專(zhuān)利名稱(chēng)：二粒小麥lrr-受體蛋白激酶基因、該基因的克隆方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種全長(zhǎng)cDNA的分離、克隆及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白激酶家族是酶中的大家族，參與信號(hào)傳導(dǎo)途徑并在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能中起重要作用，其 中很多成員介導(dǎo)真核細(xì)胞對(duì)外界刺激的應(yīng)答反應(yīng)。類(lèi)受體蛋白激酶(rec印tor-like protein kinases, RLKs)屬于蛋白激酶的一個(gè)亞家族，其結(jié)構(gòu)包含胞外結(jié)構(gòu)域(extracellular domain)、單次跨膜域(signle-pass transmembran domain)禾口胞內(nèi)激酶域(cytoplasmic protein kinase domain),它們通過(guò)胞外結(jié)構(gòu)域與胞外信號(hào)分子，如離子、小分子或多肽等 的特異結(jié)合來(lái)激活胞內(nèi)激酶域的自磷酸化和互磷酸化活性，完成跨膜傳遞信號(hào)的功能。因?yàn)?這類(lèi)蛋白激酶的分子結(jié)構(gòu)和功能酷似動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的受體蛋白激酶(rec印tor protein kinase, RPK) (Hanks等1988; Yarden和Ullrich 1988; Ullrich和Schlessinger 1990)，但對(duì)其中的 絕大多數(shù)尚未鑒定出其配基，故稱(chēng)之為類(lèi)受體蛋白激酶(Stone和Walker 1995)。依胞外結(jié)構(gòu) 域的類(lèi)型，RLK可分為S-結(jié)構(gòu)域(S-domain)型、類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子(印idermal growth factor-like)型、類(lèi)腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor rec印torlike)型、富含亮 氨酸重復(fù)序列(leucine-richr印eat，LRR)型。目前，在植物中已鑒定的類(lèi)受體激酶絕大多數(shù) 屬于LRR型。
在小麥(7>i"ciMses"n//s)高分子量麥谷蛋白基因位點(diǎn)附近有一個(gè)編碼LRR-類(lèi)受體 蛋白激酶的基因位點(diǎn)(標(biāo)記為化Za)，編碼蛋白與水稻(6!r;^3幼"ra)抗病蛋白Xa21類(lèi)似。 通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR途徑，從二粒小麥(rri"c腿^/r&o^ )的7aJa同源位點(diǎn)分離了 3個(gè)cDNA 克隆，ZS860 (GenBank査詢號(hào):EF394367), ZS2000 (GenBank査詢號(hào):EF394368)和ZS2001 (GenBank査詢號(hào)EF394369)。 一個(gè)完整的TaXa蛋白包括N-端保守區(qū)、LRR結(jié)構(gòu)域、 一個(gè) 跨膜區(qū)和位于c-端的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶功能域。在基因進(jìn)化過(guò)程中，由于堿基代換、 缺失和插入導(dǎo)致了開(kāi)放讀碼框的改變，使該位點(diǎn)基因的編碼多肽縮短。rafe位點(diǎn)的祖先基因 可能編碼1 028個(gè)氨基酸組成的多肽，但到目前為止，還未見(jiàn)從普通小麥中分離到編碼約1 028 個(gè)氨基酸的完整、全長(zhǎng)基因cDNA克隆的報(bào)告，限制了對(duì)這一同源位點(diǎn)基因功能的進(jìn)一步研究。 本發(fā)明成功分離到l個(gè)&Ja位點(diǎn)基因的全長(zhǎng)cDNA克隆，編碼l 026個(gè)氨基酸組成的多肽， 構(gòu)建了植物表達(dá)載體，這些將推動(dòng)小麥屬7sZ3基因功能的研究和利用
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
本發(fā)明成功分離到1個(gè)ra化位點(diǎn)基因的全長(zhǎng)cDNA克隆，編碼1 026個(gè)氨基酸組成的 多肽，構(gòu)建了植物表達(dá)載體，將推動(dòng)小麥屬rafe基因功能的研究和利用。 本發(fā)明的技術(shù)方案是
一種二粒小麥LRR-受體蛋白激酶基因，其特征是WZ做-5T基茵游全長(zhǎng)cZ 廁,身，其 核苷酸序列的堿基組成 '<formula>formula see original document page 4</formula>
^^^游r"必 -5TT基因編碼的蛋白，其氨基酸序列為1026 Aa<formula>formula see original document page 4</formula>
所述的7^y 7 -S7基因所編碼蛋白的特點(diǎn)該基因編碼富亮氨酸區(qū)-絲氨酸/蘇氨酸受體蛋 白激酶(LRR-S/T rec印tor protein kinase)。這個(gè)受體蛋白激酶包括N-端保守序列、富亮氨酸結(jié)構(gòu)域(LRR)、中部跨膜結(jié)構(gòu)域和C-端蛋白激酶結(jié)構(gòu)域等幾個(gè)部分。其結(jié)構(gòu)與已經(jīng)克隆 的水稻(ftT幼ssn'ra)抗白葉枯病蛋白Xa21類(lèi)似(Song等1995; GanBank査詢號(hào)U72728) 和大麥(AbiVe〃歷raJgare)的一個(gè)受體激酶(GanBank查詢號(hào)油| AAP31049. 11 )編碼蛋白
高度相似。
TtLRR-STK (TtLRR)與大麥LRR-受體蛋白激酶(Hvprk， GanBank查詢號(hào)gb|AAP31049. 11 ) 的氨基酸序列比較結(jié)果如圖3所示。
TtLRR-STK (TtLRR)與大麥LRR-受體蛋白激酶的氨基酸序列比較圖4所示。 所述r^y^-^7基因的克隆方法，包括以下步驟
(1) r"Ay -57F基因是從對(duì)小麥病害抗性程度高的二粒小麥中分離的。以二粒小麥的葉 片為材料提取總RNA (核糖核酸)，再進(jìn)一步分離mRNA (信使核糖核酸)，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄將mRNA 轉(zhuǎn)錄為cDNA (互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸)，用該cDNA為模板進(jìn)行基因克隆。
(2) 根據(jù)與植物抗病相關(guān)的LRR-類(lèi)受體蛋白激酶基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)兼并性引物(序 列 為 5' - GTATTG(A/G)TTTTCTTTGCCTGG(A/C)C-3' ; 5' -CAAGC(A/C)GT(A/C)CGTCCAATC(T/A)AT-3')，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)技術(shù)從二粒小 麥cDNA中獲得編碼序列長(zhǎng)度為3081 bp的cDNA片段，克隆于pUC18-T載體上，測(cè)序后通過(guò) 序列分析證明這個(gè)cDNA克隆編碼富亮氨酸區(qū)-絲氨酸/蘇^酸受體蛋白激酶(LRR-Serine/Threonine receptor protein kinase)。在GenBank中進(jìn)斗亍相1以'性査i旬比較，i正明為 新的二粒小麥基因，暫命名為7M7 ASS7J基因。
具體克隆技術(shù)為
cDNA的合成用TRIzor試劑提取葉片總RNA。用Poly (A) Tract* mRNA分離系統(tǒng)III分 離出mRNA。用SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒合成cDNA。
反轉(zhuǎn)錄PCR:用高保真DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)橄仍?4 ° C變性2分鐘； 接30個(gè)循環(huán)的94 ° C變性30秒，55 ° C退火30秒，72 ° C延伸3分鐘；最后在72 ° C
延伸7分鐘。
產(chǎn)物回收和測(cè)序分析擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳分離。將含有目的DNA片段的 瓊脂糖凝膠切割下來(lái)，用液氮反復(fù)凍融回收，等體積氯仿抽提純化，2倍體積的酒精沉淀。 回收的DNA片段用超純水溶解后，用T4-DNA連接酶將其與pUC18-T載體連接，4° C連接過(guò) 夜。用CaCl2熱擊法，在42° C熱擊90秒，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B菌株中。用質(zhì) 粒小量提取法提取質(zhì)粒DNA。在大連寶生物公司用ABI377自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BLASTt 和BLASTp計(jì)算機(jī)輔助程序(Altschul等1997)在美國(guó)國(guó)家生物信息中心網(wǎng)站NCBI (http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov)和相關(guān)的連網(wǎng)站點(diǎn)進(jìn)行同源序列査詢比較。在NCBI網(wǎng)站用 Marchler-Bauer等(2003)的方法進(jìn)行保守功能域數(shù)據(jù)分析。
所述的基因5T在小麥抗白粉病中的應(yīng)用。
所述的基因r^y y -5T在轉(zhuǎn)基因抗病育種中的應(yīng)用。
所述的基因f"^ -5T在轉(zhuǎn)基因抗病育種中的應(yīng)用。
所述的基因7YZ^ -5T在設(shè)計(jì)合成新抗病相關(guān)基因中的應(yīng)用。
所述基因r"vW-5T在基因芯片制作研究中的應(yīng)用，
本發(fā)明的有益效果
l.本發(fā)明的基因7YZ必 -5T^議遂/滯基因抗病育種。該基因可以插入到不同類(lèi)型的啟動(dòng) 子下游，構(gòu)建成植物表達(dá)載體，通過(guò)基因工程技術(shù)進(jìn)行植物抗病改良。啟動(dòng)子可以是組成型 表達(dá)的啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒35S的啟動(dòng)子、玉米泛素啟動(dòng)子Ubi等。連接在組成型表 達(dá)啟動(dòng)子下游的基因?qū)⒃谵D(zhuǎn)基因植物的任何組織和任何發(fā)育時(shí)期表達(dá)。啟動(dòng)子也可以是病原 菌誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子、或組織特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。連接在這些啟動(dòng)子下的基因僅在病原菌 存在時(shí)、或在特定組織中表達(dá)，使該基因的表達(dá)受到更精確的控制。 .2.本發(fā)明的基因K^y -5T^議設(shè)計(jì)合成新抗病相關(guān)基因。植物L(fēng)RR-蛋白激酶類(lèi)多肽的羧基端絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶功能域高度保守，而胞外的LRR區(qū)在基因間差異很大，它決定 抗病基因作用對(duì)象的分子特異性(Kobe和Deisenhofer 1994)，這個(gè)區(qū)域的改變可以改變基 因的作用對(duì)象，因此，氨基端的LRR結(jié)構(gòu)變化決定LRR-類(lèi)蛋白激酶與其他蛋白的互作特異性。 通過(guò)定點(diǎn)突變、或基因序列重組等技術(shù)，可以人工合成很多具有新的特性的基因，通過(guò)基因 工程技術(shù)應(yīng)用于植物抗病改良中。
3.本發(fā)明的基因n^KS5T^"以基因芯片制作?？蓪⒃摶虻目寺∮糜谛←溁蛐酒?作，應(yīng)用于小麥抗病等研究中。根據(jù)7^ypy -57F基因cDNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，在含本基因的 克隆中擴(kuò)增rt^W-S7J基因的全長(zhǎng)cDNA，或擴(kuò)增編碼N-端結(jié)構(gòu)域的基因特異性強(qiáng)的區(qū)段，進(jìn) 行基因芯片的制作。
4.本發(fā)明的TtLRR-STK基因在小麥抗白粉病反應(yīng)中起重要作用。小麥在受到小麥白粉病菌 的攻擊時(shí)，表達(dá)被激活，轉(zhuǎn)錄水平顯著增強(qiáng)(參見(jiàn)附圖5)。由圖5可見(jiàn)，未接種白粉病菌的 對(duì)照(0小時(shí))沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，接種后12至24小時(shí)的表達(dá)量最高，直到接種后72小時(shí)仍有 較高的表達(dá)。rt^W-5TT的表達(dá)譜變化證明了其在小麥抗白粉病反應(yīng)中起重要作用。


圖1是LRR-受體蛋白激酶基因的核苷酸序列圖； 圖2是LRR-受體蛋白激酶基因的氨基酸序列圖3是LRR-受體蛋白激酶基因編碼的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)圖，圖中上數(shù)字為氨基酸殘基的位置； C0G4886:與C0G4886類(lèi)似的LRR功能域；TM:跨膜結(jié)構(gòu)域；S-Tkc:絲氨酸/蘇氨酸激酶功能域。
圖4是TtLRR-STK (TtLRR)與大麥LRR-受體蛋白激酶的氨基酸序列比較圖。
圖5是通過(guò)RT-PCR技術(shù)分析r^A^-5TJ基因在小麥抗白粉病反應(yīng)中的表達(dá)變化。圖中M為分
子量標(biāo)記，0、 1、 12、 24、 72等數(shù)字為小麥白粉病接種后的時(shí)間；^cti"為小麥肌動(dòng)蛋白基
因，為穩(wěn)定表達(dá)基因，作為基因表達(dá)變化的對(duì)照。結(jié)果可見(jiàn)，7M/^-^57J基因在白粉病菌接
種后表達(dá)被激活。
圖6是表達(dá)載體質(zhì)粒pC220-ZS2002結(jié)構(gòu)圖。T-Border (L): T-DNA左邊界;T-border (R): T-DNA右邊界；HYG:潮霉素抗性基因；GUS: 0-葡萄糖苷酸酶標(biāo)記基因；LacZ: 0-牛乳糖 標(biāo)記基因；ZS2002: 7z^A!/ -6TJ基因；Ubi-1:玉米泛素-l啟動(dòng)子；N0S:胭脂堿基因終止子。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例i. rt^ / -57J基因的克隆過(guò)程
7Y^V -5TJ基因是從對(duì)小麥病害抗性程度高的二粒小麥中分離的。以二粒小麥的葉片為 材料提取總脂A (核糖核酸)，再進(jìn)一步分離mRNA (信使核糖核酸)，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄將mRNA轉(zhuǎn)錄 為cDNA (互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸)，用該cDNA為模板進(jìn)行基因克隆。
根據(jù)與植物抗病相關(guān)的LRR-類(lèi)受體蛋白激酶基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)兼并性引物(序列為 5' - GTATTG(A/G)TTTTCTTTGCCTGG(A/C)C-3' ;
5' -CAAGC(A/C)GT(A/C)CGTCCAATC(T/A)AT-3')，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)技術(shù)從二粒小 麥cDNA中獲得編碼序列長(zhǎng)度為3081 bp的cDNA片段，克隆于pUC18-T載體上，測(cè)序后通過(guò) 序列分析證明這個(gè)cDNA克隆編碼富亮氨酸區(qū)-絲氨酸/蘇^酸受體蛋白激酶(LRR-Serine/Threonine rec印tor protein kinase)。在GenBank中進(jìn)行相似性査詢比較，證明為 新的二粒小麥基因，暫命名為W^y -5TJ基因。(目前在普通小麥及一粒小麥、二粒小麥的同 源位點(diǎn)上還沒(méi)有編碼1026個(gè)氨基酸的完整cDNA克隆被報(bào)告)
具體克隆技術(shù)
cDNA的合成用TRIzor試劑提取葉片總RNA。用Poly (A)Tract" mRNA分離系統(tǒng)III分 離出mRNA。用SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄PCR:用高保真DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)橄仍?4 ° C變性2分鐘； 接30個(gè)循環(huán)的94 ° C變性30秒，55 ° C退火30秒，72 ° C延伸3分鐘；最后在72 ° C
延伸7分鐘。
產(chǎn)物回收和測(cè)序分析擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳分離。將含有目的DNA片段的 瓊脂糖凝膠切割下來(lái)，用液氮反復(fù)凍融回收，等體積氯仿抽提純化，2倍體積的酒精沉淀。 回收的DNA片段用超純水溶解后，用T4-DNA連接酶將其與pUC18-T載體連接，4° C連接過(guò) 夜。用CaCl2熱擊法，在42° C熱擊90秒，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B菌株中。用質(zhì) 粒小量提取法提取質(zhì)粒DNA。在大連寶生物公司用ABI377自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BLASTt 和BLASTp計(jì)算機(jī)輔助程序(Altschul等1997)在美國(guó)國(guó)家生物信息中心網(wǎng)站NCBI (hUp:〃麗w. ncbi. nlm. nih. gov)和相關(guān)的連網(wǎng)站點(diǎn)進(jìn)行同源序列査詢比較。在NCBI網(wǎng)站用 Marchler-Bauer等(2003)的方法進(jìn)行保守功能域數(shù)據(jù)分析。 ' 該基因所編碼蛋白的特點(diǎn)
該基因編碼富亮氨酸區(qū)-絲氨酸/蘇氨酸受體蛋白激酶(LRR-S/T rec印tor protein kinase)。這個(gè)受體蛋白激酶包括N-端保守序列、富亮氨酸結(jié)構(gòu)域(lrr)、中部跨膜結(jié)構(gòu)域和 C-端蛋白激酶結(jié)構(gòu)域等幾個(gè)部分。其結(jié)構(gòu)與已經(jīng)克隆的水稻(6!ry幼^tira)抗白葉枯病蛋 白Xa21類(lèi)似(Song等1995; GanBank査詢號(hào)U72728)和大麥(他rofe腿n/J卵re)的一個(gè)受 體激酶(GanBank查詢號(hào)gbIAAP31049. 1 i)編碼蛋白高度相似。其比較結(jié)果參見(jiàn)附圖3.
TtLRR-STK(TtLRR)與大麥LRR-受體蛋白激酶(Hvprk， GanBank查詢號(hào)gb IAAP31049.11) 的氨基酸序列比較。
<image>image see original document page 7</image>Hvprk 655 TtLRR 659Hvprk 715 TtLRR 719LQI簡(jiǎn)TAfe6/ IHI龜趣l 跨膜結(jié)構(gòu)域■ARC|VNKSB 國(guó)虛IK驛I闘DISag,iNI針:MTORIS， l:UISA'l 1)SI:SE P 1A1S，A1::LIIL'\ l'DSFSV丄ILUVKVl,muKU(;ATKSI: I SI:('\AI,iai 1 RH服l .VK\||!j達(dá).i TAAYKVi .m'g叫(;Ai s卜:(i川服lvkv絲氨te蘇&K」力能械-714 718774 778Hvprk TtLRR775 779irVCi^BM^NWK ^iit|)\(;Sl,l)KM .1ii 'ST卜:)l'H;TI'Nil .、M、'l .、 1 Al .l)VAl':AI丄:、 IWCDSLDHSGSQI'KALVLEF 11'N(;SU)KWI ,1 ll)S'iT':(;l: WJPSLV1QRIA1 A1,1)VAI':A1上Y834 838Hvprk TtLRR835 839L錢(qián)D歸PPr,' 1 l(T)VKi 'S\ 11丄)I)隨.A11L(、'I)R;1 ..\K] 1 RA:KS,」D0S〔'SV(' 1 K()T 1 SfflH!DPPIVHCDVKiJS\ 1 l丄l)IAMVAlll.('l)r('LAK1 k'Al-:liSSQSU'(;QSSSV'(; [KG'I' 1894 898Hvprk TtLRR895 899df viMfiTG:i svh( tI)vysy(; vi .i丄i':Mi ,'i r'Ki們'm)i'Fsi)'i 'ai ,pky v'i':vi八(:p(;M丄r: GYLi*S S￡IS\,i:(;l)VYSY(;VLU,l:.\lLTWWr )l'T\inT\LPKYVBl.'\t:l>G\Ll,l':954 958Hvprk TtLRR955 959t蒙NlR^fc駒4vpLMM^ si化(;l'uti";sai《ok i k i(;i)vvki':i .(;aku i i maso、' iMWfCNQEPKiTULPiy '.\Ki,(;L\('(、K(;r'.\RwnAisDYVKnL(;;aK'm..i\iAS(A1014 1018Hvprk TtLRR1015 1019YASWV服LY 1023 S輔,Q 1026實(shí)施例2.本發(fā)明的W^y -57J基因在轉(zhuǎn)基因抗病育種上的應(yīng)用。將7t^y -5TJ基因從pUC18-T載體上酶切下來(lái)，或用高保真化^DNA聚合酶和基因特異性 引物擴(kuò)增下來(lái)。用T4-麗A連接酶將r^^/ -57J連接在玉米泛素高效啟動(dòng)子Ubi(Ubiquitin-1) 的下游，再插入到pCAMBIA-Bar植物表達(dá)載體中，從而構(gòu)建成pCAMBIA-Ubi-7&^S57J表達(dá) 載體質(zhì)粒。'將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B菌株中繁殖，提取該載體的質(zhì)粒，即可進(jìn)行 轉(zhuǎn)基因抗病育種。通過(guò)基因槍(如伯樂(lè)公司的高壓氦氣基因槍?zhuān)琍DS-1000/He)將 pCAMBIA-Ubi-rt^^-57J表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)，但抗病性差的小麥品種的幼胚愈 傷組織中。利用表達(dá)載體上的篩選標(biāo)記基因——抗除草劑基因Bar，在加有除草劑PPT的MS 固體培養(yǎng)基中篩選，獲得抗PPT的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。再將篩選獲得的轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)到新 的誘導(dǎo)組織分化的分化培養(yǎng)基(含3mg/L的PPT; 1 mg/L的Zeatin，和1 mg/L的IAA， 1/2 的MS固體培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生新的再生植株。這樣就獲得了轉(zhuǎn)基因小麥。用基因特異 性引物通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的后代進(jìn)行檢測(cè)，選擇基因純合，抗病性好的理想轉(zhuǎn)基因 品系，即可進(jìn)行大田種植、推廣。下圖是將7^^!/ -5TJ基因(ZS2002)插入在玉米泛素高效 啟動(dòng)子下游構(gòu)建成的單子葉植物表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖(圖6)。實(shí)施例3.本發(fā)明的7YZ^P-6TJ基因在設(shè)計(jì)合成新抗病相關(guān)基因?，F(xiàn)代dna合成技術(shù)已經(jīng)可以合成全長(zhǎng)基因。因此，根據(jù)已經(jīng)克隆研究的植物L(fēng)RR-蛋白激 酶類(lèi)抗病基因的特征，設(shè)計(jì)合成需要的編碼特異LRR結(jié)構(gòu)域的序列，與TtLRR-STK的編碼約 第600氨基酸以后的序列相連接，就可合成全新LRR-絲氨酸/蘇氨酸受體蛋白激酶基因。然 后，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證合成基因的編碼框(ORF)是否正確。通過(guò)驗(yàn)證的基因即可進(jìn)一步構(gòu)建到植' 物表達(dá)載體中，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)合成基因的抗病性進(jìn)行檢測(cè)。具有良好抗病性的合成基因 可以用于轉(zhuǎn)基因抗病小麥新品種的培育(植物表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因的具體操作如(1)中 示例玩述)。實(shí)施例4.本發(fā)明的7yz^ -5tj基因在基因芯片制作中的應(yīng)用。以5TJ基因cDNA克隆為模板，用基因特異性引物或pUC18-T載體上的M13通用引 物通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得DNA產(chǎn)物。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，'溶解后，按照基因芯片制作程序制作小麥 基因芯片，用于抗病等相關(guān)研究。如可以用英國(guó)的BioRobotics自動(dòng)點(diǎn)膜儀將標(biāo)本點(diǎn)在8X 12厘米的尼龍膜上。每個(gè)樣品點(diǎn)2個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)的DNA量為幾納克，同時(shí)點(diǎn)上看家基因(如 18sRNA和Actin基因)作為穩(wěn)定表達(dá)基因?qū)φ?。試?yàn)研究材料的mRNA提取后用同位素(如833P)標(biāo)記作為探針，與基因芯片進(jìn)行雜交。用記錄儀分析雜交信號(hào)。根據(jù)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱分析不同實(shí)驗(yàn)條件下r^z A7基因的表達(dá)變化。研究rs^aw基因與抗病等反應(yīng)的關(guān)系。
權(quán)利要求
1.二粒小麥LRR-受體蛋白激酶基因，其特征是其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于該基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.二根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于該基因編碼的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)圖如SEQ ID N0:3所示。
4. 如權(quán)利要求l所述基因的克隆方法，包括以下步驟(1) 以二粒小麥的葉片為材料提取總RNA(核糖核酸)，再進(jìn)一步分離mRNA(信使核糖核酸)， 通過(guò)反轉(zhuǎn)錄將mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA (互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸)，用該cDNA為模板進(jìn)行基因克隆。(2) 根據(jù)與植物抗病相關(guān)的LRR-類(lèi)受體蛋白激酶基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)兼并性引物(序列為 5' - GTATTG(A/G)TTTTCTTTGCCTGG(A/C)C-3' ; 5' -CAAGC(A/C)GT(A/C)CGTCCAATC(T/A)AT-3')，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)技術(shù)從二粒小 麥cDNA中獲得編碼序列長(zhǎng)度為3081 bp的cDNA片段，克隆于pUC18-T載體上，測(cè)序后通過(guò) 序列分析證明這個(gè)cDNA克隆編碼富亮氨酸區(qū)-絲氨酸/蘇氨酸受體蛋白激酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述基因的克隆方法，其特征在于cDNA的合成方法包括用TRIzor試劑提取葉片總RNA，用Poly (A) Tract* mRNA分離系統(tǒng)III 分離出mRNA，用SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒合成cDNA;反轉(zhuǎn)錄PCR合成方法包括用高保真DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)橄仍?4° C變性2 分鐘，接30個(gè)循環(huán)的94 ° C變性30秒，55 ° C退火30秒，72 ° C延伸3分鐘，最后在 72 ° C延伸7分鐘；產(chǎn)物回收和測(cè)序分析擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳分離。將含有目的DNA片段的瓊脂 糖凝膠切割下來(lái)，用液氮反復(fù)凍融回收，等體積氯仿抽提純化，2倍體積的酒精沉淀?；厥?的DNA片段用超純水溶解后，用T4-DNA連接酶將其與pUC18-T載體連接，4 ° C連接過(guò)夜， 用CaCl2熱擊法，在42° C熱擊90秒，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B菌株中，用質(zhì)粒小 量提取法提取質(zhì)粒DNA，測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行保守功能域數(shù)據(jù)分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的基因在小麥抗白粉病中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因在轉(zhuǎn)基因抗病育種中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的基因在轉(zhuǎn)基因抗病育種中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的基因在設(shè)計(jì)合成新抗病相關(guān)基因中的應(yīng)用。 ，
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基因在基因芯片制作研究中的應(yīng)用，
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種全長(zhǎng)cDNA為3081bp基因TtLRR-STK的分離、克隆及其應(yīng)用。本發(fā)明TtLRR-STK基因是從對(duì)小麥病害抗性程度高的二粒小麥中分離的，該基因編碼富亮氨酸區(qū)-絲氨酸/蘇氨酸受體蛋白激酶，所述的受體蛋白激酶包括N-端保守序列、富亮氨酸結(jié)構(gòu)域(LRR)、中部跨膜結(jié)構(gòu)域和C-端蛋白激酶結(jié)構(gòu)域等幾個(gè)部分。其結(jié)構(gòu)與已經(jīng)克隆的水稻抗白葉枯病蛋白Xa21類(lèi)似和大麥的一個(gè)受體激酶編碼蛋白高度相似。本發(fā)明的基因TtLRR-STK可以插入到不同類(lèi)型的啟動(dòng)子下游，構(gòu)建成植物表達(dá)載體，通過(guò)基因工程技術(shù)進(jìn)行植物抗病改良，也可將該基因的克隆用于小麥基因芯片制作，應(yīng)用于小麥抗病等研究中。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101407814SQ20071018971
公開(kāi)日2009年4月15日 申請(qǐng)日期2007年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月10日
發(fā)明者瑞 劉, 牛吉山, 磊 鄭 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)