專利名稱：：一種在有機(jī)相中酶催化合成葡萄糖脂肪酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種在有機(jī)相中脂肪酶催化合成非離子型表面活性劑葡萄糖脂肪酸酯的方法，屬于食品生物化工
技術(shù)領(lǐng)域：
。技術(shù)背景葡萄糖脂肪酸酯是由葡萄糖與脂肪酸縮合而成的一類可食用的具有特殊性能的非離子表面活性劑。由于葡萄糖脂肪酸酯具有良好的表面活性、無毒、易生物降解、HLB值范圍廣而可被廣泛用于食品業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、化妝品業(yè)和洗滌業(yè)。在我國尚未有在丙酮中酶法催化合成葡萄糖脂肪酸酯的報(bào)道，但有在其他溶劑如叔丁醇溶劑中的糖酯合成報(bào)道，且局限于合成工藝的研究，沒有葡萄糖脂肪酸酯的分離純化方法。如吳可克和安慶大(2004)以蔗糖和棕櫚酸為原料，研究了其酶法合成的工藝，這些報(bào)道中使用的溶劑毒性較大，在食品醫(yī)藥等工業(yè)中不允許使用，本發(fā)明中使用的丙酮毒性較小且沸點(diǎn)低易揮發(fā)，在產(chǎn)品中容易除去無殘留，被歐共體承認(rèn)應(yīng)用在食品或食品添加劑制造上是安全的，可以應(yīng)用于食品、化妝品等行業(yè)。目前市售的糖酯主要采用化學(xué)法合成，通常情況下產(chǎn)率低，產(chǎn)物復(fù)雜，分離純化困難，并且產(chǎn)物色澤深，而酶法催化合成糖酯具有反應(yīng)選擇性高、條件溫和、副產(chǎn)物少、產(chǎn)品色澤淺，產(chǎn)物容易純化等優(yōu)點(diǎn)。脂肪酶催化合成糖酯已成為近年來國內(nèi)外普遍感興趣的糖酯合成新方法，當(dāng)前世界上對(duì)蔗糖酯等雙糖酯的研究十分活躍，而對(duì)葡萄糖等單糖酯的研究則相對(duì)較少。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供酶法合成非離子型表面活性劑葡萄糖脂肪酸酯及其分離純化的方法。通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)學(xué)模型，本方法條件溫和、反應(yīng)效率高、所得產(chǎn)物成分簡單便于分離純化，明顯優(yōu)于化學(xué)法生產(chǎn)。本發(fā)明的技術(shù)方案一種在有機(jī)相中酶催化合成葡萄糖脂肪酸酯的方法，采用在恒溫震蕩水浴條件下，在丙酮中采用脂肪酶NOV0435催化酯化間歇反應(yīng)合成葡萄糖脂肪酸酯，生產(chǎn)工藝條件為(1)葡萄糖起始濃度為50mmol/L;(2)脂肪酸的起始濃度為50-350mmol/L;(3)催化劑脂肪酶NOVE435添加量為10-40g/L;(4)分子篩的添加量為40-80g/L;(5)恒溫震蕩水浴條件30-60°C，100-200rpm;(6)反應(yīng)時(shí)間為4-72小時(shí)；將收集的反應(yīng)液減壓蒸餾，回收溶劑丙酮，同時(shí)得到固體物質(zhì)；將得到的固體物質(zhì)采用正己烷萃取去除殘余脂肪酸后，利用硅膠柱層析分離純化，利用薄層色譜檢測(cè)收集葡萄糖脂肪酸酯產(chǎn)品。所用脂肪酸為月桂酸、豆蔻酸、棕櫚酸或硬酯酸。所述方法的優(yōu)化工藝條件為(1)葡萄糖起始濃度為50mmol/L;(2)月桂酸起始濃度為250mmol/L;(3)催化劑脂肪酶NOVE435添加量為30g/L;(4)分子篩的添加量為68g/L;(5)恒溫震蕩水浴條件50°C,150rpm;(6)反應(yīng)時(shí)間為30小時(shí)；硅膠柱層析流動(dòng)相條件甲苯乙酸乙酯甲醇水體積比為10:40:4.5:1.0;薄層色譜檢測(cè)的展開劑條件甲苯乙酸乙酯甲醇水體積比為10:40:4.5:1.0。在恒溫振蕩水浴條件下，在丙酮溶劑中以葡萄糖和脂肪酸(月桂酸、豆蔻酸、棕櫚酸、硬酯酸)為原料，脂肪酶為催化劑合成葡萄糖脂肪酸酯，經(jīng)過分離純化得到產(chǎn)物葡萄糖脂肪酸單酯，同時(shí)分離出未反應(yīng)的脂肪酶可重復(fù)使用，蒸發(fā)出有機(jī)溶劑回收利用。脂肪酶催化葡萄糖脂肪酸酯合成方法的研究包括設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化得到酸醇摩爾比、脂肪酶添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間，并確定產(chǎn)物的分離純化方法。反應(yīng)溫度的確定實(shí)驗(yàn)中采用的反應(yīng)溫度為30°C，40°C,45°C，50°C，60°C，隨著溫度升高，葡萄糖單酯轉(zhuǎn)化率升高，因此優(yōu)選反應(yīng)溫度為5(TC。反應(yīng)時(shí)間的確定實(shí)驗(yàn)中采用的反應(yīng)時(shí)間為4h、8h、10h、15h、24h、30h、36h、48h、72h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在30h后產(chǎn)率開始下降，因此優(yōu)選反應(yīng)時(shí)間為30h。酸醇摩爾比的影響丙酮中添加月桂酸與葡萄糖的摩爾比分別為1，2，3，4，5，6，7，隨著酸醇摩爾比的增加，.葡萄糖單酯轉(zhuǎn)化率提高，當(dāng)酸醇摩爾比大于5時(shí)，轉(zhuǎn)化率提高緩慢。催化劑脂肪酶NOVE435添加量的影響實(shí)驗(yàn)中脂肪酶的添加量分別為5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，30g/L,35g/L，40g/L,酶添加量越多，單酯產(chǎn)量越高，當(dāng)添加量大于30g/L時(shí)，產(chǎn)量增長緩慢。分子篩添加量的影響實(shí)驗(yàn)中分子篩的添加量分別為20g/L、40g/L、60g/L、80g/L、100g/L、120,，隨著分子篩添加量增大，單酯轉(zhuǎn)化率先升高后降低。選定分子篩的添加量為40-80g/L，經(jīng)響應(yīng)面分析分子篩量為68g/L時(shí)單酯轉(zhuǎn)化率最高。最佳工藝條件的確定在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，因素和水平如表1所示，優(yōu)化出丙酮中脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯的最佳工藝條件當(dāng)加酶量為30g/L，酸醇比為1:5，分子篩量為68g/L時(shí)，葡萄糖濃度為50mmol/L，5CTC振蕩水浴150rpm反應(yīng)30h，葡萄糖月桂酸單酯產(chǎn)量達(dá)到80.2%。表1響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素和水平<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>反應(yīng)液的分離純化方法經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出了薄層色譜分析葡萄糖酯的展開劑條件甲苯乙酸乙酯甲醇水=io:40:4.5:1.0(v/v/v/v)，將此展開條件作為柱層析的流動(dòng)相可分離純化出葡萄糖單酯。將酶促反應(yīng)液通過減壓蒸餾蒸出反應(yīng)溶劑丙酮，隨后加入正己烷來溶解未反應(yīng)的月桂酸，然后以硅膠柱層析來分離葡萄糖單酯，利用薄層色譜檢驗(yàn)并收集分離純化出的單酯，經(jīng)HPLC檢測(cè)，分離純化所得葡萄糖月桂酸單酯純度達(dá)到99°/。以上，如圖1所示。本發(fā)明的有益效果采用本發(fā)明利用脂肪酶催化制備葡萄糖月桂酸酯的方法可以大大提高產(chǎn)物的產(chǎn)量和反應(yīng)的效率，葡萄糖單酯轉(zhuǎn)化率達(dá)到約80.2%，經(jīng)分離純化后的單酯純度達(dá)到99%以上。本發(fā)明方法具有酶法生產(chǎn)的條件溫和、綠色安全、反應(yīng)效率高、產(chǎn)品容易純化等優(yōu)點(diǎn)。在生產(chǎn)的工程中，由于反應(yīng)以有機(jī)溶劑為反應(yīng)介質(zhì)，生產(chǎn)過程中基本沒有微生物的影響，而且所采用的溶劑為丙酮和正己烷，這兩種溶劑均被允許在食品工業(yè)中運(yùn)用。得到的葡萄糖脂肪酸酯產(chǎn)品可作為表面活性劑應(yīng)用到食品業(yè)、化妝品業(yè)和洗滌業(yè)。圖1分離純化出的葡萄糖月桂酸單酯的HPLC圖譜具體實(shí)施方式實(shí)施例1反應(yīng)初始在反應(yīng)器中當(dāng)加酶量為30g/L，以月桂酸為原料，酸醇比為1:5，分子篩量為68g/L時(shí)，葡萄糖濃度為50mmol/L,5(TC振蕩水浴150rpm反應(yīng)30h，得葡萄糖月桂酸酯，經(jīng)HPLC檢測(cè)葡萄糖單酯產(chǎn)量達(dá)到82%，經(jīng)分離純化后得到單酯純度達(dá)到99%以上。實(shí)施例2:反應(yīng)條件同實(shí)施例1，以豆蔻酸為原料，得葡萄糖豆蔻酸酯。實(shí)施例3:反應(yīng)條件同實(shí)施例l，以棕櫚酸為原料，得葡萄糖棕櫚酸酯。實(shí)施例4:反應(yīng)條件同實(shí)施例l，以硬脂酸為原料，得葡萄糖硬脂酸酯。權(quán)利要求1.一種在有機(jī)相中酶催化合成葡萄糖脂肪酸酯的方法，其特征是采用在恒溫震蕩水浴條件下，在丙酮中采用脂肪酶NOVO435催化酯化間歇反應(yīng)合成葡萄糖脂肪酸酯，生產(chǎn)工藝條件為(1)葡萄糖起始濃度為50mmol/L；(2)脂肪酸的起始濃度為50-350mmol/L；(3)催化劑脂肪酶NOVE435添加量為10-40g/L；(4)分子篩的添加量為40-80g/L；(5)恒溫震蕩水浴條件30-60℃，100-200rpm；(6)反應(yīng)時(shí)間為4-72小時(shí)；將收集的反應(yīng)液減壓蒸餾，回收溶劑丙酮，同時(shí)得到固體物質(zhì)；將得到的固體物質(zhì)采用正己烷萃取去除殘余脂肪酸后，利用硅膠柱層析分離純化，利用薄層色譜檢測(cè)收集葡萄糖脂肪酸酯產(chǎn)品。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用脂肪酸為月桂酸、豆蔻酸、棕櫚酸或硬酯酸。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是工藝條件為(1)葡萄糖起始濃度為50mmol/L;(2)月桂酸起始濃度為250mmol/L;(3)催化劑脂肪酶NOVE435添加量為30g/L;(4)分子篩的添加量為68g/L;(5)恒溫震蕩水浴條件5(TC,150rpm;(6)反應(yīng)時(shí)間為30小時(shí)；硅膠柱層析流動(dòng)相條件甲苯乙酸乙酯甲醇水體積比為10:40:4.5:1.0;薄層色譜檢測(cè)的展開劑條件甲苯乙酸乙酯甲醇水體積比為10:40:4.5:1.0。全文摘要一種在有機(jī)相中酶法催化合成葡萄糖脂肪酸酯的方法，屬于食品生物化工
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明在丙酮中利用脂肪酶NOVO435分別催化合成了葡萄糖月桂酸酯、葡萄糖豆蔻酸酯、葡萄糖棕櫚酸酯和葡萄糖硬脂酸酯，確定了其最佳生產(chǎn)工藝條件和產(chǎn)物的分離純化方法。在最佳工藝條件下葡萄糖月桂酸單酯轉(zhuǎn)化率達(dá)到80.2％，分離純化后的單酯純度達(dá)到99％以上。本發(fā)明方法具有條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品容易分離純化、綠色安全等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C12P19/00GK101225420SQ20071019136公開日2008年7月23日申請(qǐng)日期2007年12月19日優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日發(fā)明者骉馮,張文斌,張曉鳴,霞李,賈承勝申請(qǐng)人:江南大學(xué)