專利名稱：：一種穩(wěn)定的酶法測定唾液酸液體雙試劑及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種雙試劑，具體涉及一種酶法測定唾液酸液體雙試劑及其應用。
背景技術：
：唾液酸又稱N-乙酰神經氨酸(SialicAcid,SA),是細胞膜糖蛋白的重要組成部分，以與細胞膜糖蛋白、糖脂結合兩種形式存在。唾液酸與生物體的許多生物學功能有關，當細胞代謝異常時，唾液酸脫落進入體液，以致血中唾液酸升高。測定血清唾液酸濃度，可作為癌腫診斷輔助性指標和療效觀察指標，癌癥患者SA水平動態(tài)變化與病情相關，可以用于早期發(fā)現腫瘤的轉移和復發(fā)，對肝硬化的診斷及預后判斷有重要意義，SA升高也是心血管疾病的危險因素之一，近年來SA含量與疾病的關系研究更涉及到糖尿病腎病等臨床診斷應用中。除此之外，SA含量檢測也可應用在食品安全和健康領域，如燕窩、奶粉中的唾液酸含量檢測。唾液酸的檢測方法主要有HPLC、酶法、化學比色法(常見的硫代巴比妥酸法、間苯二酚法)。HPLC法具有靈敏度高、特異性好，但儀器昂貴且不適合臨床批量檢測，化學比色法雖然價糾氐廉，但特異性較低、操作復雜，需高溫萃取，不適合自動化分析，其試劑成分具有一定的腐蝕性及對人體的危害性。酶分析法具有特異性高、操作簡單快捷、準確安全，可自動化分析，酶法中最常用的是偶聯乳酸脫氫酶的紫外法，由于以往自動化分析儀未普及試劑用量大、干粉試劑復溶后穩(wěn)定時間短、適用機型少，用戶使用成本高、無法滿足臨床檢測需求。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于(1)提供一種穩(wěn)定的酶法測定唾液酸液體雙試劑；(2)提供一種穩(wěn)定的酶法測定唾液酸液體雙試劑在制備肺瘤篩查或唾液酸斥企測試劑中應用。本發(fā)明的目的是通過以下技術方法來實現的本發(fā)明人經過對試劑的主要成分神經氨酸苷酶、N-乙酰神經氨酸醛縮酶、還原型輔酶NADH特性進行仔細研究發(fā)現(見圖1、2,唾液酸測定試劑中幾個重要成份的特性)，進口的干粉單一試劑成本過高原因，主要是單一試劑的系統(tǒng)設計無法滿足上述反應成分的最佳條件，主要表現在1、本反應的關鍵工具酶神經氨酸苷酶在其反應條件下活性只有最佳狀態(tài)的50%活性左右，由于神經氨酸苷酶價格十分昂貴，致使試劑成本過高；2、還原型輔酶NADH在其反應條件下不穩(wěn)定，必須制成干粉試劑才能達到長期保存穩(wěn)定，復溶后須盡快使用，否則在保存過程中NADH降解很快對試劑性能造成影響，由于進口干粉單一試劑都是大包裝，中小用戶使用復溶后如不及時用完，造成試劑浪費增力n成本。本發(fā)明的技術方案如下一種穩(wěn)定的酶法測定唾液酸液體雙試劑，由試劑1和試劑2組成，試劑1包括神經氨酸苷酶0.01-50KU/L乳酸脫氫酶0.1-50KU/L緩沖液25-100mmol/L試劑2包括N-乙酰神經氨酸醛縮酶0.1-50KU/L還原型輔酶NADH0.05-5mmol/L葡萄糖脫氫酶0.1-10000U/L葡萄糖0.1-500mmol/L緩沖液25-100mmol/L所述的緩沖液選自Trh類緩沖液、磷酸鹽緩沖液、焦磷酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、二乙醇胺、三乙醇胺類緩沖液、碳酸鹽緩沖液、MES緩沖液、Good's緩沖液或硼酸類緩沖液，其PH值在3.0至11.0,試劑1、試劑2中還包括穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑，所述的穩(wěn)定劑選自Mg離子、NaCl、KC1、CaCl2、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、抗生素、鰲合劑EDTA類、聚乙二醇、二糖類、多元醇、雙甘肽及抗氧化劑，抗生素選自氯霉素、紅霉素、青霉素、慶大霉素，二糖類選自山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖，多元醇選自乙二醇、丙三醇、丙二醇，表面活性劑選自Tween系列、TritonX-100等非離子表面活性劑，防腐劑選自慶大霉素、麝香草酚、羥基苯曱酸、氮化鈉等。一種穩(wěn)定的酶法測定唾液酸液體雙試劑，由試劑1和試劑2組成，試劑1包括100mmol/L240U/L10KU/LMES緩沖液pH6.2神經氨酸苷酶乳酸脫氫酶試劑2包括Tris緩沖液pH8.75N-乙酰神經氨酸醛縮酶還原型輔酶NADH葡萄糖脫氫酶葡萄糖50mmol/L10KU/L0.3mmol/L15U/L20mmol/L。一種穩(wěn)定的酶法測定唾液酸液體雙試劑在制備腫瘤篩查或唾液酸沖全測試劑中應用。本發(fā)明所公開一種穩(wěn)定的酶法測定唾液酸液體雙試劑，其優(yōu)點表現在使用方便無需溶解液復溶，瓶間差異小，其包裝能適各類自動生化分析儀，可避免二次污染、簡化生產工藝方法。圖1:NADH在不同pH的穩(wěn)定性研究，在高溫40。C保存一周的加速試驗結果，NADH在pH堿性有較好的穩(wěn)定性。圖2:唾液酸測定試劑中兩個工具酶在不同pH下的活性情況。神經氨酸苦酶在pH6.O活性最高，相對干粉單一試劑pH7.9活性增強一倍左右；N-乙酰神經氨酸醛縮酶對不同pH都有較好的活性。圖3:本發(fā)明試劑1神經氨酸苷酶的設計的反應條件處于最佳狀態(tài)，比干粉商品試劑pH7.9i^作用提高一倍左右。具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步描述，所提及的實施例是對本發(fā)明詳細說明，而不是對本發(fā)明范圍的限定。實施例1試劑1MES緩沖液pH6.2100mraol/L神經氨酸苷酶乳酸脫氫酶表面活性劑TritonX-100牛血清白蛋白NaN3試劑2Tris緩沖液pH8.75N-乙酰神經氨酸醛縮酶還原型輔酶NADH牛血清白蛋白葡萄糖實施例2試劑1包括神經氨酸普酶乳酸脫氬酶BES緩沖液pH6.0海藻糖苯曱酸試劑2包括N-乙酰神經氨酸醛縮酶還原型輔酶NADH葡萄糖脫氫酶240U/L10KU/L1ml/L2g/L1g/L50mmol/L10KU/L0.3mmol/L2g/L15U/L20mmol/L10KU/L5KU/L100,1/L10g/L1.5g/L20KU/L0.25mmol/L100U/L8葡萄糖100IMOl/L甘氨酸緩沖液pH9.075mmol/L海藻糖10g/L羥基苯曱酸曱酯1.5g/L實施例3試劑1包括神經氨酸苷酶20KU/L乳酸脫氫酶15KU/L檸檬酸緩沖液pH6.080mraol/L聚乙二醇2g/L慶大霉素3g/L試劑2包括N-乙酰神經氨酸醛縮酶10KU/L還原型輔酶NADH1mmol/L葡萄糖脫氫酶20U/L葡萄糖5O腿ol/LAMP緩沖液pH8.530畫ol/L聚乙二醇2g/L慶大霉素3g/L實施例4試劑1包括神經氨酸苷酶1KU/L乳酸脫氬酶咪唑緩沖液pH6.215KU/L100mmol/L試劑2包括N-乙酰神經氨酸醛縮酶還原型輔酶NADH葡萄糖脫氫酶葡萄糖CAPSO緩沖液pH9.21KU/L0.35mmol/L50U/L500咖ol/L100畫1/L實施例5試劑2ATris緩沖液pH8.75N-乙酰神經氨酸醛縮酶還原型輔酶NADHNaN350mmol/L10KU/L0.3mmol/L1g/L干粉單一復溶試劑:神經氨酸苷酶N-乙酰神經氨酸醛縮酶乳酸脫氬酶還原型輔酶NADH0.27U/ml2.7U/ml8900U/ml0.13imnol/LTris緩沖液pH7.9100mraol/L將本發(fā)明試劑2A和干粉單一復溶試劑在4(TC一周做加速試驗，一周后與新鮮制備試劑同時測定NADH含量，結果如下表，以新鮮試劑為100%,加速試驗試劑相對值表示:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本實施例試劑2A的pH明顯提升NADH殘余量，考慮到過高的pH對N-乙酰神經氨酸醛縮酶的穩(wěn)定性影響，最佳pH在8.75-9.0。實施例6由于N-乙酰神經氨酸醛縮酶、乳酸脫氬酶中的雜酶如NADH氧化酶會對NADH氧化作用生成NAD,長期保存，NADH會逐漸下降，本實施例在試劑2B中加入葡萄糖脫氫酶和葡萄糖將NAD重新生成NADH。試劑2BTris緩沖液pH8.7550咖ol/LN-乙酰神經氨酸醛縮酶10KU/L還原型輔酶NADHQ.3mmol/L牛血清白蛋白2g/L葡萄糖脫氫酶15U/L葡萄糖30mmol/L將本發(fā)明試劑2A和試劑2B在8'C保存九個月，九個月后與新鮮制備試劑同時測定NADH含量，結果如下表，以新鮮試劑為100y。，試驗試劑相對值表示<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本實施例試劑2B比試劑2A的MDH殘余量得到明顯提升。將實施例1制得的雙試劑在日立7060的測定參數:Rl-240|u1，R2-80|u1,樣品-8jal,波長340/405nm讀點21-27點<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從上述與干粉試劑測定臨床標本相關性實驗結果看本發(fā)明試劑和干粉測定值的相關系數r=0.991,表明本發(fā)明試劑方法有良好的準確性。實施例1的試劑1神經氨酸苷酶的設計的反應條件處于最佳狀態(tài)，比干粉商品試劑pH7.9^作用提高一倍左右(圖3)，相應達到同等反應水平所需酶只需干粉試劑的一半左右。根據上述各種測定結果，表明本發(fā)明的唾液酸酶法測定試劑在穩(wěn)定性上得到明顯提高，滿足檢測需求，在降低成本30%左右其準確性仍能達到干粉試劑水平。權利要求1、一種穩(wěn)定的酶法測定唾液酸液體雙試劑，由試劑1和試劑2組成，其特征在于試劑1包括神經氨酸苷酶0.01—50KU/L乳酸脫氫酶0.1—50KU/L緩沖液25—100mmol/L試劑2包括N-乙酰神經氨酸醛縮酶0.1—50KU/L還原型輔酶NADH0.05—5mmol/L葡萄糖脫氫酶0.1—10000U/L葡萄糖0.1—500mmol/L緩沖液25—100mmol/L所述的緩沖液選自Tris類緩沖液、磷酸鹽緩沖液、焦磷酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、二乙醇胺、三乙醇胺類緩沖液、碳酸鹽緩沖液、MES緩沖液、Good′s緩沖液或硼酸類緩沖液，其PH值在3.0至11.0。2、根據權利要求1所述的雙試劑，其特征在于試劑1、試劑2中還包括穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑，所述的穩(wěn)定劑選自Mg離子、NaCl、KC1、CaCl2、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、抗生素、鰲合劑EDTA類、聚乙二醇、二糖類、多元醇、雙甘肽中的一種，及抗氧化劑。3、根據權利要求2所述的雙試劑，其特征在于所述的抗生素選自氯霉素、紅霉素、青霉素、慶大霉素，二糖類選自山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖，多元醇選自乙二醇、丙三醇、丙二醇中的一種。4、根據權利要求2所述的雙試劑，其特征在于所述的表面活性劑選自非離子表面活性劑，所述的非離子表面活性劑是Tween系列、TritonX-IOO中的一種。5、根據權利要求2所述的雙試劑，其特征在于防腐劑選自慶大霉素、麝香草酚、羥基苯曱酸、氮化鈉中的一種。6、根據權利要求l-5任一所述的雙試劑，其特征在于試劑1包括MES緩沖液pH6.2神經氨酸苷酶乳酸脫氳酶試劑2包括Tris緩沖液pH8.75N-乙酰神經氨酸醛縮酶還原型輔酶NADH葡萄糖脫氫酶葡萄糖100mmol/L240U/L10KU/L50mmol/L10KU/L0.3mmol/L15U/L20mmol/L。7、根據權利要求1-5任一所述的雙試劑在制備腫瘤篩查或唾液酸檢測試劑中應用全文摘要本發(fā)明涉及一種雙試劑，具體涉及一種酶法測定唾液酸液體雙試劑及其應用。本發(fā)明的技術方案如下一種穩(wěn)定的酶法測定唾液酸液體雙試劑，由試劑1和試劑2組成，試劑1包括神經氨酸苷酶0.01-50KU/L，乳酸脫氫酶0.1-50KU/L，緩沖液25-100mmol/L；試劑2包括N-乙酰神經氨酸醛縮酶0.1-50KU/L，還原型輔酶NADH0.05-5mmol/L，葡萄糖脫氫酶0.1-10000U/L，葡萄糖0.1-500mmol/L，緩沖液5-100mmol/L。本發(fā)明優(yōu)點表現在使用方便無需溶解液復溶，瓶間差異小，其包裝能適各類自動生化分析儀，可避免二次污染、簡化生產工藝方法。文檔編號C12Q1/527GK101469344SQ20071017340公開日2009年7月1日申請日期2007年12月29日優(yōu)先權日2007年12月29日發(fā)明者夏煜煜申請人:上海鉑錦診斷用品有限公司