專(zhuān)利名稱(chēng)：生物合成生產(chǎn)混合長(zhǎng)鏈二元酸的新方法
生物合成生產(chǎn)混合長(zhǎng)鏈二元酸的新方法技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及微生物轉(zhuǎn)化正烷烴生產(chǎn)ci ， "一二羧酸，尤其是轉(zhuǎn)化 200"輕蠟油高產(chǎn)包括Cn C,.,二元酸的混合二元酸(DCm)的方法。
技術(shù)背景 長(zhǎng)鏈二元酸是合成香料、尼龍T.程塑料、熱熔膠、涂料、潤(rùn)滑油、 樹(shù)脂和醫(yī)藥等的重要原料。DCm是合成高性能共聚尼龍工程塑料、服裝用高檔尼 龍熱熔膠、高級(jí)潤(rùn)滑油和涂料的重要原料。尼龍12是目前國(guó)際上開(kāi)發(fā)出來(lái)碳鏈 最長(zhǎng)，質(zhì)量最好，價(jià)格最高，年產(chǎn)量達(dá)到IO萬(wàn)噸的高級(jí)尼龍工程塑料。尼龍12 是1966年由德國(guó)Huls公司和瑞士 Emser公司投產(chǎn)，后來(lái)法國(guó)、H本、美國(guó)也 均有生產(chǎn)，他們多采用純化學(xué)方法，以丁二烯為原料，在高溫、高壓、催化劑 條件下，經(jīng)過(guò)7個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)步驟生產(chǎn)的，步驟多、收率低，成本高，我國(guó)目 前還不能生產(chǎn)。如果以DCm為原料合成共聚尼龍，只需經(jīng)過(guò)4個(gè)反應(yīng)步驟，條 件溫和，步驟少，收率高，成本低，而且性能更優(yōu)，是競(jìng)爭(zhēng)力更強(qiáng)的合成方法。 因此，利用微生物特異的氧化能力，在常溫常壓下轉(zhuǎn)化200"輕蠟油生產(chǎn)DCm, 開(kāi)辟了二元酸的新來(lái)源和新品種，為共聚尼龍工程塑料、高級(jí)潤(rùn)滑油、服裝用 高檔熱熔膠和高級(jí)涂料等的工業(yè)生產(chǎn)提供物美價(jià)廉的重要原料。 在專(zhuān)利文獻(xiàn)中，未見(jiàn)生物合成生產(chǎn)混合長(zhǎng)鏈二元酸的專(zhuān)利。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所用的菌株為熱帶假絲酵母(Candida tropicalis) CH-14-328，是以一株氧化正垸烴生產(chǎn)混合二元酸的熱帶假絲酵母(參見(jiàn)《微生 物學(xué)報(bào)》20 (1): 88 93， 1980)為出發(fā)菌株，通過(guò)硝基胍、亞硝酸、紫外線(xiàn) 和N+注入等多種誘變方法，經(jīng)過(guò)多次反復(fù)誘變篩選培育出來(lái)的，能從Cu U 的各種單一正烷烴和混合正垸烴，尤其是以200"輕蠟油為原料，高產(chǎn)出相應(yīng)的混合長(zhǎng)鏈二元酸(DCm)。熱帶假絲酵母Candida tropicalis) CH—14一328 (以 下簡(jiǎn)稱(chēng)CH—14一328)已于2007年11月27 H保藏在北京朝陽(yáng)區(qū)大屯路甲3號(hào) 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保 藏號(hào)為CGMCC NO. 2269。 CH—14—328的生理特征如下一、 糖類(lèi)的發(fā)酵葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麥芽糖+，乳糖-。二、 同化葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麥芽糖+，纖維二糖+,海藻 糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松二糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+， L-阿戊糖+， D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，a-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤鮮醇-，甘露醇+，肌醇-，核糠醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，檸檬酸鈉-，丁 二酸鈉+，乳酸鈣-。二、生長(zhǎng)素的需要生物素++，維生素B,++，維生素B2+，維生素B6+，維生素 B,2+，葉酸+，煙酸+,泛酸+，肌醇+，對(duì)氨基苯甲酸+。四、其它硝酸鹽-，凍化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛務(wù)，油脂酶-。 形態(tài)特征奶油白色，皺褶型，菌落為蛋糕狀和桃酥狀。培養(yǎng)特征在麥芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，假菌絲多而長(zhǎng)；在烷烴種子培養(yǎng)基 培養(yǎng)時(shí)，有一定數(shù)量的短假菌絲；而在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵時(shí)，大部分是單個(gè)橢 圓細(xì)胞。本發(fā)明的種子培養(yǎng)基(1) 10Be'糖度的麥芽汁加2%瓊脂制成的固體斜面；(2) 10Be'糖度的麥芽汁液體培養(yǎng)基；(3) 烷烴種子培養(yǎng)基包含KH2P04 6 12g/L，酵母膏3 8g/L，玉米漿3 8 g/L，蔗糖10 30g/L，重蠟10 30g/L，自來(lái)水配置，自然pH。培養(yǎng)種子的過(guò)程為取一接種環(huán)CH—14一328酵母菌體，涂布在麥芽汁固體斜面上(4)15X180試管，每支裝6 7mL培養(yǎng)基，滅菌后放成斜面)，于28 30。C培養(yǎng)40小時(shí)。取一支上述培養(yǎng)好的CH—14一328菌種全部刮入裝有30mL 烷烴種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于28 30°C 220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng) 40 48小時(shí)，作為搖瓶發(fā)酵種子或取兩支上述培養(yǎng)好的CH—14一328斜面菌種 全部刮入裝有500mL培養(yǎng)基的5000mL三角瓶中，于220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床28 3(TC培養(yǎng)44 48小時(shí)，作為一級(jí)種子罐的種子。用本發(fā)明的CH—14一328菌株生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸，特別是DCm的具體方法是 把培養(yǎng)好的經(jīng)過(guò)鏡檢，沒(méi)有雜菌的菌種液接入pH5. 5 9. 0，最好是6. 0 6. 8的 含有15 30% (v/v)的2008輕蠟油和85 70% (v/v)發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液中。 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為堿金屬磷酸鹽4 15 g/L，最好為6 10 g/L，氯化鈉0. 5 2. 5g/L，最好為1.0 2.0g/L，硝酸鹽l 10g/L，最好是2 8g/L，醋酸鹽2 6g/L，最好是3 5g/L，消泡劑400 1200ppm，重蠟或蔗糖15 30g/L，青霉素 100 200單位/mL，最好是120 180單位/mL及一些其他公知的營(yíng)養(yǎng)源，在 pH6. 0 7. 5下將上述混合物在25 34°C，最好在27 31'C通氣發(fā)酵72 170小 時(shí)。第一階段，體系pH控制在5.5 7.0，以菌體生長(zhǎng)為主，同時(shí)生產(chǎn)一定數(shù)量 的二元酸；第二階段，體系pH控制7.0 8.0之間，以發(fā)酵產(chǎn)酸為主，也生長(zhǎng) 部分菌體；第三階段，只產(chǎn)酸，不長(zhǎng)菌體。從72小時(shí)開(kāi)始，每天補(bǔ)加一定量正 垸烴，使發(fā)酵液中正烷烴濃度始終〉5X(v/v)，堿金屬磷酸鹽可從KH2P04或NaH2P(X 中選一種。發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行破乳分層，上層殘油回收再用，放出中間清液，下層菌 體層再處理一次或壓濾；合并清液，加入適量活性炭在85 90'C脫色30分鐘， 除去活性炭后，脫色液加熱至70 80°C ，加HC1或ftS04至pH3進(jìn)行酸化結(jié)晶， 冷卻至3(TC，壓濾，空氣吹干，烘干機(jī)烘干，得白色二元酸。用本發(fā)明的CH—14一328菌株和發(fā)酵方法，可生產(chǎn)Cu U的各種單一二元 酸和混合二元酸。其中在3(W發(fā)酵罐，發(fā)酵生產(chǎn)DCm時(shí)，發(fā)酵163小時(shí)，產(chǎn)酸 量達(dá)150g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到90. 5% ，后處理總收率達(dá)到90. 1% 。具體完成方式 實(shí)例1.(1) 取一接種環(huán)CH — 14一328菌種，涂布在①15X180大試管麥芽汁固體 斜面上，3CTC培養(yǎng)兩天。(2) 取上述菌種一支，接入裝有30mL垸烴種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中， 于30。C在220轉(zhuǎn)/分的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)46小時(shí)。烷烴種子培養(yǎng)基中KH2P04 8g/L, 酵母膏3g/L,玉米漿3g/L，蔗糖15g/L，尿素3g/L,重蠟30mL/L,自來(lái)水配制， pH5. 0， 1KTC滅菌30分鐘。(3) 在裝有15mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，接入3. 5mL上述種子液， 在220轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)搖床上發(fā)酵4天，每24小時(shí)用Na0H調(diào)一次pH至7. 5 8. 0。 發(fā)酵培養(yǎng)基中含KHm 8g/L， NaAc 4g/L,認(rèn)03 3g/L,酵母膏2g/L，玉米漿 2. 5g/L，NaCl lg/L，尿素2g/L，蔗糖20g/L,青霉素160單位/mL， 200"輕蠟油 200mL/L,自來(lái)水配制，pH7. 3， IIO'C滅菌30分鐘。發(fā)酵結(jié)束后，用6mol HC1 調(diào)pH至3。用乙醚提取，除去乙醚，得白色結(jié)晶，用標(biāo)準(zhǔn)Na0H溶液滴定，計(jì)算 二元酸含量。結(jié)果DCm產(chǎn)量為86. 6g/L。實(shí)例2.按照實(shí)例1的方法，只是正烷烴用nCn(純度99X)結(jié)果DCu產(chǎn)量為50. 5g/L， DCn純度為98.5%。 實(shí)例3.按照實(shí)例l的方法，只是正垸烴用nU (純度98%)，不加重蠟，結(jié)果DCm產(chǎn)量為71. 5g/L, DC,4純度為98. 1%。 實(shí)例4.按照實(shí)例1的方法，只是正垸烴用nC"純度98X )，結(jié)果DC,7產(chǎn)量為58. lg/L， DCn純度為97.8%。 實(shí)例5.(1) 種子和發(fā)酵培養(yǎng)基同實(shí)例1。(2) 把2. 5L培養(yǎng)2天，0D (X30， 620nm)為0. 88， pH4. 2，健壯，無(wú)雜 菌的菌種液接入裝有600L種子培養(yǎng)基，經(jīng)121'C滅菌40分鐘的種子罐中，29 土rC， 350轉(zhuǎn)/分，罐壓1.0kg/cm2，通氣量l: 1，培養(yǎng)46小時(shí)，作為發(fā)酵罐 的種母。(3) 把(2)中培養(yǎng)的健壯、無(wú)雜菌，OD為0. 88的600L種母液接入裝有 31113發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)12rC滅菌40分鐘的5n/發(fā)酵罐中，在29士1'C， 250轉(zhuǎn)/分， 罐壓1. 0kg/cm2，通氣量l: 1條件下發(fā)酵160小時(shí)。20小時(shí)內(nèi)，體系pH控制在 7. 0以下，菌體迅速生長(zhǎng)，同時(shí)產(chǎn)生12. lg/L DCm，然后體系pH控制在7. 0 8. 0， 繼續(xù)發(fā)酵，到72小時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)到64. 5g/L， 70小時(shí)后每天補(bǔ)一定量的200# 輕蠟油。發(fā)酵130小時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)到135g/L，發(fā)酵160小時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)165g/L。實(shí)例6.(1) 種子培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法和發(fā)酵培養(yǎng)基同實(shí)例1。(2) 把3L培養(yǎng)兩天，OD (X30， 620nm)為0. 62 pH 3.8，健壯，無(wú)雜菌 種液接入裝有10L發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)12rC滅菌40分鐘的16L發(fā)酵罐中，29±1 °C 650轉(zhuǎn)/分，罐壓1.0kg/cm2，通氣量l: 1。開(kāi)始時(shí)，油醇l. 5L， 30小時(shí)內(nèi)， 體系pH控制在7. 1以下，菌體迅速生長(zhǎng)，同時(shí)產(chǎn)生6. 5g/L的A9DC,8，然后體系pH在7.0 8.0，繼續(xù)發(fā)酵，到67小時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)到25. lg/L， 70小時(shí)后每天 補(bǔ)加一定量油醇，使發(fā)酵液中油醇濃度始終>4% (v/v)。發(fā)酵144小時(shí)，產(chǎn)酸 量達(dá)110.5g/L。發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行破乳分層，回收上層殘余油醇，下層菌體層 通過(guò)壓濾，除去菌體，合并清液，加入0. 6 0. 7%活性炭9(TC脫色20分鐘， 壓濾除去活性炭，脫色清液加熱后加入濃H2S(X至pH3，冷卻至室溫，壓濾，空 氣吹干，固形物烘干，得白色粉末狀A(yù)9Dd,產(chǎn)品。油醇轉(zhuǎn)化率為82. 1%，后處理 總收率達(dá)到84. 5%。
權(quán)利要求
1、一種利用生物合成生產(chǎn)長(zhǎng)鏈α，ω-二羧酸的方法，其特征在于(1)把用一株熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)CH-14-328突變菌株培養(yǎng)成的種母液接入pH值為5.5～9.0含有5～40％(v/v)10～18個(gè)碳原子的石油正烷烴和95～60％(v/v)發(fā)酵培養(yǎng)基的混合液中。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為堿金屬磷酸鹽4～15克/升，氯化鈉0.5～2.5克/升，蔗糖10～30克/升，硝酸鹽1～10克/升，尿素1～5克/升，吐溫0.2～1.5克/升，醋酸鹽0.2～0.6％和抗菌素100～200單位/毫升及其他營(yíng)養(yǎng)源。(2)上述混合液在24～34℃下轉(zhuǎn)化48～168小時(shí)，然后將生產(chǎn)的α，ω-二羧酸進(jìn)行分離純化。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于混合液中正垸烴的含量為15 40 % (v/v)，發(fā)酵培養(yǎng)基含量85 60% (v/v)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基的組成中堿金屬磷酸 鹽6 10克/升，硝酸鹽2 8克/升，尿素1.5 2. 5克/升，吐溫0.4 0.8克/ 升，醋酸鹽0.3 0.5%，抗菌素120 180單位/毫升。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征在于所說(shuō)的正烷烴為混合正烷烴。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征在于所說(shuō)的混合正烷烴為含有11 14個(gè)碳原子的混合正烷烴，即200#輕蠟油。
6、 根據(jù)權(quán)利要求i和3所述的方法，其特征是堿金屬磷酸鹽最好是鈉鹽或鉀鹽; 硝酸鹽最好是KN03或NaN03，吐溫最好是吐溫60或吐溫80，醋酸鹽最好是鈉 鹽或銨鹽，抗菌素最好是青霉素。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是發(fā)酵混合液的溫度控制在26 32'C， pH值為6. 5 8. 5。
8、 熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)CGMCC No. 2269菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用生物合成生產(chǎn)長(zhǎng)鏈α、ω-二羧酸的方法，特別是高產(chǎn)C₁₁～C₁₄混合長(zhǎng)鏈二元酸(DCm)的方法。所用微生物為CH-14-328突變菌株，屬于熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)。其特點(diǎn)是在微生物菌種接入含有C₁₁～C₁₈各種正烷烴為基質(zhì)的培養(yǎng)基后，第一階段，控制體系以菌體生長(zhǎng)為主，也轉(zhuǎn)化正烷烴生產(chǎn)二元酸；第二階段，控制反應(yīng)系統(tǒng)，以產(chǎn)酸為主，也生長(zhǎng)部分菌體；第三階段，控制系統(tǒng)只產(chǎn)酸，不長(zhǎng)菌體。本方法用于轉(zhuǎn)化200^#輕蠟油生產(chǎn)DC₁₁～DC₁₄混合二元酸，在5m³發(fā)酵罐中試，160小時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)到165g/L，在30m³發(fā)酵罐中，發(fā)酵163小時(shí)，發(fā)酵清液中混合二元酸的總量達(dá)到150g/L左右。
文檔編號(hào)C12P7/46GK101225411SQ20071019584
公開(kāi)日2008年7月23日 申請(qǐng)日期2007年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者悅 席, 郝秀珍, 陳遠(yuǎn)童 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所