專利名稱：：一種重組甲基營養(yǎng)桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種重組甲基營養(yǎng)桿菌及其應用。技術背景L-絲氨酸屬生糖氨基酸，是組成蛋白質的20種基本氨基酸之一。L-絲氨酸雖屬于非必需氨基酸，但具有許多重要的生理功能和作用L-絲氨酸是合成嘌呤、胸腺嘧啶、膽堿的前體；L-絲氨酸的羥基經磷酸化作用后，能衍生出具重要生理功能的磷絲氨酸，磷絲氨酸具有解除疲勞、恢復體力等功效；L-絲氨酸具有穩(wěn)定滴眼液pH值的作用，且滴眼后無刺激性；L-絲氨酸是重要的自然保濕因子(NMF)之一，是皮膚角質層保持水分的主要角色，高級化妝品中的關鍵添加劑；同時絲氨酸的衍生物也具有優(yōu)良的藥用和生物活性，如a—取代絲氨酸被應用于設計肽，而且是免疫抑制劑ISP(多球殼菌素myriocin，嗜熱菌殺酵母素thermozymocidin)和免疫激活劑、神經鞘真菌素E等生物活性物質的有效組成部分；由L-絲氨酸制成的偶氮絲氨酸常用于治療腫瘤。在世界氨基酸生產行業(yè)中，L-絲氨酸是工業(yè)化生產難度較大的氨基酸。雖然L-絲氨酸可從蠶絲水解液中提取，但是，其得率低、成本高、利潤薄。由于技術原因，我國目前還不能大規(guī)模地生產L-絲氨酸，國內使用的L-絲氨酸基本靠國外進口。目前L-絲氨酸的生產方法主要有蛋白質水解法、化學法和微生物發(fā)酵法三種方法。國內主要采用蛋白質水解法生產L-絲氨酸，但其產量低、效率低、成本高，國外應用較多的方法是利用微生物發(fā)酵生產L-絲氨酸。L-絲氨酸處于氨基酸代謝的中間位置，在體內代謝運轉速度極快。與其他氨基酸相比，L-絲氨酸很難直接利用微生物發(fā)酵法生產?，F有的L-絲氨酸生產方法大多采用以甘氨酸、甘氨酸三甲內鹽或甘油酸為前體利用微生物發(fā)酵生產，所采用的微生物種類較多，大致可以分為兩類，即甲基營養(yǎng)型細菌和異養(yǎng)型細菌(如嗜甘氨酸棒桿菌、諾卡氏菌等)。其中研究得最多、L-絲氨酸產量最高的是甲基營養(yǎng)型細菌。甲基營養(yǎng)型細菌是一類可以利用甲醇等單碳化合物作為唯一碳源和能源進行生長的微生物。根據其利用碳源情況的不同，甲基營養(yǎng)型細菌可以分為以下三類1、嚴格甲基營養(yǎng)型細菌(oW/gflfemW/^/Wrap/w)，如Me^;/o6ac"/1^，此類細菌只能利用單碳化合物作為唯一碳源進行生長；2、限制性兼性甲基營養(yǎng)型細菌("Wn'"W/ac^加'vewe^;/Wra;/w)，如M"/zy/o;/H7t^，此類細菌除了能在以單碳化合物為碳源的培養(yǎng)基上生長外，還能利用小范圍的多碳化合物作為碳源和能源；3、典型的兼性甲基營養(yǎng)型細菌(《y/7/ca//ac^a"wmeA;;/o加;fo)，如M"/^/ovon^，此類細菌比限制性兼性甲基營養(yǎng)型細菌利用的多碳化合物的類型更多。由于甲基營養(yǎng)型細菌具有極為相似的形態(tài)學和代謝機制的特點，用于分類到不同屬或種的標準還得根據其遺傳和生理生化特性來決定。能進行發(fā)酵生產L-絲氨酸的微生物種類豐富，包括/fy-om/cro&調sp.、她鄉(xiāng)/。6octe,/,sp.、尸-yewc/o腳"a51sp.、TVocaWasp.、5^cz'"asp.等。目前已經分離到多株產L-絲氨酸的甲基營養(yǎng)型細菌菌株。如Izumi等篩選鑒定到1株產L-絲氨酸的嗜甲基生絲微菌(//j^^,'cra6/wmme^y/o6orwm)菌株KM146，KM146菌株在含48mg/ml甲醇、100mg/ml甘氨酸、30mg/ml菌體、Tris-HC1(pH9.0)0.05mmol/ml的反應體系中，于28。C振動培養(yǎng)3天后，可以生成24mg/ml的L-絲氨酸，摩爾轉化率為17%。Yoshida等篩選到一株生絲微菌(/fyp/zom/cro6&m印.)菌株NCIB10099，NCIB10099菌株在含88mg/ml甲醇、100mg/ml甘氨酸、40mg/ml菌體、Tris-HC1(pH9.O)的反應體系中，于28°C振動培養(yǎng)3天，可以生成43rag/ml的L一絲氨酸。1986年，Sirirote等報道了利用扭曲甲基桿菌(M"/zy/ok7"en^wexto^wem)菌株NR1生產L-絲氨酸的情況，研究表明，在甲醇濃度為10mg/ml、甘氨酸濃度為100mg/ml、細胞濃度為30.94mg/ml、溶解氧為0.5ppm、反應溫度為30°C、控制pH的條件下，反應24小時，可以獲得24.9mg/ml的L-絲氨酸。Hagishita等從土壤中分離到產L-絲氨酸的甲基桿菌(Me^y/o6actehwm印.)菌株MN43，研究表明，在甲醇濃度為104mg/ml、甘氨酸濃度為50mg/ml的條件下，反應5天后，可以獲得65mg/ml的L-絲氨酸，摩爾轉化率為93%。這是目前已報道的利用甲醇和甘氨酸生產L一絲氨酸產量和摩爾轉化率最高的一株甲基營養(yǎng)型細菌。Morinaga等分離到一株兼性甲基營養(yǎng)型細菌MS31，鑒定為假單胞菌(/^Womoww取)，在培養(yǎng)后期添加甘氨酸和甲醇后，MS31菌株可以積累2.5mg/ml的L-絲氨酸。通過誘變獲得的鄰甲基絲氨酸抗性突變體S395可以積累10-12mg/ml的L-絲氨酸。絲氨酸羥甲基轉移酶基因(gJj^)廣泛存在于各種生物體中，是生物體中的一種重要基因，并能自身編碼產生絲氨酸羥甲基轉移酶(serinehydroxymethyltransferase,SHMT)。自然界中的細菌體內一般都含有基因，如細菌中的Eco"。在體外條件下，當有一定濃度的四氫葉酸存在時，SHMT可以催化甲醛和甘氨酸可逆的合成L-絲氨酸。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種重組甲基營養(yǎng)桿菌。本發(fā)明的重組甲基營養(yǎng)桿菌，是將絲氨酸羥甲基轉移酶基因插入到原核細胞表達載體的多克隆位點，得到重組表達載體，再將所述重組表達載體導入大腸桿菌中得到重組菌，以該重組菌作為供體菌，以轉入幫助質粒pRK2073或pRK2013(購自Promega公司)的重組大腸桿菌為幫助菌，以甲基營養(yǎng)桿菌(Me^yZo^cten'謂sp.)MB200為受體菌，通過三親本雜交將所述重組表達載體導入到甲基營養(yǎng)桿菌(M"/o^cteW"msp.)MB200中，得到重組甲基營養(yǎng)桿菌。所述原核細胞表達載體可為現有的能在大腸桿菌細胞內表達復制的載體，如pLAFR3。所述重組表達載體為將所述絲氨酸羥甲基轉移酶基因插入到pLAFR3的多克隆位點，得到的重組表達載體pLAFRg。其中，所述絲氨酸羥甲基轉移酶的氨基酸序列如GenBankAccessionNumberL33463所示。所述三親本雜交是將供體菌、協(xié)助菌與受體菌混合起來，使菌體細胞緊密接觸，供體中的質粒在協(xié)助質粒的幫助下通過接合轉移方式導入受體菌中。所述絲氨酸羥甲基轉移酶基因的編碼序列具體可為序列表中序列1的自5'端第79—1383位核苷酸。其中，自5'端第79—1383位核苷酸是該基因的開放閱讀框架，自5'端第79—81位核苷酸為該基因的起始密碼子ATG,自5'端第1381—1383位核苷酸為該基因的終止密碼子TAA。所述三親本雜交中的供體菌為將pLAFRg導入大腸桿菌(如DH5a)中得到的重組菌；所述幫助菌為將幫助質粒pRK2073或pRK2013(購自Promega公司)導入大腸桿菌(如DH5a)得到的重組菌。其中，所述重組甲基營養(yǎng)桿菌具體可為甲基營養(yǎng)桿菌(Me^y/o^"m'wmsp.)MB202，已于2007年8月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為中國武漢武漢大學)，保藏登記號為CCTCCN2M207126。本發(fā)明的第二個目的是提供一種生產絲氨酸羥甲基轉移酶的方法。本發(fā)明所提供的生產絲氨酸羥甲基轉移酶的方法，是發(fā)酵培養(yǎng)所述重組甲基營養(yǎng)桿菌，得到絲氨酸羥甲基轉移酶。所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法配制(NH4)2HP043g、K2HP042g、NaCllg、MgS047H200.2g、FeS047H2010mg、MnS044-6H205mg，維生素Bl10iig、核黃素20"g、泛酸鈣20ug、維生素B620wg、生物素1ug、對氨基苯甲酸10ug，加水到1000ml，pH7.0，滅菌后加入體積百分比為1.25%的甲醇；所述發(fā)酵的培養(yǎng)溫度為28—32'C;培養(yǎng)時間為48—72小時。本發(fā)明的第三個目的是提供一種生產L-絲氨酸的方法。本發(fā)明所提供的生產L-絲氨酸的方法，是培養(yǎng)上述重組甲基營養(yǎng)桿菌的靜息細胞，得到L-絲氨酸。所述靜息細胞的培養(yǎng)體系為甘氨酸10-60rog，甲醇50-100mg，菌體108—109CFU，pH8.5的50慮Tris-HCl至終體積lmL;所述培養(yǎng)溫度為28-37°C，所述培養(yǎng)時間為48-72小時。本發(fā)明構建的重組甲基營養(yǎng)桿菌能通過發(fā)酵培養(yǎng)生產絲氨酸羥甲基轉移酶，絲氨酸羥甲基轉移酶的酶活力達到115U，是出發(fā)菌株MB200的3.5倍；還能夠通過培養(yǎng)重組甲基營養(yǎng)桿菌的靜息細胞轉化甘氨酸和甲醇生產L-絲氨酸，L-絲氨酸的產量達11.5mg/mL，與出發(fā)菌株MB200相比，提高了5倍。而且本發(fā)明生產L-絲氨酸的方法中，利用甲醇和甘氨酸為原料，成本低，可以獲得較高的利潤。本發(fā)明的重組甲基營養(yǎng)桿菌在生產L-絲氨酸、絲氨酸羥甲基轉移酶和處理甲醇廢水中都有具有十分廣闊的應用前景。圖1:MB200基因組DNA分別經5amHI、///^/III酶切后的Southern雜交結果圖2:基因文庫的菌落原位雜交免疫反應顯影圖3:g義W基因在大腸桿菌中的表達圖4:重組菌株MB202提取質粒的酶切驗證結果圖5:野生菌株MB200生長時期與SHMT酶活情況分析圖6:重組菌株MB202生長時期與S麗T酶活情況分析圖7:薄層層析檢測MB202靜息細胞反應液中L-絲氨酸與甘氨酸圖8:L-絲氨酸與甘氨酸標準溶液混合后的定量分析圖9:MB200靜息細胞反應液中L-絲氨酸與甘氨酸的定量檢測圖10:MB202靜息細胞反應液中L-絲氨酸與甘氨酸的定量檢測具體實施方式本發(fā)明實施例中所用到的材料包括大腸桿菌(^c/zen'c/z/aco//)Tuner(DE3)(購自Novagen公司)；載體為pLAFR3(購自Promega公司)；抗生素、限制性內切酶、修飾酶、TaqE、dNTP、pGEMT-easy載體試劑盒購自Promega公司，其它化學試劑購自廣西藍天實業(yè)有限公司。在本發(fā)明實施例中所用到的培養(yǎng)基培養(yǎng)甲基營養(yǎng)桿菌的mediumII培養(yǎng)基(即M培養(yǎng)基)(1000ml)(NH4)2HP043g、K2HP042g、NaCllg、MgS047H200.2g、FeS047H2010mg、MnS044-6H205mg,微量元素維生素Bl10ixg、核黃素20ug、泛酸鈣20ng、維生素B620yg、生物素liig、對氨基苯甲酸10ug，加水到1000ml，pH7.0，滅菌后在超凈臺內加入1.25%(體積百分比)的甲醇，固體培養(yǎng)基加入llg的瓊脂粉。LA培養(yǎng)基的組成(1000ml):10.0g胰蛋白胨(購自Oxoid公司)；5.Og酵母浸出粉(購自Difco公司)；5.0gNaCl;pH7.0，瓊脂粉1.2%。實施例l、重組甲基營養(yǎng)桿菌MB202的制備一、^州基因的克隆1、三親本雜交的受體菌-甲基營養(yǎng)桿菌(A/e^y/o6acfeWwwsp.)MB200CGMCCNo1526的篩選從廣西隆安縣某沼氣池中采集泥樣0.5g，加入到含100mlmediumII液體培養(yǎng)基的三角瓶中，32。C搖床培養(yǎng)3天，將培養(yǎng)好的菌液按1%的接種量轉接到100mlmediumII液體培養(yǎng)基中繼續(xù)于32。C搖床培養(yǎng)3天，取100y1上述菌液稀釋涂布于mediumII固體培養(yǎng)基上，32匸培養(yǎng)3天，待長出菌落后，用接種環(huán)挑取單菌落接種于mediumII固體培養(yǎng)基上，將長出的單菌落分別編號，其中編號為MB200的菌株經鑒定為甲基營養(yǎng)桿菌(M"/y;/ok/"m'wwsp.)，其保藏號為CGMCCNo1526。2、探針的制備根據Me^y/o6acfeWwmextor《we"sAMl的gJ/J基因序歹!j(GenBankAccessionNumberL33463)使用vectorNTI軟件設計合成了一對絲氨酸羥甲基轉移酶部分基因的特異引物GF和GR，GF為5'-CGACTCCTTCTTCTCGGCTC-3'，GR為5'-CGTTCTTGTTGCAGGTGATG-3'，以MB200的基因組DNA為模板，PCR擴增得到大小約0.65Kb的DNA片段，該片段經序列測定后發(fā)現與Mexto^we似AMl的^/^基因序列相似性達到95%，確定從MB200中擴增到部分^7j^基因片段。作為下一步Southem雜交的探針。3、Southern雜交根據VectorNTI軟件分析的探針酶切位點圖譜，選擇適當的限制性內切酶對MB200的基因組DNA進行Southern雜交驗證。用限制性內切酶5am^1、歷"dIII分別完全酶切MB200基因組DNA，將PCR產物經Promega公司的雜交專用試劑盒標記后作為探針，雜交之前的基因組DNA酶切、電泳、轉膜等按文獻所述方法進行(YoshitakeTanaka,KazumiArakiandKiyoshiNakayama.1980,StrainimprovementofNocardiabutanicaformicrobialconversionofglycineintoL國serine.Ferment.Technol,58(2):163-166.)，然后58。C預雜交2—4h，以隨機引物標記試劑盒標記探針，65。C雜交過夜，在嚴格條件下洗膜，壓磷屏，用AmershamBiosciences公司的Typhoon9410掃描成像。結果表明用5am^1、歷"dlII兩種酶分別酶切處理MB200基因組DNA，均出現陽性雜交帶，陽性雜交帶的大小分別為3.5Kb、22Kb左右，結果如圖l所示，其中，M為1KbDNAMarker;l為5amHI酶切結果；2為///"dill酶切結果。根據基因大小和陽性印記片段的大小，選用酶切基因組DNA的產物作為構建文庫的外源DNA。4、基因文庫構建為了獲得完整的Wjo4基因，在構建以pGEM-3Zf(+)(購自Promega公司)為載體的文庫時，將MB200的基因組DNA用^am^1完全酶切，回收3.5Kb附近的酶切片段用于文庫的構建。將上述回收的3.5Kb附近的酶切片段與經過相同酶切后去磷酸化的質粒載體pGEM-3Zf(+)相連接，形成重組表達質粒。將連接產物用電脈沖方法導入宿主感受態(tài)細胞DH5a內，經過l小時的預培養(yǎng)后，涂布于含有X-gal(40ug/ml)、IPTG(40ng/ml)、氨節(jié)青霉素(Amp)(50ug/ml)的LA平板上，37X:恒溫培養(yǎng)過夜，篩選得到約3000個白色轉化子。5、菌落原位雜交將所獲得的白色菌落按相應位置點在雜交尼龍膜上，置于含Amp的LA平板上培養(yǎng)12小時，待菌落大小在2mm左右時，用Southern雜交的方法進行菌落原位雜交，結果如圖2。結果得到10個可能的陽性菌落。6、陽性克隆序列分析將其中一個陽性菌落提取質粒，酶切驗證后，送至大連寶生物公司進行測序。測序結果表明，該陽性菌含有序列表中序列1所示的DNA序列。其中，序列自5，端的第79—1383位核苷酸為^7j^基因的開放閱讀框(OpenReadingFrame,ORF)，編碼如GenBankAccessionNumberL33463所示的^j^;自5，端的第79—81位核苷酸為^/j^基因的起始密碼子ATG,自5'端的第1381—1383位核苷酸為g義W基因的終止密碼子TAA。7、g義W基因在大腸桿菌中的表達根據上述測序的基因序列設計引物P1(5，-CTAGGATCCCATGAGCGCCGGAACTG-3')、P2(5'-ACGAAGCTTGTTGTAGATCGGGAAGC-3')，下劃線分別為5am肌和///^/111的酶切位點，以10ngMB200的基因組DNA為模板，PCR擴增序列1的自5'端第79—1383位核苷酸，其它反應物按說明書添加，反應程序為96。C2min，95°C50sec，61°C50sec，72°C1.5min,30個循環(huán)，72°C5min。將該PCR產物進行測序，結果表明該PCR擴增產物的核苷酸序列是序列表中序列1的自5'端第79-1383位核苷酸。將該PCR擴增得到的產物經瓊脂糖凝膠電泳再經試劑盒純化，用5amM和///"dill雙酶切該片段，回收后連接到用同樣酶切處理的pET-blue(購自Novagen公司)載體上，將該重組表達載體命名為pET:og，然后將重組表達載體pET:og導入到大腸桿菌Tuner(DE3X購自Novagen公司)中，得到了重組表達菌株Tuner(pet:og)。同時，將pET-blue轉入大腸桿菌Tuner(DE3)中，得到重組菌株Tuner(pet:blue)。接種Tuner(pet:og)于3mlLB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。將3ml菌液全部加入到盛有100mlLB液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，振蕩培養(yǎng)。當OD,到0.4—0.6時加入IPTG至終濃度為1.OmM，誘導培養(yǎng)4一5小時左右。將誘導表達的菌液于10000rpm，4'C離心，收集菌體。超聲波破碎細胞，15000rpm離心20min去除細胞殘留物，將上清液進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，檢測SHMT蛋白是否表達及其可溶性，檢測結果如圖3所示，其中，1:純化的SHMT蛋白(用Ni柱親和層析純化。具體方法將上述細胞破碎后離心的上清液裝填Ni-NTA親和層析柱，按常規(guī)方法上Ni+層析柱先平衡層析柱，平衡緩沖液(20raraol/LTirs-HCl，0.5mol/LNaCl，5ramol/L咪唑pH7.9);低速上樣后，再用同樣的平衡緩沖液洗柱以去除雜蛋白；最后洗脫目的蛋白，洗脫緩沖液(20mmol/LTirs-HC1，0.5mol/LNaCl，10—200mmol/L咪唑)，收集洗脫峰，得到純化的SHMT蛋白)，2:從上至下依次為116.0，66.2，45.0，35.0，25.0，18.4，14.4kDa的蛋白質分子量標準，菌株Tuner(pet:og)的誘導表達結果，4:對照菌株Tuner(pet:blue)的誘導表達結果。結果表明，得到48kDa的SHMT，且該蛋白可溶。二、三親本雜交制備重組甲基營養(yǎng)桿菌MB202將上述步驟一的7中得到的PCR產物經///Mdl11和Sam^I酶切后連接到用同樣酶切處理的pLAFR3(購自Promega公司)載體上，得到重組表達質粒，將該重組表達質粒命名為pLAFRg，將pLAFRg導入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中，得到的重組菌作為供體菌；將幫助質粒pRK2073(購自Promega公司)轉入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中，得到的重組大腸桿菌作為幫助菌；以甲基營養(yǎng)桿菌(Me,/^/ok/"e^msp.)MB200為受體菌，通過三親本雜交將pLAFRg導入到甲基營養(yǎng)桿菌(Me^y/o6a"en^msp.)MB200中，得到重組甲基營養(yǎng)桿菌MB202。具體方法如下將上述供體菌、幫助菌、受體菌三種菌都培養(yǎng)到對數生長期，將以上菌液按照1:1:4的體積比混合均勻，離心收集菌體，TE洗3次，然后點到共培養(yǎng)基(M+20X(體積百分含量)LB)平板上，32i:共培養(yǎng)2-3天。挑取單菌落稀釋涂布到含四環(huán)素(15ug/ml)和萘啶酮酸(50ug/ral)兩種抗生素的M培養(yǎng)基平板上進行篩選，得到的篩選子進一步提取質粒用歷'"oTI1和fey^I進行雙酶切鑒定，其中編號為MB202的菌株的質粒酶切鑒定結果如圖4，其中，M為1KbDNAMarker,泳道l為從重組甲基營養(yǎng)桿菌MB202中提取的質粒，泳道2為該質粒經必'/^rn和酶切后的酶切結果。說明甲基營養(yǎng)桿菌(Me^y/oZ^cten'wmsp.)MB202是將重組表達質粒pLAFRg導入到甲基營養(yǎng)桿菌(Af"/o6acten'wmsp.)MB200得到的重組甲基營養(yǎng)桿菌。甲基營養(yǎng)桿菌(Me^y/o6"cfen'wmsp.)MB202已于2007年8月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為中國武漢武漢大學)，保藏登記號為CCTCCN2M207126。實施例2、甲基營養(yǎng)桿菌(Me/A>;/o6a"m'wmsp.)MB202cctccNqM207126生產絲氨酸羥甲基轉移酶和L-絲氨酸的能力檢測一、甲基營養(yǎng)桿菌(Me^y/otocfeWwmsp.)MB202CCTCCNqM207126生產絲氨酸羥甲基轉移酶為了確定菌株的SHMT酶活力與生長時期的關系，將菌株MB200和MB202分別接種于mediumII液體培養(yǎng)基中，于32"C培養(yǎng)12小時后，每3小時測定一次菌液的0DW()值，并收集0.6mg的濕菌體(2X106—2X107CFU)測定酶活。其中酶活的測定方法是lral酶反應體系中含50mM磷酸緩沖液(pH8.5)，0.05mmol/mlDL-3-苯基絲氨酸，0.05umol/ml磷酸吡眵醛，0.03%CTAB及0.6mg的濕菌體(2X106—2X10'CFU)，反應溫度45。C，酶活力單位以每小時產生l咖ol苯甲醛的量為一個酶活力單位。實驗設3次重復，檢測結果如圖5和圖6所示，表明甲基營養(yǎng)桿菌/otocten'wwsp.)MB200CGMCCNo1526在培養(yǎng)33小時酶活達到最高，每毫克菌體的酶活為33U±4U(平均值士標準差)，g卩33U±4U/3.3X106—3.3X107CFU;甲基營養(yǎng)桿菌(Me^;/o6acten'wmsp.)MB202CCTCCNsM207126在培養(yǎng)36小時，酶活達到最高，每毫克菌體的酶活為115U±5U(平均值土標準差)，即115U±5U/3.3X106-3.3X107CFU。MB202的最高酶活是MB200最高酶活的3.5倍。圖5和圖6中的數據是3次重復的平均值。二、生產L-絲氨酸1、靜息細胞培養(yǎng)接種一環(huán)甲基營養(yǎng)桿菌(Me^;/o^"m'wmsp.)MB202CCTCC他M207126到lOmLmediumII培養(yǎng)基中，32t:搖床培養(yǎng)3天。然后轉接lmL培養(yǎng)物到lOOmL新鮮的mediumII培養(yǎng)基中，繼續(xù)32"搖床培養(yǎng)到0D6。。為0.8-1.0(即培養(yǎng)24-32小時)，4"C條件下，8000rpm離心10分鐘收集菌體。同時，以相同方法培養(yǎng)的甲基營養(yǎng)桿菌(Me^y/o6acter/wmsp.)MB200CGMCCNo1526作為對照。將收集的菌體用生理鹽水洗3次后，按以下次序將各成分在指形瓶內混合Tris-HCl(pH8.5)50mM，甘氨酸10mg，甲醇50mg，菌體30rag(108—109CFU)，加50raMTris-HC1(pH8.5)至終體積lmL。置于32。C搖床上培養(yǎng)48hr，13000rpm離心10分鐘，取上清液，-2(TC保存待測。其中，上述搖床的轉速為200rpm，離心半徑為135mm。2、L-絲氨酸檢測(1)L-絲氨酸定性分析DNS-氨基酸聚酰胺薄膜層析采用聚酰胺薄膜(10X10cm)。吸取培養(yǎng)上清液于EP管中，加入等體積的DNS-C1丙酮溶液。于4(TC恒溫箱保溫30分鐘，移入8(TC烘箱10分鐘。加入1mol/L鹽酸至pH2—3，加入水飽和的乙酸乙酯充分混勻。取上層液點樣，以苯冰醋酸(9:1)為展開劑展開，在紫外光下看到黃色熒光，采用L-絲氨酸(購自Sigma公司，產品目錄號為CA-118)和甘氨酸(購自Sigma公司，產品目錄號為CA-066.)作對照，通過與對照比較判斷有L-絲氨酸的產生。DNS-氨基酸聚酰胺薄膜層析結果如圖7所示，其中，CK:L-絲氨酸標準品和甘氨酸標準品混合液的薄膜層析結果，l:待測樣品的薄膜層析結果。(2)L-絲氨酸定量分析反應體系離心取上清液送廣西分析測試研究中心測定，采用日本日立公司的氨基酸自動分析儀L-8800AAAsystemhanager，柱子為26223C柱，檢測L-絲氨酸的含量和甘氨酸的殘留量。結果如圖8、9、IO所示，其中，圖8:L-絲氨酸與甘氨酸標準溶液混合后的定量分析結果，圖9:甲基營養(yǎng)桿菌(MW/z;;/o6acten^msp.)MB200CGMCCNq1526發(fā)酵反應液中L-絲氨酸與甘氨酸的定量檢測結果，圖10:甲基營養(yǎng)桿菌(Me^y/o6acten'wwsp.)MB202cctccNqM207126發(fā)酵反應液中L-絲氨酸與甘氨酸的定量檢測結果。3次重復實驗的結果表明，甲基營養(yǎng)桿菌(MW/^/o6acten'wmsp.)MB202CCTCCNsM207126每毫升反應體系中L—絲氨酸的含量為11.5rag±0.2mg(平均值士標準差)，即11.5mg土0.2mg/108-109CFU，甲基營養(yǎng)桿菌(M"ty/o6acten、msp.)MB200CGMCCNs1526每毫升反應體系中L一絲氨酸的含量為2.8mg士0.2mg(平均值士標準差)，即2.8mg土0.2mg/108—109CFU。序列表<<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權利要求1、一種重組甲基營養(yǎng)桿菌，是將絲氨酸羥甲基轉移酶基因插入到原核細胞表達載體的多克隆位點，得到重組表達載體，再將所述重組表達載體導入大腸桿菌中得到重組菌，以該重組菌作為供體菌，以轉入幫助質粒pRK2073或pRK2013的重組大腸桿菌為幫助菌，以甲基營養(yǎng)桿菌(Methylobacteriumsp.)MB200為受體菌，通過三親本雜交將所述重組表達載體導入到甲基營養(yǎng)桿菌(Methylobacteriumsp.)MB200中，得到重組甲基營養(yǎng)桿菌；所述甲基營養(yǎng)桿菌(Methylobacteriumsp.)MB200的保藏號為CGMCCNo1526。2、根據權利要求l所述的重組甲基營養(yǎng)桿菌，其特征在于所述重組表達載體為將所述絲氨酸羥甲基轉移酶基因插入到pLAFR3的多克隆位點，得到的重組表達載體pLAFRg;所述三親本雜交中的供體菌為將pLAFRg導入大腸桿菌中得到的重組菌；所述幫助菌為將幫助質粒pRK2073或pRK2013導入大腸桿菌中得到的重組菌。3、根據權利要求2所述的重組甲基營養(yǎng)桿菌，其特征在于所述大腸桿菌為DH5a。4、根據權利要求l、2或3所述的重組甲基營養(yǎng)桿菌，其特征在于所述絲氨酸羥甲基轉移酶的氨基酸序列如GenBankAccessionNumberL33463所示。5、根據權利要求4所述的重組甲基營養(yǎng)桿菌，其特征在于所述絲氨酸羥甲基轉移酶基因的編碼序列是序列表中序列1的自5'端第79—1383位核苷酸。6、根據權利要求5所述的重組甲基營養(yǎng)桿菌，其特征在于所述重組甲基營養(yǎng)桿菌為甲基營養(yǎng)桿菌(Me^y/o6fl"er/wwsp.)MB202，其保藏號為CCTCCNoM207126。7、一種生產絲氨酸羥甲基轉移酶的方法，是發(fā)酵培養(yǎng)權利要求1至6中任一所述的重組甲基營養(yǎng)桿菌，得到絲氨酸羥甲基轉移酶。8、根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基按照如下方法配制(NH4)2HP043g、K2HP042g、NaCllg、MgS047H200.2g、FeS047H2010mg、MnS044-6H205mg，維生素Bl10yg、核黃素20ng、泛酸轉20ug、維生素B620iig、生物素lug、對氨基苯甲酸lOyg，加水到1000ml，pH7.0，滅菌后加入體積百分比為1.25%的甲醇；所述發(fā)酵的培養(yǎng)溫度為28—32。C;培養(yǎng)時間為48—72小時。9、一種生產L-絲氨酸的方法，是培養(yǎng)權利要求1至6中任一所述的重組甲基營養(yǎng)桿菌的靜息細胞，得到L-絲氨酸。10、根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述靜息細胞的培養(yǎng)體系為甘氨酸10-60mg，甲醇50-100mg，菌體108—109CFU，pH8.5的50raMTris-HCl至終體積lmL;所述培養(yǎng)溫度為28-37°C，所述培養(yǎng)時間為48-72小時。全文摘要本發(fā)明公開了一種重組甲基營養(yǎng)桿菌及其應用。本發(fā)明的重組甲基營養(yǎng)桿菌是將glyA基因插入到載體pLAFR3的多克隆位點，得到重組表達載體pLAFRg，再將pLAFRg通過三親本雜交導入到甲基營養(yǎng)桿菌MB200中，得到重組甲基營養(yǎng)桿菌MB202。MB202在10mg甘氨酸，50mg甲醇，10⁸-10⁹CFU菌體量，pH8.5的50mMTris-HCl至終體積1mL的條件下，32℃搖床培養(yǎng)48小時，L-絲氨酸的產量達11.5mg/mL；MB202在32℃條件下，發(fā)酵培養(yǎng)12小時后，絲氨酸羥甲基轉移酶的酶活達115U。本發(fā)明在利用重組甲基營養(yǎng)桿菌MB202的靜息細胞生產L-絲氨酸、在處理甲醇廢水中都有具有十分廣泛的應用前景。文檔編號C12N1/21GK101165172SQ200710175890公開日2008年4月23日申請日期2007年10月15日優(yōu)先權日2007年10月15日發(fā)明者倩歐,波武,申佩弘申請人:廣西大學