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一種發(fā)酵法生產(chǎn)苯乙酮酸的培養(yǎng)基的制作方法

文檔序號(hào):436076閱讀:212來源:國知局
專利名稱:一種發(fā)酵法生產(chǎn)苯乙酮酸的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域,具體說,本發(fā)明涉及一種發(fā)酵法生 產(chǎn)苯乙酮酸的培養(yǎng)基。
背景技術(shù)
苯乙酮酸(phenylglyoxilic acid )又名苯甲酰甲酸(benzoylformic acid ),
是合成某些農(nóng)藥和醫(yī)藥產(chǎn)品的重要中間體,可合成除草劑苯嗪草酮、醫(yī)藥 產(chǎn)品胃長(zhǎng)寧等。R (-)-扁桃酸是極其重要的手性藥物中間體,被廣泛應(yīng)用 于光學(xué)純的氨基酸、血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑、輔酶A的不對(duì)稱合成。目 前國內(nèi)已有研究以苯乙酮酸為底物,不對(duì)稱合成R (-)-扁桃酸。但目前苯 乙酮酸的制備方法主要有苯甲酰氰水解法、苯乙烯氧化法兩種方法,前者 在苯甲酰氰的制備中涉及到劇毒的氰化鈉的使用,而后者則收率很低,所 以導(dǎo)致環(huán)境影響大,成本居高不下。因此迫切需要找尋新的更為廉價(jià)的底 物原料。
Hiroshi Kanzaki等人發(fā)表在Agric Biol. Chem" 1990, 2101-2105的題為 "Production of Benzoylformic Acid from Phenylglycine by Sacc/zoTomjcop* /*o/j^'ca"的論文報(bào)道了采用復(fù)膜孢酵母屬進(jìn)行微生物 轉(zhuǎn)化制備苯乙酮酸,其方法是將培養(yǎng)好的^cc/zaram:^o/wz、 /^w/;;"ca種 子液以8%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(果糖0.2 wt。/。,蛋白胨0.7wt。/。, (NH4) 2SO40.1wt%, KH2PO40.4 wt%, 2ml微量元素液,lml維生素溶液,pH7.0, 100ml微量元素液包括5 gMgCl2'2H20、 0.47g MnCl2'4H20、 FeCl2'H20、 0.2g ZnCl2、 0.1gCaCl2、 0.02g CoCl2'H20、 0.02g CuCl2-2H20、 O.Olg NaMoO小H20、 和O.Ol gNa2B407, lOOml維生素溶液包含l mg維生素BLHC1、 2mg核黃素, 2mg泛酸鈣、2mg維生素B6'HC1、 0.1 mg維生素H、 1 mg p-安息香酸和2mg 煙堿酸),相同條件好氧培養(yǎng)6d,當(dāng)?shù)孜餄舛?0g/L時(shí),苯乙酮酸轉(zhuǎn)化率為 36.25%。此方法的缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)化培養(yǎng)過程中生物量低;初始pH為7.0時(shí),轉(zhuǎn)化過程中pH值維持在苯甘氨酸的等電點(diǎn)附近,對(duì)底物溶解度和底物氨基基
團(tuán)的分子形態(tài)均造成影響;原轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中鈣離子濃度0.0002 wt。/。則偏低, 起不到最佳的作用效果,因此,造成底物濃度和轉(zhuǎn)化率無法繼續(xù)提高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的要解決的技術(shù)問題是進(jìn)一步提高微生物酶法制備苯乙酮酸 的轉(zhuǎn)化率。
我們研究發(fā)現(xiàn)以通過微生物酶法,以廉價(jià)的苯甘氨酸為底物,制備苯 乙酮酸,粗品可直接用于不對(duì)稱合成R (-)-扁桃酸,可以大大節(jié)約成本, 為其工業(yè)化進(jìn)程提供了更廣闊的空間。
為此,本發(fā)明提供一種發(fā)酵法生產(chǎn)苯乙酮酸的培養(yǎng)基,所述培養(yǎng)基包 含果糖、蛋白胨、(NH4)2S04、 KH2P04、酵母提取物,微量元素、維生素 和D,L-苯甘氨酸等,其特征在于,所述培養(yǎng)基的初始pH值為pH"至pH =10。
所述pH值可用NaOH調(diào)節(jié)。
本發(fā)明培養(yǎng)基中果糖的濃度可以為0-1.5wt%,蛋白胨的濃度可以為 0.3-1.5wt%, (NH4)2S04的濃度可以為0-0,4wt%, KH2P04的濃度可以為 0.2-1.0wt。/。。所述果糖、蛋白胨、(NH4)2SO4、KH2PO4的濃度也可參照Hiroshi Kanzaki等人發(fā)表的論文中所述的培養(yǎng)基來選定。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn),當(dāng)Hiroshi Kanzaki等人將初始pH調(diào)節(jié)為7.0時(shí),轉(zhuǎn) 化過程中pH值維持在苯甘氨酸的等電點(diǎn)附近,這對(duì)底物溶解度和底物氨 基基團(tuán)的分子形態(tài)均造成影響。因此本發(fā)明人對(duì)培養(yǎng)基的pH值做了一系 列試驗(yàn),結(jié)果如附圖3所示,從附圖3可以清楚看出,pH值大于7時(shí)苯 乙酮酸的相對(duì)轉(zhuǎn)化率呈明顯上升趨勢(shì),到pH值等于9時(shí)苯乙酮酸的相對(duì) 轉(zhuǎn)化率達(dá)到頂峰,而pH值為10時(shí)苯乙酮酸的相對(duì)轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)下降趨勢(shì), 但仍略大于現(xiàn)有技術(shù)中pH值為7時(shí)的相對(duì)轉(zhuǎn)化率。而當(dāng)pH值大于等于 11時(shí),因超出酵母生長(zhǎng)的pH適應(yīng)范圍,菌體生長(zhǎng)嚴(yán)重受阻。因此,將本 發(fā)明培養(yǎng)基的pH值控制在大于7到10。本發(fā)明所述培養(yǎng)基的最佳pH值 為9。
本發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),往該培養(yǎng)基中加入酵母提取物能進(jìn)一步提高苯乙酮酸的轉(zhuǎn)化率。由附圖1可見,添加酵母提取物后,苯乙酮酸的相對(duì)轉(zhuǎn) 化率亦呈明顯上升趨勢(shì),到酵母提取物的濃度為1.2wt。/。時(shí)苯乙酮酸的相對(duì) 轉(zhuǎn)化率達(dá)到頂峰,當(dāng)酵母提取物的濃度為2.4wtM時(shí),促進(jìn)作用略低于酵母 提取物的濃度為1.2wt。/。時(shí)苯乙酮酸的相對(duì)轉(zhuǎn)化率,未發(fā)現(xiàn)明顯抑制苯乙酮
酸轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。因此,從成本角度出發(fā),將培養(yǎng)基中的酵母提取物的添加濃
度控制在0.3 2.4wt%,優(yōu)選1.2wt%。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn),現(xiàn)有技術(shù)中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的微量元素中的鈣離子濃度 0.0002 wt。/。偏低,當(dāng)培養(yǎng)基中鈣離子濃度大于0.0002 wt。/。時(shí),苯乙酮酸的 相對(duì)轉(zhuǎn)化率亦呈明顯上升趨勢(shì),到鈣離子的濃度為0.075wt。/。時(shí)苯乙酮酸的 相對(duì)轉(zhuǎn)化率達(dá)到頂峰,而當(dāng)酵母提取物的濃度為0.125wt。/。時(shí),苯乙酮酸的 相對(duì)轉(zhuǎn)化率將低于現(xiàn)有技術(shù)。因此,將培養(yǎng)基中的鈣離子的濃度控制在 Ca2 + >0.0002wt%至Ca2 + = 0.015wt% ,所述牽丐離子的最佳濃度為 0.0075wt%。
本發(fā)明培養(yǎng)基中底物D,L-苯甘氨酸的濃度范圍可以為2 5wt%,優(yōu)選 2wt%。當(dāng)?shù)孜餄舛刃∮?wtn/。時(shí),從成本角度則不經(jīng)濟(jì),而大于5wt。/。則 由于底物過多,且溶解度小,而造成發(fā)酵液過于濃厚,影響溶氧,不利于 菌體生長(zhǎng),轉(zhuǎn)化率降低,從而造成底物浪費(fèi)。
因此,本發(fā)明最優(yōu)選的培養(yǎng)基由下列成分組成
果糖 0.2wt%
蛋白胨 0.7wt%
(NH4)2S04 0.1 wt%
KH2P04 0.4wt%
酵母提取物 1.2wt%
氯化f丐 0.0075wt%
D,L-苯甘氨酸 2wt%
且該培養(yǎng)基的初始pH值為9.0。
HPLC檢測(cè)方法為轉(zhuǎn)化結(jié)束后取出5ml發(fā)酵液,濃鹽酸酸化至pHl.O 左右,加入3ml的乙酸乙酯。取50pl上清液真空抽干,加入lml的甲醇充分 溶解后進(jìn)行HPLC分析。色譜柱Waters (318柱(4.6mmx250mm, 5|im); 進(jìn)樣量2(Hd;檢測(cè)波長(zhǎng)254nm;流動(dòng)相磷酸鹽緩沖液:甲醇=9:1;流速0.8ml/min。轉(zhuǎn)化率的測(cè)定樣品溶液制備同HPLC測(cè)定,對(duì)照品溶 液為0.6g/L標(biāo)準(zhǔn)品的甲醇溶液。轉(zhuǎn)化率的計(jì)算樣品的轉(zhuǎn)化率=底物轉(zhuǎn)化 濃度/底物投料濃度xlOOX。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是在優(yōu)化培養(yǎng)基條件下,底物投料量可提高到50g/L, 培養(yǎng)6d,轉(zhuǎn)化率達(dá)36.8%,反應(yīng)特異性高,幾乎無副產(chǎn)物,只需簡(jiǎn)單萃取 即可,操作非常方便。


圖1的曲線顯示培養(yǎng)基中添加不同濃度酵母提取物后對(duì)苯乙酮酸相對(duì) 轉(zhuǎn)化率的影響(以對(duì)比例的轉(zhuǎn)化率為參照);
圖2的曲線顯示培養(yǎng)基中添加不同濃度鈣離子后對(duì)苯乙酮酸相對(duì)轉(zhuǎn)化 率的影響(以對(duì)比例的轉(zhuǎn)化率為參照);
圖3的曲線顯示不同初始pH的培養(yǎng)基對(duì)苯乙酮酸相對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響 (以對(duì)比例的轉(zhuǎn)化率為參照)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:
將OwAWa //po/j^ca SlPI0201菌種接種于25ml種子培養(yǎng)基中(葡萄糖 3 wt%,酵母提取物0.3 wt%,,蛋白胨0.3 wt%, K2HP04.3H20 0.1 wt%, MgS04.7H20 0.05 wt0/0, KC1 0.05 wt%,自然pH) , 30°C、 230r/min好氧培 養(yǎng)20h,得到種子液,然后以8X的接種量接入25ml發(fā)酵培養(yǎng)基(果糖0.2 wt。/。,蛋白胨0.7 wt%, (NH4)2S04 0.1 wt%, KH2PO40.4 wt%,酵母提取物0.3 wt%,氯化鈣0.0003 wt%, D,L-苯甘氨酸2 wt%,用NaOH將pH值調(diào)節(jié)為8.0), 相同條件好氧培養(yǎng)6d, HPLC分析苯乙酮酸得率為35.9。/。。
實(shí)施例2:
將OwAWa /^ o/^/ca SlPI0201菌種接種于25ml種子培養(yǎng)基中(葡萄糖 3 wt%,酵母提取物0.3 wt%,,蛋白胨0.3 wt%, K2HP04-3H20 0.1 wt%, MgSO4'7H2O0.05 wt%, KC1 0.05 wt%,自然pH) , 30°C、 230r/min好氧培 養(yǎng)20h,得到種子液,然后以8X的接種量接入25ml發(fā)酵培養(yǎng)基(果糖0.2wt。/。,蛋白胨0.7 wt%, (NH4)2SO40.1 wt%, KH2PO40.4 wt%,酵母提取物1.2 wt%,氯化鈣0.005 wt°/。, D,L-苯甘氨酸2wt。/。,用NaOH將pH值調(diào)節(jié)為7.5), 相同條件好氧培養(yǎng)6d, HPLC分析苯乙酮酸得率為39.5。/。。
實(shí)施例3:
將Om^/a SlPI0201菌種接種于25ml種子培養(yǎng)基中(葡萄糖
3 wt%,酵母提取物0.3 wt%,,蛋白胨0.3 wt%, K2HP04.3H20 0.1 wt%, MgS04-7H20 0.05 wt%, KC1 0.05 wt%,自然pH) , 30°C、 230r/min好氧培 養(yǎng)20h,得到種子液,然后以8^的接種量接入25m撥酵培養(yǎng)基(果糖0.2wt。/0, 蛋白胨0.7 wt%, (NH4)2S04 0.1 wt%, KH2P04 0.4 wt%,酵母提取物2.4 wt%, 氯化韓0.005 wt%, D,L-苯甘氨酸2 wt%,用NaOH將pH值調(diào)節(jié)為8.0),相同 條件好氧培養(yǎng)6d, HPLC分析苯乙酮酸得率為37.70/。。
實(shí)施例4:
將Om^WaSlPI0201菌種接種于25ml種子培養(yǎng)基(葡萄糖3 wt%,酵母提取物0.3 wt%,,蛋白胨0.3 wt%, K2HP04-3H20 0.1 wt%, MgS04-7H20 0.05 wt0/o, KC1 0.05 wt%,自然pH) , 30。C、 230r/min好氧培 養(yǎng)20h,得到種子液,然后以8X的接種量接入25ml發(fā)酵培養(yǎng)基(果糖0.2wtn/。, 蛋白胨0.7 wt%, (NH4)2S04 0.1 wt%, KH2P04 0.4 wt%,氯化l丐0.0075 wt%, D,L-苯甘氨酸2 wt%,用NaOH將pH值調(diào)節(jié)為8.0),相同條件好氧培養(yǎng)6d, HPLC分析轉(zhuǎn)化率為41.1%。
實(shí)施例5:
將Om^Wa//po一z'ca SlPI0201菌種接種于25ml種子培養(yǎng)基(葡萄糖3 wt%,酵母提取物0.3 wt%,,蛋白胨0.3 wt%, K2HP04- 3H20 0.1 wt%, MgS04'7H20 0,05 wt°/。, KC10.05wt%,自然pH) , 30°C、 230r/min好氧培 養(yǎng)20h,得到種子液,然后以8%的接種量接入25ml發(fā)酵培養(yǎng)基(果糖0.2wt。/。, 蛋白胨0.7wt。/。, (NH4)2S04 0.1 wt%, KH2P04 0.4 wt%,氯化f丐0.015 wt%, D,L-苯甘氨酸2 wt%,用NaOH將pH值調(diào)節(jié)為8.5),相同條件好氧培養(yǎng)6d, HPLC分析轉(zhuǎn)化率為37.3%。實(shí)施例6:
將Ca^/Wa//po(y"'ca SlPI0201菌種接種于25ml種子培養(yǎng)基(葡萄糖3 wt%,酵母提取物0.3 wt%,,蛋白胨0.3 wt%, K2HP04-3H20 0.1 wt%, MgS04'7H20 0.05 wt%, KC1 0.05 wt%,自然pH) , 30°C、 230r/min好氧培 養(yǎng)20h,得到種子液,然后以8%的接種量接入25ml發(fā)酵培養(yǎng)基(果糖0.2wty。, 蛋白胨0.7 wt%, (NH4)2S04 0.1 wt%, KH2P04 0.4 wt%,氯化f丐0.0075 wt%, D,L-苯甘氨酸2 wt%,用NaOH將pH值調(diào)節(jié)為8.0),相同條件好氧培養(yǎng)6d, HPLC分析轉(zhuǎn)化率為39.7n/。。
實(shí)施例7:
將Ca"AWa/^ o/;^'ca SlPI0201菌種接種于25ml種子培養(yǎng)基(葡萄糖3 wt%,酵母提取物0.3 wt%,,蛋白胨0.3 wt%, K2HP04- 3H20 0.1 wt%, MgS04.7H20 0.05 wt%, KC1 0.05 wt%,自然pH) , 30°C、 230r/min好氧培 養(yǎng)20h,得到種子液,然后以8%的接種量接入25ml發(fā)酵培養(yǎng)基(果糖0.2wt。/。, 蛋白胨0,7wt。/。, (NH4)2S04 0.1 wt%, KH2P04 0.4 wt%,氯化f丐O.OOl wt%, D,L-苯甘氨酸2 wt%,用NaOH將pH值調(diào)節(jié)為9.0),相同條件好氧培養(yǎng)6d, HPLC分析轉(zhuǎn)化率為42.4e/。。
實(shí)施例8:
將OmAWa//po/;;"ca SlPI0201菌種接種于25ml種子培養(yǎng)基(葡萄糖3 wt%,酵母提取物0.3 wt%,,蛋白胨0.3 wt%, K2HP04-3H20 0.1 wt%, MgS04'7H20 0.05 wt%, KC1 0.05 wt%,自然pH) , 30°C、 230r/min好氧培 養(yǎng)20h,得到種子液,然后以8X的接種量接入25ml發(fā)酵培養(yǎng)基(果糖0.2wtn/。, 蛋白胨0.7wt0/。, (NH4)2S04 0.1 wt%, KH2P04 0.4 wt%,氯化f丐0.0075 wt%, D,L-苯甘氨酸2 wt%,用NaOH將pH值調(diào)節(jié)為lO.O),相同條件好氧培養(yǎng)6d, HPLC分析轉(zhuǎn)化率為38.2。/。。
實(shí)施例9:
將Ca"AWaSlPI0201菌種接種于25ml種子培養(yǎng)基(葡萄糖3wt%,酵母提取物0.3 wt%,,蛋白胨0.3 wt%, K2HPCV 3H20 0.1 wt%, MgS04,7H20 0.05 wt%, KC1 0.05 wt%,自然pH) , 30°C、 230r/min好氧培 養(yǎng)20h,得到種子液,然后以8Q^的接種量接入25ml發(fā)酵培養(yǎng)基(果糖0.2wto/。, 蛋白胨0.7 wt%, (NH4)2S04 0.1 wt%, KH2P04 0.4 wt%,酵母提取物1.2 wt%, 氯化鈣0.0075 wt%, D,L-苯甘氨酸2 wt%,用NaOH將pH值調(diào)節(jié)為9.0),相 同條件好氧培養(yǎng)6d, HPLC分析轉(zhuǎn)化率為47.4n/。。
實(shí)施例10:
將Ow^/a/*o/_y//ca SlPI0201菌種接種于25ml種子培養(yǎng)基(葡萄糖3 wt%,酵母提取物0.3 wt%,,蛋白胨0.3 wt%, K2HP04-3H20 0.1 wt%, MgS04,7H20 0,05 wt%, KC1 0.05 wt%,自然pH) , 30°C、 230r/min好氧培 養(yǎng)20h,得到種子液,然后以8%的接種量接入75ml發(fā)酵培養(yǎng)基(果糖0.2wt。/c, 蛋白胨0.7 wt%, (NH4)2S04 0.1 wt%, KH2P04 0.4 wt%,酵母提取物1.2 wt%, 氯化鈣0.0075 wt%, D,L-苯甘氨酸2.5 wt%,用NaOH將pH值調(diào)節(jié)為9.0), 相同條件好氧培養(yǎng)6d, HPLC分析轉(zhuǎn)化率為46.3e/。。
實(shí)施例lh
將OwAWa //po&"ca SIPI0201菌種接種于25ml種子培養(yǎng)基(葡萄糖3 wt%,酵母提取物0.3 wt%,,蛋白胨0.3 wt%, K2HP04-3H20 0.1 wt%, MgS04.7H20 0.05 wt%, KC1 0.05 wt%,自然pH) , 30°C、 230r/min好氧 培養(yǎng)20h,得到種子液,然后以8%的接種量接入25ml發(fā)酵培養(yǎng)基(果糖 0.2wt。/o,蛋白胨0.7wt。/0, (NH4)2S04 0.1 wt%, KH2P04 0.4 wt%,酵母提取 物2.1 wt%,氯化鈣0.0075 wt%, D,L-苯甘氨酸5 wt%,用NaOH將pH值 調(diào)節(jié)為9.0),相同條件好氧培養(yǎng)6d, HPLC分析轉(zhuǎn)化率為36.8%。
對(duì)比例
將Om^Wa //po/;^/ca SIPI0201菌種接種于25ml種子培養(yǎng)基中(葡萄 糖3wt%,酵母提取物0.3wt。/。,,蛋白胨0.3wt。/。,K2HP(V3H20 0.1 wt%, MgS04.7H20 0.05 wt%, KC1 0.05 wt%,自然pH) , 30°C、 230r/min好氧 培養(yǎng)20h,得到種子液,然后以8%的接種量接入25ml發(fā)酵培養(yǎng)基(果糖0.2wt。/o,蛋白胨0.7 wt%, (NH4)2S04 0.1 wt%, KH2P04 0.4 wt%,氯化,丐 0.0002 wt%, D,L-苯甘氨酸2 wt%,用NaOH將pH值調(diào)節(jié)為7.0),相同條 件好氧培養(yǎng)6d, HPLC分析苯乙酮酸得率為31.2%。
權(quán)利要求
1. 一種發(fā)酵法生產(chǎn)苯乙酮酸的培養(yǎng)基,所述培養(yǎng)基包含鈣離子和D,L-苯甘氨酸,其特征在于,所述培養(yǎng)基的初始pH值為pH>7至pH=10。
2. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述培養(yǎng)基的初始pH值為9。
3. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述D,L-苯甘氨酸的濃 度為2 5wt。/。。
4. 如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述D,L-苯甘氨酸的濃 度為2wt。/。。
5. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述培養(yǎng)基還包含酵母 提取物。
6. 如權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述酵母提取物的濃度 為0.3 2.4wt0/。。
7. 如權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述酵母提取物的濃度 為1.2wt0/0。
8. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述鈣離子的濃度為 0&2+>0.0002 1%至€32+ = 0.015wt% 。
9. 如權(quán)利要求8所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述鈣離子的濃度為 0.0075wt%。
10. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述培養(yǎng)基由下列成分組成果糖 0.2wt%蛋白胨 0.7wt%(NH4)2S04 0.1 wt%KH2P04 0.4wt%酵母提取物 l.2wt%氯化轉(zhuǎn) 0.0075wt%D,L-苯甘氨酸 2wt%且該培養(yǎng)基的初始pH值為9.0。
全文摘要
本發(fā)明公開一種發(fā)酵法生產(chǎn)苯乙酮酸的培養(yǎng)基,所述培養(yǎng)基包含鈣離子和D,L-苯甘氨酸,其特征在于,所述培養(yǎng)基的初始pH值為pH>7至pH=10。采用本發(fā)明的培養(yǎng)基生產(chǎn)苯乙酮酸,底物投料量可提高到50g/L,轉(zhuǎn)化率達(dá)36.8%,反應(yīng)特異性高,幾乎無副產(chǎn)物,只需簡(jiǎn)單萃取即可,操作非常方便。
文檔編號(hào)C12P7/40GK101463369SQ200710172640
公開日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2007年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者琴 張, 梅 徐, 胡海峰 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院
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