專利名稱：一種發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種3-羥基丙酸的生產(chǎn)方法，具體地說涉及一種采用鈹褶 假絲酵母(Candidamgosa)進行發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法。
背景技術：
3-羥基丙酸(3-hydroxpropionic acid，簡稱3-HP，下同)是一個三碳 無手性有機酸，與乳酸互為同分異構體，具有羥基和羧基兩種官能團。3-羥基丙酸無色、無味、油狀，可與水、醇、醚等多種有機溶劑互溶，廣泛 應用于涂料、膠粘劑、水處理化學品和個人護理用品的生產(chǎn)；同時，3-羥 基丙酸是近年來興起的一種重要的化學中間體，它脫水生成丙烯酸、氧化 生成丙二酸、與醇酯化作用生成酯、還原生成l,3-丙二醇等。
目前，3-羥基丙酸的制備法主要依靠化學法。通過將鄰鹵代醇與氰化 鉀作用生成的3-羥基丙腈水解或Reformat sky反應可制備3-羥基丙酸。丙烯 酸催化水解也可得到3-羥基丙酸，這是市場上3-羥基丙酸的主要來源。由 于丙烯酸和丙烯腈易燃，且工藝需高溫，故安全性較低、對設備要求高。 受丙烯酸的原料來源限制，該法生產(chǎn)的3-羥基丙酸已遠不能滿足市場需求。 同時，3-羥基丙酸傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝還存在能耗高、污染大、副產(chǎn)物多、分離 困難等缺點，這在很大程度上限制了該技術的進一步發(fā)展。
生物轉化法制備3-羥基丙酸已有一定的研究。1968年Harada和 Hirabayashi研究Hansenula miso對醇的利用時發(fā)現(xiàn)該菌株可氧化l,3-丙二醇 得到3-羥基丙酸。1974年Miyoshi和Harada在石開究fY^an'wm men'smo/a^對 1，4-丁二醇利用過程中，發(fā)現(xiàn)該菌可利用丙酸羥基化生產(chǎn)3-羥基丙酸。1982 年，Hasegawa等發(fā)現(xiàn)一株不積累丙酸，而能以丙酸為底物生產(chǎn)3-羥基丙酸 的突變株，丙酸轉化率達89%。 1994年Takamizawa等利用微生物轉化丙烯 酸生產(chǎn)3-羥基丙酸，其底物原料還可以為丙醇、丙酸、丙醛、丙烯酸、1 ，3-丙二醇等。但是這些過程的生產(chǎn)周期長，產(chǎn)物得率較低，制約了生物轉化
3生產(chǎn)3-羥基丙酸的產(chǎn)業(yè)化進程，應用前景有限。
近年來，日本專利和美國專利分別描述了構建基因工程菌以甘油或葡 萄糖為底物直接發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸的生物轉化路線。但這些過程需要修
改大量基因，難度很大，尚未見產(chǎn)業(yè)化報道。Suthers等在1999年把來自肺 炎克雷伯氏菌甘油脫水酶基因和來自酵母的醛脫氫酶基因克隆到大腸桿 菌，構建了由甘油生產(chǎn)3-羥基丙酸的大腸桿菌工程菌。但該工程菌產(chǎn)量較 低，達不到工業(yè)生產(chǎn)的要求。后來日本學者對此進行了改進，以二醇脫水 酶替代甘油脫水酶，以丙烯醛脫氫酶、磷酸轉乙酰酶和丙酸激酶替代醛脫 氫酶，從而解決了舊合成途徑產(chǎn)量低的瓶頸，使3-羥基丙酸產(chǎn)率提高到 40%，但迄今為止仍然未見產(chǎn)業(yè)化報道。Cargill公司在專利中設計了3條從 葡萄糖經(jīng)丙酮酸發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸的途徑，包括乳酸途徑、乙酰輔酶A 途徑和13-丙氨酸途徑，且實驗室實驗證明這些過程的可行性，但目標基因 在細胞內穩(wěn)定性、酶的表達水平及活性、宿主細胞對的耐受性以及產(chǎn)物的 輸出和收集等都成為其實際應用中的挑戰(zhàn)。因此，本領域需要一種優(yōu)化的 培養(yǎng)基以及調控方法，并對發(fā)酵過程進行調控，以提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸的效率。

發(fā)明內容
針對現(xiàn)有3-羥基丙酸生物制備方法的不足，本發(fā)明的目的在于提供一 種皺褶假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法，其步驟 如下
A) 采用常規(guī)的方法培養(yǎng)皺褶假絲酵母
B) 將步驟A的皺褶假絲酵母種子液以培養(yǎng)基體積4-7%的接種量接 種，攪拌，pH控制在5.3±0.2，在25-40。C下發(fā)酵培養(yǎng)10-20小時；培養(yǎng)
基的組分和重量含量為
蔗糖1隱12%、酵母粉0.1-0.5%、蛋白胨0.5-2.0%、丙酸鈉0-0.5%、硫 酸鎂0.01-0.1%、磷酸二氫鉀0.01-0.1%、硫酸鐵0.001-0.004%;
C) 加入丙酸鈉，其加入量為培養(yǎng)基重量的0.1-1.0%， pH控制在 4.7±0.2，在25-40。C下發(fā)酵培養(yǎng)15-30小時；D)將pH控制在4.2士0.2，在25-40。C下發(fā)酵培養(yǎng)20-40小時，得到
含有3-羥基丙酸的發(fā)酵培養(yǎng)液。
所述的方法，其中，步驟B中的攪拌速度控制為200-300 rpm。
所述的方法，其中，以NaOH或HCl溶液調節(jié)pH值。
所述的方法，其中，步驟D中通過補充蔗糖水溶液使發(fā)酵培養(yǎng)液中的
蔗糖濃度維持在4-10 gL—1。
所述的方法，其中，步驟D的發(fā)酵培養(yǎng)液中，菌體比生長速率小于
0.05時補充氨基酸粉水溶液，至菌體細胞密度大于25。
本發(fā)明公開的利用活細胞進行發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法，具有以下
特點
(1) 菌株要求的培養(yǎng)基簡單，生長周期短，成本低。
(2) 能將蔗糖直接發(fā)酵生成3-羥基丙酸，底物成本低，轉化率高。
(3) 采用單因子實驗、正交實驗、響應面分析實驗相結合的靜態(tài)優(yōu)化 方法，優(yōu)化了培養(yǎng)基，并首次發(fā)現(xiàn)丙酸能夠促進細胞生長，縮短了發(fā)酵周 期，提高3-羥基丙酸的發(fā)酵產(chǎn)量。
(4) 采用了不同發(fā)酵階段調控不同的pH值來生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法。 通過分階段控制pH值，使第一階段，以菌體生長為主；第二階段，以菌 體生長和產(chǎn)物生成相結合的生產(chǎn)模式；第三階段，以產(chǎn)物生成為主。通過 分階段調控，優(yōu)化菌體生長與代謝的平衡，使得3-羥基丙酸產(chǎn)量得到大幅 度提高。
(5) 采用了產(chǎn)物促進因子一丙酸鈉來提高3-羥基丙酸產(chǎn)量。通過在第二 階段補充丙酸鈉，可以加速丙酸的代謝，大幅提高3-羥基丙酸的產(chǎn)量。
類似本發(fā)明利用皺褶假絲酵母(Candida mgosa)進行發(fā)酵制備3-羥基 丙酸的方法，至今未見有報道。
具體實施例方式
本發(fā)明提出了采用皺褶假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸，其中培養(yǎng)基成 分是影響3-羥基丙酸發(fā)酵水平的一個關鍵因素。同時，由于3-羥基丙酸發(fā) 酵屬于異型產(chǎn)酸發(fā)酵過程，發(fā)酵過程中伴隨著有害副產(chǎn)物的形成，如乙酸、 乙醇以及其它有機酸等，且這些有害副產(chǎn)物通常導致pH的劇烈下降。過
5低的PH會抑制細胞的生長和細胞的生理代謝過程。這就要求針對細胞的 生理代謝特性，對發(fā)酵液的pH值進行有效控制。通常，細胞的最適生長 條件并不是細胞最佳的產(chǎn)物生產(chǎn)條件，在發(fā)酵初期實現(xiàn)細胞的最佳生長， 并通過pH調控，在細胞濃度達到一定水平后，逐步過渡到細胞產(chǎn)物生產(chǎn)
的最適pH范圍，從而實現(xiàn)最佳的過程效率。
本發(fā)明的技術方案其構思如下
通過靜態(tài)優(yōu)化，選擇合適的培養(yǎng)基，從而促進細胞生長與糖耗速度， 縮短了發(fā)酵周期，提高3-羥基丙酸的產(chǎn)量。
在發(fā)酵時期的不同階段，以細胞生長密度為控制點，調控合適的pH
值來平衡菌體的生長與代謝，使底物主要朝產(chǎn)物生成途徑轉化。
本發(fā)明的方法包括如下步驟
(1) 采用常規(guī)的方法培養(yǎng)皺褶假絲酵母(Candidarugosa)，優(yōu)選的培 養(yǎng)時間為20-30小時，培養(yǎng)溫度為25-40°C，培養(yǎng)皺褶假絲酵母的培養(yǎng)基 組分主要包括碳源、氮源、磷源和無機鹽，優(yōu)選的組分和重量含量包括
葡萄糖1-10%;酵母粉0.2-1%;蛋白胨0.2-2%;硫酸銨0-2%;磷酸
二氫鉀0.05-0.5%;硫酸鎂0.04-0.1%以及硫酸鐵0.001-0.004%。
本發(fā)明所選用的皺褶假絲酵母(Candidamgosa)是由中國工業(yè)微生物 菌種保藏管理中心提供的，編號為皺褶假絲酵母CICC 31280;
(2) 將步驟(l)培養(yǎng)的鈹褶假絲酵母種子液基于發(fā)酵培養(yǎng)基體積4-7% (體積比)的接種量接種于培養(yǎng)基中，攪拌，pH控制在5.3±0.2，在25-40°C
下發(fā)酵培養(yǎng)10-20小時，OD600值為6-10之間；
發(fā)酵培養(yǎng)基的組分和重量含量為
蔗糖1-12%、酵母粉0.1-0.5%、蛋白胨0.5-2.0%、丙酸鈉0-0.5%、磷 酸二氫鉀(KH2P04 ) 0.01-0.1%、硫酸鎂0.01-0.1%、硫酸鐵0.001-0.004%
以及余量的水；
優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基為蔗糖5%、酵母粉0.5%、蛋白胨1.2%、丙酸鈉 0.4%、硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鐵0.002%。
發(fā)酵液pH值可以通過流加酸或堿進行以控制，流加蔗糖水溶液 (10-40wt。/。)補料使培養(yǎng)基中的蔗糖濃度控制在4-10gL";當菌體比生長速 率小于0.05 h—'時，補入氨基酸粉水溶液(10-30wt。/。)，流速為l-lOgh"m-3培養(yǎng)基，當OD 600大于25時停止補加。
進一步將發(fā)酵液pH值控制在4.7±0.2，在25-40°C下發(fā)酵培養(yǎng)15-30 小時，OD600值為25-30之間；最后，將發(fā)酵培養(yǎng)液pH值控制在4.2±0.2， 發(fā)酵20-40小時，即獲得含有3-羥基丙酸的發(fā)酵培養(yǎng)液，3-羥基丙酸產(chǎn)量 達到28 g L"以上，轉化率達到0.32 g g"蔗糖以上，生產(chǎn)能力大于0.54 g L" h—、發(fā)酵液pH值可以通過流加酸或堿加以調節(jié)，同時流加蔗糖水溶液 (10-30wt。/。)使培養(yǎng)基中的蔗糖的濃度維持在4-10gL";此過程中無需補充 氨基酸水溶液。
"OD600"規(guī)范的技術名稱是菌體細胞密度，指的是由于微生物生長引 起的培養(yǎng)物混濁度的增高。因此，通過紫外分光光度計測定在600 nm波 長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況，在微生物學中有詳細的定義。
本發(fā)明采用的發(fā)酵培養(yǎng)基是將正交試驗和《實驗設計與分析》書中公 開的響應面設計方法相結合后所篩選的，包括如下步驟
首先采用單因素試驗，考察碳源、丙酸對3-羥基丙酸發(fā)酵水平的影響， 然后根據(jù)正交試驗，篩選出影響發(fā)酵水平的三個關鍵因素丙酸、pH和 酵母粉，最后采用響應面設計的方法，優(yōu)化得到丙酸和酵母粉在培養(yǎng)基中 的最適濃度以及最適發(fā)酵pH。
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)丙酸能促進細胞代謝，縮短發(fā)酵周期，提高3-羥基丙 酸的發(fā)酵產(chǎn)量。
本發(fā)明中的所選皺褶假絲酵母(Candidamgosa)是由中國工業(yè)微生物 菌種保藏管理中心提供的，編號為皺褶假絲酵母CICC 31280;
酵母粉為上海國安化學試劑有限公司提供產(chǎn)品，蔗糖為玉棠牌食用 糖，其它試劑為國產(chǎn)分析純試劑。
下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的說明，其目的是為了更好地理解 本發(fā)明的內容，因此，所列舉的實施例并不限制本發(fā)明的保護范圍。
實施例1
以下均為重量百分比。
將酵母粉0.5。/。、蛋白胨1.2%、丙酸鈉0.4%、磷酸二氫鉀0.05%、硫 酸鎂0.05%加750ml水溶解，用5mol/L的NaOH溶液或3 mol/L的鹽酸 溶液調pH5.70后，滅菌。
7稱取培養(yǎng)基總量0.003%的七水硫酸鐵加40ml水溶解，加4 ml濃度為 1/5 (v/v)的鹽酸助溶，使溶液較澄清，用無菌過濾膜過濾后，與滅菌的 上述溶液無菌條件下混合。
將滅好菌的蔗糖與上述已冷卻好的培養(yǎng)基混合，獲得濃度為5%的蔗 糖，即獲得發(fā)酵培養(yǎng)基。
實施例2
(1) 皺褶假絲酵母的種子培養(yǎng)
培養(yǎng)時間為20小時，培養(yǎng)溫度為30。C，種子培養(yǎng)基的組分和重量含
葡萄糖2%、酵母粉0.4%、蛋白胨1.5%、磷酸氫二鉀0.06%、硫酸鎂 0.05%、硫酸鐵0.002%。以NaOH或HCl溶液調pH5.5。
(2) 發(fā)酵培養(yǎng)
初始發(fā)酵培養(yǎng)基體積1.8 L，采用的初始培養(yǎng)基組成如下 蔗糖5%、酵母粉0.5%、蛋白胨1.2%、丙酸鈉0.4%、磷酸二氫鉀0.05%、 硫酸鎂0.05%、硫酸鐵0.002%。以NaOH或HCl溶液調pH5.5。
補料液各成分濃度為 補料l:蔗糖水溶液40wt7。；
補料2:工業(yè)氨基酸粉水溶液10wt。/c)(在第二階段補加)
以體積比5。/。的接種量接入皺褶假絲酵母種子液，30。C培養(yǎng)15小時左 右至OD600大于10，此階段發(fā)酵液pH值控制在5.3±0.2。
然后一次性補加產(chǎn)物促進因子-丙酸，補加量為4 g L—4咅養(yǎng)基。發(fā)酵 過程中通過酸、堿流加將發(fā)酵液pH值控制在4.7士0.2。同時在此階段補加 蔗糖，將蔗糖濃度控制在4-10gL"。此階段培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)15小 時至OD600大于25;當菌體比生長速率小于0.05時補入氨基酸粉水溶液。
最后進入調控后期，培養(yǎng)溫度為30。C。用上述同樣的手段將pH值控 制在4.2±0.2左右。將蔗糖控制在4-10 g L"，此階段培養(yǎng)20小時，至OD600 達到30左右結束發(fā)酵。
本發(fā)明使得3-羥基丙酸產(chǎn)量達到28§1/1，轉化率達0.32gg—1蔗糖， 生產(chǎn)能力為0.54 gL"h—1。
實施例3使用原始培養(yǎng)基培養(yǎng)皺褶假絲酵母生產(chǎn)3-羥基丙酸
培養(yǎng)基組分葡萄糖5%、酵母粉0.4%、蛋白胨1.2%、磷酸氫二鉀
0.05%、硫酸鎂0.05%、硫酸鐵0.005%。滅菌前調pH5.5。
以體積比5。/。的接種量接入皺褶假絲酵母種子液，30。C搖床300 rpm
培養(yǎng)，用NaOH和硫酸流加控制培養(yǎng)液pH值為5.3士2.0， 50小時糖耗完，
測得3-羥基丙酸產(chǎn)量為6gL—'。 實施例4
使用不加丙酸的培養(yǎng)基，培養(yǎng)鈹褶假絲酵母生產(chǎn)3-羥基丙酸。
培養(yǎng)基組分:蔗糖5%、酵母粉0.5%、蛋白胨1.2%、磷酸二氫鉀0.05%、 硫酸鎂0.05%、硫酸鐵0.002%。以NaOH或HCl溶液調pH5.5。
以體積比5%的接種量接入皺褶假絲酵母種子液，30°C、200 rpm培養(yǎng)， 用NaOH和硫酸控制培養(yǎng)過程pH值為5.3±0.2， 48小時糖耗完，測得3-羥基丙酸產(chǎn)量為9g/L。
實施例5
采用傳統(tǒng)發(fā)酵補料方法，目的是與實施例2進行對比，從而看出本發(fā) 明所說的pH分階段調控策略的優(yōu)點。
初始發(fā)酵體積1.8L，采用的初始培養(yǎng)基組成如下
蔗糖5%、酵母粉0.5%、蛋白胨1.2%、丙酸鈉0.4%、磷酸二氫鉀 0.05%、硫酸鎂0.05%、硫酸鐵0.002%。以NaOH或HCl溶液調pH5.5。
補料液各成分濃度為
補料1蔗糖水溶液40 wt%;
補料2工業(yè)氨基酸粉水溶液10wt% (在第二階段補加)。
首先，以體積比5%的接種量接入皺褶假絲酵母種子液，30。C培養(yǎng)20 小時至OD600大于10。
然后進行蔗糖補料(補料1)，控制發(fā)酵液中蔗糖濃度在4-10 g L—1之 間。工業(yè)氨基酸粉在整個補料過程中采用恒速補料(補料液2)，補料速率 為10mlh-、補IO小時左右。
整個發(fā)酵過程pH控制為5.3±0.2，發(fā)酵完畢后3-羥基丙酸產(chǎn)量為12
g/L。
9實施例6
采用本發(fā)明的pH分段調控，但在發(fā)酵第二階段沒有一次性添加丙酸，
目的是與實施例2進行對比，從而看出本發(fā)明所說的中期添加丙酸的重要 性。
初始發(fā)酵體積1.8L，采用的初始培養(yǎng)基組成如下
蔗糖5%、酵母粉0.5%、蛋白胨1.2%、丙酸鈉0.4%、磷酸二氫鉀 0.05%、硫酸鎂0.05%、硫酸鐵0.02%。以NaOH或HCl溶液調pH5.5。 補料液各成分濃度為 補料1蔗糖水溶液40 wt%;
補料2工業(yè)氨基酸粉水溶液10wt% (在第二階段補加)。
首先，以體積比5%的接種量接入皺褶假絲酵母種子液，30。C培養(yǎng)15 小時至OD600大于10。此階段pH值控制在5.3i0.2;然后通過控制酸堿 添加將pH控制在4.7士0.2，培養(yǎng)20小時左右，至OD600大于25;當菌體 比生長速率小于0.05時補入氨基酸粉水溶液。
最后進入調控后期，培養(yǎng)溫度為30。C。用上述同樣的手段將pH值控 制在4.2士0.2左右。將蔗糖控制在4-10 g L"，此階段培養(yǎng)25小時，至OD600 達到30左右結束發(fā)酵。
本發(fā)明使得3-羥基丙酸產(chǎn)量達到17gU1，轉化率為0.16gg'1蔗糖， 生產(chǎn)能力為0.27§1/、'。
權利要求
1、一種皺褶假絲酵母發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法，其步驟如下A)采用常規(guī)的方法培養(yǎng)皺褶假絲酵母B)將步驟A的皺褶假絲酵母種子液以培養(yǎng)基體積4-7％的接種量接種，攪拌，pH控制在5.3±0.2，在25-40℃下發(fā)酵培養(yǎng)10-20小時；培養(yǎng)基的組分和重量含量為蔗糖1-12％、酵母粉0.1-0.5％、蛋白胨0.5-2.0％、丙酸鈉0-0.5％、硫酸鎂0.01-0.1％、磷酸二氫鉀0.01-0.1％、硫酸鐵0.001-0.004％；C)加入丙酸鈉，其加入量為培養(yǎng)基重量的0.1-1.0％，pH控制在4.7±0.2，在25-40℃下發(fā)酵培養(yǎng)15-30小時；D)將pH控制在4. 2±0.2，在25-40℃下發(fā)酵培養(yǎng)20-40小時，得到含有3-羥基丙酸的發(fā)酵培養(yǎng)液。
2、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，步驟B中的攪拌速度控制為 200-300 rpm。
3、 根據(jù)權利要求l所述的方法，其中，以NaOH或HC1溶液調節(jié)pH值。
4、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，步驟D中通過補充蔗糖水溶 液使發(fā)酵培養(yǎng)液中的蔗糖濃度維持在4-10 g L"。
5、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，步驟D的發(fā)酵培養(yǎng)液中，菌 體比生長速率小于0.05時補充氨基酸粉水溶液，至菌體細胞密度大于25。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸的方法。將皺褶假絲酵母種子液接種在培養(yǎng)基中、攪拌，pH控制在5.3±0.2；然后補入產(chǎn)物促進因子，補充蔗糖水溶液和氨基酸水溶液，pH控制在4.7±0.2；最后補入蔗糖水溶液，并將pH控制在4.2±0.2，發(fā)酵培養(yǎng)，即獲得含有3-羥基丙酸的發(fā)酵培養(yǎng)液。本發(fā)明的方法采用單因子實驗、正交實驗、響應面實驗相結合的靜態(tài)優(yōu)化方法，優(yōu)化了培養(yǎng)基，并采用pH分階段調控來優(yōu)化3-羥基丙酸的生產(chǎn)，使得3-羥基丙酸的產(chǎn)量得到大幅度提高，達到28g L^-1以上，轉化率達0.32g g^-1蔗糖，生產(chǎn)能力為0.54g L^-1h^-1，具有工業(yè)化推廣應用的前景。
文檔編號C12P7/40GK101457239SQ20071017941
公開日2009年6月17日 申請日期2007年12月12日 優(yōu)先權日2007年12月12日
發(fā)明者寅 劉, 朱建航, 辜旭輝 申請人:青島生物能源與過程研究所