養(yǎng)2周,每2天換液1次,即形成含復(fù)層毛囊干細(xì)胞的復(fù)合皮。其余 同實(shí)施例1。
實(shí)施例4本發(fā)明的復(fù)合皮的構(gòu)建
制備復(fù)合皮時(shí),將經(jīng)基因轉(zhuǎn)染的毛囊干細(xì)胞按2X 105個(gè)/(^12密度接 種于海綿狀膠原膜真皮替代物表面,培養(yǎng)l周即形成復(fù)合皮。其余同實(shí) 施例l。
實(shí)施例5本發(fā)明復(fù)合皮的動(dòng)物移植試驗(yàn)
雄性Balb/c-nu小鼠(裸鼠,上海西普爾一必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提 供),體重18士2克,16只,共分為二組。分別為本發(fā)明復(fù)合皮組(即轉(zhuǎn) 基因毛囊干細(xì)胞組)和含未進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的毛囊干細(xì)胞的復(fù)合皮組(即單 純毛囊干細(xì)胞組)
裸鼠經(jīng)氯胺酮腹腔麻醉后,剃除背部皮膚毛發(fā),切除脊柱偏腹側(cè)部 全層皮膚及深筋膜達(dá)肌肉層。將實(shí)施例1中所述的經(jīng)體外培養(yǎng)1周的復(fù) 合皮移植于創(chuàng)面。為防止創(chuàng)周皮膚收縮及表皮爬行,影響移植結(jié)果的觀 察,采用移植艙將創(chuàng)面與周邊皮膚隔離。復(fù)合皮上覆蓋含DMEM培養(yǎng)液的 膠原膜,定期更換敷料并觀察創(chuàng)面愈合情況。復(fù)合皮移植后2周打開(kāi)創(chuàng) 面觀察存活率。并取材,制成厚約5ium的石蠟切片,行常規(guī)組織切片HE 染色觀察。
結(jié)果表明,本發(fā)明復(fù)合皮移植后存活率為83.5%,明顯高于含單純毛 囊干細(xì)胞的復(fù)合皮組(存活率為72.8%)。組織學(xué)觀察可見(jiàn),本發(fā)明復(fù)合 皮移植后4周表皮層增厚,明顯角化。表皮與真皮連接區(qū)開(kāi)始形成皮釘 與乳頭,兩者連接較緊密。而含單純毛囊干細(xì)胞的復(fù)合皮移植后4周, 表皮與真皮連接區(qū)較平坦。
權(quán)利要求
1、一種以毛囊干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的復(fù)合皮的構(gòu)建方法,其特征在于該方法包括如下步驟A)分離、培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞;B)構(gòu)建突變型β-連環(huán)蛋白基因質(zhì)粒表達(dá)載體;C)將質(zhì)粒表達(dá)載體與毛囊干細(xì)胞共培養(yǎng),轉(zhuǎn)染毛囊干細(xì)胞;D)將轉(zhuǎn)染了突變型β-連環(huán)蛋白基因的毛囊干細(xì)胞按1-5×105個(gè)/cm2的密度接種于真皮替代物表面,體外培養(yǎng)1-2周,形成含單層或復(fù)層細(xì)胞膜片的復(fù)合皮。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種以毛囊干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的復(fù)合皮的構(gòu) 建方法,其特征在于該方法的具體步驟如下A) 分離、培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞切取小塊頭皮,采用酶消化法分離毛囊外根鞘細(xì)胞群,制備成單個(gè)毛囊干細(xì)胞懸液,按2.5-5Xl()S個(gè)/cn^細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中,置于 37。C培養(yǎng)箱中以完全型DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞達(dá)70% 80。%融 合時(shí)進(jìn)行傳代、擴(kuò)增;B) 構(gòu)建突變型e-連環(huán)蛋白基因質(zhì)粒表達(dá)載體采用反轉(zhuǎn)錄PCR克隆全長(zhǎng)野生型日-連環(huán)蛋白基因,以此為模板,采 用PCR技術(shù),擴(kuò)增編碼140 781位氨基酸的N端功能區(qū)截短突變體 基因,以質(zhì)粒為載體,插入突變型P-連環(huán)蛋白基因構(gòu)建成表達(dá)載體;C) 毛囊干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染將1 P g質(zhì)粒表達(dá)載體與毛囊干細(xì)胞共培養(yǎng),轉(zhuǎn)染毛囊干細(xì)胞,采用 Westemblot檢測(cè)細(xì)胞漿內(nèi)P-連環(huán)蛋白表達(dá)水平;D) 復(fù)合皮的構(gòu)建將轉(zhuǎn)染了突變型P-連環(huán)蛋白基因的毛囊干細(xì)胞按1-5X105個(gè)/cm2 的密度接種于真皮替代物表面,加入完全型DMEM培養(yǎng)液經(jīng)體外培養(yǎng) 1-2周,每2 3天換液一次,形成含單層或復(fù)層細(xì)胞膜片的復(fù)合皮。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種以毛囊干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的復(fù)合皮 的構(gòu)建方法,其特征在于其中的真皮替代物是脫細(xì)胞真皮、海綿狀膠原膜、透明質(zhì)酸膜或聚乳酸/聚羥基乙酸膜。
4、 一種如權(quán)利要求1、 2或3所述的方法構(gòu)建的復(fù)合皮。
5、 如權(quán)利要求4所述的方法構(gòu)建的復(fù)合皮作為創(chuàng)面修復(fù)移植材料的應(yīng) 用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)創(chuàng)面修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域。體外構(gòu)建含自體表皮細(xì)胞的復(fù)合皮用于移植已成為創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),但體外培養(yǎng)擴(kuò)增表皮細(xì)胞存在如培養(yǎng)條件苛刻、皮源嚴(yán)重不足等缺陷。本發(fā)明的目的在于提供一種以毛囊干細(xì)胞作為種子細(xì)胞構(gòu)建的復(fù)合皮及其構(gòu)建方法,本發(fā)明將毛囊干細(xì)胞分離培養(yǎng)后,經(jīng)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染突變型β-連環(huán)蛋白基因,然后將該毛囊干細(xì)胞接種在真皮替代物表面,經(jīng)體外培養(yǎng)后形成復(fù)合皮。本發(fā)明不僅能控制毛囊干細(xì)胞的分化,促進(jìn)毛囊干細(xì)胞增殖,使毛囊干細(xì)胞能在較短的時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增較多的數(shù)量,滿足應(yīng)用的需要,而且毛囊干細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖性,能提高復(fù)合皮移植后的抗感染能力。
文檔編號(hào)C12N15/85GK101182547SQ20071017204
公開(kāi)日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2007年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月11日
發(fā)明者夏照帆, 朱世輝, 楊曉妍, 田建廣, 肖仕初 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)