專利名稱：重組桿狀病毒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工程中的基因工程生產(chǎn)基因重組疫苗 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禽流感，是由禽甲型流感病毒某些亞型中的一些毒株引起的急性 呼吸道傳染病。人禽流感，即人禽流行性感冒，是由禽甲型流感病毒 某些亞型中的一些毒株引起的急性呼吸道傳染病。近年來，不斷有報 道人禽流感導(dǎo)致死亡的事例。人禽流感一旦大規(guī)模爆發(fā)，其危害程度
不亞于SARS，甚至超過SARS。疫苗的發(fā)現(xiàn)可謂是人類發(fā)展史上具 有里程碑意義的事件，疫苗，是一種為了預(yù)防、控制傳染病的發(fā)生、 流行，用于人體預(yù)防接種的疫苗類預(yù)防性生物制品。而人禽流感疫苗 是預(yù)防與治療人禽流感一種行之有效的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種重組桿狀病毒； 本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備本發(fā)明所述的重組桿狀 病毒的方法；
本發(fā)明的另 一 目的在于提供本發(fā)明所述的重組桿狀病毒在制 備禽流感病毒疫苗中的應(yīng)用；
本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備禽流感疫苗的方法。
一方面，本發(fā)明提供一種重組桿狀病毒，該病毒帶有g(shù)p64信號
肽(家蠶桿狀病毒囊膜糖蛋白gp64信號肽)、HA基因(禽流感病毒 血凝素基因)和gp64跨膜域基因(家蠶桿狀病毒囊膜糖蛋白gp64跨 膜域基因)形成的融合蛋白。此重組病毒有利于疫苗的分離純化，同 時作為禽流感病毒的偽病毒，能將抗原展示在病毒的囊膜上，利于刺 激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
在一個具體實施方式
中，所述gp64信號肽序列具體序列見SEQ IDNO. 1)、 HA基因編碼序列見SEQIDNO. 2; gp64跨膜域基因全 部跨膜域編碼序列見SEQ ID NO. 3。
在一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供重組桿狀病毒，該病毒為家
蠶桿狀病毒。利用本發(fā)明的家蠶桿狀病毒接種家蠶，可獲得家蠶生物 反應(yīng)器。我國蠶桑業(yè)具有悠久的歷史，屬于民族產(chǎn)業(yè)，家蠶生物反應(yīng) 器具有傳統(tǒng)優(yōu)勢和資源優(yōu)勢；而且該反應(yīng)器可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，具有 成本優(yōu)勢。當(dāng)然，本發(fā)明的重組桿狀病毒不僅可以接種家蠶，還可以 接種其他昆蟲細(xì)胞。
在一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供一種重組桿狀病毒，該病毒 保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在 北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，保藏日期為2007年4月28日， 保藏編號為CGMCCNo. 2033，分類命名為家蠶核型多角體病毒 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus)。
另一方面，本發(fā)明提供一種制備重組桿狀病毒的方法，該方 法包括
分別制備gp64信號肽、HA基因和gp64跨膜域基因序列； 將所制備的包含gp64信號肽、HA基因和gp64跨膜域基因的融 合基因序列導(dǎo)入桿狀病毒中，形成重組桿狀病毒。
在一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供重組桿狀病毒的方法，其
中將gp64信號肽、HA基因和gp64跨膜域基因序列形成融合基因 gp64HA，再將該gp64HA克隆至轉(zhuǎn)移載體中獲得重組轉(zhuǎn)移載體，然 后使該重組轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒發(fā)生同源重組而獲得重組桿狀病毒。 所述重組轉(zhuǎn)移載體可以與線性化家蠶桿狀病毒進(jìn)行同源重組(發(fā)生 同源重組部位在載體的多克隆位點上下游同源序列上)，將外源基因 插入家蠶桿狀病毒基因組中，同時大大提高重組病毒的篩選效率。 另一方面，本發(fā)明提供一種重組桿狀病毒在制備禽流感病毒疫苗
中的應(yīng)用。
在一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供一種重組桿狀病毒在制備禽 流感病毒疫苗中的應(yīng)用，其中所述的疫苗為人用疫苗。
另一方面，本發(fā)明提供一種制備禽流感疫苗的方法，該方法包括 利用本發(fā)明所述的重組桿狀病毒接種家蠶(優(yōu)選家蠶的幼蟲和/或 蛹)，家蠶桿狀病毒出芽使HA展示于其表面，對病毒粒子進(jìn)行分離 純化獲得禽流感疫苗。HA展示于家蠶桿狀病毒表面不僅利于純化， 而且還有利于刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
在一個具體實施方式
中，本發(fā)明提供利用本發(fā)明所述的重組桿狀 病毒接種家蠶，家蠶桿狀病毒出芽使HA展示于其表面，勻漿破碎細(xì) 胞，多步離心去除雜質(zhì)，超速離心沉淀病毒粒子，無菌溶解液重懸沉 淀后，進(jìn)行區(qū)帶離心純化樣品，超濾脫糖和冷凍干燥。
在一個具體實施方式
中，本發(fā)明利用家蠶作為生物反應(yīng)器，采用 表面展示技術(shù)使目的蛋白HA表達(dá)于重組桿狀病毒表面，在家蠶幼蟲
及蛹中高效表達(dá)具有極高臨床應(yīng)用價值的人禽流感疫苗。本方法生產(chǎn) 的疫苗經(jīng)鼠、猴體中試驗證實，該疫苗產(chǎn)生抗體，具有保護(hù)作用。本 方法適用于大規(guī)模生產(chǎn)，降低了成本，且產(chǎn)量高，所生產(chǎn)的人禽流感
疫苗應(yīng)用價值大。


圖1:含gp64HA融合基因的重組質(zhì)粒pGEM-gp64HA;
圖2:含gp64HA融合基因桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacgp64HA;
其中，P: polyhedrin,多角體蛋白基因啟動子；A: PolyhedinPoly A+signal,多角體蛋白基因聚腺苷酸化信號；M13 on; M13噬菌體 復(fù)制起始點；Amp:氨芐青霉素抗性基因；on': pUC復(fù)制起始點；
圖3:修飾型病毒BmBacPAK6;
圖4:目的蛋白的鑒定，其中箭頭所示為HA融合蛋白。
具體實施例方式
在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，本發(fā)明所述的利用家蠶生物反 應(yīng)器表面展示技術(shù)生產(chǎn)人禽流感疫苗的方法，是通過PCR的方法獲 得gp64HA融合基因，并在其5，和3'端分別引入BamH I和Not I酶 切位點，與家蠶桿狀病毒載體pBacPAK8相連接后，連接產(chǎn)物與野生 型家蠶桿狀病毒BmBacPAK6在家蠶細(xì)胞中發(fā)生同源重組，通過空斑 篩選，獲得帶有g(shù)p64HA的家蠶重組桿狀病毒(保藏在中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京巿海淀區(qū)中關(guān)村北一 條13號，保藏日期為2007年4月28日，保藏編號為CGMCC No. 2033 ，分類命名為家蠶核型多角體病毒Bombyx mori nucleopolyhedrovirus)，人工接種家蠶幼蟲、蛹，經(jīng)5-7天后收集幼 蟲體液和蛹體，勻漿，進(jìn)行離心，分離純化，冷凍干燥，無菌條件下 制成人禽流感疫苗凍干粉。
在本發(fā)明的另一具體實施方式
中，利用基因工程技術(shù)獲得帶有禽
流感病毒主要抗原基因HA與家蠶桿狀病毒基因gp64的融合基因 gp64HA重組桿狀病毒，通過家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)該重組病毒，利用 表面展示技術(shù)使目的蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜表面，重組病毒通過出芽形成 病毒囊膜并使目的蛋白展示于病毒囊膜上。帶有融合基因gp64HA重 組桿狀病毒經(jīng)接種家蠶幼蟲、蛹后高效表達(dá)，表達(dá)量達(dá)0.5mg/ml,表 達(dá)后HA蛋白展示于桿狀病毒囊膜上，經(jīng)分離純化，冷凍干燥，制成 具有較高生物活性的人禽流感疫苗凍干粉。該重組桿狀病毒已提交 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址在北 京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，保藏日期為2007年4月28日， 保藏編號為CGMCC No.2033，分類命名為家蠶核型多角體病毒 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus。該方法原料易得,生產(chǎn)成本低， 且疫苗可產(chǎn)生保護(hù)性抗體，無毒害，實施價值重大。 實施例
下面結(jié)合實施例詳細(xì)闡述本發(fā)明的具體內(nèi)容，這些實施例并不用 于限定本發(fā)明。
1.融合基因gp64HA的構(gòu)建。
為了使HA蛋白能表達(dá)于桿狀病毒表面，在HA基因的5，和3， 端分別連接編碼桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽基因序列和gp64跨膜 域基因序列，并在融合基因的5，和3'端分別引入5"Mi I和WW I酶 切位點。分別以桿狀病毒BmNPV gp64信號肽基因序列(家蠶桿狀病 毒基因組，Genbank號NP 074525。)、禽流感病毒H5N1 HA基因序
列(禽流感病毒H5N1杭州流行株，Genbank號DQ520855。)和gp64 跨膜域基因序列(家蠶桿狀病毒基因組Genbank號NP 074525)為模 板設(shè)計3對引物，首先擴增目的片段gp64信號肽(sp)、 HA和gp64 跨膜域(tm)，然后利用各目的片段互為引物和模板合成融合基因 gp64HA。設(shè)計引物如下
Psp 1: 5 ， gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3 ， (SEQ ID NO. 4 ) Psp2: 5' catgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgccgcc 3' (SEQ ID NO. 5)
Pha 1: 5 ， gaaaagaacgttactgttacacatgc 3 ， ( SEQ ID NO. 6 ) Pha2: 5， aatgcaaattctgcattgtaacgac 3 ， ( SEQ ID NO. 7 ) Ptml: 5， gtcgttacaatgcagaatttgcatt ttcatgtttggtcatgtagc 3， (SEQ ID NO, 8)
Ptm2: 5' gagcggccgc ttaatattgtctactattacggttt 3' (SEQ ID NO. 9 )
(1) gp64信號肽(sp)的擴增
以gp64DNA為模板，PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)計為，94'C預(yù)變性3min， 94。C變性30s, 68。C復(fù)性延伸30s， 30個循環(huán)，68。C延伸5min。 在一個無菌的0.5ml離心管中，混合下列成分
10 XPCR Buffer 10 Pl
25mmol MgCl2 8 U 1
2.5 mmol dNTPs 8 P 1
Pspl 1 u 1
Psp2 1 P1
模板 1 lU
KOD-Plus DNA聚合酶 1 u 1 (購自TOYOBO公司) 加無菌雙蒸水至100 ul
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)。 待反應(yīng)結(jié)束后，電泳鑒定擴增片段，同時切膠回收目的片段。該目的 片段可作為模板sp用于后續(xù)實驗。
(2) gp64跨膜域(tm)的擴增
以gp64DNA (由本實驗室保存家蠶桿狀病毒毒種中提取，制備 方法參考《昆蟲桿狀病毒分子生物學(xué)》呂鴻聲主編，中國農(nóng)業(yè)科技出 版社出版)為模板，PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)計為，94r預(yù)變性3min， 94°C 變性30s， 68。C復(fù)性延伸30s， 30個循環(huán)，68"延伸5min。
100ul的反應(yīng)體系同上，所用引物為Ptml和Ptm2，各組分混勻 后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后， 電泳鑒定擴增片段，同時切膠回收目的片段。該目的片段可作為模板 tm用于后續(xù)實驗。
(3) HA基因的擴增
以禽流感病毒H5N1 HA基因(從患病豬血清中提取，克隆過程 見HA基因的擴增)為模板，PCR反應(yīng)參數(shù)為94"C預(yù)變性3min， 94 。C變性30s， 68。C復(fù)性延伸lmin， 30個循環(huán)，68'C延伸5min。
在一個無菌的0.5ml離心管中，混合下列成分
lOXPCRBuffer 10 iU
25mmol MgCl2 8 y 12.5 mmol dNTPs 8 U 1
Phal 1 u 1
Pha2 1 u1
模板 1 " 1
KOD-Plus DNA聚合酶 1 U 1
加無菌雙蒸水至100 ul
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)。 待反應(yīng)結(jié)束后，電泳鑒定擴增片段，同時切膠回收目的片段。該目的 片段可作為模板HA用于后續(xù)實驗。
(4) gp64信號肽sp基因與HA基因的融合
PCR反應(yīng)參數(shù)為94'C預(yù)變性3min， 94'C變性30s， 68°。復(fù)性延 伸lmin， 30個循環(huán)，68。C延伸5min。
在一個無菌的0.5ml離心管中，混合下列成分
10 XPCR Buffer 10 ul
25mmol MgCl2 8 u 1
2.5 mmol dNTPs 8 P 1
Pspl 1 P 1
Pha2 1P1
模板sp (獲自前面步驟l) llU 模板HA (獲自前面步驟3) lul
KOD-Plus DNA聚合酶 1 li 1 加無菌雙蒸水至100 Pi
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)。 待反應(yīng)結(jié)束后，電泳鑒定擴增片段，同時切膠回收目的片段。該目的 片段可作為模板sp-HA用于后續(xù)實驗。
因為sp的下游引物Psp2設(shè)計時加入了 HA基因5'端的部分序列， 所以PCR擴增出的sp片段3'端序列與HA基因5'端序列存在重疊， 再次利用PCR方法就可以擴增出sp-HA融合基因序列。
(5)融合基因sp-HA再次與tm的融合，構(gòu)建出gp64HA融合基
因
PCR反應(yīng)參數(shù)為94。C預(yù)變性3min， 94。C變性30s， 68。C復(fù)性延 伸1.5min， 30個循環(huán)，68。C延伸5min。
在一個無菌的0.5ml離心管中，混合下列成分
10 XPCR Buffer 10 lU
25mmol MgCl2 8 ti 1
2.5 mmol dNTPs 8 w 1
Pspl 1 P 1
Ptm2 1 p 1
模板sp-HA (獲自前面步驟4) lul
模板tm (獲自前面步驟2) ltU
KOD-Dash DNA聚合酶 1 u 1 ( TOYOBO公司)
加無菌雙蒸水至100 Pi
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計30個循環(huán)。 待反應(yīng)結(jié)束后，電泳鑒定擴增片段，同時切膠回收目的片段。
同上，因為tm的上游引物Ptml設(shè)計時加入了 HA基因3'端的部 分序列，所以PCR擴增出的tm片段5'端序列與HA基因3'端序列存 在重疊，再次利用PCR方法就可以擴增出sp-HA-tm融合基因即 gp64HA序列。
2.克隆質(zhì)粒pGEM-gp64HA的構(gòu)建
將PCR擴增出的融合基因gp64HA連接到pGEM-T vector上 融合基因gp64HA 2ul pGEM畫T vector (購自promage公司) 0.5 u 1
2 X Rapid Ligation buffer 5 u 1
T4 DNA ligase (購自promage公司) 1 U 1
ddH20_1.5ti 1
I 10u 1
混勻，25"C反應(yīng)lh 反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5 a中
① 用冷卻的無菌吸頭從感受態(tài)細(xì)胞懸液中取40ul轉(zhuǎn)移到無菌的微 量離心管中，加入上一步中的連接產(chǎn)物，輕輕混勻，在冰中放置 30分鐘；
② 將離心管放到預(yù)加溫到42t:的循環(huán)水浴中，放在試管架上，恰恰 放置90秒，不要搖動試管；
③ 快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻l-2分鐘；
每管加400!ULB液體培養(yǎng)基。將管轉(zhuǎn)移到37。C搖床上，溫育45 分鐘使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的氨芐抗生素抗性標(biāo)記基因；
⑤ 將適當(dāng)體積(每個90mm平板可達(dá)200 Ul)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞 轉(zhuǎn)移到含氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基上；
⑥ 將平板置于室溫直至液體被吸收；
⑦ 倒置平皿，于37'C培養(yǎng)，12-16小時后可出現(xiàn)菌落。
挑取單菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切初步鑒定，經(jīng)測序，序列完全 正確。
3. 含gp64HA融合基因桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacgp64HA的獲得 質(zhì)粒pGEM-gp64HA經(jīng)5awH I和I雙酶切切下gp64HA融
合基因片段克隆至經(jīng)5"mH I和WW I雙酶切的pBacPAK8 (購自 Clontech公司)中，使gp64HA融合基因置于多角體蛋白(polyhedrin， ph)基因啟動子控制之下，構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacgp64HA，經(jīng)酶切 分析鑒定基因序列正確。
4. 含gp64HA融合基因的家蠶重組桿狀病毒Bmgp64HA的獲得 取5 u 1重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBacgp64HA DNA禾n 6 P 1經(jīng)Bsu361酶切線
性化的修飾型病毒BmBacPAK6 DNA (購自上海生化細(xì)胞所)，加入 100Pl無血清的TC-100培養(yǎng)基(GIBCOBRL公司)混均。取6tU Dosper (寶靈曼公司)加入100 u 1無血清的TC-100培養(yǎng)基混均。將 事先培養(yǎng)在35mm平皿中的BmN細(xì)胞(購自上海生化細(xì)胞所)用無 血清的TC-100培養(yǎng)基洗漆兩次，并逐滴加入pBacgp64HA轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 和Dosper混合物，27"培養(yǎng)4-5天，收取上清進(jìn)行第一輪噬斑篩選。 取5ul上清感染35mm平皿中的BmN細(xì)胞，1小時后棄去上清加 入等量混合的TC-100培養(yǎng)基和低熔點瓊脂糖。4-5天后挑取噬斑，感染BmN細(xì)胞3-4天，保存上清，細(xì)胞用NaOH裂解用于Southern blot 斑點雜交，以gp64HA融合基因作模板用隨機引物探針標(biāo)記試劑盒 (寶靈曼公司)標(biāo)記探針，雜交方法按照《分子克隆》(科學(xué)出版社， 1995)。取陽性克隆的上清進(jìn)行第二輪噬斑篩選。取陽性克隆的上清 感染家蠶細(xì)胞擴增。即可得到大量的含gp64HA融合基因的重組桿狀 病毒Bmgp64HA。該病毒能感染家蠶細(xì)胞，在顯微鏡下細(xì)胞呈發(fā)病 狀。該重組桿狀病毒已提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心保藏，地址在北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，保藏 日期為2007年4月28日，保藏編號為CGMCCNo. 2033，分類 命名為家香核型多角體病毒Bombyx mori nucleopolyhedrovirus。
5. 重組家蠶桿狀病毒Bmgp64HA在家蠶5齡幼蟲和蛹中的表達(dá) 將重組病毒Bmgp64HA以10 MOI感染BmN細(xì)胞進(jìn)行病毒擴增，
按1 X 1(^PFU/條針刺接種法接入家蠶五齡起蠶，在感染5-7天后采取 蠶體液和蛹體，經(jīng)高速離心(12000rpm, 30min)，取上清測血淋巴中 的HA活性(血凝法)，在感染的第6天血淋巴中的HA活性達(dá)到5 X104U/ml。高速離心后的上清加入等體積的2X蛋白質(zhì)上樣緩沖液 (100MmTris.HCl，4% SDS，0.1。/。溴酚藍(lán)，10%甘油)，IO(TC加熱10min， 取20ul進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，重組病毒己表達(dá)HA融合 蛋白。
6. 表面展示HA蛋白的桿狀病毒Bmgp64HA的獲得
(1)從蠶蛹中分離純化出Bmgp64HA病毒粒子(人禽流感疫苗) a.取適量經(jīng)Bmgp64HA感染的蠶蛹樣品，在4。C下解凍后，與
0.85%生理鹽水適量混和，勻漿至漿液細(xì)致均勻即可；
b. 將勻漿液加入500ml離心管中，配平，3000rpm離心20-60min， 取上清，小心棄去油脂；
c. 將3000rpm離心上清液倒入新500ml離心管中，配平，6000rpm 離心20-60min，取上清，棄油脂；
d. 6000rpm離心的上清液倒入50ml離心管，配平，12000rpm離 心30-120min，取上清，棄油脂;
e. 12000rpm離心上清液轉(zhuǎn)入新的50ml離心管，配平，18000rpm 離心30-120min，取上清，棄油脂；
f. 18000rpm離心后的上清，在超凈臺上分裝于滅菌的超離管中， 平衡，35000rpm離心30-90min，使病毒粒子沉淀下來；
g. 35000rpm離心后的上清裝入滅菌的瓶中，先置于4。C，沉淀用 無菌溶解液(0.05MPB, 0.5MNaCl， 0.04%EDTA)重懸，用槍頭反復(fù) 輕輕吹打，使沉淀能充分溶解；沉淀全部溶解后，定容至一定體積
(300-500ml)，用于區(qū)帶離心(Zonal Centrifuge),進(jìn)一步純化。 (2)區(qū)帶離心
區(qū)帶離心所需的不同濃度蔗糖均用工作液配制，加樣順序依次為 150-200ml滅菌工作液、300-500ml樣品、300-500ml 20%蔗糖、 300-500ml 30%蔗糖，最后加52%蔗糖充滿轉(zhuǎn)頭(總體積為1690ml)。 35000rpm離心3小時后收樣，用濃度高于52%的蔗糖作頂液，把轉(zhuǎn) 頭里的樣品頂出來，用核酸蛋白檢測儀檢測，無菌離心管收集樣品。
樣品中含糖量較高，需要除去，采用超濾器，使用中空纖維膜進(jìn) 行脫糖。首先是選擇合適的中空纖維膜規(guī)格(截留分子量為750kD)， 進(jìn)行清洗，再加樣脫糖，用無菌超純水置換樣品中的蔗糖，直至樣品
中蔗糖濃度低于5%。
(4) Bmgp64HA病毒粒子(人禽流感疫苗)生物活性鑒定 區(qū)帶離心脫糖后的樣品，逐管測活，測活方法采用紅細(xì)胞凝集試
驗。取24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在每一排的1到6孔(Al-A6)加250 ti 1生 理鹽水(0.85%)后，加入250ul樣品于第一孔，做倍比稀釋，同時 設(shè)置陰性對照孔，加入不含樣品的液體做倍比稀釋，再加入1%雞紅 細(xì)胞懸液250Pl至每一孔內(nèi)，輕輕震蕩培養(yǎng)板，于37'C孵育4小時 后觀察結(jié)果。
用Bradford法(考馬斯亮藍(lán)法)檢測樣品蛋白含量。 人禽流感病毒比活計算(mg/mL)公式如下人禽流感病毒比活
=2"乂4/樣品濃度，n為發(fā)生紅細(xì)胞凝集的孔數(shù)。該方法所獲得的人
禽流感病毒比活可達(dá)20以上。
(5) 保存及檢測
比活較高且脫糖的樣品，無菌分裝，-50"冷凍干燥，制成人禽流 感疫苗凍干粉。同時，再鑒定凍干粉比活，達(dá)到20以上者為合格樣 品。12。/。SDS-PAGE跑電泳，檢測樣品，在45kD處有目的蛋白的表 達(dá)(見圖4)。
(6) 疫苗效果
選用清潔級BALB/C小鼠，雄性，56只，體重20-22g由北京維通
利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號
SCXK-(軍)2002畫001。
根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯嶒炘O(shè)計要求，實驗設(shè)空白對照組、佐劑對照組
(氫氧化鋁與生理鹽水1: 9 (W/V)混合液)、疫苗高劑量組
(100-300ug/kg)、疫苗中劑量組(10-100ug/kg)、疫苗低劑量組 (0.1-10ug/kg)，分組的原則是各組動物間體重沒有顯著性差異。各
組劑量見下
組別 性別 動物數(shù)
TA (疫苗高劑量組) $ 14只
TB (疫苗中劑量組) $ 14只
TC (疫苗低劑量組) $ 14只
CN1 (溶媒對照組) 悉 14只
給藥途徑模擬臨床給藥途徑，頸部皮下注射，分2點，每點0.5ml。 給藥頻率和時限每兩周免疫一次，免疫3次后檢測抗體效價。動物 攻毒方法為滴鼻
通過一般觀察、病理檢查、病毒分離、抗體效價檢測來綜合評價 疫苗在小鼠實驗中的藥效學(xué)。結(jié)果顯示人禽流感疫苗進(jìn)行動物體中 試驗，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗體，其保護(hù)抗體效價大于1: 200，攻毒試 驗結(jié)果顯示該疫苗具有明顯保護(hù)效果。
選用普通級恒河猴(Rhesus macaque),雌性10只，雄性10只，年 齡為3-4歲，體重3.5-5.0公斤，由實驗動物北京協(xié)爾鑫生物資源研究 所提供，動物許可證號為SCXK (京)2005-0005。跟據(jù)實驗?zāi)康暮?實驗設(shè)計要求，本次實驗設(shè)溶媒對照組、疫苗高劑量組
(300-600ug/kg )、疫苗中劑量組(80-300ug/kg)、疫苗低劑量組 (0.1-80ug/kg)，分組的原則是各組動物間體重沒有顯著性差異。
組別__動物數(shù)
TA 早 2只
(疫苗高劑量組) $ 2只
TB 早 2只
(疫苗中劑量組) $ 2只
TC 早 2只
(疫苗低劑量組) $ 2只
CN1 早 2只
(溶媒對照組) $ 2只
給藥途徑為頸部皮下注射，分2點，每點0.5ml，每兩周免疫一 次，免疫3次。動物攻毒方法為滴鼻。通過一般觀察、病理檢查、病 毒分離、抗體效價檢測來綜合評價疫苗在猴實驗中的藥效學(xué)。結(jié)果顯 示在猴體內(nèi)產(chǎn)生抗體，其保護(hù)抗體效價大于1: 100，攻毒試驗結(jié) 果顯示該疫苗具有明顯的保護(hù)效果。根據(jù)國家生物制品安全藥理要求 進(jìn)行疫苗的安全性評價，結(jié)果顯示該疫苗對小鼠和猴的心血管、呼吸 系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、體溫等無明顯影響。長毒結(jié)果顯示該疫苗對大鼠和 猴無毒性。急毒結(jié)果顯示該疫苗對大鼠和小鼠進(jìn)行皮下注射，大鼠最 大耐受劑量大于94mg/kg，小鼠最大耐受劑量大于141mg/ml。致突變 試驗結(jié)果顯示該疫苗無致突變性。
可見，該疫苗在動物體中能產(chǎn)生抗體，具有明顯保護(hù)作用，無毒 副作用，安評結(jié)果表明該疫苗安全有效。 序列表
<110>申請人浙江中奇生物藥業(yè)股份有限公司 <120>重組桿狀病毒及其制備方法和應(yīng)用
<130> 案巻號071436-I-CP-NZJ <160> 9
< 170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 111
<212〉 DNA
<213>家蠶桿狀病毒
<400> 1
atgctacteg teaatcagtc atacc犯ggc ttcgataEig3犯c3C3c犯g cg3gatggta 60 ggcgctattg ttttatacgt gcttttggcg gcggcgcatt ctgcctttgc g 111
<210> 2
<211> 1593
<212> DNA <213>禽流感病毒
<400> 2
g3肌3gaacg ttectgttac 3catgccca3 g3catoctgg aaaagacaca caacgggEiag 60
ctctgcgatc tagatggagt gaaacctctg attttaagag attgtagtgt agctggatgg 120
ctcctcggga acccaatgtg tgacgaattc atcaatgtgc cggaatggtc ttacatagtg 180
gagaaggcca acccagccaa tgacctctgt tacccaggga atttcaacga ctatgaagaa 240
ctg犯3C3cc tattgagcag aateaaccat tttgaga犯3 ttcagatcat cccc犯aagt 300
tcttggtccg atcatgaagc ctcatcaggg gtgagctcag catgtccata ccagggaacg 360
ccctcctttt tcagaaatgt ggtatggctt atcaaaaaga acaatacata cccaacaata 420
aagagaagct acaataatac caaccaggaa gatcttttga tactgtgggg gattcatoat 480
tctaatgatg cggcagagca gacaaagctc tatcaaaacc caaccaccta tatttccgtt 540
gggacatcaa C3cte犯cca gagattggta ccsaaaateg ctactegatc caa敏aaac GOO
gggcaaagtg gaaggatgga tttcttctgg acaattttaa aaccgaatga tgcaatcaac 660
ttcgagagta atggaaattt cattgctcca gaatatgcat acaaaattgt caagaaaggg 720
gactcagcaa ttatgaaaag tgaagtggaa tatggtaact gcaacaccaa gtgtcaaact 780
ccaatagggg cgataaactc tagtatgcca ttccacaaca tacaccctct caccatcggg 840
gaatgcccca aatatgtgaa atcaaacaaa ttagtccttg cgactgggct cagaaatagt 900
cctctaagag aaagaagaag aaaaagagga ctatttggag ctatagcagg gtttatagag 960 ggaggatggc agggaatggt agatggttgg tatgggtacc accatagcaa tgagcagggg 1020
agtgggtacg ctgcagacaa agaatccact caaaaggcaa tagatggagt caccaataag 1080
gtcaactcga tcattgacaa aatgaacact cagtttgagg ccgttggaag ggaatttaat 1140
aacttagaaa ggagaataga gaatttaaac aagaaaatgg aagacggatt cctagatgtc 1200 tggacttata atgctgaact tctggttctc atggaaaatg agagaactct agacttccat1260
gactcaaatg tcaagaacct ttacgacaag gtccgactac agcttaggga taatgcaaag 1320
gagctgggta acggttgttt cgagttctat cacaaatgtg ataatgaatg tatggaaagt 1380 gtaagaaacg gaacgtatga ctacccgcag tattcagaag aagcaagatt aaaaagagag 1440 g肌at犯gtg gagtaaaatt ggaatcsate ggaacttecc犯atoctgtc aatttattca1500 acagttgcga gttctctagc actggcaatc atggtggctg gtctatcttt gtggatgtgc1560 tccaatgggt cgttacaatg cagaatttgc att 1593
<210> 3
<211> 96
<212> DNA
<213>家蠶桿狀病毒
<400> 3
ttcatgtttg gtcatgtagc cacttttgta attgtattta ttgtaatttt atttttgtac 60 tgtatggtta gaaaccgtaa tagtagacaa tattaa 96
<210> 4
<211> 28
<212> DNA <213〉人工序列
<220>
<223〉 引物
<400> 4
gcggatccat gctactagta aatcagtc 28
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
catgtgtaac agtaacgttc ttttccgcaa aggcagaatg cgccgccgcc 50
<210> 6
<211> 26
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
gaaaagaacg ttactgttac acatgc 26
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<■> 7
aatgcaaatt ctgcattgta acgac 25
<210> 8
<211> 45
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
gtcgttacaa tgcagaattt gcattttcat gtttggtcat gtagc 45
<210> 9
<211> 35
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223> 引物 <400> 9
gagcggccgc ttaatattgt ctactattac ggttt 3權(quán)利要求
1、一種重組桿狀病毒，該病毒帶有g(shù)p64信號肽、HA基因和gp64跨膜域基因形成的融合基因。
2、 如權(quán)利要求l所述的重組桿狀病毒，其中所述的gp64信號肽 為SEQIDNO. 1所示的序列，HA基因為SEQ ID NO. 2所示的序列， gp64跨膜域基因為SEQ ID NO. 3所示的序列。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的重組桿狀病毒，該病毒為家蠶桿狀病毒o
4、 如權(quán)利要求3所述的重組桿狀病毒，該病毒保藏在中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 2033。
5、 一種制備權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒的方法，該方 法包括(a) 分別制備gp64信號肽、HA基因和gp64跨膜域基因序列；(b) 將所制備的gp64信號肽、HA基因和gp64跨膜域基因序 列導(dǎo)入桿狀病毒中，形成重組桿狀病毒。
6、 如權(quán)利要求5所述的方法，其中先將gp64信號肽、HA基因 和gp64跨膜域基因序列形成融合基因gp64HA，再將該gp64HA克隆 至轉(zhuǎn)移載體中獲得重組轉(zhuǎn)移載體，然后使該重組轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒 發(fā)生同源重組而獲得重組桿狀病毒。
7、 如權(quán)利要求1 4任一項所述的重組桿狀病毒在制備禽流感病 毒疫苗中的應(yīng)用。
8、 如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述的疫苗為人用疫苗。
9、 一種制備禽流感疫苗的方法，該方法包括利用權(quán)利要求1 4任一項所述的重組桿狀病毒接種家蠶，家蠶桿狀病毒通過出芽方式使 HA展示于其表面，對病毒粒子進(jìn)行分離純化。
10、如權(quán)利要求9所述的方法，該方法包括利用權(quán)利要求1 4任一項所述的重組桿狀病毒接種家蠶，家蠶桿狀病毒出芽使HA展示于其表面，勻漿破碎細(xì)胞，多步離心去除雜質(zhì)，超速離心沉淀病毒 粒子，無菌溶解液重懸沉淀后，進(jìn)行區(qū)帶離心純化樣品，超濾脫糖和 冷凍干燥。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組桿狀病毒及其制備方法和應(yīng)用。具體地說，本發(fā)明涉及一種重組桿狀病毒，該病毒帶有g(shù)p64信號肽、HA基因和gp64跨膜域基因形成的融合基因。所述重組桿狀病毒被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.2033。利用所述重組桿狀病毒經(jīng)接種家蠶幼蟲、蛹后高效表達(dá)，表達(dá)后HA蛋白展示于桿狀病毒囊膜上，經(jīng)分離純化，冷凍干燥，制成具有較高生物活性的禽流感疫苗凍干粉。
文檔編號C12N15/866GK101168743SQ20071017575
公開日2008年4月30日 申請日期2007年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月11日
發(fā)明者呂正兵, 張耀洲, 金來榮, 陳建國 申請人:浙江中奇生物藥業(yè)股份有限公司