專利名稱：：用于細菌基因組擴增反應(yīng)的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于在細菌的16SrRNA編碼區(qū)中的基因組擴增反應(yīng)的引物。本發(fā)明還涉及此類引物的組合的引物組、具有這種引物組的試劑盒以及借助引物組檢測細菌的方法。相關(guān)技術(shù)的說明過去和現(xiàn)在主要采用常規(guī)培養(yǎng)方法在檢測對象(例如血液和痰)中鑒定引起傳染性疾病的致病性細菌。隨后通過觀看菌落特征和每種培養(yǎng)基的生長條件來鑒定致病性細菌。已經(jīng)提出了一些建議來改進現(xiàn)存的鑒定致病性細菌的技術(shù)，并且提供了新技術(shù)以使對病人的治療和藥療更加快速和更加合適。新提出的有代表性的技術(shù)包括那些分析細菌DNA序列并從DNA序列中鑒定細菌物種的技術(shù)。例如，Ezaki等人在日本專利申請?zhí)亻_平2001-299396中提出了一種使用DNA芯片(其中染色體DNA被錨定為DNA探針)的細菌鑒定方法。采用這種建議的方法，有可能通過讓源自多種已知細菌的具有各自的互相不同的GC含量的染色體DNA和源自檢測對象中的未知細菌的染色體DNA發(fā)生反應(yīng)并檢測產(chǎn)生的雜交復(fù)合物，來檢測檢測對象中的未知細菌。0hno等人在日本專利申請?zhí)亻_平H06-133798中提出了一種真菌檢測探針，其使用限制性酶切片段作為探針用于DNA芯片中，用于在傳染性疾病中檢測傳染性細菌。0hno等人在日本專利申請?zhí)亻_平H10-394896和日本專利申請?zhí)亻_平H10-304897中進一步提出了一種綠膿假單胞菌CPseM咖加asaeri/^f'/7Ma)檢測探針和分別使用大腸埃希氏桿菌(&c力er/cA/aco//)、肺炎克雷白氏桿菌U7e6"'e7/a/7/3e咖o/7/se)和陰溝腸桿菌(i^fero6a"erc/oacae)限制性酶切片段的檢測探針。日本專利申請?zhí)亻_平2004-313181公開了一種使用具有相對較短鏈長的寡核苷酸作為探針制備的DM芯片，以用來增加檢測的準(zhǔn)確性。公開的芯片能鑒定如下所示的10種不同物種，它們極為經(jīng)常被臨床檢測為傳染性細菌。金黃色葡萄球菌a"re^)、表皮葡萄球菌Ue;/^3r/n/(f/力、大腸埃希氏桿菌(Act/2')、肺炎克雷白氏桿菌(J.;wei/邁c/2/ae)、綠膿假單胞菌(戶.aer"《/'/oiT3)、粘質(zhì)沙雷氏菌鵬rce"e/力、肺炎鏈球菌;7/2e"/z70/7/ae)、流感嗜血桿菌(V.///7i/e/zse)、陰溝腸桿菌c/oacae)、糞腸球菌/"aeca/i'ir)。采用上述引用的專利文件中公開的方法，選擇那些細菌物種的細菌特異性寡核苷酸探針，來觀察哪種細菌的探針和檢測對象中的DNA雜交并確定細菌物種。更特別地，檢測對象中的DNA被提取出來并隨后在預(yù)備過程中通過PCR進行擴增，來擴增并標(biāo)記目標(biāo)核酸區(qū)域。隨后，所獲得的PCR產(chǎn)物和DM芯片中的任意探針雜交，并根據(jù)DNA芯片的亮度數(shù)據(jù)鑒定細菌物種。日本專利申請?zhí)亻_平2004-313181的鑒定細菌類型的方法包含了PCR擴增的預(yù)備過程。雖然PCR擴增是一種高效的核酸擴增技術(shù)，但是它的有效性依賴于在檢測對象中含有的模板的數(shù)量而變化。例如，在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)的細菌的數(shù)量非常多，因此當(dāng)PCR提供一定水平的擴增效果時，有可能實現(xiàn)足夠程度的檢測靈敏度。當(dāng)檢測對象是人血液時，如果樣本被培養(yǎng)一整天，并生長到擴增的足夠水平，那么就可以獲得足夠數(shù)量的細菌基因組，或足夠數(shù)量的模板。但是，當(dāng)人血液中含有的細菌未經(jīng)培養(yǎng)(擴增)并且直接鑒定細菌物種時，需要非常高水平的檢測靈敏度，因為血液中的細菌濃度非常低，并且在顯示高細菌濃度的敗血癥的情況下lmL血液最多含有幾十到幾百個活的細菌。當(dāng)血液中的細菌未濃縮時，對于血液來說，能夠被用作用于PCR擴增的模板的量最多縮減為大約0.3mL。這樣，源自細菌的基因組的數(shù)量最多等于大約100個細菌的基因組的數(shù)量。當(dāng)然，在嚴(yán)重性較低的傳染性疾病中血液中的細菌濃度更低。在PCR擴增中，理論上在每個循環(huán)中模板的數(shù)量增加一倍，因此對于PCR擴增有可能從一個拷貝的模板起始。但是，PCR擴增的效率通常不會高于2倍，并且當(dāng)模板數(shù)量少時模板顯然實際上沒有被擴增的情況也時常發(fā)生。有各種增加或降低PCR效率的因素，有代表性的包括酶的種類、熱循環(huán)程序、引物序列和緩沖液條件，其中引物序列對于增加或降低PCR效率是重要的。因此，選擇正確的引物是重要的。發(fā)明概述為了能有效率地擴增許多不同物種(例如，62個物種)的細菌，必須制備兩種或兩種以上不同種類的引物的混合物。但是，設(shè)計每個引物并且選擇引物的合適組合通常是困難的。因此，本發(fā)明的目的是提供引物或引物組，其能有效擴增選自大量細菌物種(特別的是62種)的目標(biāo)細菌的16SrRM基因序列。作為深入研究的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，具有選自下面列出的序列號l-6的堿基序列的引物作為擴增選自62種細菌的16SrRNA特定區(qū)域的引物是有效的。因此，根據(jù)本發(fā)明的用于PCR的引物是用于細菌16SrRM基因序列的PCR擴增的引物，其具有選自于下面列出的序列號1-6的堿基序列。(1)GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCG(序列號1)(2)GCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCG(序列號2)(3)GCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCG(序列號3)(4)ATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGC(序列號4)(5)ATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGG(序列號5)(6)ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTACGG(序列號6)根據(jù)本發(fā)明的用于細菌16SrRNA基因序列的PCR擴增的細菌基因組擴增反應(yīng)引物組，包括下面列出的引物(A)-(L)中的至少兩種，其中至少一種選自于引物(A)-(F)。(A)具有GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCG(序列號l)的引物,(B)具有GCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCG(序列號2)的引物，(C)具有GCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCG(序列號3)的引物，(D)具有ATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGC(序列號4)的引物，(E)具有ATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGG(序列號5)的引物，(F)具有ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTACGG(序列號6)的引物，(G)具有GCGGCGTGCCTAATACATGCAAG(序列號7)的引物,(H)具有GCGGCAGGCCTAACACATGCAAG(序列號8)的引物，(I)具有GCGGCAGGCTTAACACATGCAAG(序列號9)的引物，(J)具有ATCCAGCCGCACCTTCCGATAC(序列號10)的引物,(K)具有ATCCAACCGCAGGTTCCCCTAC(序列號ll)的引物，和(L)具有ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTAC(序列號12)的引物。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒是包括如上限定的引物或引物組并且適合用于鑒定細菌的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的細菌鑒定方法是使用如上限定的引物或引物組的基因組擴增方法，通過DM探針來檢測細菌基因組。因此，通過根據(jù)本發(fā)明的引物，有可能進行62種細菌物種的任意一種的16SrRM的特定區(qū)域的非常有效的PCR擴增。并且，借助于根組，還可^非常^"效的擴增所有62種細菌。一''根據(jù)下述例示性的實施方案，本發(fā)明的進一步特征將變得更為清楚。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明的引物是用于擴增細菌基因組16SrRM的特定區(qū)域的引物。它是具有選自下面列出的序列號1-6的堿基序列的引物。(1)GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCG(序列號1)(2)GCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCG(序列號2)(3)GCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCG(序列號3)(4)ATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGC(序列號4)(5)ATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGG(序列號5)(6)ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTACGG(序列號6)根據(jù)本發(fā)明的引物能被應(yīng)用于任何細菌或源自于活體的對象，只要它具有能允許PCR擴增的基因組，無論序列是否一致。根據(jù)本發(fā)明的引物的主要的合適的應(yīng)用是擴增下面62種細菌物種。金黃色葡萄球菌a盯e"力、表皮葡萄球菌(i".ep/^r/z7/d/力、大腸埃希氏桿菌(Aco//)、肺炎克雷白氏桿菌OT.;/2e咖o/72'ae)、綠膿假單胞菌CP.seru^7/70sa)、粘質(zhì)沙雷氏菌邁srce"e"s)、肺炎鏈球菌(S,/7/e咖o/7/ae)、流感嗜血桿菌(〃.2'/2/7〃e"zfle)、陰溝腸桿菌c/oacae)、糞腸球菌(A./aeca"力、溶血葡萄球菌(51.力aeiZ7o/7〃c^Ay)、人葡萄球菌(義^o/ff/zn's)、腐生葡萄球菌UM/7r0/7力/"cM)、熒光假單胞菌(尸./7"oresce/z力、惡臭假單胞菌(戶.pu〃^3)、洋蔥伯克霍爾德菌(Acepac/a)、鮑曼不動桿菌(A6a咖a/2///)、蠟狀芽孢桿菌(Acerews)、枯草桿菌(Aw6"7/s)、醋酸鉤不動桿菌(丄ca7coace"'cu力、木糖氧化產(chǎn)堿菌U1//0服2禱)、豬霍亂沙門(氏)菌Uc力o/erae頻、)、龜分支桿菌(#.C力e/o/zae)、星狀諾卡氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌(匯o^^oca)、產(chǎn)氣腸桿菌U2eroge/ie力、蜂房哈夫尼菌(Aa/rei)、液化沙雷氏菌/勿t/e尸ac/e/^)、奇異變形菌(戶.組'ra627")、普通變形菌(尸.^/^sW》、摩氏摩根(氏)菌(脫J770i^a"http://)、雷氏普羅威登斯菌(戶.re"ger/)、嗜水氣單胞菌(AA^/o/^7a)、無乳鏈球菌a^3/ac〃ae)、變異鏈球菌(i1.、化膿鏈球菌AFO^e"e》、血鏈球菌、鳥腸球菌(Aaw'咖)、屎腸球菌(A尸aec/咖)、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(^則/"/7力///3)、弗勞地氏檸檬桿菌(C./Vei//^27)、溫和氣單胞菌(丄so6r/a)、創(chuàng)傷弧菌(K^///7//7cw》、陰道加德納氏菌、脆弱類桿菌(及/Vag//")、多形擬桿菌(及Me"/o"o邁/cro/2)、痤掩丙酸桿菌(戶.ac"e》、難辨梭狀芽孢桿菌(C.d27Y7c27e)、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(C.wr/r^ew)、遲緩埃格特菌(A7e/2")、核粒梭桿菌(尸.""c/eaM邁)、嗜酸乳芽孢桿菌a.ac/f/o/7力27"s)、普氏厭氧球菌";re^7〃/)、不解糖嗜胨菌(戶.awcc力aro7/〃ci^)、不解糖p卜啉單胞菌(尸.雄C由ro/7〃CS)、牙齦卟啉單胞菌(尸.《//7《2>3//力、白喉棒狀桿菌(C.c/2X力er/ae)、侵肺軍團菌U./7/e咖op力"a)、堪薩斯氏分枝桿菌(#.h/^w//)、胞內(nèi)分枝桿菌//"ace//i//are)、壞死梭桿菌(A/zecro/7力or"/77)和棲牙普雷沃氏菌(尸.de/7〃co/a)。根據(jù)本發(fā)明的引物被設(shè)計為能夠特異性地識別16SrRNA區(qū)域并通過PCR擴增它們。換句話說，引物被設(shè)計為不僅顯示擴增細菌DNA序列的目標(biāo)區(qū)域所必需的特異性序列，同時還不顯示和源自人類的、可能在從血液中收集細菌基因組時同時存在的DNA序列相似的任意序列。另一方面，不管細菌物種中的菌林差異和突變而能均勻擴增目標(biāo)細菌的序列是合適的。目標(biāo)檢測對象需要處在PCR試劑能直接反應(yīng)的條件下，如在從細菌中提取的DNA的情況下，雖然達到該條件的過程不受任何限制。換句話說，培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基中的任意細菌能被使用，只要它們的基因組能被提取或和PCR試劑反應(yīng)。檢測對象可選自于源于人類和家畜的能存在細菌的任意樣本，包括體液，包括血液、血液組分、脊髓液、痰、胃液、陰道分泌物和口腔內(nèi)粘液，和排泄物，包括尿和糞便。此外，檢測對象還可以是所有能被細菌污染的介質(zhì)，例如能發(fā)生食物中毒或污染的食物和飲料，環(huán)境中的水例如溫泉水，或空氣清潔器的濾器。此外，檢測對象還可以是選自于進出口檢疫篩查中的取自動物和植物的樣本。此外，檢測對象還可以選自于通過任意不同的生物化學(xué)技術(shù)所獲得的對象，例如各種試劑、PCR產(chǎn)物和用限制性酶處理的核酸片段。根據(jù)本發(fā)明的引物能和通常使用的任何與PCR擴增相關(guān)的技術(shù)一起使用。有可能選擇分別針對正側(cè)(F鏈)和反側(cè)(R鏈)的引物(任意選擇的濃度)，并將它們用于PCR擴增。還可能只使用一個鏈進行不對稱PCR擴增。還可能使根據(jù)本發(fā)明的引物在其任意位置接受任意選擇的標(biāo)記。例如，可以標(biāo)記熒光物質(zhì)或放射性同位素。根據(jù)本發(fā)明的引物能被用在通過混合多種不同類型的F鏈和R鏈所獲得的混合引物中。引物混合物可以根據(jù)擴增對象進行任意配制?？梢詢?yōu)選使用包括下面列出的引物(A)-(L)中的至少兩種引物的引物組，其中至少一個選自引物(A)-(F)。(A)具有GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCG(序列號l)的引物，(B)具有GCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCG(序列號2)的引物，(C)具有GCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCG(序列號3)的引物，(D)具有ATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGC(序列號4)的引物，(E)具有ATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGG(序列號5)的引物，(F)具有ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTACGG(序列號6)的引物，(G)具有GCGGCGTGCCTAATACATGCAAG(序列號7)的引物，(H)具有GCGGCAGGCCTAACACATGCAAG(序列號8)的引物，(I)具有GCGGCAGGCTTAACACATGCAAG(序列號9)的引物，(J)具有ATCCAGCCGCACCTTCCGATAC(序列號10)的引物，(K)具有ATCCAACCGCAGGTTCCCCTAC(序列號ll)的引物，和(L)具有ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTAC(序列號12)的引物。優(yōu)選包括(D)到(I)的至少6種引物的引物組，和包括(D)、(F)、(G)、(H)、(I)和(K)的至少6種引物的引物組。此外，優(yōu)選的是通過等量混合(D)到(1)6種引物所制備的引物組和通過等量混合(D)、(F)、(G)、(H)、(1)和(K)這6種引物所制備的引物組。以平衡良好的方式，這種引物組能夠擴增上面列出的62種細菌物種。如果在檢測對象中含有的細菌物種是未知的，那么根據(jù)本發(fā)明的引物組能適合用于PCR擴增，以通過某種或其他方法來分析PCR產(chǎn)物。當(dāng)在根據(jù)本發(fā)明的引物組中使用了兩種或兩種以上引物的混合物時，有可能任意并且獨立地標(biāo)記每種引物組分。可以無限制地使用能用于PCR的任何酶(熱穩(wěn)定DM聚合酶)。典型的酶包括TakaraBioInc.生產(chǎn)的ExTaq、ABI(AppliedBiosystems)生產(chǎn)的AmpliTaqGold和InvitrogenCorporation生產(chǎn)的AccuPrime。在PCR擴增反應(yīng)中，除了普通底物以外還有可能將標(biāo)記的底物和PCR反應(yīng)溶液相混合，并使PCR產(chǎn)物接納源自底物的標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明的引物和引物組能被用于多種應(yīng)用中，沒有任何特定的限制。例如，根據(jù)本發(fā)明的引物或引物組能被用作探針，錨定在DNA微陣列的固相載體上。如果是這種情況，那第根據(jù)本發(fā)明的并顯示高擴增率的引物能合適地用于有效制備DNA微陣列。當(dāng)檢測觀察對象(檢測對象)以發(fā)現(xiàn)檢測對象中含有的細菌物種時，根據(jù)本發(fā)明的引物能非常有有效率地進行擴增。雖然可以使用各種技術(shù)中的任一種來分析PCR試劑產(chǎn)物(擴增產(chǎn)物，但流行的分析技術(shù)包括電泳方法、測序方法、定量PCR方法和使用DNA微陣列的分析方法。在這些方法中，特別有利地采用使用DNA微陣列的技術(shù)，在所述DNA微陣列上錨定有用于檢測作為檢測對象的目標(biāo)核酸的探針，因為擴增區(qū)域中的序列能更簡單的方式被定量分析。更特別的，對于不知道能否在其中發(fā)現(xiàn)細菌的檢測對象，借助于能擴增所有62種細菌物種的引物組對所述檢測對象進行PCR擴增，來獲得PCR產(chǎn)物。通過再次使用標(biāo)記性引物進行PCR來標(biāo)記獲得的PCR產(chǎn)物。標(biāo)記的PCR產(chǎn)物和DNA微陣列雜交，并觀測微陣列來找到微陣列上的對于雜交實際上起作用的探針，并且對雜交程度進行定量。使用顯示出目標(biāo)細菌物種所具有的特征序列的寡核苷酸探針。這種寡核苷酸探針被設(shè)計為主要對于當(dāng)PCR產(chǎn)物中含有目標(biāo)細菌物種時的雜交起作用。還可能包裝根據(jù)本發(fā)明的引物或引物組并將該包裝提供為試劑盒。對于試劑盒來說，舍有選自引物(A)-(F)的至少一種引物已經(jīng)是足夠的了。換句話說，有可能提供一種試劑盒，其中至少裝有一種引物。這種引物或引物組能以任意形式提供。雖然這種引物一般溶解在緩沖液中或液體介質(zhì)例如水中，并作為液體提供，但還可能以僅具有小范圍液體組分的粉末的形式提供這種引物或引物組。還可能提供薄薄地吸附在微珠、玻璃載體或樹脂表面上的這種引物或引物組。當(dāng)這種引物或引物組以試劑盒的形式提供時，更多情況是和一種或一種以上的用于PCR的酶、緩沖液和/或標(biāo)記性底物組合在一起提供。換句話說，這種引物或引物組能和任何此類物質(zhì)組合在一起并提供為試劑盒。特別的，當(dāng)這種引物或引物組和DNA微陣列組合在一起并提供為"用于鑒定細菌物種的試劑盒，，時，該試劑盒能應(yīng)用于鑒定引起傳染性疾病的細菌物種。因此，根據(jù)本發(fā)明提供了一種通過根據(jù)本發(fā)明的引物、引物組或試劑盒檢測細菌的方法。實施例通過使用根據(jù)本發(fā)明的引物，對列于上面的62種細菌物種進行PCR擴增實驗。實驗結(jié)果在下面詳細描述。注意下面描述的實施例完全不局限本發(fā)明的范圍。實施例1(10種細菌物種)1.細菌培養(yǎng)對于本發(fā)明的目的來說是主要檢測對象并在ATCC中被描述的10種細菌物種的標(biāo)準(zhǔn)菌林通過下面的預(yù)定步驟來獲得。獲得的細菌菌抹通過正確的方法進行處理以用于保存，并隨后冷凍(-80。C)并儲存。10種細菌物種列于下面金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希氏桿菌、肺炎克雷白氏桿菌、綠膿假單胞菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、陰溝腸桿菌、糞腸球菌。用粕環(huán)在細菌冷凍儲存物的表面刮下少量并將刮取的細菌施加到各自的平板培養(yǎng)基上。巧克力瓊脂培養(yǎng)基僅用于流感嗜血桿菌，并且羊血瓊脂培養(yǎng)基用于其余9種細菌物種。細菌在3丌C下培養(yǎng)，同時觀察生長情況。結(jié)果，所有物種大約在1到2天里增殖。對于每種物種，通過使用濁度計和其它工具制備合適細菌濃度的細菌溶液。2.提取細菌基因組和人基因組借助于核酸純化試劑盒(FastPrepFP100A(FastDNAKit，F(xiàn)unakoshiCorporation生產(chǎn))從對應(yīng)的細菌培養(yǎng)溶液中提取并純化每種細菌物種的基因組DNA。對收集的基因組DNA進行瓊脂糖電泳并通過已建立的步驟來測量260/280nm吸收以測定其品質(zhì)(小分子量核酸的混合比率，分解程度)和收集的數(shù)量。在這個實施例中，對于提取的10種細菌物種中的每種收集到大約5-15Mg源自細菌的基因組DNA，盡管收集到的數(shù)量因物種而異。收集到的基因組DNA的品質(zhì)非常好，沒有觀察到降解和混有rRNA。用TE稀釋收集的基因組DNA來制備每1ju1含有10個細菌基因組DM的溶液。同時，從來自于健康人的血液中提取源自人類的基因組。使用核酸純化試劑盒(QIAampDNABloodMiniKit，QIAGEN生產(chǎn))提取源自血液的人基因組。從大約200m1血液中提取大約8jug基因組DM。將獲得的基因組DM溶解于TE中來制備200ng/1M1濃度的溶液。將細菌基因組和人基因組等量混合，獲得每2ju1含有IO拷貝細菌基因組和200ng人基因組的基因組混合溶液的模式檢測對象(樣本)。3.制備引物下面顯示的核酸序列被設(shè)計為用于擴增16SrRNA基因(靶基因)的PCR引物，用于檢測細菌的目的。更特別的是，特異性擴增編碼16SrRNA的基因組部分的探針組，其中的引物對應(yīng)于大約1400-1700個堿基長度的16srRNA編碼區(qū)的兩端，它們釆用盡可能相等的特異性退火溫度。注意，設(shè)計多種不同類型的引物以使得能夠同時擴增突變菌抹和存在于基因組中的多種16SrRNA基因。(A)ATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGC(序列號4)(B)ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTACGG(序列號6)(C)GCGGCGTGCCTAATACATGCAAG(序列號7)(D)GCGGCAGGCCTAACACATGCAAG(序列號8)(E)GCGGCAGGCTTAACACATGCAAG(序列號9)(F)ATCCAACCGCAGGTTCCCCTAC(序列號ll)借助于DNA自動合成儀合成引物并在合成后借助于高效液相色譜(HPLC)進行純化。每種引物溶于Tris-HClEDTA緩沖溶液(lxTE)中至濃度為3.0liM。將相等數(shù)量的A到F這6種不同類型的引物溶液互相混合以制備6種類型引物的引物混合物(引物組)，濃度為0.5iaM。4.PCR擴增使用每種制備的引物組，按下述方式進行PCR。使用AmpliTaqGoldLD型的酶(試劑盒)(AppliedBiosystems生產(chǎn))作為PCR酶試劑盒。根據(jù)酶試劑盒所附的說明書制備引物組。對于每種引物組，制備具有下面列出內(nèi)容的PCR反應(yīng)溶液。表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>對獲得的每種PCR產(chǎn)物進行電泳來觀察擴增反應(yīng)獲得的擴增量。使用Agilent生產(chǎn)的微芯片型電泳設(shè)備"Bioanalyzer"進行電泳。1.0M1的每種PCR產(chǎn)物加于設(shè)備的芯片中并根據(jù)該設(shè)備所附的說明書進行電泳。電泳后，通過該設(shè)備所附的軟件對PCR產(chǎn)物的合成數(shù)量進行定量。待擴增的PCR產(chǎn)物的鏈長大約1500bp。下面的表2顯示了所有IO種細菌物種的PCR產(chǎn)物。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>所有條帶顯示了與其理論鏈長相近的各自的長度，并且沒有觀察到其它鏈長的顯著條帶，因此證實了源自細菌的基因組得到了非常有效的擴增。擴增程度不因細菌物種的不同而顯著變化，證實了該引物混合物對于所有10種細菌物種來說進行了均一的運作。雖然在這個實施例中，每個PCR管中加入200ng源自人類的基因組，但人基因組沒有被擴增，因此證實了人基因組沒有抑制這種擴增。實施例2l.DNA微陣列的制備制備了能鑒定IO種細菌物種的DNA微陣列。在這個實施例中制備的DM微陣列被設(shè)計為使得能夠通過分析在實施例1中詳細描述的擴增出的每種16SrRNA序列來鑒定細菌物種。換句話說，在這個實施例中制備的DNA微陣列是這樣一種DNA微陣列，其中與各細菌物種特異性反應(yīng)的寡核苷酸探針被設(shè)計并作為微點固定于玻璃載體上。所設(shè)計的分別用于各細菌物種的探針列于下面。探針A:金黃色葡萄球菌5，TAACCTTTTAGGAGCTAGCCGTCGA3，(序列號13)探針B:表皮葡萄球菌5，AGTAACCATTTGGAGCTAGCCGTC3，(序列號14)探針C:大腸埃希氏桿菌5，CGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGT3，(序列號15)探針E:肺炎克雷白氏桿菌5，CCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGC3，(序列號16)探針F:綠膿假單胞菌5，TGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTC3，(序列號17)探針G:粘質(zhì)沙雷氏菌5，GAAACTGGCAAGCTAGAGTCTCGTAGA3，(序列號18)^笨針H:肺炎鏈球菌5，GACGGCAAGCTAATCTCTTAAAGCCA3，(序列號19)探針I(yè):流感嗜血桿菌5，GGCGTTTACCACGGTATGATTCATGA3，(序列號20)探針J:陰溝腸桿菌5，ATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCT3，(序列號21)4笨針K:糞腸球菌5，CGAGGTCATGCAAATCTCTTAAAGCTTCT3，(序列號22)根據(jù)日本專利申請?zhí)亻_平2004-313181所描述的方法制備固定有這些寡核苷酸探針的DNA微陣列。2.第二PCR對在實施例1中獲得的PCR產(chǎn)物進行標(biāo)記和其它操作。首先，通過已經(jīng)建立的方法純化在實施例1中獲得的PCR產(chǎn)物。純化所用試劑盒是QIAGEN銷售的QIAquickPCR純化試劑盒。每種PCR產(chǎn)物都被吸附到試劑盒所提供的柱子上，并用50|li1水洗脫。隨后如實施例1中所述借助于Bioanalyzer來分析所獲得的純化的PCR產(chǎn)物，以測定相應(yīng)細菌物種的DNA濃度。隨后，合成引物G用于第二PCR。因為在后續(xù)實驗中必須使每種引物顯影，所以每種引物在5，末端都標(biāo)記有Cy3。在合成后，通過高效液相色譜(HPLC)純化引物。引物G以10pmol/iu1的濃度溶于TE緩沖液中。G)TACCTTGTTACGACTTCACCCCA(序列號23)引物G1被用于非對稱PCR,其中使用獲得的PCR產(chǎn)物作為模板。通過下面的制備方法進行PCR。雖然關(guān)于用于相應(yīng)模板的DNA，原則上使用20|a1在第一個PCR中純化的每種DNA，但當(dāng)DM總量有可能超過30ng時，用水稀釋溶液，這樣總量就不會超過30ng。(*)表3:PCR混合物寶生物公司生產(chǎn)的ExTaq，(預(yù)混型2x)25.Om1引物G5.Ojj1H20Om1(*)模板薩20.Ojj1(*)熱循環(huán)儀的溫度按如下設(shè)置。a)95。C600秒b)92。C45秒c)65。C45秒共25個b)—d)的循環(huán)d)72"C45秒e)72°C600秒f)4°C儲存用QIAGEN生產(chǎn)的純化試劑盒按與上述相同的方法純化所獲得的PCR產(chǎn)物。(用50m1水洗脫)3.雜交使用在上面"1.DNA微陣列的制備"中制備的DNA微陣列和在上面"2.第二PCR，，中制備的標(biāo)記的檢測對象(樣本)進行雜交反應(yīng)。3-1.封閉DM微陣列BSA(牛血清白蛋白級分V，Sigma生產(chǎn))按照1w"/。溶于100mMNaCl/10mM磷酸鹽緩沖液中。制備的DNA微陣列在室溫下浸于該溶液中2小時，進行封閉過程。封閉后，用清洗液按下面所示清洗DNA微陣列并隨后用純水漂洗，并用旋轉(zhuǎn)式脫水機甩千DM微陣列。清洗液2xSSC溶液(NaCl30QmM，檸檬酸鈉(二水檸檬酸三鈉，C6H5Na3'2H20)30mM，pH.7.0)，含有0.1wt。/。的SDS(十二烷基硫酸鈉)。3-2.雜交甩干的DNA芯片置于雜交儀(HybridizationStation,GenomicSolutions公司生產(chǎn))中，并在雜交溶液中進行雜交反應(yīng)，條件列于下面。3-3.雜交溶液6xSSPE/10%甲酰胺/耙標(biāo)(第二PCR的全部產(chǎn)物)/0.05wt%SDS(6xSSPE:NaCl900mM，NaH2P04.H2050mM，EDTA6mM，pH7.4)3-4.雜交條件65°C3分鐘—55°C4小時—在50。C下用2xSSC/0.1%SDS清洗—在20。C下用2xSSC清洗—(用仏0漂洗手工)—旋轉(zhuǎn)干燥。4.掃描在上述雜交反應(yīng)后，用DM微陣列熒光檢測儀(GenePix"00B:AxonInstruments生產(chǎn))觀測DNA微陣列的熒光。結(jié)果，每種細菌物種都能以可被良好重現(xiàn)的方式以足夠的信號強度被檢測到。所有細菌物種的雜交反應(yīng)后的熒光觀測結(jié)果列于下面的表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>如上面列出的結(jié)果所示，每種細菌物種和相應(yīng)探針有效雜交，顯示高亮度值。雖然每種細菌物種的標(biāo)記的DNA實際上不和其它任何細菌物種的探針雜交，但是它可能部分地引起在其它某些細菌物種檢測探針中的亮度值。這種現(xiàn)象被推測為序列上的交叉雜交，因此觀測到的雜交是正常雜交。因此，通過分析擴增產(chǎn)物證實了根據(jù)本發(fā)明的引物組顯示高特異性的檢測效果。實施例3(52種細菌物種)1.細菌培養(yǎng)對于本發(fā)明的目的來說是主要檢測對象并在ATCC中描述的的52種細菌物種的標(biāo)準(zhǔn)菌林通過下面的預(yù)定程序來獲得。一些無法得到的細菌菌林通過下面預(yù)定程序從JCM獲得或從臨床分離物中獲得。獲得的細菌菌林通過正確的方法進行處理以用于保存，并隨后冷凍(-80'C)并儲存。通過培養(yǎng)時使用的培養(yǎng)基類型對52種細菌進行分類，并列于下面。溶血葡萄球菌C力ae/z/o/y〃c"s入人葡萄球菌C力o/z/z7/s入腐生葡萄球菌Csapro/力/〃ci^入焚光假單胞菌廣尸./7"ore"e/2W、惡臭假單胞菌P./Jw〃^入洋蔥伯克霍爾德菌但cepac/a入鮑曼不動桿菌G.6a咖a/m/"、蠟狀芽孢桿菌伍cereu^、枯草桿菌但^^///W、醋酸鈣不動桿菌".ca/coaceO'cus入木糖氧化產(chǎn)械菌Q.1//os0z/da/7sj、豬霍舌L沙、門(氏)菌^S1.c力o/eraesi;/s,、龜分支桿菌傲c力e/Mae入星狀諾卡氏菌naWero/creW、產(chǎn)酸克雷伯氏菌".o;r/^ca入產(chǎn)氣腸桿菌伍aeroge/7e^、蜂房哈夫尼菌伍a"e/,、液化沙雷氏菌".//《i/e/ac/ei7^、奇異變形菌^/z2'ra6/7/W、普通變形菌(？.w/^sr/W、摩氏摩根(氏)菌沐頂o/^a/7/7入雷氏普羅威登斯菌(？.re〃《er/入嗜水氣單胞菌"A^ro/力//^(上述細菌使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基)；無乳鏈球菌Ca#a/a"/ae,、變異鏈球菌".歷""/^入化膿鏈球菌Cp/c^e"es入血鏈球菌Csa/^"/"/s入鳥腸球菌Car/"邁入屎腸球菌伍尸aec/咖入嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌C肌/^/力/7/a入弗勞地氏檸檬桿菌(T./VeM力7入溫和氣單胞菌0.^6W^(上述細菌使用大豆酪蛋白消化瓊脂培養(yǎng)基)；創(chuàng)傷弧菌m7"/"http://7(^^(上述細菌使用Marine瓊脂培養(yǎng)基)；陰道加德納氏菌瓜^g/"a/2V入脆弱類桿菌但尸ra^7/W、多形擬桿菌T及Me"/o&0邁/croi3入痤療丙酸桿菌P.ac/es入難辨梭狀芽孢桿菌(T.t///77c//e,、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌C/7er/V/ge/W、遲緩埃格特菌伍/e/"乂、核粒梭桿菌P."uc/ea^/z^、嗜酸乳芽孑包軒菌".ac/cTo/7力2'/w^、普氏厭氧3求菌"preyo〃/'入不解糖嗜胨菌廣尸.awcc力aro/7〃cws入不解糖p卜啉單月包菌awcc力aro/7〃cs入牙齦p卜啉單胞菌廣尸.g/z^/ra//^(上述細菌使用厭氧瓊脂培養(yǎng)基)；白喉棒狀桿菌CcT2'/7力Mer/ae(上述細菌使用腦心注入(BrainHeartInfusion)瓊月旨培養(yǎng)基)；侵肺軍團菌"./7/7ei/邁0/7力27^(上述細菌使用緩沖的木炭酵母浸出物瓊脂培養(yǎng)基)；堪薩斯氏分枝桿菌沐h/《"/2、胞內(nèi)分枝桿菌沐2'/"sce//w/are>)(上述細菌使用2%Ogawa培養(yǎng)基)；壞死梭桿菌""ecro/7力ori/邁J和棲牙普雷沃氏菌(.c/e/7〃co/^(上述細菌使用羊血瓊脂培養(yǎng)基)。用柏環(huán)在細菌冷凍儲存物的表面刮下少量并將刮取的細菌施加到各自的培養(yǎng)基上。在各自的最適生長溫度下培養(yǎng)細菌(30°C到37。C)，同時觀測生長情況。結(jié)果，所有物種大約在幾天里增殖。對于每種物種，通過使用濁度計和其它工具制備合適細菌濃度的細菌溶液。2.提取細菌基因組和人基因組借助于核酸純化試劑盒(MORA-EXTRACT，Kyokuto制藥有限公司生產(chǎn))從對應(yīng)的細菌培養(yǎng)溶液中提取并純化每種細菌物種的基因組DNA。對收集的細菌基因組DNA進行瓊脂糖電泳并通過已建立的步驟來測量260/280認(rèn)吸收以測定其品質(zhì)(小分子量核酸的混合比率，分解程度)和收集的數(shù)量。在這個實施例中，對于提取的52種細菌物種中的每種收集到大約5-15jjg源自細菌的基因組DNA，盡管收集到的數(shù)量因物種而異。收集到的基因組DNA的質(zhì)量非常好，沒有觀察到降解和混有rRM。用TE稀釋收集的基因組DM來制備每1p1含有1百萬個細菌的基因組DM的溶液。同時，從來自于健康人的血液中提取源自人類的基因組。使用核酸純化試劑盒(QIAampDNABloodMiniKit,QIAGEN生產(chǎn))提取源自血液的人基因組。從大約200jj1血液中提取大約8jug基因組DNA。將獲得的基因組DM溶解于TE中來制備200ng/11濃度的溶液。將細菌基因組和人基因組等量混合，獲得每2jli1含有100000個拷貝的細菌基因組和200ng的人基因組的基因組混合溶液的模式檢測對象(樣本)。3.制備引物如實施例1的3.中所述的方式制備引物4.PCR擴增如實施例1的4.中所述方式實現(xiàn)PCR擴增。注意，按照2-2所述方式制備的模板DM被用于顯示于實施例1的表1中的PCR反應(yīng)溶液。5.電泳對獲得的每種PCR產(chǎn)物進行電泳來觀察擴增反應(yīng)獲得的擴增量。使用Agilent生產(chǎn)的微芯片型電泳設(shè)備"Bioanalyzer"進行電泳。使用用于DM的7500系列作為凝膠試劑盒。l.Oni1的每種PCR產(chǎn)物加于設(shè)備的芯片中并根據(jù)該設(shè)備所附的說明書進行電泳。電泳后，通過該設(shè)備所附的軟件對PCR產(chǎn)物的合成數(shù)量進行定量。待擴增的PCR產(chǎn)物的鏈長大約1500bp。下面的表5顯示了所有52種細菌物種的PCR產(chǎn)物。表5:<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>所有條帶顯示了與其理論鏈長相近的各自的長度，并且沒有觀察到其它鏈長的顯著條帶，因此證實了源自細菌的基因組得到了非常有效的擴增。擴增程度不因細菌物種的不同而顯著變化，證實了該引物混合物對于所有52種細菌物種來說進行了均一的運作。雖然在這個實施例中，每個PCR管中加入200ng源自人類的基因組，但人基因組沒有被擴增，這反而證實了人基因組沒有抑制這種擴增。實施例4(借助于DNA微陣列進行檢測)借助于DNA微陣列，使用是實施例3擴增產(chǎn)物的部分細菌，所獲得的檢測結(jié)果將在此處顯示。l.DNA微陣列的制備制備了能鑒定9種細菌物種的DNA微陣列。所制備的DNA微陣列是一種被設(shè)計為通過分析在實施例3中詳細描述的擴增出的16SrRM序列來鑒定細菌物種的DNA微陣列。換句話說，所制備的DNA微陣列是這樣一種DNA微陣列，其中與各自細菌物種特異性反應(yīng)的寡核苷酸探針被設(shè)計并作為微點固定于玻璃載體上。所設(shè)計的分別用于各自細菌物種的探針列于下面。探針ll:普氏厭氧球菌5，CGTTGGAAACGACGAATAATACCCTATGA3，(序列號24);探針12:不解糖嗜胨菌5，AGTGACACATGTCATAACGATCAAAGTGA3，(序列號25);探針13:不解糖吟啉單胞菌5，GTGGTGAATAACCCGATGAAAGTCGG3，(序列號26);探針14:嗜水氣單胞菌5，GGCTGTGACGTTACTCGCAGAAG3，(序列號27);探針15:溫和氣單胞菌5，TAATGCCTGGGGATCTGCCCAG3，(序列28);探針16:脆弱類桿菌5，AATACCCGATAGCATAATGATTCCGCATG3，(序列號29);探針17:多形擬桿菌5，CACGTATCCAACCTGCCGATAACTC3，(序列號30);探針18:痤瘡丙酸桿菌5，AAAGTTTCGGCGGTTGGGGATG3，(序列號31);探針19:難辨梭狀芽孢桿菌5，GCATCTCTTGAATATCAAAGGTGAGCC3，(序列號32)。根據(jù)日本專利申請?zhí)亻_平2004-313181所描述的方法制備固定有這些寡核苷酸探針的DNA微陣列。2.第二PCR如實施例2-2進行第二PCR。此處使用在實施例3中所獲得的PCR產(chǎn)物。3.雜交使用在[1.DM微陣列的制備]中制備的DM微陣列和在[2.第二PCR]中制備的標(biāo)記的檢測對象，如實施例2-3-1和2-3-4中所述進行雜交反應(yīng)。4.掃描在上述雜交反應(yīng)后，用DNA微陣列熒光檢測儀(GenePix4000B:AxonInstruments生產(chǎn))觀測DM孩t陣列的熒光。結(jié)果，每種細菌物種都能以可被良好重現(xiàn)的方式以足夠的信號強度被檢測到。所有細菌物種的雜交反應(yīng)后的熒光觀測結(jié)果列于下面的表6中。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>如上面列出的結(jié)果所示，每種細菌物種和相應(yīng)探針有效雜交，顯示高亮度值。雖然每種細菌物種的標(biāo)記的DM實際上不和其它任何細菌物種的探針雜交，但是它可能部分地引起在其它某些細菌物種檢測探針中的亮度值。這種現(xiàn)象被推測為序列上的交叉雜交，因此觀測到的雜交是正常雜交。因此，通過分析擴增產(chǎn)物證實了根據(jù)本發(fā)明的引物組顯示高特異性的檢測效果。雖然使用了能鑒定9種目標(biāo)細菌的DNA微陣列，并且檢測結(jié)果顯示于上述每個實施例中，但對剩下的所有43種細菌物種可以使用相同的技術(shù)。制備用于檢測那些細菌的DNA微陣列并用于雜交，并且借助于每種被設(shè)計用于特定一種細菌物種的探針，獲得了高熒光亮度。因此，結(jié)果，能以足夠的信號強度，以可被良好重現(xiàn)的方式檢測出每種細菌物種。雖然已經(jīng)用例示性實施方案描述了本發(fā)明，不過應(yīng)該知道本發(fā)明不局限于公開的例示性實施方案。下面的權(quán)利要求的范圍符合使之包括所有這些改良和相同的結(jié)構(gòu)和功能的最廣泛的解釋。序列表<110>佳能株式會社<120〉用于細菌基因組擴增反應(yīng)的引物<130〉10048391CN01<150>JP2006-319976〈151〉2006-11-28<160>32<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211>26<212〉DNA<213〉人工序列<220><223>用于細菌基因組的擴增的引物<400〉1gcggcgtgcctaatacatgcaagtcg26<210>2<211>26<212>飄<213>人工序列<220><223>用于細菌基因組的擴增的引物<400>2gcggcaggcctaacacatgcaagtcg26<210〉3<211>26<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉用于細菌基因組的擴增的引物<400〉3gcggcaggcttaacacatgc幼gtcg26<210>4<211>25<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉用丁-細菌基因組的擴增的引物<400>4atccagccgcaccttccgatacggc25<210>5<211>24<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉用于細菌基因組的擴增的引物<400〉5atccaaccgcaggttcccctacgg24<210>6〈211〉24<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>用于細菌基因組的擴增的引物<400〉6atccagccgcaggttcccctacgg24<210>7<211>23<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223〉用于細菌基因組的擴增的引物〈400〉7gcggcgtgcctaatacatgcaag23<210〉8<211〉23<2〗.2〉DNA<213>人工序列<220〉<223〉用于細菌基因組的擴增的引物<400>8gcggcaggcctaacacatgcaag23<210〉9<211〉23<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉用于細菌基因組的擴增的引物<400>9gcggcaggcttaacacatgcaag23<210>10<211〉22<212>DNA<213〉人工序列<220>〈223〉用于細菌基因組的擴增的引物<400>10atccagccgcaccttccgatac22<210〉11<211〉22<212〉腿<213>人工序列<220〉<223>用于細菌基因組的擴增的引物<400〉11atccaaccgcaggttcccctac<210〉12<211〉22<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉用于細菌基因組的擴增的引物<400〉12atccagccgcaggttcccctac<210>13<211〉25〈212〉腿<213>人工序列<220>〈223〉用于檢測細菌基因組的探針<400〉13taaccttttaggagctagccgtcga<210>14<211〉24<212>腿〈213〉人工序列<220〉<223〉用于檢測細菌基因組的探針<400>14agtaaccatttggagctagccgtc<210〉<211〉<212〉<213>1525DNA人工序列<220〉<223〉用于檢測細菌基因組的探針<400〉15cggacctcataaagtgcgtcgtagt<210>16<211〉22<212〉DNA<213〉人工序列<220><223〉用于檢測細菌基因組的探針<400〉16cctttgttgccagcggttaggc<210>17<211>25<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>用于檢測細菌基因組的探針<400〉17tggccttgacatgctgagaactttc<210〉1824252225<211>27<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉用于檢測細菌基因組的探針<400〉18gaaactggcaagctagagtctcgtaga27<210〉19〈211〉26<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223〉用于檢測細菌基因組的探針<400>19gacggcaagctaatctcttaaagcca26<210>20<211〉26<212>DNA<213>人工序列<220〉〈223〉用于檢測細菌基因組的探針<400〉20ggcgtttaccacggtatgattcatga26<210〉21<211〉25<212〉腿<213〉人工序列<220>'〈223〉用于檢測細菌基因組的探針<400〉21attcgaaactggcaggctagagtct25<210〉22<211〉29<212>,<213>人工序列〈220〉<223>用于檢測細菌基因組的探針<400〉22cgaggtcatgcaaatctcttaaagcttct<210〉23<211〉23<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉用于擴增細菌基因組的引物<400〉23taccttgttacgacttcacccca<210〉24<211>29<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223〉用于檢測細菌基因組的探針<400>24cgttggaaacgacgaat犯taccctatga<210〉25<211〉29<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223>用于檢測細菌的探針<400〉25agtgac3catgtcat朋cgatcsaagtga29<210〉26<211〉26<212〉隱<213>人工序列<220〉<223〉用于檢測細菌的探針<400〉26gtggtgaataacccgatgaaagtcgg26<210〉27<211>23<212〉腿<213〉人工序列<220><223〉用于檢測細菌的探針<400>27ggctgtgacgttactcgcagaag23<210〉28<211〉22<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉用于檢測細菌的探針<400〉28taatgcctggggatctgcccag22<210>29<211〉29<212〉DNA<213〉人工序列<220>〈223〉用于檢測細菌的探針，<400〉29aatacccgatagcataatgattccgcatg29<210〉30<211〉25<212〉DNA<213>人工序列<220>〈223〉用于檢測細菌的探針<400>30cacgtatccaacctgccgataactc25<210〉31<211〉22<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉用于檢測細菌的探針<400〉31aaagtttcggcggttggggatg22<210>32<211>27〈212>DNA<213〉人工序列<220><223>用于檢測細菌的探針<400>32gcatctcttgaatatcaaaggtgagcc2權(quán)利要求1.用于細菌的16SrRNA基因序列的PCR擴增的引物，包含選自于下面列出的序列號1-6的堿基序列(1)GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCG(序列號1)(2)GCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCG(序列號2)(3)GCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCG(序列號3)(4)ATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGC(序列號4)(5)ATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGG(序列號5)(6)ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTACGG(序列號6)。2.用于細菌的16SrRNA基因序列的PCR擴增的引物組，包含下面列出的引物(A)-(L)中的至少兩種引物，其中至少一種選自于引物(A)-(F):(A)具有GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCG(序列號l)的引物,(B)具有GCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCG(序列號2)的引物,(C)具有GCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCG(序列號3)的引物，(D)具有ATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGC(序列號4)的引物，(E)具有ATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGG(序列號5)的引物，(F)具有ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTACGG(序列號6)的引物，(G)具有GCGGCGTGCCTAATACATGCAAG(序列號7)的引物，(H)具有GCGGCAGGCCTAACACATGCAAG(序列號8)的引物，(I)具有GCGGCAGGCTTAACACATGCAAG(序列號9)的引物，(J)具有ATCCAGCCGCACCTTCCGATAC(序列號IO)的引物，(K)具有ATCCAACCGCAGGTTCCCCTAC(序列號ll)的引物，和(L)具有ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTAC(序列號12)的引物。3.根據(jù)權(quán)利要求2的引物組，至少含有引物(D)-(I)。4.根據(jù)權(quán)利要求2的引物組，至少含有引物(D)、(F)、(G)、(H)、(I)和(K)。5.用于鑒定細菌的試劑盒，該試劑盒含有根據(jù)權(quán)利要求1的引物或根據(jù)權(quán)利要求2到4中任一項的引物組。6.用于進行DNA擴增過程的細菌檢測方法，使用根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1的引物或根據(jù)權(quán)利要求2到4中任一項的引物組，并且借助DM探針檢測細菌DNA。7.據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1的引物或根據(jù)權(quán)利要求2到4中任一項的引物組，其中細菌選自于葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、假單胞菌屬、腸道桿菌屬、嗜血桿菌屬、沙雷氏菌屬、克雷白氏桿菌屬、大腸埃希氏桿菌屬、伯克霍爾德菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、不動桿菌屬、無色桿菌屬、弧菌屬、沙門氏菌屬、檸檬酸細菌屬、哈夫尼亞菌屬、變形菌屬、摩根氏菌屬、普羅威登斯菌屬、氣單胞菌屬、加德納菌屬、棒狀桿菌屬、軍團桿菌屬、桿菌屬、分枝桿菌屬、諾卡氏菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬、埃格特菌屬、梭形桿菌屬、乳酸桿菌屬、厭氧球菌屬、嗜胨菌屬、卟啉單胞菌屬、普雷沃氏菌屬、丙酸桿菌屬。全文摘要能夠從選擇的62種細菌物種中有效擴增出目標(biāo)細菌16SrRNA的基因序列的引物或引物組。具有選自序列號1-6的堿基序列的至少一種引物被用作細菌基因組擴增反應(yīng)的引物(1)GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCG(序列號1)(2)GCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCG(序列號2)(3)GCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCG(序列號3)(4)ATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGC(序列號4)(5)ATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGG(序列號5)(6)ATCCAGCCGCAGGTTCCCCTACGG(序列號6)。文檔編號C12Q1/68GK101191146SQ20071019286公開日2008年6月4日申請日期2007年11月28日優(yōu)先權(quán)日2006年11月28日發(fā)明者加藤綾子,鈴木智博申請人:佳能株式會社