專利名稱：與甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F緊密連鎖的特異片段及其獲得方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與甜瓜白粉病抗性基因/^-^^緊密連鎖的特異片段及其獲 得方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甜瓜為葫蘆科黃瓜屬(C"c腿i's /7 e^ L.)—年生蔓生草本植物，是一 種國內(nèi)外廣泛栽培的重要經(jīng)濟(jì)作物。我國已有3000多年的甜瓜栽培歷史， 是世界上最早栽培甜瓜的國家之一，也是目前世界上甜瓜栽培面積最大、 產(chǎn)量最高的國家。
白粉病是危害甜瓜生產(chǎn)的一種世界性病害，在許多國家和地區(qū)都有發(fā) 生，嚴(yán)重影響甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，甚至?xí)斐山^產(chǎn)，引起了世界各國的廣 泛重視。白粉病主要由瓜單囊殼菌(&力aerof力ecs /Wi^z'/7ea)和二孢白 粉菌(f/yw'p力e "c力07^ces/7/歷)引起。目前人們已較深入地對病原菌的 致病性、傳播途徑、預(yù)防措施等進(jìn)行了研究，也為尋找相關(guān)抗源基因做了 大量工作，但白粉病菌的危害還是有不斷發(fā)展的趨勢，開展抗病品種的選 育是解決這一問題的有效途徑。因此，對瓜類白粉病抗病育種的研究已成 為育種工作的主要目標(biāo)之一。
傳統(tǒng)育種方式費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要非常大的群體對白粉病菌的抗性進(jìn)行嚴(yán) 格篩選。利用與抗病性狀緊密連鎖的特異標(biāo)記片段進(jìn)行品種篩選，可大大 縮短傳統(tǒng)育種的研究周期，加速目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)移。目前，與抗病性狀緊密 連鎖的特異標(biāo)記片段的獲得主要來源于各種分子標(biāo)記技術(shù)，如隨機(jī)擴(kuò)增多 態(tài)性DNA (RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)、微衛(wèi)星DNA或簡單重復(fù)序列(SSR)、特異序列擴(kuò)增(SCAR)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)等。其中， RAPD和AFLP標(biāo)記技術(shù)檢測易受環(huán)境條件的影響而造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性差， SCAR和SNP標(biāo)記技術(shù)需要利用已知DNA序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，而 SSR標(biāo)記技術(shù)具有重復(fù)性好，標(biāo)記穩(wěn)定可靠，便于統(tǒng)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)，是目前實(shí) 際應(yīng)用中比較穩(wěn)定的標(biāo)記工具，而且利用SSR標(biāo)記技術(shù)獲得的特異片段序 列也是開發(fā)SCAR和SNP等其他分子標(biāo)記的重要基礎(chǔ)。因此，本項(xiàng)研究擬 利用SSR標(biāo)記技術(shù)尋找與甜瓜白粉病抗性基因緊密連鎖的特異標(biāo)記片段， 這將是今后進(jìn)行甜瓜白粉病抗性分子育種的基礎(chǔ)，而由此獲得的擴(kuò)增序列 又是開發(fā)SCAR和SNP等特異分子標(biāo)記的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種與甜瓜白粉病抗性基因/fe-i^緊密連鎖的 特異片段，該特異片段可用于甜瓜抗白粉病分子標(biāo)記輔助育種中。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供這種特異片段的獲得方法。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種與甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F緊密連鎖的特異片段，其具有序列
表中SEQ ID N0:1 4所述的DNA序列。
序列表中SEQ ID N0:1為抗病特異擴(kuò)增片段SSR509-172的序列； 序列表中SEQ ID N0:2為抗病特異擴(kuò)增片段SSR510-98的序列； 序列表中SEQ ID N0:3為感病特異擴(kuò)增片段SSR509-170的序列； 序列表中SEQ ID N0:4為感病特異擴(kuò)增片段SSR510-104的序列。 一種與甜瓜白粉病抗性基因/^-2,緊密連鎖的特異片段的獲得方法，
所述方法包括如下步驟
(1)與甜瓜白粉病抗性基因/to-i^緊密連鎖的特異片段的篩選提取
基因組DNA，使用SSR引物對基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析；通過BSA法，尋找與甜瓜白粉病抗性基因/fe-2尸緊密連鎖的特 異SSR片段，測定連鎖距離并驗(yàn)證連鎖關(guān)系；
(2)與甜瓜白粉病抗性基因P邁-^,緊密連鎖的特異擴(kuò)增序列的獲得 對SSR產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆和測序，獲得特異片段序列。
上述的一種與甜瓜白粉病抗性基因i^緊密連鎖的特異片段的獲得
方法，所述步驟(1)中SSR引物為SSR引物509和SSR引物510;
所述SSR引物509上游引物序列為5， -CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3，， 509下游引物序列為5， - CAAAAAGCATCAAAATGGTTG -3，。
所述SSR引物510上游引物序列為5， -TTTCACTTTTTCCCGCCG -3，， 510下游引物序列為5， - AATGGAAAAGGGAAGTGCAA -3'。
上述的一種與甜瓜白粉病抗性基因尸歷-2尸緊密連鎖的特異片段的獲得 方法，其中，所述步驟(1)中的提取基因組DNA是指將1.5克葉片在液 氮中研磨成粉末，加入9ml 2。/oCTAB提取液，混勻65。C水浴1小時(shí)；從水 浴中取出離心管，加1/3體積5M醋酸鉀，混勻冰浴20分鐘；加入等體積 氯仿/異戊醇抽提兩次；取上清加入2/3體積異丙醇沉淀DNA;洗滌緩沖液 洗滌一次，吹干，加TE緩沖液溶解；加入RNase A使其終濃度達(dá)100 ii g/ml， 混勻37t:水浴l小時(shí)；用等體積氯仿/異戊醇抽提；取上清，加入l/2體 積7.5M醋酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀DNA; 70%乙醇洗滌沉淀，吹干， 加適量ddH20溶解DNA。
上述的一種與甜瓜白粉病抗性基因尸歷-2,緊密連鎖的特異片段的獲得 方法，其中，所述步驟(1)中的PCR反應(yīng)條件是25ul的反應(yīng)體系中含 有2. 5ullOX buffer, 2. 0 u 1 25mM MgCh， 2. 0 w 1 2. 5mM dNTP， 1U Taq DNA聚合酶，30ngSSR引物，50 ng模板DNA;反應(yīng)程序?yàn)椋?4。C預(yù)變性 5min，然后94°C1 rain， 52°C1 min， 72°C2 min下循環(huán)35次，72。C延伸7min后保存在4X:條件下。
上述的一種與甜瓜白粉病抗性基因/^-i^緊密連鎖的特異片段的獲得 方法，其中，所述步驟(2)中的SSR產(chǎn)物的回收、克隆和測序是指用 Gene-Clean試劑盒純化回收已證明是連鎖的SSR特異片段，然后連接 到pGEM@-T Vector Easy載體上，將重組質(zhì)粒DNA用Ecoi I進(jìn)行酶切 處理，用SSR-PCR驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物，觀察擴(kuò)增出的片段是否與原來的目 的片段和酶切片段一致，并測序。
本發(fā)明應(yīng)用簡單重復(fù)序列(Simple Sequence R印eat, SSR)技術(shù)， 在甜瓜重組自交系(Recombinant Inbred Line, RIL)群體中采用混合分 組分析法(Bulked Segregating Analysis, BSA)篩選了與甜瓜白粉病抗 性基因戶歷-^^緊密連鎖的SSR特異片段，并將SSR特異片段克隆測序獲得 了特異擴(kuò)增序列。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明獲得的SSR特異片段具有重復(fù)性好，標(biāo)記穩(wěn) 定可靠，便于統(tǒng)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)，其特異擴(kuò)增序列亦是開發(fā)其它特異標(biāo)記的基礎(chǔ)。
下面結(jié)合附圖及最佳實(shí)施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，以使公眾對發(fā) 明內(nèi)容有整體和充分的了解，而并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。前述部分 已經(jīng)充分公開了本發(fā)明可以實(shí)施的保護(hù)范圍，因此凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容 進(jìn)行的任何本領(lǐng)域公知的等同替換，均屬于對本發(fā)明的侵犯。


圖1為引物SSR509和510對抗感親本、F,、抗感池DNA擴(kuò)增結(jié)果圖； 圖2為引物SSR509對重組自交系群體的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖； 圖3為引物SSR510對重組自交系群體的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖； 圖4為引物SSR509對甜瓜種質(zhì)資源的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖； 圖5為引物SSR510對甜瓜種質(zhì)資源的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例與甜瓜白粉病抗性基因尸歷-i^緊密連鎖的特異片段及其擴(kuò)增 序列的獲得
一、材料和方法 1. 1材料
供試材料親本為日本類型甜瓜材料K7-1和典型的新疆哈密瓜株系
K7-2。兩材料均由新疆農(nóng)科院吳明珠院士提供。父本K7-1為日本高抗白 粉病材料，母本K7-2高感白粉病，為典型的新疆哈密瓜，果實(shí)糖度高， 肉質(zhì)脆，貨架期長，有特殊的芳香味。以二者為親本進(jìn)行雜交，從它們的 雜交后代F,材料中隨機(jī)抽樣自交，通過單粒傳獲得F^重組自交系構(gòu)成RIL 群體，共106個(gè)株系，用于特異片段及序列研究。
為進(jìn)一步驗(yàn)證獲得的標(biāo)記，還采用了本實(shí)驗(yàn)室特有的120份優(yōu)良甜瓜 種質(zhì)資源，其中13份抗病種質(zhì)資源，107份感病種質(zhì)資源。
1. 2研究方法
1.2.1基因組DNA的提取
參照Murry等(1980)的方法(Murray M， Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA [J]. Nucl Acid Res, 1980， 8: 668-673.)加以改進(jìn)后進(jìn)行DNA提取。
將1. 5克葉片在液氮中研磨成粉末，加入9ml 2%CTAB提取液(2% CTAB， 1.4mMNaCl， lOOmM Tris-HC1 pH8. 0， 20mM EDTA pH8. 0， 1% PVP-40， 0.2% e-巰基乙醇)，混勻65t:水浴l小時(shí)；從水浴中取出離心管，加l/3體積 5M醋酸鉀，混勻，冰浴20分鐘；加入等體積氯仿/異戊醇(24: 1)抽提 兩次；取上清加入2/3體積異丙醇沉淀DNA;洗滌緩沖液(76%乙醇，lOmM 乙酸銨)洗滌一次，吹干，加TE緩沖液(10raMTris-HC1， lmMEDTA, pH7.4)溶解；加入RNase A使其終濃度達(dá)100ug/ml，混勻37'C水浴1小時(shí)；用 等體積氯仿/異戊醇(24: 1)抽提；取上清，加入1/2體積7.5M醋酸銨 和2倍體積無水乙醇沉淀DNA; 70%乙醇洗滌沉淀，吹干，加適量ddH20溶 解纖。
DNA濃度用紫外分光光度計(jì)(Shimadzu UV-1201,日本)以O(shè)D260值 測定，并用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。 1.2.2 PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物的檢測
25u 1的反應(yīng)體系中含有2. 5u 1 10X buffer, 2. OiU 25mM MgCl2， 2. OiU 2. 5mM dNTP， 1U Taq DNA聚合酶，30 ng弓|物，50 ng模板DNA。 Taq DNA聚合酶及反應(yīng)緩沖液購自TaKaRa公司。dNTP購自上海Sangon公 司。SSR引物由北京奧科生物公司合成。
反應(yīng)程序?yàn)椋?4。C預(yù)變性5min，然后94。Clmin， 52。Clmin， 72。C2min 下循環(huán)35次，72。C延伸7min后保存在4'C條件下。PCR儀為美國Biorad 公司制造的PTC-100。
取擴(kuò)增產(chǎn)物與載樣緩沖液(98%甲酰胺，10 mM EDTA， 0. 25%溴酚蘭， 0. 25%二甲苯青)各5 W混合，94C變性5 min，立即置于冰上冷卻。每 個(gè)樣品取5 W上樣，采用6%聚丙烯酰胺凝膠、75 W恒功率電泳分離，至 二甲苯青指示劑跑到膠的2/3處結(jié)束電泳。銀染顯現(xiàn)結(jié)果并分析。
1. 2. 3特異擴(kuò)增PCR產(chǎn)物與白粉病抗性基因的連鎖關(guān)系
銀染顯現(xiàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，對電泳譜帶進(jìn)行分析。來自父本K7-1的 純合帶型記為"a"，來自母本K7-2的純合帶型記為"b"，模糊不清或 者丟失的帶記為"-"。利用Joinmap3. 0軟件分析特異擴(kuò)增PCR產(chǎn)物與 白粉病抗性基因的連鎖關(guān)系。
1.2.4特異擴(kuò)增序列的獲得確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與白粉病抗性基因存在緊密連鎖關(guān)系后，用ddH20 將膠板沖洗干凈，用刀片切取差異條帶，浸泡在高鹽緩沖液中(20%乙醇， 1MLiCl， 10mMTris) 24h，然后氯仿抽提，乙醇沉淀后吹干，溶于ddH20 中，取5Ml用作模板在與選擇性擴(kuò)增相同的PCR條件下重新擴(kuò)增。產(chǎn)物在 1.5%的瓊脂糖上檢測，如果確定為目標(biāo)帶，采用博奧生物公司的凝膠回收 純化試劑盒Gene-Clean對目的片段進(jìn)行純化。PCR產(chǎn)物與載體的連接采用 Promega公司的PGEM-T easy Vector系統(tǒng)。參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中 的方法進(jìn)行重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與篩選。利用天根生物公司的質(zhì)粒小提試劑盒 提取重組質(zhì)粒，采用酶切方法與PCR法對其進(jìn)行檢測。將經(jīng)過PCR和酶切 檢測為陽性克隆的質(zhì)粒送于北京奧科生物公司進(jìn)行測序并提供結(jié)果。
1.2.5父本、母本、Fi和重組自交系苗期抗病接種鑒定
1. 2. 5. 1白粉病菌源及接種菌源制備
從國家蔬菜工程技術(shù)研究中心四季青農(nóng)場收集南瓜上的白粉病菌，采 用孢子懸浮液噴霧法接種于西葫蘆幼苗上純化繁殖后，用于白粉病的接種 鑒定。
用毛筆刷取西葫蘆病葉葉片上的孢子置于無菌水的燒杯中，攪拌均勻 配制孢子懸浮液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分生孢子數(shù)。接種濃度為2.0X1()5個(gè)孢
子/mL。
1.2. 5.2苗期抗病接種鑒定
父本、母本、F,和重組自交系F^的106個(gè)株系，各取20粒種子，設(shè)2 次重復(fù)，1次重復(fù)10株苗。種子用紗布包好，55'C溫湯浸種消毒后，再浸 泡4h，置于28t:恒溫培養(yǎng)箱中催芽18小時(shí)，播于裝有滅菌營養(yǎng)土的72 孔穴盤中，生長于空調(diào)溫室內(nèi)，晝/夜溫度為25 28。C/18 20。C。子葉展 平后，采用孢子粉噴霧法接種5". /"">&e3小種2F，接種12至15天充分發(fā)病后開始調(diào)查抗感反應(yīng)。
1. 2. 5. 3苗期抗病接種鑒定的分級標(biāo)準(zhǔn)
共分6級。0級整株沒有任何病斑；l級僅子葉有很少量病斑；2 級僅子葉有較多病斑或子葉有病斑，莖上有很少量病斑；3級子葉有 很多病斑，莖上有少量病斑；4級子葉和莖上布滿病斑；5級植株死亡。
1.2. 5.4父本、母本、Fj口重組自交系苗期抗感表現(xiàn)型的確定標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)病情指數(shù)DI確定父本、母本、F和重組自交系的抗感表現(xiàn)型。 病情指數(shù)DI"S級別X株數(shù))X100/ (總株數(shù)X6)。 病情指數(shù)大于40定為感病，小于40定為抗病。 二、結(jié)果與分析
2.1甜瓜白粉病抗性基因/^-i^遺傳規(guī)律分析
對抗病親本K7-1、感病親本K7-2、 F,、重組自交系F^的106個(gè)株系進(jìn)
行苗期抗病接種鑒定，按照白粉病病情分級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查每個(gè)株系的發(fā)病率并 計(jì)算病情指數(shù)。結(jié)果表明，K7-1、 K7-2和F,的病情指數(shù)分別是0. 00、 93. 03 和3.44，分別表現(xiàn)為抗病、感病、抗病，說明甜瓜K7-l對白粉病 5. /Wi^V^s生理小種2F的抗性是由顯性基因控制。而重組自交系的抗病 鑒定結(jié)果表明106個(gè)株系有58個(gè)抗病株系和48個(gè)感病株系，分離比符合 1: 1的理論比例，卡平方檢驗(yàn)x^0.94〈a2。我,二3.84，表明甜瓜K7-1對 白粉病S/w力'^V7M生理小種2F的抗性為一對基因控制。綜合雙親、F 和重組自交系的106個(gè)株系的苗期抗病鑒定結(jié)果，甜瓜K7-l對白粉病 S. fuliginea生理小種2F的抗性受一對顯性基因尸/z -2尸控制。
2. 2與甜瓜白粉病抗性基因/^-2,緊密連鎖的特異片段 采用集團(tuán)混合分析法獲得與甜瓜白粉病抗性基因尸歷-^尸緊密連鎖的特異片段。
根據(jù)重組自交系苗期抗病鑒定結(jié)果，各取5份純合的抗感株系DNA混
合構(gòu)建抗感基因池。以抗病親本K7-1、感病親本K7-2、 F,和抗感基因池為 模板，對660對SSR引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出能在雙親和抗感基因 池之間產(chǎn)生明顯差異條帶的引物組合。660對SSR引物序列來自于目前已 經(jīng)發(fā)表的論文(Danin-Poleg-2001， Genzalo et al. 2005， Joobeur T et al， 2004， Fazio et al. 2002 )和根據(jù)互連網(wǎng)中甜瓜EST信息庫 (http:〃melon. bti. Cornell, edu) 自行設(shè)計(jì)。
集團(tuán)混合分析結(jié)果顯示，660對SSR引物中只有引物SSR509和SSR510 的抗感親本擴(kuò)增條帶與抗感池的擴(kuò)增譜帶一致，如圖1所示，圖l為引物 SSR509和SSR510對抗感親本、Fl、抗感池的PCR擴(kuò)增結(jié)果。(M. 30-330bp marker; 1,6. K7-2; 2,7. K7-1; 3,8. F,; 4，9.抗病基因池;5, 10.感病 基因池)
所述SSR引物509上游引物序列為5， -CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3，， 509下游引物序列為5， - CAAAAAGCATCAAAATGGTTG -3'。
所述SSR引物510上游引物序列為5， -TTTCACTTTTTCCCGCCG-3，， 510下游引物序列為5' - AATGGAAAAGGGAAGTGCAA -3'。
將抗病親本K7-l利用引物SSR509和SSR510進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的抗 病特異擴(kuò)增片段分別定名為SSR509-172和SSR510-98。將感病親本K7-2 利用引物SSR509和SSR510進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的感病特異擴(kuò)增片段分別定 名為SSR509-170和SSR510-104。
利用引物SSR509和SSR510分別對106個(gè)重組自交系的株系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。
引物SSR509的PCR擴(kuò)增中，如圖2所示，圖2為引物SSR509對重組自交系群體的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖(1: K7-1; 2: K7-2; 3-57: RIL株系)。58 個(gè)抗病株系中有56個(gè)株系只擴(kuò)增出SSR509-172抗病特異片段，2個(gè)抗病 株系同時(shí)擴(kuò)增出SSR509-172抗病特異片段和SSR509-170感病特異片段， &和FH兩代苗期抗病接種鑒定結(jié)果顯示這2個(gè)抗病株系為雜合株系，因此 PCR擴(kuò)增結(jié)果與田間抗病鑒定結(jié)果一致。48個(gè)感病株系中有47個(gè)株系只 擴(kuò)增出SSR509-170感病特異片段，1個(gè)株系擴(kuò)增出SSR509-172抗病特異 片段，即106個(gè)重組自交系株系中只有1個(gè)交換株系。經(jīng)Joinmap3.0軟 件分析，抗病特異片段SSR509-172與甜瓜白粉病抗性基因尸"-i"尸的連鎖 距離為lcm，呈現(xiàn)緊密連鎖關(guān)系。
引物SSR510擴(kuò)增中，如圖3所示，圖3引物SSR510對重組自交系群 體的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖(1: K7-l; 2: K7-2; 3-50: RIL株系；)。58個(gè)抗病 株系中有55個(gè)株系只擴(kuò)增出SSR510-98抗病特異片段，2個(gè)抗病株系同時(shí) 擴(kuò)增出SSR510-98抗病特異片段和SSR510-104感病特異片段，F(xiàn) 和R兩 代苗期抗病接種鑒定結(jié)果顯示這2個(gè)抗病株系為雜合株系，1個(gè)抗病株系 只擴(kuò)增出SSR510-104感病特異片段，表明該抗病株系為交換株系。48個(gè) 感病株系中有47個(gè)株系只擴(kuò)增出SSR510-104感病特異片段，1個(gè)感病株 系擴(kuò)增出SSR510-98抗病特異片段，說明此感病株系也為交換株系。因此， 106個(gè)重組自交系株系中共有2個(gè)交換株系。經(jīng)Joinmap3.0軟件分析，抗 病特異片段SSR510-98與甜瓜白粉病抗性基因尸歷-2F的連鎖距離為3cM， 呈現(xiàn)緊密連鎖關(guān)系。
為進(jìn)一步確認(rèn)抗病特異片段SSR509-172、 SSR510-98與甜瓜白粉病抗 性基因/^-2F的連鎖關(guān)系，利用本實(shí)驗(yàn)室的120份優(yōu)良甜瓜種質(zhì)資源材料 進(jìn)行驗(yàn)證。田間抗病鑒定結(jié)果顯示120份甜瓜種質(zhì)資源材料中有13個(gè)抗 病品種和107個(gè)感病品種。SSR509的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，如圖4所示，圖4為引物SSR 509對甜 瓜種質(zhì)資源的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；13個(gè)抗病品種中有4個(gè)品種擴(kuò)增出 SSR509-172抗病特異片段，其余品種擴(kuò)增出的譜帶在另一位置；107個(gè)感 病品種中有101個(gè)擴(kuò)增出SSR509-170感病特異片段，與田間抗病鑒定結(jié) 果吻合率為87. 5%。
SSR510擴(kuò)增結(jié)果顯示，如圖5所示，圖5為引物SSR510對甜瓜種質(zhì) 資源的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；13個(gè)抗病品種中有4個(gè)品種擴(kuò)增出SSR510-98抗 病特異片段，107個(gè)感病品種中有83個(gè)擴(kuò)增出SSR510-104感病特異片段， 與田間調(diào)查結(jié)果的吻合率達(dá)到72. 5%。
上述PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了抗病特異片段SSR509-172和 SSR510-98、感病特異片段SSR509-170和SSR510-104與甜瓜白粉病抗性 基因尸歷-2,的緊密連鎖關(guān)系，準(zhǔn)確性高，說明上述標(biāo)記片段在鑒別抗、感 病品種時(shí)有非常高的利用價(jià)值。
2.4特異片段的測序結(jié)果
將抗病特異擴(kuò)增片段SSR509-172和SSR510-98和感病特異擴(kuò)增片段 SSR509-170和SSR510-104進(jìn)行測序。4個(gè)測序片段的兩端分別有引物 SSR509和SSR510的上下游結(jié)合位點(diǎn)，且片段的大小與依分子量標(biāo)準(zhǔn)估計(jì) 的基本吻合，證實(shí)了測序片段的正確性。利用SSR引物509擴(kuò)增得到的抗、 感特異片段長度分別為172bp和170bp，只有2個(gè)堿基"CT"的插入。利 用SSR引物510擴(kuò)增得到的抗、感特異片段長度分別為98bp和102bp，只 有4個(gè)堿基"CTCT"的缺失。序列表
<110> 北京市農(nóng)林科學(xué)院
<120>與甜瓜白粉病抗性基因/^-i^緊密連鎖的特異片段及其獲得方法
<130〉
〈160〉 4
<170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1 〈211> 172 〈212〉 腿
<213〉 葫戶科黃瓜屬(C"c"肌、L.) <400〉 1
ctggccccct cctaaactaa acacagacgt ctcagaactg cacgactttc gtgcaaaggc 60 tttcagcttg ctctctattg ctggggtctc tggcttctgc caggttctct ctctctctct 120 ctctctctct ctctctctta aaagttaaaa tcaaccattt tgatgctttt tg 172
〈210〉 2
〈211> 98
〈212〉 匿 〈213>人工序列
〈400〉 2<formula>formula see original document page 16</formula>
權(quán)利要求
1、一種與甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F緊密連鎖的特異片段，其特征在于，其具有序列表中SEQ ID NO1～4所述的DNA序列。
2、 一種與甜瓜白粉病抗性基因v^j,緊密連鎖的特異片段的獲得方 法，其特征在于，所述方法包括如下步驟(1) 與甜瓜白粉病抗性基因/fe-2尸緊密連鎖的特異片段的篩選提取 基因組DNA，使用SSR引物對基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行 電泳分析；通過BSA法，尋找與甜瓜白粉病抗性基因/^-2,緊密連鎖的特 異SSR片段，測定連鎖距離并驗(yàn)證連鎖關(guān)系；(2) 與甜瓜白粉病抗性基因/^-2,緊密連鎖的特異擴(kuò)增序列的獲得 對SSR產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆和測序，獲得特異片段序列。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種與甜瓜白粉病抗性基因i^緊密連 鎖的特異片段的獲得方法，其特征在于，所述步驟(1)中SSR引物為SSR 引物509和SSR引物510;所述SSR引物509上游引物序列為5， -CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3，， 509下游引物序列為5， -CAAAAAGCATCAAAATGGTTG -3，。所述SSR引物510上游引物序列為:5， -TTTCACTTTTTCCCGCCG -3，， 510下游引物序列為5， -AATGGAAAAGGGAAGTGCAA -3，。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種與甜瓜白粉病抗性基因尸歷-^尸緊密連 鎖的特異片段的獲得方法，其特征在于，所述步驟(1)中的提取基因組 DNA是指將1.5克葉片在液氮中研磨成粉末，加入9ml2y。CTAB提取液，混 勻65'C水浴1小時(shí)；從水浴中取出離心管，加1/3體積5M醋酸鉀，混勻 冰浴20分鐘；加入等體積氯仿/異戊醇抽提兩次；取上清加入2/3體積異 丙醇沉淀DNA;洗滌緩沖液洗滌一次，吹干，加TE緩沖液溶解；加入RNaseA使其終濃度達(dá)100 y g/ml，混勻37"C水浴1小時(shí)；用等體積氯仿/異戊醇 抽提；取上清，加入1/2體積7.5M醋酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀DNA; 70%乙醇洗漆沉淀，吹干，加適量ddH20溶解DNA。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種與甜瓜白粉病抗性基因/^-2,緊密連 鎖的特異片段的獲得方法，其特征在于，所述步驟(1)中的PCR反應(yīng)條 件是25u 1的反應(yīng)體系中含有2. 1 10X buffer, 2. 0 u 1 25mMMgCl2， 2.0ul 2. 5mM dNTP， 1U Taq DNA聚合酶，30 ng SSR引物，50 ng模板 DNA;反應(yīng)程序?yàn)椋?4X:預(yù)變性5min，然后94°C lmin， 52°C lmin， 72°C 2min下循環(huán)35次，72。C延伸7min后保存在4。C條件下。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種與甜瓜白粉病抗性基因尸歷-i^緊密連 鎖的特異片段的獲得方法，其特征在于，所述步驟(2)中的SSR產(chǎn)物的 回收、克隆和測序是指用Gene-Clean試劑盒純化回收已證明是連鎖的 SSR特異片段，然后連接到pGEM⑥-T Vector Easy載體上，將重組質(zhì) 粒DNA用進(jìn)行酶切處理，用SSR-PCR驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物，觀察擴(kuò) 增出的片段是否與原來的目的片段和酶切片段一致，并測序。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F緊密連鎖的特異片段，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，其具有序列表中SEQ ID NO1～4所述的DNA序列。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明獲得的SSR特異片段具有重復(fù)性好，標(biāo)記穩(wěn)定可靠，便于統(tǒng)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)，其特異擴(kuò)增序列亦是開發(fā)其它特異標(biāo)記的基礎(chǔ)，并且在鑒別抗、感病品種時(shí)有非常高的利用價(jià)值。
文檔編號C12N15/29GK101440366SQ20071017802
公開日2009年5月27日 申請日期2007年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月23日
發(fā)明者宮國義, 張海英, 芳 蘇, 勇 許, 郭紹貴 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院