專利名稱：一種鹽生植物Na⁺/H⁺反向運輸?shù)鞍准捌渚幋a基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物耐逆生物技術(shù)領(lǐng)域中一種鹽生植物Na7H+反向運輸?shù)鞍准捌渚幋a 基因與應(yīng)用，特別涉及一個來源于大米草(5^r"'"a a/^"ca)的與耐逆性相關(guān)的Na7tT 反向運輸?shù)鞍准捌渚幋a基因和應(yīng)用。
技術(shù)背景我國有著5億多畝鹽荒地， 一億多畝次生鹽漬化土地，植物耐鹽機理的研究有著 廣泛的現(xiàn)實意義。對鹽生植物的研究發(fā)現(xiàn)，其對鹽脅迫的應(yīng)對主要有兩種形式 一種是拒鹽式，即 以某些方式使土壤鹽分盡量少的進入植物體內(nèi)，或者即使進入也以泌鹽的方式，將其 排出體外；另一種是耐鹽式，即植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的調(diào)滲因子如脯氨酸、甜菜堿、 可溶性糖和醇類物質(zhì)等，或是將鹽離子隔離、聚集到某特定的組織器官，以降低其在 細胞質(zhì)中的濃度。液泡占整個植物細胞總體積的40%-99%，它是細胞內(nèi)一個相對獨立的腔室，負責(zé) 儲存營養(yǎng)物質(zhì)，維持細胞的膨壓，以及隔離細胞內(nèi)有毒的陰陽離子等等，在植物細胞 的生理生化過程中起著重要作用。在液泡膜上定位有氫質(zhì)子泵向液泡內(nèi)泵入氫質(zhì)子， 由此所產(chǎn)生的液泡膜內(nèi)外的PH和電勢差為液泡內(nèi)外離子的運輸提供了主要的能量來 源。對模式植物擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，Na+離子在液泡中的聚集主要通過液泡Na7H+反向 運輸?shù)鞍?AtNHX)。液泡Na7H+反向運輸?shù)鞍桌靡号菽?nèi)外的PH和電勢差將tf離子被 動泵出液泡而將Na+離子主動泵進液泡。擬南芥Na7H+反向運輸?shù)鞍准易逵?個基因，其 中的AtNHX 1、 AtNHX 2、 AtNHX 5在液泡表達，是液泡型Na7H+反向運輸?shù)鞍?。而在葉 組織中的主要液泡Na7H+反向運輸?shù)鞍资茿tNHX 1。 AtNHX 1同時也是一個K7H+反向運輸 蛋白(Differential expression肌d function of ylra62'afc1ps/s t力a7j'朋s NHX Na+/H+ antiporters in the salt stress response. Plant J. 2002， 30(5):529-39.) 轉(zhuǎn) 基因試驗表明在擬南芥中過量表達AtNHX l可以提高擬南芥對鹽的耐受性，使其在 200mMNaCl濃度下仍能維持正常的生長(Salt Tolerance Conferred by Overexpression of a Vacuolar Na+/H+ Antiport in Ara6j'obpw's. Science 1999, 285(5431) :1256-1258.)。在擬南芥中過量表達小麥的NHX1基因也能增強擬南芥的抗鹽 及抗旱能力 (Overexpression of wheat Na+/H+ antiporter TNHX1 and H+-pyrophosphatase TVP1 improve salt- and drought-stress tolerance in /ij"a6/cfo/ s!'s t力a力'朋a plants. Journal of Experimental Botany 2007, 58(2) :301 -308.)。在細胞膜上也存在著Na7lT反向運輸?shù)鞍?，擬南芥Na7H+反向運輸?shù)鞍准易宓?個基 因中，S0S1定位于細胞膜上，在植株的根尖、維管束組織表達，在擬南芥中過量表達 SOSl基因可通過外排作用減少轉(zhuǎn)基因植物木質(zhì)部中Na+離子濃度，提高轉(zhuǎn)基因植株的耐 鹽性(Overexpression of a plasma membrane Na+/H+ antiporter gene improves salt tolerance in Ara6油/w/s z^s7i朋a Nat Biotechnol. 2003， 21 (1) :81-85.)。研 究還表明S0S1可調(diào)控與耐氧化脅迫相關(guān)基因的表達，參與植株耐氧化脅迫反應(yīng)(The plasma membrane Na+/H+antiporter S0S1 interacts with RCD1 and functions in oxidative stress tolerance in PNAS. 2006，103(49):18816 - 18821.)。將從鹽生藻青菌/IpAa加"ece Aa7o/^j^/ca中克隆的甜菜堿合成酶基因、過氧化 氫酶基因、伴侶蛋白基因和NHX基因分別轉(zhuǎn)入水生藻青菌5y/jec力ococci/s PCC 7942 的實驗證明，只有轉(zhuǎn)NHX基因的水生藻青菌能夠在海水中生長(0verexpression of a Na7fT antiporter confers salt tolerance on a freshwater cyanobacterium， making it capable of growth in sea water.PNAS. 2002, 99(6): 4109 -4114.)。這從一個角度顯示了從鹽生生物中克隆NHX進行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灒墚a(chǎn)生的明顯效果。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種鹽生植物NaVK反向運輸?shù)鞍准捌渚幋a基因。 本發(fā)明所提供的植物Na7H+反向運輸?shù)鞍?，名稱為DMCNHX，其來源于鹽生植物大 米草，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1) 序列表中的SEQ ID Na: 1;2) 將序列表中SEQ ID Na: 1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取 代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列1由540個氨基酸殘基組成。自序列1的氨基端第84位至 第440位氨基酸殘基是Na7lT反向運輸?shù)鞍椎慕Y(jié)構(gòu)域。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘 基的取代和/或缺失和/或添加。上述植物Na7H+反向運輸?shù)鞍拙幋a基因(zwowao也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述植物Na7H+反向運輸?shù)鞍椎腸DNA基因，可具有下述核苷酸序列之一1) 序列表中SEQ ID Na: 2的DNA序列；2) 編碼序列表中SEQ ID Na: 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3) 在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID Na: 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴謹條件可為在雜交液中60° C雜交，在0.5XSSC， 0. 1% SDS的溶液中 6(TC洗膜。其中，序列表中的SEQ ID Na: 2由1730個脫氧核苷酸組成，自5'第33位至1655 位脫氧核苷酸為編碼序列。含有本發(fā)明基因的表達載體、人工導(dǎo)入細胞系、宿主菌及表達盒均屬于本發(fā)明的 保護范圍。利用現(xiàn)有分子生物學(xué)的方法可以得到含有ZWCM^的表達載體，如pBI121m::dmc nhx (物理圖譜如圖l所示)。所述表達盒包括植物啟動子、ZWCAKT基因和終止子。 所述植物啟動子可為組成型、誘導(dǎo)型或組織特異性啟動子。本發(fā)明的ZWiGWJ基因在構(gòu)建到植物表達載體中時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上 任何一種組成型啟動子、組織特異性啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物 細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記 (GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素，卡那霉素等)。 被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，其中，單子葉植物可 為各種草坪草、小麥、大麥、燕麥、水稻或玉米等，雙子葉植物可為馬鈴薯、煙草、 棉花、萵苣、番茄、甜瓜、黃瓜、豌豆、甜菜或向日葵等。攜帶有ZWOKT基因的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直 接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織， 并將轉(zhuǎn)化的組織培育成植株。實驗表明，本發(fā)明的DMCNHX蛋白及其編碼基因能增強植物對逆境，特別是旱鹽脅 迫的耐性。該基因?qū)V泛用于培育耐逆轉(zhuǎn)基因植物，具有深遠的理論意義及廣泛的實 踐意義。


，圖1為植物轉(zhuǎn)化載體pBI121m的物理圖譜圖2為植物轉(zhuǎn)化載體pBI121m: :dmc nhx的物理圖譜圖3為DMCNHX轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱實驗結(jié)果圖4為DMCNHX轉(zhuǎn)基因煙草的PCR驗證結(jié)果具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。 實施例l、 DMCNHX編碼基因的獲得以液氮研碎-70。C保存的大米草葉片，每O. lg的植物葉片中加入lml TRIZOL RNA 提取液(鼎國生物技術(shù)公司)，并按供應(yīng)商提供的方案進行總RNA的提取。將得到的總RM用DNase酶(Prmega, America)消化，以去除殘存的DNA,以分光光度計(E卯endorf 公司，德國)檢測樣品中總RNA的濃度。取5Hg總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大 連)有限公司)按試劑盒的方法進行反轉(zhuǎn)錄，以得到的cDNA片段為模板進行PCR擴增反 應(yīng)，擴增nhx的cDNA片段。根據(jù)已知的NaVH+反向運輸?shù)鞍妆Ｊ貐^(qū)域設(shè)計兼并引物 NHX-DE-S: 5'-AAGMRAARCARTTYTTCCG和NHX-DE-A: 5'-TCDATRTCNARBGCATCCAT。 25Ml PCR反應(yīng)體系為:0. 1MgcDNA、 1.5mMMgCl2、 20mMTris-HC1 (pH8. 4) 、 50mMKCl、 0. 2mM dNTP混合物、0. 2MM引物NHX-DE-S和0. 2幽引物NHX-DE-A，以及l(fā)U的Taq聚合酶(上海申 能博彩生物技術(shù)公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行 PCR循環(huán)94°C預(yù)變性5分鐘；再94。C 30秒，55°C 30秒，72°C l分，共30個循環(huán)；最 后72'C IO分鐘。將擴增得到的約680bp DNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科 技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，用pGEM-Teasy vector系統(tǒng)(Promega 公司，美國)按試劑盒提供的方案克隆該片段并測序(三博遠志生物技術(shù)公司)，序列 分析表明該序列是化+/[{+質(zhì)子泵反向運輸?shù)鞍谆虻谋Ｊ貐^(qū)片段。根據(jù)該保守區(qū)段設(shè) 計5' RACE和3' RACE的特異性引物，取5ug總RNA進行5' RACE和3， RACE反應(yīng)。RACE 程序按照寶生物工程(大連)有限公司提供的5' RACE和3' RACE試劑盒的說明書進行。 5' RACE反應(yīng)的引物包括磷酸化RT引物TCTCAGAAATGAATGACAAAG; dmc nhx-Sl: 5， -ATGCTTATGGCTTACCTCTCTTACA; dmc nhx-Al: 5'-AAGAAMTCGCCAACATCCAG; dmc nhx-S2: 5, -GAGTGGCATTCTCACCGTGTT和dmc nhx-A2: 5'-GGATATCATTGTCCCAACAGCA， 以磷酸化RT引物進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，連接反應(yīng)后，再以S1和A1為引物進行第一輪擴增， 然后再用稀釋100倍的第一輪PCR產(chǎn)物作模板，以S2和A2為引物進行第二輪PCR擴增。 25rtPCR反應(yīng)體系為0. lMgcDNA、 L5mMMgCl2、 20mMTris-HC1 (pH8. 4) 、 50raMKCl、 0.2mMdNTP混合物、0. 2mM正向及反向引物，以及l(fā)個單位的Pfu酶(上海申能博彩生物 技術(shù)公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)。其 中，第一輪PCR反應(yīng)條件94。C預(yù)變性5分鐘；再94i: 30秒，57°C 30秒，72°C 1分30 秒，共30個循環(huán)；最后72。C IO分鐘。第二輪PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5分鐘；再94 °C 30秒，57°C 30秒，72°C l分30秒，共30個循環(huán)；最后72。C IO分鐘。 3， RACE的引物為dmc nhx-3S: 5'-CTCTTCCTCTATGTCGGTATGG和試劑盒提供的接頭引 物。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5分鐘；再94。C 30秒，55。C 30秒，72°C l分30秒，共30 個循環(huán)；最后72'C IO分鐘。所得5' -RACE和3' -1^0￡產(chǎn)物經(jīng)克隆測序，合成引物，取5^大米草葉片總1^八， 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)按試劑盒的方法反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，克隆nhxl基因的cDNA。合成的引物為dmc tihx-TS: 5' -AGGAAGACGACGACGACAGC 和dmc nhx-TA: 5'-TCAGTAGCAGCCMACTCTTCAC; 25(4 PCR反應(yīng)體系為0. lPg cDNA、1. 5mM MgCl2、 20mM Tri s-HCl (pH8. 4) 、 50mM KC1 、 0. 2mM dNTP混合物、0. 2幽dmc nhx-TS 和0. 2MM dmc nhx-TA，以及1個單位的Pfu酶(上海申能博彩生物技術(shù)公司)。按照 下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)以擴增nhxl基因的 cDNA: 94°C預(yù)變性5分鐘；再94°C 30秒，60°C 30秒，72°C 2分30秒，共30個循 環(huán)；最后72'C IO分鐘。將擴增得到的片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有 限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，插入pBluscriptlIKSM的^boRV位點，該 重組質(zhì)粒被命名為pBS::dmc nhx，測序(三博遠志生物技術(shù)公司)，測序結(jié)果表明該 片段大小為1730bp,具有序列表中序列2的核苷酸序列，名稱為dmcnhx;序列分析表 明該cDNA的第33位至1655位脫氧核苷酸編碼具有序列1的氨基酸殘基序列DMCNHX。 DMCNHX自序列1的氨基端第84位至第440位氨基酸殘基是Na7H+反向運輸?shù)鞍椎慕Y(jié)構(gòu) 域。實施例2、 DMCNHX植物表達載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因煙草的耐逆實驗1. 植物轉(zhuǎn)化載體pBI121(Genebank: AF485783)的改造質(zhì)粒pCAMBIA2300 (Genebank: AF234315)上的35S啟動子(命名為eP35S)片斷經(jīng)&tXI-雙酶切回收后連接到經(jīng)酶切的具有相同互補末端的質(zhì)粒pUC18 (Genbank: L09136)上，然后再經(jīng)&'/7din-JAaI雙酶切回收，連接到pBI121的相同位點，得到 的重組質(zhì)粒被命名為pBI121ml。此外，PBI121原有的gusA基因被5"鵬I-feci雙酶切 平滑化處理后，插入到質(zhì)粒pUC18的5feal位點上，再經(jīng)^邁al-fecl雙酶切回收插入到 pBI121ml的相同位點處，該重組質(zhì)粒被命名為pBI121m (圖1)。2, 大米草dmcnhx基因植物表達載體的構(gòu)建；iTp/ I-5^el雙酶切質(zhì)粒pBS: :dmc nhx_， 回收約1. 8kb的dmcnhx基因片段，插入到具有同樣互補末端的經(jīng)fp"I-Z6al雙酶切的 質(zhì)粒pBI121m上，得到的重組質(zhì)粒命名為pBI121m::dmcnhx， dmcnhx基因受到啟動子 eP35S的控制，終止子為Tnos (圖2)。將pBI121m:: dmc nhx轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404,得 到含有pBI121m::dnicnhx的農(nóng)桿菌菌株，命名為TpBI-nhxl，將質(zhì)粒pBI121m轉(zhuǎn)化根 癌農(nóng)桿菌LBA4404,得到含有pBI121m空載體的菌株，命名為TpBI121m。用無菌刀片 將煙草無菌苗葉片切成四邊長約lcni的葉盤，分別在ODeoo值為1的TpBI-nhxl和 TpBI121m (轉(zhuǎn)空載體對照)菌液中浸泡10分鐘，轉(zhuǎn)接入共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng) 基加6—芐氨基嘌呤1.0mg/L、吲哚乙酸O. lmg/L、蔗糖30g/L, pH5.4),于25。C暗培 養(yǎng)3天，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基加6 —芐氨基嘌呤1. Omg/L、吲哚乙酸0. lmg/L、 羧芐青霉素250mg/L、卡那霉素50mg/L、蔗糖30g/L， p照.8);繼續(xù)培養(yǎng)14天，再轉(zhuǎn) 入再生培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基加6—芐氨基嘌呤1. Omg/L、羧芐青霉素250mg/L、卡那 霉素50mg/L、蔗糖30g/L， pH5.8)。待葉片邊緣長出叢生再生芽至2-3cm時，用解剖 刀將再生芽切下，并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基加卡那霉素50mg/L、蔗糖20g/L，pH5.8。)中培養(yǎng)20天，共得到31棵轉(zhuǎn)pBI121ra::dmc nhx植株和30株轉(zhuǎn)pBI121m植 株。用CTAB法分別提取轉(zhuǎn)pBI121ra: :dmc nhx和pBI121m煙草基因組DNA。分別以500ng 提取的基因組DNA為模板，引物F: 5' -CCCACTATCCTTCGCMGACC和引物R: 5' -TGMGAAGGATATCATTGTCCCMC進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為25Hl,含有500ng基因 組DNA、 1.5mMMgCl2、 20mM Tris-HCl (pH8. 4) 、 50mMKCl、 0. 2mM dNTP混合物、0.2141 引物F和0.2MM引物R、 1U的T叫聚合酶(上海申能博彩生物技術(shù)公司)。按照下列 方案在PCR-熱循環(huán)儀(E卯endorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)先94'C 5分鐘；再 94'C 30秒，58。C 30秒，72°C 1分鐘，共30個循環(huán)；最后72°C 10分鐘。將擴增產(chǎn) 物進行電泳，對轉(zhuǎn)基因植物進行PCR實驗確認。將轉(zhuǎn)pBI121m::dmc nhx煙草和轉(zhuǎn)pBI121m (空載體對照)煙草種植于大田，分別 收種，然后同時播種于蛭石中，一盆蛭石分別成對角播種六棵轉(zhuǎn)基因苗及對照。常規(guī)管 理，待長至8片葉時停止?jié)菜?，三周后?fù)水一次, 一周后觀察轉(zhuǎn)pBI121m煙草全部枯萎， 而轉(zhuǎn)pBI121m::dmcnhx煙草l號和2號植株恢復(fù)生長較為良好，如圖3所示，上角為 轉(zhuǎn)pBI121m::dmc nhx煙草1號植株，下角為轉(zhuǎn)pBI121m: :dmc nhx煙草2號植株，左 右為煙草對照植株。取存活植株的葉片用CTAB法提取其基因組DNA,并用實施例2中 的引物對植株進行PCR反應(yīng)驗證，結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)pBI121m::dmcnhx煙草l號和 2號植株P(guān)CR擴增產(chǎn)物分別在從左到右第3至5和第6泳道上，在預(yù)計的約552bp (箭 頭示)處有清晰的條帶，而轉(zhuǎn)pBI121m (空載體對照)煙草PCR產(chǎn)物在從左至右第2個 泳道上無條帶。取1號和2號植株的種子重復(fù)上述實驗兩遍，均得到相似的結(jié)果。序列表<160> 2〈210> 1 〈211> 540 〈212〉 PRT〈213〉大米草(Spartina anglica) 〈400〉 1MGPGLVAHLVRLGVLSSTSDHASVVSINLFVALLCACIVLGHLLEEN亂NESITALIIG60LCTGAVILLTTNGKSSHVLVFSEDLFFIYLLPPIIFNAGFQVKKKQFFRN FMTIMLFGAV120GTMISFFTISIGAIAIFSRMNLGTLDVGDFLAIGAIFSATDSVCTLQVLN QDETPLLYSL180VFGEG兩DATSVVLFNALQNFDL腿DMVVLKFLGNFCYLFLSSTFLG VFSGLLSAYI240IKKLYIGRHSTDREVA函LMAYLSYMLAELSDLSGILTVFFCGIVMSHY TWHNVTESSR300VTTKHAFATLSFISETFLFLYVGMDALDIEKWKFASDSPGKSIGVSSILL GLVLVGRMF360VFPLSFLSNLTKKADFEKITWRQQIVIWWAGLMRGAVSIALAYNKFTRSG HTQLHGNAIM420ITSTITVVLFSTMVFGMMTKPLIRFLLPASSSTVSSEPSSPKSLHSPLLA SMQGSDLETA■SHSHIIRPSSL亂LSKPTHTVHYYWRKFDMLMRPMFGGRGFVPFYPGS PTEQSVHGGR540<210> 2〈211〉 1730<212〉腿<213>大米草(Spartina anglica)<400〉 2agga卿cgacgacgacagctgtgaggccgccatggggcccggcctggtg gcgcacctgg60tgcgcctgggcgtgctgagctcgacctcagaccacgcctcggtggtctcc atcaacctgt120tcgtcgcgctgctctgcgcctgcatcgtcctcggccacctcctcgaggag肌ccggtggc180tgaacgagtccatcaccgcgctcatcattgggctctgcaccggcgccgtg atcttgctga 240ccaccaacggaaagagctcgcacgtcctcgtcttcagcgeiggacctcttc ttcatctatc300ttctccctcc gatcatattc aatgccggtt atttcatgac aatcatgttg tttggtgctg caattggcgc catogcaata ttcagcagga ttcttgcaat tggagctatc ttttctgcaa atcaggatga aactcccctt ctgtacagcc ccacgtcagt tgtgctcttc aacgcactgc cagttgtact gaaattcttg gggaacttct gagtgttttc tggtttgctc agtgcttata ccactgatcg cgaggttgct cttatgatgc agctatcaga tttgagtggc attctcaccg acacttggca taatgtgaca gagagctcaa tgtcattcat ttctgagaca tttctcttcc 肌aagtggaa gtttgccagt gacagccctg taggattggt tctegtggga agagctgctt tgacaaaaaa ggcagatttc g肌aaaat肌 ctggact肌t g,ggggct gtgtcgattg gacacactca gcttcacggc aatgcgataa ttagcactat ggtgtttggg atgatgacga caagcagcac agtctcctcc gagccgtctt cgagcatgca gggttctgac ctcgagacgg gcctccgcat gctcctcagcgccgaccc acgatgcgct gatgcggcct atgtttggcg cgcccactga gcagagtgtc catggaggac aacacgaaga gaagacatat ttttcgtgtgttcaggtgaagaagaagcaattcttccgga360ttgggacaatgatatccttcttcaccatat420tgaaccttgggacgctggatgttggcgatt480cagattctgtctgcacattgcaggtcctca540ttgtgtttggtgaaggagtt gtgtgatg600agaactttgatcttaact atcgatgcag660gctatttatttttgtcaagcaccttccttg720taatcaagaaattatatataggaaggcatt780ttatggcttacctctcttacatgctggctg840tgttcttctgtggcatcgtgatgtcacatt900gagttacaaccaagcatgcttttgcaactt960tctatgtcgg tatggatgca ctagatatcg 1020 gaaagtccat tggagtaagc tcaattttgc 1080 ttgttttccc tctgtcgttc ctgtctaact 1140 cctggagaca acaaattgta atatggtggg 1200 cgcttgctta caataagttc acaagatctg 1260 tgataaccag cacaatcact gtagttctat 1320 agccattaat ccggttcctg cttccagcgt 1380 ctcccaagtc tctgcactct cctctcctcg 1440 cctcacattc gcatattatc aggccctcca 1500 acaccgtcca ctactactgg cgcaaatttg 1560 ggcgtgggtt cgtgcccttc taccctggat 1620 ggtgaacatt gagaagaaaa ccaagggtta 1680 aagagtttgg ctgctectga 1730
權(quán)利要求
1、一種植物Na+/H+反向運輸?shù)鞍?，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白質(zhì)具有序列表中的SEQ ID Na: 1的氨基酸殘基序列。
3、 權(quán)利要求1或2所述的植物Na7H+反向運輸?shù)鞍椎木幋a基因。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于:所述植物Na7iT反向運輸?shù)鞍椎腸DNA 基因，具有下述核苷酸序列之一1) 序列表中SEQ ID Ns: 2的DNA序列；2) 編碼序列表中SEQ ID 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3) 在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID Na: 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5、 含有權(quán)利要求3或4所述基因的表達載體。
6、 含有權(quán)利要求3或4所述基因的人工導(dǎo)入細胞系。
7、 含有權(quán)利要求3或4所述基因的宿主菌。
8、 含有權(quán)利要求3或4所述基因的表達盒。
9、 權(quán)利要求1或2所述的植物NaYH+反向運輸?shù)鞍准捌渚幋a基因在培育耐逆性植 物中的應(yīng)用。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述耐逆性為耐旱性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物耐逆性相關(guān)Na⁺/H⁺反向運輸?shù)鞍准捌渚幋a基因與應(yīng)用。該蛋白是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №1；2)將序列表中SEQ ID №1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因能增強植物對逆境的耐性。
文檔編號C12N15/29GK101235082SQ20071017911
公開日2008年8月6日 申請日期2007年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月11日
發(fā)明者茜 吳, 徐健勇, 蕾 陳 申請人:北京北方杰士生物科技有限責(zé)任公司