專利名稱：：白芨多糖膠精制工藝的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于天然植物多糖膠深加工
技術領域：
，涉及一種白芨多糖膠精制工藝，特別是涉及白芨多糖膠生物酶法精制和溶劑處理相結(jié)合的精制純化工藝。
背景技術：
：白芨[Blettilastriata(Thunb.)Reichb.f.]蘭科白芨屬植物，又稱小白芨、蓮及草、雪如末等，是藥食兩用傳統(tǒng)中藥資源，千百年來一直作為傳統(tǒng)中藥使用，其主要功能是斂瘡止血、補肺、消腫生肌等。白芨鱗莖中大量水溶液性多糖，其化學成分是葡萄甘露聚糖，是白芨膠(或稱白芨多糖膠)的主要功能性成分。其地下鱗莖含有30%以上的葡甘聚糖，其甘露糖和葡萄糖兩種糖基的比例大約為4:1，平均分子量在280萬，白芨多糖膠是一種優(yōu)良的天然增稠劑，是安全性較高的醫(yī)藥原料、性能卓越的藥用輔料和有相當發(fā)展前景的生物醫(yī)學材料。此外，白芨多糖膠還可應用于日化產(chǎn)品中，替代化學增稠劑，并具有減少刺激性、保護皮膚、延緩衰老等功能。白芨多糖的提取和精制工藝主要有水提法，乙醇一水提法，連續(xù)逆流提取法，這些方法提取所得產(chǎn)品得率一般不高，且產(chǎn)品的純度較低，粗白芨多糖純度一般低于80%，色澤略黃，且?guī)в兴幬?，作為食品添加劑或醫(yī)藥材料還需要進行精制。大大限制了白芨多糖膠在食品和醫(yī)藥上的應用。白芨作為我國的特有藥食兩用植物資源，研究條件得天獨厚，但迄今為止，國內(nèi)有關白芨多糖純化精制的文獻不是很多，更值得一提的是，尚沒有對白芨多糖中非糖類雜質(zhì)的系統(tǒng)研究報道，國外對于白芨多糖膠的研究可謂鳳毛麟角，幾乎沒有涉足者。雖然文獻報道和相關研究不甚豐富，對于白芨葡甘聚糖純化帶來了極大的不便和困難，同時也為研究白芨純化技術的必要性提供了契機。在實踐上，有人采用單純采用乙醇多次沉淀、乙醚和丙酮類有機溶劑洗滌等措施均能夠顯著提高其純度，而活性碳、高嶺土等介質(zhì)吸附操作效果較差。但單獨所使用復合溶劑洗滌沉淀法，有機溶劑消耗量大，成本較高，進一步提高純度要依靠層析技術、酶法精制或特殊化學處理手段來實現(xiàn)。白芨鱗莖多糖直接使用時感官不良，一般提取工藝僅能夠生產(chǎn)75%左右的粗多糖，因帶有較為典型的藥味，且顏色偏深，在食品加工中受到限制，提高白芨葡甘聚糖的純度能夠較好地解決上述問題，但因白芨多糖膠溶液粘度大，且色素、多酚、蛋白等雜質(zhì)與多糖呈鍵合狀態(tài)，一般精制手段難以實現(xiàn)。粗白芨多糖在脫水干燥后，溶解性能降低，尤其是采用醇沉淀一干燥工藝，速溶問題是一個很大的缺陷。其原因除了上面提高的雜質(zhì)高外，還與多糖膠較高的分子量有關。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種生物酶法精制和溶劑處理相結(jié)合的白芨多糖膠精制純化工藝。本發(fā)明技術方案的理論基礎(1)側(cè)鏈基團對雜質(zhì)的纏繞作用較大，通過蛋白酶進行修建；(2)蛋白酶可以起到部分脫除糖蛋白作用，在去除蛋白基團的同時，也使結(jié)合到蛋白上的部分雜質(zhì)予以去除；G)通過復合溶劑處理，使脂類、色素類成分予以清除。課題的技術難點是酶法修剪，體現(xiàn)在酶的篩選、條件優(yōu)化。未經(jīng)處理的白芨多糖，分子量可達到200萬以上，其溶解需要充分的溶漲后才能較為徹底。本發(fā)明通過對白芨多糖分子的適度降解，來提高溶解性能，其適度降解作用主要體現(xiàn)在2個方面，一是對蒂合大分子進行酶法剪切，切除分子間聯(lián)接的蛋白，二是對主鏈進行調(diào)整。在此基礎上，結(jié)合溶劑的分步沉淀獲得組分相對均一的多糖組分，提高產(chǎn)品的速溶性能，拓寬應用范圍。白芨膠的主要成分為多糖(特別是葡萄甘露聚糖)，故本發(fā)明所稱白芨多糖膠、白芨多糖、白芨葡甘聚糖均可代表白芨膠。本發(fā)明的目的是通過下列技術措施實現(xiàn)的白芨多糖膠精制工藝，該工藝包括下列步驟-a.白芨粗多糖加入60-70。/。乙醇65-75'C洗滌，冷卻，過濾，95~98%乙醇洗滌三次，真空抽濾；b.按2530ml水/g洗滌后的衡干重白芨粗多糖的比例加入水復溶；c.加入蛋白酶，根據(jù)蛋白酶適宜pH及溫度條件下酶解15-25h;d.滅酶，離心，收集上清液，加入3-5倍上清液體積的乙醇，醇沉3-5h;e.洗滌，95-98%乙醇洗滌2-3次，丙酮洗滌2-3次，乙醚洗滌2-3次，真空抽濾；f.烘干，貯存。所述白芨多糖膠精制工藝，其步驟a中白芨粗多糖與60-70%乙醇比例按重量體積比(g/ml)為1:3~5。所述白芨多糖膠精制工藝，其中蛋白酶為木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶中的一種或多種。所述白芨多糖膠精制工2，其步驟c中加入的乙醇濃度為95~98%。工藝過程詳述如下-白芨粗多糖預處理白芨粗多糖顏色較深，具有典型的中藥味，其中含有還原糖、蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)，所以需要對連續(xù)逆流提取的白芨多糖用熱醇洗滌以初步脫色除雜。稱取白芨粗提物，按物料重量體積比1:3~5加入濃度為70%的乙醇溶液(例白芨多糖膠100g，70X乙醇300500ml，下同)，設定水浴溫度至70。C，加熱0.51.5h,冷去口，真空抽濾，用濃度為95%的乙醇洗滌三次。白芨多糖的復溶白芨粗多糖膠液粘度大，溶解性不佳，工業(yè)生產(chǎn)上需要確定其最佳溶劑用量，以節(jié)約成本。本實驗選擇溶劑水加入量梯度分別為10ml，20ml，30ml/g衡干重白芨粗多糖。10ml水加入量的水成白芨溶液粘度偏大，比較粘稠，轉(zhuǎn)移困難。20ml水成溶液粘度適中，30ml溶液比較稀，成水狀，可隨意轉(zhuǎn)移，綜合考慮白芨膠溶液的溶解特性，選取2530ml溶劑水/g洗滌后的衡干重白芨粗多糖。最佳酶解工藝的確定大多多糖的提取是以水溶液為主，加入酸、堿、鹽或者酶等物質(zhì)，加入乙醇、季銨鹽等陽離子表面活性劑，使多糖沉淀出來。由于白芨粗多糖中主要雜質(zhì)為蛋白質(zhì)，通常除蛋白的方法有酶解法、sevag法，三氯乙酸法、鹽酸法。再經(jīng)透析除去小分子，達到基本純化的目的。目前的分級方法有l(wèi).沉淀法包括乙醇沉淀，含鹽溶液沉淀法，季銨鹽沉淀法；2.電泳法；3.離子交換，凝膠過濾?？紤]到白芨葡甘聚糖膠作為藥食兼用的添加劑的產(chǎn)品應具有安全性高的特點，及保持并提高其高粘度的理化特性，本發(fā)明選擇溫和的酶法工藝進行蛋白脫除。蛋白酶水解把白芨多糖膠置于200ml錐形瓶中，按30ml/g干重加入溶劑水，不斷攪拌，使之溶解，待其完全溶解后，分別參照各酶的最佳作用條件，設定水浴鍋溫度，并調(diào)整pH到最佳作用范圍內(nèi)。從加入蛋白酶開始計時，酶解15-25h。離心醇沉蛋白酶水解后的白芨膠水成液，在水浴中7080'C滅酶10min,用高速冷凍離心機6000r/min，離心15min。傾出上清液，加入3~5倍上清液體積的95%乙醇攪拌，醇沉4h。真空抽濾真空抽濾后的白芨膠用95%的乙醇洗滌2次，丙酮洗滌3次，乙醚洗滌3次，濾干。烘干貯存濾干后的白芨膠其內(nèi)含有一定的水分，為便于保存期間，需要在烘箱中進行干燥處理。設定烘箱溫度為6(TC，烘2h。本發(fā)明的有益效果處理后白芨葡甘聚糖的粘度基本上不受影響，具有相當高的粘度。準確稱取干重為4g的白芨葡甘聚糖溶于200mL的蒸餾水中配制濃度為2%白芨葡甘聚糖溶液。用內(nèi)徑為lmm毛細管粘度計，兩次測定的時間分別為4min22sec85，4minl9sec52。粘度平均值為17.55mm2/s。本法制得的產(chǎn)品純度高，有良好的溶解性能成膜性能優(yōu)于羧甲基纖維素鈉和聚乙烯醇，在食品添加劑工業(yè)上是一種優(yōu)良的天然增稠劑、乳化劑和穩(wěn)定劑。溶解性能好，解決白芨粗多糖直接使用溶解性不佳現(xiàn)象，提高了增溶性能，拓寬了產(chǎn)品應用范圍，可以形成高濃度、低粘度型膠液，有突出的抗鹽和抗酸性能，受pH、無機離子、溫度等因素影響較少，適合復雜組成的食品加工；具有多重功能和良好的復配特性；安全性高，生物相容性好。用酶量小，原料易得，價格低廉，為白芨膠的生物化學方法精制純化找到了一條商業(yè)化的的新途徑，對于白芨膠的深度純化加工以及大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，拓展其作為特色資源在現(xiàn)代食品加工及醫(yī)藥領域的應用范圍具有極為深遠的意義。具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。實施例l:中性蛋白酶處理白芨葡甘聚糖膠工藝稱取白芨粗多糖，按物料重量體積比l:4加入濃度為70%的乙醇溶液(即白芨粗多糖100g，70W乙醇400ml)，設定水浴溫度至70。C，加熱lh，然后冷卻。真空抽濾，用濃度為95%的乙醇洗滌三次。準確稱取乙醇洗滌后衡干重白芨粗多糖樣品，按30ml水/g洗滌后衡干重白芨粗多糖的比例加入水，置于5(TC水浴中，不斷攪拌，使之充分溶解，按洗滌后衡干重白芨粗多糖重量的0.5%加入中性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH6.5-7.0，5(TC完全水解20h。酶解液7(TC滅酶處理10min，用高速冷凍離心機6000r/min,離心15min。傾出上清液，加入4倍上清液體積的95%乙醇，醇沉4h后真空抽濾，真空抽濾后的白芨膠用純度為95%的乙醇洗滌2次，丙酮洗滌3次，乙醚洗滌3次，濾干。6CTC烘干2h后貯存。樣品多糖含量的測定樣品溶液的配制準確稱取未純化白芨粗多糖及純化后的白芨多糖膠干燥品0.125g充分攪拌溶解，定容至250ml;用移液管取10ml，準確定容至100ml(此時溶液濃度在50ppm左右),備用。<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>以試劑空白為參比樣，吸取樣品液各lml，按照上述步驟操作，測定吸光值，以標準曲線計算多糖純度。多糖含量^二c樣x^x0.9x10—4xl00%;注c為測定樣品附樣溶液中的糖含量，N為原樣品溶液的稀釋倍數(shù)，V為原樣品溶液的體積。測定的白芨粗多糖和處理后的白芨多糖吸光度分別為0.146，0.170。根據(jù)公式計算出未純化及純化的白芨多糖的含量分別為85%，97.8%。純化多糖的粘度測定準確稱取干重為4g的純化后的白芨多糖溶于200mL的蒸餾水中配制濃度為2%白芨多糖溶液。用內(nèi)徑為lmm毛細管粘度計運動粘度為17.55mm2/s。精制后白芨葡甘聚糖純度(97.8%)大于95%;黏均分子量在1020xl04;2。％膠液粘度<100cp;穩(wěn)定分散pH范圍3.58.5，抗鹽粘度大于2.0%;其他指標達均到食品添加劑通用標準規(guī)定，彌補目前食品添加劑中低分子量、抗酸、抗鹽天然增稠劑的不足。實施例2-4所用蛋白酶見表l，工藝流程及其他參數(shù)同實施例1。表l<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權利要求1、白芨多糖膠精制工藝，其特征于該工藝包括下列步驟a.白芨粗多糖加入60-70％乙醇65-75℃洗滌，冷卻，過濾，95～98％乙醇洗滌三次，真空抽濾；b.按25～30ml水/g洗滌后的衡干重白芨粗多糖的比例加入水復溶；c.加入蛋白酶，根據(jù)蛋白酶適宜pH及溫度條件下酶解15-25h；d.滅酶，離心，收集上清液，加入3-5倍上清液體積的乙醇，醇沉3-5h；e.洗滌，95-98％乙醇洗滌2-3次，丙酮洗滌2-3次，乙醚洗滌2-3次，真空抽濾；f.烘干，貯存。2、根據(jù)權利要求1所述白芨多糖膠精制工藝，其特征在于步驟a中白芨粗多糖與60-70%乙醇比例按重量體積比(g/ml)為h3~5。3、根據(jù)權利要求1所述白芨多糖膠精制工藝，其特征在于蛋白酶為木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶中的一種或多種。4、根據(jù)權利要求1所述白芨多糖膠精制工藝，其特征在于步驟c中加入的乙醇濃度為95~98%。全文摘要本發(fā)明屬于天然植物多糖膠深加工
技術領域：
，公開了白芨多糖膠精制工藝。該工藝步驟是將白芨粗多糖用熱醇洗滌，加水復溶，加入蛋白酶酶解，滅酶，離心，收集上清液，加入乙醇醇沉，再用復合溶液洗滌，過濾，烘干，貯存。該工藝制得的產(chǎn)品純度高，有良好的溶解性能，拓寬了產(chǎn)品應用范圍；該工藝用酶量小，原料易得，成本低，易于工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號C12P19/00GK101195839SQ20071019199公開日2008年6月11日申請日期2007年12月28日優(yōu)先權日2007年12月28日發(fā)明者史勁松,孔俊豪,孫達峰,張衛(wèi)明,朱昌玲,顧龔平申請人:中華全國供銷合作總社南京野生植物綜合利用研究院