專利名稱：：肌醇六磷酸酶變體的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及親^MJf六磷酸酶的變體，具體為熱穩(wěn)定性和/或比活性提高的變體。本發(fā)明也涉及編碼此變體的DNA序列，在重組宿主細胞生產(chǎn)它們，以及^JD所述變體的方法，脅在動物飼料領域。優(yōu)選的親^RSI六磷酸酶是包含SEQIDNO:2的隔孢伏革菌屬(尸era'o/^ora)Mii享六磷酸酶。
背景技術：
：名稱為"Modifiedphytases"的EP897010公開了本文^J見的(i.a.)煙曲霉G4s/e^z7/ws^7Ww^紐)月/LS孚六磷酸酶的某些變體。名稱為"Consensusphytases"的EP897985公開了本文^t見的可基于例如數(shù)個子嚢菌月/Uil"六磷酸酶的序列多重比對i殳計的真菌共有(Consensus)MJ孚六石粦酸酵。名稱為"Thermostablephytasesinfeedpreparationandplantexpression"的WO99/48380涉及4躺熱穩(wěn)定的月/LS孚六磷酸酶的某些方面。熱穩(wěn)定的肌醇六磷酸酶的實施例見第30頁粗線下列出的數(shù)個共有(consensus)MJ孚六磷酸酶。名稱為"Improvedphytases"的WO00/43503涉^^文未現(xiàn)的熱穩(wěn)定性增加的某些MJ享六磷酸酶變體，該變體可通過EP897985所述類似的方法來設計。熱穩(wěn)定的月/U享六磷S吏酶的實施例見第54-55頁粗線下所示。這些MJ享六磷酸酶均與SEQIDNO:2具有75%以下的百分比同一性。本發(fā)明的一個目的是提供新的和改進的M^I六磷酸酶變體,具體為熱穩(wěn)定性改進和/或比活性增加。WO98/28408中公開了來自尸ew/op/Kra/yd/的肌醇六磷酸酶，并且WO99/49022中公開了它的某些變#<見例如在第76-77頁的權利要求31)，然而已放棄了為了4^發(fā)明目的的變體。
發(fā)明內容本發(fā)明涉及親代肌醇六磷酸酶的變體，包含在選自如下區(qū)域的至少一個區(qū)域的至少一個位置的取代20;26;28-31;37-48;55-69;73-83;91-119;123-126;135-142;152-163;169-199;204-222;229-238;248-266;284-289;300-308;321-335;343-350;384-398;407-412;和419-430;其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；并且(b)每個位置對應于SEQIDNO:2的一個位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO:2有至少75%的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體不是選自如下的戶e"/o;/zora/yc//CBS686.96月/LSf六磷酸酶的變體G26S;Y28N;D29S;F31Y;E42D，KA;T45R;V46I;W59F;S62D;A64K;R65Q,E,GA;S66T;R67A，I，Q，K;Q68Y,V,I;K74民A;A99N;D100S;L102V;P103E;F104L;扁7T，Q;S109M;H腦，V;Qll1E，N;Tl12A,S;M116F，I,L;A135S;D137Y;Q138D,S,G;D142A;()154fH;S155N;G156P;E157Q，S;E169S;E170A，P;G171A;0171aS;T174P，A;N177S;N178S,T;M179T,V，L;N182A，V;V184G;D185E;()185eT;G186S,A;D187R^K，S;()187aV，T;E188Q,S，A,V;S189E;V195L;N199A，P;L204N;A207D,H;S216T;D217E;L219Y，T;T220Y，N;L221F;M222L;L230V;()235eE，Q;V248民I;S249Q,A;E251D;Y254A，L，G;D255N;D257K;Y259F;T262H;P264A;G286民H;Q287K,S;A288P;T321Q，S，G;M322I;V323I;P324A;A327S，F(xiàn),I,L;F332Y;N333P;E344R;R346P;W348F;V349L,A,S;D350S,V;G388A;V393R;E395KT;或L396R。本發(fā)明也涉及編碼所必/LS享六磷酸酶變體的分離的核酸序列，和包含所述核酸序列的核酸構建體，載體，^Jft主細胞，以M產(chǎn)并使用所iiMJ爭六磷酸酶變體的方法。具體地說，本申請涉及如下方面(1)親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下區(qū)域的至少一個區(qū)域的至少一個位置的取代20;26;28-31;37-48;55-69;73-83;91-119;123-126;135-142;152-163;169-199;204-222;229-238;248-266;284-289;300-308;321-335;343-350;384-398;407-412;和419-430;其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；和(b)每個位置對應于SEQIDNO:2的位置；和(c)所述變體與SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；和(d)附帶條件是所述變體不是選自如下的Pe"/o//2oraCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體G26S;Y28N;D29S;F31Y;E42D，K,A;T45R;V46I;W59F;S62D;A64K;R65Q,E，GA;S66T;R67A，I，Q，K;Q68Y,V,1;K74R，A;A99N;D100S;L102V;P103E;F104L;N107T,Q;S109M;H110S,V;Q111E,N;T112A,S;M116F，I，L;A135S;D137Y;Q138D,S，G;D142A;()154fH;S155N;G156P;E157Q,S;E169S;E170A，P;G171A;()171aS;T174P，A;N177S;N178S，T;M179T,V,L;N182A，V;V184G;D185E;()185eT;G186S，A;D187R，K，S;()187aV,T;E188Q，S,A，V;S189E;V195L;N199A，P;L204N;A207D，H;S216T;D217E;L219Y,T;T220Y,N;L221F;M222L;L230V;()235eE，Q;V248R，I;S249Q,A;E251D;Y254A,L，G;D255N;D257K;Y259F;T262H;P264A;G286R,H;Q287K,S;A288P;T321Q,S,G;M322I;V323I;P324A;A327S，F(xiàn)，I，L;F332Y;N333P;E344R;R346P;W348F;V349L，A，S;D350S，V;G388A;V393R;E395K,T;和L396R。(2)項1的變體，其含有的取代或取代的組合選自下述取代和取代的組合(i)20R+95R+97V+98G;(ii)29N+102I;(iii)29N+118A;(iv)29N+163P+324S;(v)29N+163P+324S+395G;(vi)29N+234S;(vii)29N+324S;(viii)29S;(xi)29S+95H+110W+183W+324A+350V;(xii)29S+95M+110W+183W+324A+350V;(xiii)29S+95N+110R+183W+324A+350V;(xiv)29S+95R+110W+183W+324A+350V;(xv)29S+95S+l10R+183W+324A+350V;(xvi)29S+95S+110W+183W+324A+350V;(xvii)29S+95T+110R+183W+324A+350V;(a0s￡+SW7￡+Vl7a+18i2+asn+s6z(a!pO〗A0S￡+V1^￡+NS81+叢￡8l+人01HS6乙(n!F):A0S￡+3l7e￡+Vt^￡+CKn+a66+S6S(mx):A0S￡+V1^￡+AV￡8I+A0II+丄S6+S6乙(nx)(Vl7Z￡+AV￡8I+A0n+lS6+S6Z(P0〗A0S￡+V1^￡+CI8t^+AV￡81+入(HI+丄S6+S6乙(XPX):八OS￡+Vt^￡+lI611+入011十工S6+S6乙("!八皿):AOS￡+V1/Z￡+S81^+dS81+AV￡81+入011+丄S6+S6乙(n八xxx)〗A0Se+V1^+O,+dS8I+yM8I+人0II+丄S6+S6Z(!證x):AOSS+Vt7^+丄8t^+3S81+AV￡81+人011十丄S6+S6乙(八xxx)()():A0S￡+Vt^￡+S81^+:^8I+yW￡8I+A0n+lS6+S6Z(!xxx)—O01乙+S161+3061+S/<811+AV￡81+人011十丄S6+S6乙(XIXX):AOS￡+VW￡+€)81^+HS81+叢￡81+入011+1S6+S6Z(H!axx)-Vt7^￡+V￡^￡+VI2￡+￡)8l7^+HS8I+AV￡8I+A0II+丄S6+S6乙(H八xx):AOS￡+VW￡+S81^+3S81+AV￡81+人011十丄S6+S6乙(!八xx)tA0S￡+V1^￡+38t^+VS8I+AV￡8I+A(HI+IS6+S6Z(Ap)(A0S￡+Vt^￡+O8t^+VS8I+AV￡8I+A0n+lS6+S6Z(!nxx)fA0"+V匿+V8t7乙+VS8I+A^8I+入0II+丄S6+S6乙(Hxx)乙+"H161+S061+"H/<811+AV￡81十^I厶SI+人011十丄S6+S6乙(!xx):AOS￡+Vt^￡+AV￡81I+"H9SI+人011十丄S6+S6乙(xx)￡+叢￡811SI+39^I+VZ^I+人011+丄6^(x!x):A0^+Vl7^+S98乙+A^8I+CKn+人0H+丄S6+S6乙(!nAX)雖s8/，憲法能改(xlvii)29S+125D+324A;(xlviii)29S+125D+324A+330R+395G;(xlix)29S+125D+324A+350V;(1)29S+183A+324A+350V;(li)29S+183G+324A+334E+344S+350V;(lii)29S+183W+324A+350V;(liii)29S+205S;(liv)29S+324A+350V;(Iv)29T+324L;(Ivi)45A+350V+421R+422R+423N+424S+425L+426E+427G+428R+4291+43OM;(Ivii)69A+334E;(Iviii)99D+398T;(lix)114A+187G+194R+324S;(Ix)218T+334G;(Ixi)323A+324S;(Ixii)324S;(Ixiii)324S+328T;(Ixiv)324S+345D+347Q;(Ixv)324S+395G;(Ixvi)330R;(Ixvii)334D+343N+344V;(Ixviii)334E+344A;(Ixix)345H+347P+350V;和(Ixx)350V。(3)分離的核酸序列，其包含編碼項1或2變體的核酸序列。(4)核酸構建體，其包含項3的核酸序列，其可操縱連接到一或多個指導在適宜表達宿主生產(chǎn)所述多肽的可控序列。(5)重組表達載體，其包含項4的核酸構建體。(6)重組宿主細胞，其包含項4的核酸構建體和/或項5的表達載體。(7)生產(chǎn)項1或2任一的變體的方法，其包含(a)培養(yǎng)項6的宿主細胞來生產(chǎn)包含所述變體的上清；和(b)回收所述變體。(8)轉基因植物，或植物部分，其能表達項1或2的肌醇六磷酸酶變體。(9)轉基因，非人動物，或產(chǎn)物，或其元件，其能表達項1或2的肌醇六磷酸酶變體。(10)包含項1或2的至少一個肌醇六磷酸酶變體的組合物，和(a)至少一種脂肪可溶維生素；(b)至少一種水溶維生素；和/或(c)至少一種痕量礦物質。(11)項10的組合物，其還包含至少一個選自下述酶的酶木聚糖酶，葡聚糖內切酶，內切-1,3(4)-(3葡聚糖酶，和蛋白酶。(12)項10或11的組合物，其為動物如]^l"添加劑。(13)動物飼料組合物，其粗制蛋白質含量為50-800g/kg，并包含項1或24壬一的變體或項10或124壬一的組合物。(14)提高動物飼料營養(yǎng)價值的方法，其中將項1或2任一的變體或項10或12任一的組合物加到所述飼料。(15)降低動物糞便中肌醇六磷酸鹽水平的方法，包含喂給動物有效量的項13的飼料。(16)處理植物蛋白質的方法，包含將項l或2任一的變體或項10或12任一的組合物加到至少一個植物蛋白質或蛋白質源的步驟。(17)項1或2任一的變體或項10或12任一的組合物在如下的用途在動物飼料中；在動物飼料制備中；為提高動物飼料營養(yǎng)價值；降低動物糞便中肌醇六磷酸鹽水平；處理植物蛋白質；或從肌醇六磷酸酶底物釋放磷。圖1提供了含有SEQIDNO:2的氨基酸序列的尸em'op/zora/_yc//肌醇六磷酸酶3D結構的坐標。發(fā)明詳述隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶的三維結構才艮才居在X隱RayStructureDetermination,Stout,G.K.andJensen,L.H.,JohnWiley&Sons,Inc.NY,1989給出的X-射線結晶(crystallographic)方法的原理得到所述尸e"/op/wra/_yc"肌醇六磷酸酶的結構。用同晶置換(isomorphousreplacement)方法在2.2A分辨率下在圖1以標準的PDB格式(ProteinDataBank,BrookhavenNationalLaboratory,Brookhaven,CT)給出所述晶體結構的結構坐標。圖i的PDB文件僅涉及此肌醇六磷酸酶序列的一部分，也就是對應于SEQIDNO:2的殘基22-422的部分。分子動力學(Dynamics)(MD)分子動力學(MD)模擬(simulations)指示了所述氨基酸在蛋白質結構內的流動性(見McCammon，JAandHarvey,SC.,(1987)，"Dynamicsofproteinsandnucleicacids"，CambridgeUniversityPress)。所述蛋白質的動力學通?？膳c所述結晶B因子(見Stout,GHandJensen,LH,(1989),"X-raystructuredetermination",Wiley)相關。通過在例如不同溫度進行所述MD模擬，可模擬殘基與溫度相關的流動性。建議隨機誘變流動性或柔性(flexibility)(這里指各向同性波動(isotropicfluctuations))最高的區(qū)域?？梢岳斫庠谒龅鞍踪|的某些區(qū)域發(fā)現(xiàn)的高流動性，可以通過取代這些殘基來溫度改進(thermallyimproved)。用程序CHARMM(MolecularSimulations(MSI)),用MD在300,350，400，450，和500K處理上述的隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶結構300和600ps，然后用300stepsSteepestDescent,600stepsConjugatedGradients,和3000stepsABNR以0.001kcal/mole的公差等級(tolerancegrade)最小化。由MD才莫擬產(chǎn)生如下建議的誘變區(qū)域300和400K無水MD:37-48，91-119，232-238,300-308,325-335，343-348;300和400K有水MD:407-412;300K無水MD:229-236;有周期(period)邊界(boundary)的立方水盒(waterbox)的MD:123-126,154-157,204-216，284-289,419-423。由對X-結構中B-因子的評估產(chǎn)生如下建議的誘變區(qū)域73-83,207-217。上述區(qū)域可凈皮組合如下37-48;73-83;91-119;123-126;154-157;204-217;229-238;284-289;300-308;325-335;343-348;407-412;419-423。得自MD模擬的其他區(qū)域是154-163;204-218;323-335;342-350。得自B-因子評估的其他區(qū)域是1-29,優(yōu)選1-28;59-106;169-171;178-247;339-344;367-371;417向前。更優(yōu)選的區(qū)域是1-24;69-94;182-188;199-220;229-241;368-370;420-423?；钚晕稽c和底物結合殼(Shells)可用本領域已知的程序，如MolecularSimulationsMSI，SanDiego，California的INSIGHTII來限定包含那些與所述催化殘基(H55，D319,R54)很臨近的氨基酸殘基的活性位點殼。也可限定底物結合殼，其包含與所述底物結合位點(H55,R54，R139,N320)很臨近并因此可期待與所述底物接觸的那些氨基酸殘基。很臨近可被限定為與相關殘基距離例如，0A，15A，16A,或20A?？赏ㄟ^將肌醇六磷酸或其衍生物如肌醇-l,4,5-三磷酸(Brookhavendatabasefileldjx.肌醇-l,4,5-三磷酸)楔入(dock)所述活性位點裂縫(cleft)(所述殘基構成(makingup)所述活性位點的表面)來推斷底物結合的信息。制備變體的策略基于圖1的3D-結構和SEQIDNO:2，隨后對活性位點和底物結合殼(16A，優(yōu)選15A，更優(yōu)選10A)的研究，以及分子動力學，主要為了改進熱穩(wěn)定性和/或增加比活性，建議對下述區(qū)域進行誘變氨基酸26-31;55-69;99-104;135-142;169-193;253-266;或SEQIDNO:2的氨基酸321-323。優(yōu)選對SEQIDNO:2上述區(qū)域的下述位置進行誘變G26,P27,Y28，D29,P30，W59,P60，T61,S62,G63,A64，R65,S66,R67，Q68，V69,A99,D100,L102,P103，F(xiàn)104,A135,G136,D137，Q138，V141，D142,E169,E170,N177,N178,M179,P181,N182,D189，T191,W192,L193,Y253,Y254,D257,K258,Y259，Y260，T262,G265,N266,T321,和/或V323。包括下述變體G26S,A;P27X,M;Y28F,N,Q;D29S，T，A;F30X;W59X,F，Y;P60S;T61S;S62A;G63A,S;A64G，K,R,S;R65A;S66K,T;R67X，K,A，L，V，S;Q68E,D,N，M;V69X;A99X，D，S，E,N;D100X，S,E，N;LI02V;P103X,E;F104X,L;A135S，D;G136X,S，D;D137S;Q138X，D，N;V141X;D142X;E169A;E170X,A，T;N177D;N178A，GL;M179V，T;P181X，T,V;N182X，A;D189X;T191X;W192X;L193T，I;Y253N，G;Y254A,G;D257S;K258L;Y259X，F(xiàn)，P，W;Y260X,P，W;T262Y，V;G265X;N266Q;T321Q，L,N;和/或V323I。主要指向所述底物的氨基酸殘基或位置如下P27，Y28,R65,R67,Q68，A99,DIOO，L102,A135,G136,D137,E169,N177,T191,W192,Y253,Y254,T262,和T321。在一或多個這些位置改變的變體具體包括，例如包含在這些位置的至少一個，至少兩個，至少三個，至少四個，至少五個，至少六個，至少七個，至少八個，至少九個，或至少十個改變的變體。在具體實施方案中，所述變體包含在至少十一個，至少十二個，至少十三個，至少十四個，至少十五個，至少十六個，至少十七個，至少十八個，或在所有的十九個位置上的改變。所述變體的實施例是選自如下的那些包含至少一個，兩個，三個，四個，五個，六個，七個，/\個，九個，或至少十個突變的變體P27X，M;Y28F，N，Q;R65A;R67X,K,A,L，V,S;Q68E,D，N,M;A99X,D，S,E，N;D100X，S，E,N;L102V;A135S，D;G136X,S，D;D137S;E169A;N177D;T191X;W192X;Y253N，G;Y254A，G;T262Y，V;和/或T321Q，L,N。在具體實施方案中，所述變體含有至少十一個，十二個，十三個，十四個，十五個，十六個，十七個，至少十八個，或十九個這些突變。具有肌醇六磷酸酶活性的多肽本文中，具有肌醇六磷酸酶活性的多肽(肌醇六磷酸酶)是催化肌醇六磷酸鹽(肌醇六磷酸鹽(hexakisphosphate))水解為(1)肌醇和/或(2)其一磷酸鹽，二磷酸鹽，三磷酸鹽，四磷酸鹽，和/或五磷酸鹽和(3)無積疇酸鹽的酶。本文中，術語肌醇六磷酸酶底物包括本文未示的肌醇六磷酸及任何肌醇六磷酸鹽(肌醇六磷酸的鹽)，及上面(2)所列的磷酸鹽。互聯(lián)網(wǎng)上的ENZYME地址(http:〃www.expasy.ch/enzyme/)匯集了與酶命名相關的信息。它主要根據(jù)國際生物化學和分子生物學聯(lián)合會命名委員會(IUB-MB)的推薦并且它描述了每種提供了EC(酶學委員會)編號的定性的(characterized)酶(BairochA.TheENZYMEdatabase,2000,NucleicAcidsRes28:304-305)。也見NC-IUBMB的EnzymeNomenclature手冊，1992。根據(jù)所述ENZYME地址，已知兩種不同種類的肌醇六磷酸酶所謂的3-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸鹽3-磷酸水解酶，EC3丄3.8)及所謂的6-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸鹽6-磷酸水解酶，EC3丄3.26)。本發(fā)明中，肌醇六磷酸酶的定義包括這兩種類型。本發(fā)明中以單位FYT測定所述肌醇六磷酸酶活性，一FYT為每分鐘釋放(liberates)l微摩爾無機正磷酸鹽的酶。在下述條件pH5.5;溫度37。C;底物肌醇六磷酸鈉(C6H6024P6Na,2)濃度為(X0050mo1/1。適當?shù)募〈剂姿崦冈囼?assay)是WO00/20569實施例1所述的FYT和FTU試驗。FTU是為了測定飼料和預先混合物中的肌醇六磷酸酶活性。所述FYT試驗也在本文實施例2描述。親代肌醇六磷酸酶親代肌醇六磷酸酶是與來自尸em'op/wra/_yc"CBS686.96的肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶。本文中，同源的是指與本文SEQIDNO:2具有至少60%的同一性，所述的SEQIDNO:2對應于所述完整(complete)氨基酸序列的氨基酸17-439，其包括來自Pem'o//7ora(yc//CBS686.96(WO98/28408的SEQIDNO:2)肌醇六磷酸酶的信號肽部分。通常如下氨基酸同源性部分所述來測定同源性。所述親代肌醇六磷酸酶可為野生型或自然出現(xiàn)的多肽，或其等位變體，或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段，特別是其成熟部分。它也可為其變體和/或遺傳工程化或合成多肽。在具體實施方案中所述野生型親代肌醇六磷酸酶是真菌肌醇六磷酸酶,如絲狀真菌的肌醇六磷酸酶，或酵母肌醇六磷酸酶。酵母肌醇六磷酸酶的實施例是US5830732所述的許旺酵母(5W2w朋m-o^yc^occ/A"to/^)月幾醇六磷酸酶。在另一具體實施方案中，所述野生型真菌親代肌醇六磷酸酶來自絲狀真菌，例如子嚢菌04wom_ycoto)門或擔子菌(5asWowycoto)門(分別為子嚢菌肌醇六磷酸酶，或擔子菌肌醇六磷酸酶)。子嚢菌肌醇六磷酸酶的實施例來自曲霉(/1;^^///^)的菌抹，例如泡盛曲霉0^/erg"/wsavramon〕PHYA(SWISSPROTP34753,Gene133:55-62(1993)),黑曲霉G4w^^〃Mm'gw)(無花果曲霉(/c麗m))PHYA(SWISSPROTP34752,EP420358,Gene127:87-94(1993))，泡盛曲霉PHYB(SWISSPROTP34755,Gene133:55-62(1993))，黑曲霉PHYB(SWISSPROTP34754,Biochem.Biophys.Res.Commun.195:53-57(1993));或翹孢霉屬()的菌才朱,例如構巢#果孑包殼(五we〃'ce〃"wV/w/ara)PHYB(SWISSPROT000093,Biochim.Biophys.Acta1353:217-223(1997));或嗜熱霉屬(77^^7^^^"(腐質霉屬(/^柳^/0))的菌林，例如WO97/35017所述的細毛嗜熱霉(77^rwomycey/aw^/ww^)肌醇六磷酸酶。其他子嚢菌肌醇六磷酸酶的實施例在公開EP684313(例如來自煙曲霉，土曲霉G^/wg/〃wte〃ew力，和嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila);JP11000164(來自青霉菌屬(尸em'c/〃/ww)菌抹的肌醇六磷酸酶)；US6139902(來自曲霉菌抹的肌醇六磷酸酶)，及WO98/13480(Mo"oscw肌醇六磷酸酶)。擔子菌肌醇六磷酸酶的實施例是所述來自巻邊樁菇(尸fljd〃w/"w/w/to),線毛檢菌(rra附etespw^cem1)，々racy6e/Waties1和Pem'op/zora(y"7(見WO98/28409)的肌醇六磷酸酶。優(yōu)選的親代肌醇六磷酸酶來自隔孢伏革菌種，優(yōu)選來自尸e"/o/7/zora(yc//的菌林，最優(yōu)選來自所述/^2/op/wra/_yc"CBS686.96的菌抹。不管上述種已知的種名，可以理解其定義包括完全(perfect)和不全階段(imperfectstates),及其它分類學等效物(叫uivalent)例如，無性型。本領域技術人員很容易辨認適當?shù)刃锏耐恍?。公眾可容易地在?shù)個培養(yǎng)物保藏中心，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DSMZ),真菌菌種保藏中心(CBS),和農(nóng)業(yè)研究機構保藏中心，北方地區(qū)研究中心(NRRL)得到這些種的菌林。另外，可用合適探針從其他來源，包括從自然(例如土壤，堆肥，水等)分離的微生物鑒定并得到所述多肽。從自然生長環(huán)境分離微生物的技術在本領域已知。然后可以通過類似篩選其它微生物的基因或cDNA文庫得到所述氨基S吏序列。一旦已用所述探針檢測出編碼多肽的氨基酸序列，可用本領域一般技術人員已知的技術(見例如，Sambrook等，1989,見上文)分離或克隆所述序列。在另一具體實施方案中所述親代肌醇六磷酸酶是合成的肌醇六磷酸酶。合成的肌醇六磷酸酶是人設計的，并希望不會在自然出現(xiàn)。EP897985和WO00/43503公開了這些合成的，真菌的肌醇六磷酸酶的實施例，通常叫做共有肌醇六磷酸酶。改組的(Shuffled)肌醇六磷酸酶是合成或遺傳工程化的親代肌醇六磷酸酶的其它實施例，可如本領域通常已知，例如通過定點誘變，通過PCR(用含有所需突變的PCR片,殳作為所述PCR反應的引物之一)，或通過隨機誘變來制備它。合成的肌醇六磷酸酶的概念中還包括任何雜種的(hybrid)或嵌合的肌醇六磷酸酶，即肌醇六磷酸酶含有來自至少兩個肌醇六磷酸酶的部分氨基酸序列的組合。所述親代肌醇六磷酸酶可含有所述特定氨基酸序列，或它可能是其等位變體；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段。在一實施方案中，所述親代肌醇六磷酸酶含有所述特定氨基酸序列或其等位變體；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段。在另一實施方案中，所述親代肌醇六磷酸酶由特定氨基酸序列或其等位變體；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段組成。特定氨基酸序列的片段是從此氨基酸序列氨基和/或羧基末端缺失一或多個氨基酸的多肽。在一實施方案中，所述片段包含至少150，或至少200，或至少250，或至少260,或至少280,或至少300，或至少320,或至少340,或至少360，或至少380,或至少390,或至少400，或至少410,或至少420，或至少430，或至少440,或至少450個氨基酸殘基。等位變體指占據(jù)相同染色體位點的基因的兩或多個可選形式中的任一。等位變化通過突變自然出現(xiàn)，并且可導致種群內多態(tài)性(polymorphism)?；蛲蛔兛赡苁浅聊?所編碼多肽無改變)或者可編碼氨基酸序列改變的多肽。多肽的等位變體是基因等位變體所編碼的多肽。所述親代肌醇六磷酸酶也可是上述任一氨基酸序列中的成熟部分。成熟部分指成熟的氨基酸序列并且指在已經(jīng)剪切可能的信號肽部分后保留的氨基酸序列的那部分。在另一實施方案中，所述親代肌醇六磷酸酶可以是上述肌醇六磷酸酶的變體，其包含一或多個氨基酸的取代，缺失，和/或插入。所述肌醇六磷酸酶變體的氨基酸序列可能不同于由于插入或缺失了一或多個氨基酸殘基和/或用不同氨基酸殘基取代一或多個氨基酸殘基而特定的氨基酸序列。氨基酸變化優(yōu)選性質次要(minornature)的變化，即不顯著影響所述蛋白質折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小型(small)缺失，通常1到約30氨基酸；小型氨基或羧基末端延伸，如氨基末端曱硫氨酸殘基；至多約20-25殘基的小接頭(linker)肽；或通過改變凈電荷或其他功能，如多組氨酸區(qū)(tract),抗原表位或結合區(qū)來利于純化的小型延伸。保守取代的實施例在堿性氨基酸(精氨酸，賴氨酸和組氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸(亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸)，芳香族氨基酸(苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸)，及小(small)氨基酸(甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和曱硫氨酸)范圍內。通常不改變比活性的氨基酸取代在本領域已知并在例如H.Neurath和R.L.Hill,1979，In,TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最常出現(xiàn)的交換是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr，Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly，Tyr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/lle,Leu/Val，Ala/Glu,和Asp/Gly以及這些的逆向方式。微生物分類學(Taxonomy)涉及分類學的問題可以通過參考分類數(shù)據(jù)庫，如位于下述互聯(lián)網(wǎng)址http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/的NCBI分類學瀏覽器，和/或通過參考分類學手冊解決。本發(fā)明涉及的真菌分類的手冊優(yōu)選為DictionaryoftheFungi,9thedition,Kirk，P.M.，P.F.Ca畫n，J.C.David&J.A.Stalpers編輯，CAB出版，2001。合成的肌醇六磷酸酶，如共有的肌醇六磷酸酶，改組的肌醇六磷酸酶，或雜種的肌醇六磷酸酶可含有來自至少兩種子嚢菌肌醇六磷酸酶，至少兩種擔子菌肌醇六磷酸酶或來自至少一種子嚢菌和至少一種擔子菌肌醇六磷酸酶的部分氨基S吏序列的組合。部分氨基酸序列所來自的這些子嚢菌和擔子菌肌醇六磷酸酶可為例如，任一本文所指的那些具體的肌醇六磷酸酶。本文中，來自至少一個真菌的合成的肌醇六磷酸酶是真菌的肌醇六磷酸酶。另外，僅來自子嚢菌肌醇六磷酸酶的合成的肌醇六磷酸酶是子嚢菌肌醇六磷酸酶；并且僅來自擔子菌肌醇六磷酸酶的合成的肌醇六磷酸酶是擔子菌肌醇六磷酸酶。任何來自至少一種子嚢菌肌醇六磷酸酶以及至少一種擔子菌肌醇六磷酸酶的合成肌醇六磷酸酶可被命名為混合子嚢菌/擔子菌肌醇六磷酸酶。命名隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶指來自隔孢伏革菌屬的野生型肌醇六磷酸酶，包括其等位變體，片段或變體，或基于至少一種，優(yōu)選至少兩種隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶，更優(yōu)選只基于隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶制備的合成的肌醇六磷酸酶。隔孢伏革菌種的實施例為尸e"/op/oraawra"^aca，灰隔孢^en'<i/(9"a//5"，灃果隔孑包伏革菌(Pwwt/a)'Pp/ceae,p/w/'i/o(ygw/",i3n^，變色隔孢伏革菌(Pvera/co/o。，和被簡單歸類隔孢伏革菌的菌種。優(yōu)選的種是尸em'op/zora/少"7。優(yōu)選的菌抹是尸emb;/zora/一CBS686.96。氛基酸同源性本發(fā)明涉及具有的氨基酸序列與SEQIDNO:2(下文"同源肌醇六磷酸酶")有某種程度同一性的肌醇六磷酸酶。本發(fā)明中，通過程序"align",它是Needleman-Wunsch序列對比(即總體序列對比)來測定兩氨基酸序列之間的同一性程度，以及兩核苷酸序列之間的同一性程度。該程序可用于多肽，以及核苷酸序列的序列對比。所述缺省記分矩陣(matrix)BLOSUM50用于多肽序列對比，并且所述缺省同一性矩陣用于核苷酸序列對比。缺口的第一個殘基的罰分對多肽是-12并且對核香酸是-16。缺口的更多殘基的罰分對多肽是-2，對核苷酸是-4。"Align"是FASTA軟件包版本v20u6(見W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),"ImprovedToolsforBiologicalSequenceAnalysis",PNAS85:2444-2448,及W.R.Pearson(1990)"RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA，"MethodsinEnzymology183:63-98)的一部分。FASTA蛋白質序列對比使用不限制缺口尺寸的Smith-Waterman算法(見"Smith-Watermanalgorithm"，T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147:195-197)。在具體實施方案中，所述親代肌醇六磷酸酶的氨基酸序列與SEQIDNO:2的同一性程度為至少約55%,或至少約60%,或至少約65%，或至少約70%，或至少約75%,或至少約80%,或至少約85%，或至少約90%,或至少約91%,或至少約92%,或至少約93%，或至少約94%,或至少約95%，或至少約96%，或至少約97%,或至少約98%,或至少約99%。在另一具體實施方案中，這些同源的親代肌醇六磷酸酶具有的氨基酸序列與所述特定的氨基酸序列差三十，二十五，二十二，二十一，二十，十九，十/\，十七，十六，十五，十四，十三，十二，十一，十，九，y、七，六，五，四，三，二，或^f義一個氨基酸。所得變體肌醇六磷酸酶也與SEQIDNO:2同源。在具體實施方案中，所述變體肌醇六磷酸酶含有或具有的氨基酸序列與SEQID.NO:2的同一性程度為至少約55%,或至少約60%,或至少約65%,或至少約70%，或至少約71%，或至少約72%,或至少約73%,或至少約74%,或至少約75%,或至少約76%,或至少約77%,或至少約78%，或至少約79%,或至少約80%,或至少約82%，或至少約85%,或至少約87%，或至少約90%,或至少約92%，或至少約95%，或至少約97%。核酸雜交可選的，同源的親代肌醇六磷酸酶，以及變體肌醇六磷酸酶，可被定義為所述核酸序列所編碼，該核酸序列在很低嚴格條件，優(yōu)選低嚴格條件，更優(yōu)選中度嚴格條件，更優(yōu)選中高度嚴格條件，甚至更優(yōu)選高度嚴格條件，而且最優(yōu)選很高嚴格條件下與SEQIDNO:1的核苷酸49-1320,或其亞序列(subsequence)或互補鏈雜交(J.Sambrook,E.RFritsch,和T.Maniatus,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。亞序列可為至少100個核苷酸，或至少200，300,400，500,600,700,800，900,1000，1100,1200，或至少1300個核苦酸。并且，所述亞序列可編碼具有相關酶活性的多肽片段。對于長度至少IOO個核苷酸的長探針，從很低到很高的嚴格條件被限定為在42°C在5xSSPE，0.3%SDS,200pg/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA,和25%曱酰胺(對于很低和低嚴格度)，35%曱酰胺(對于中度到中高度嚴格度)，或50%曱酰胺(對高度和很高嚴格度)中預雜交并雜交，之后是標準Southern印跡法步驟。對于長度至少100個核苷酸的長探針，最后洗滌所述載體物質3次，每次用2xSSC，0.2%SDS優(yōu)選至少在45。C(很低嚴格度)，更優(yōu)選至少在50。C(低嚴格度)，更優(yōu)選至少在55。C(中嚴格度)，更優(yōu)選至少在60。C(中高嚴格度)，甚至更優(yōu)選至少在65。C(高嚴格度)，并最優(yōu)選至少在7(TC(很高嚴格度)洗滌15分鐘。對于長度約15個核苷酸到約70個核苷酸的短探針，嚴格條件被限定為在低于使用根據(jù)Bolton和McCarthy的計算(1962,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)所算出的Tm5°C到10°C在0.9MNaCl,0.09MTris陽HClpH7.6,6mMEDTA,0.5%NP-40,1xDenhardt's溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉，0.1mMATP，以及每毫升0.2mg酵母RNA中預雜交、雜交和雜交后洗滌，之后是標準Southern印跡法步驟。對于長度約15個核苷酸到約70個核苷酸的短探針，將所述載體物質用6xSCC加0.1%SDS洗滌15分鐘一次，并用6xSSC在低于所計算的Tm5°C到10°C洗滌15分鐘各2次。位置編號本文用來限定氨基酸位置的命名基本如WO99/49022所述，即參照來自尸em'o//7ora(y"7CBS686.96的肌醇六磷酸酶氨基酸序列，除了本上下文的編號從WO99/49022的圖1所示的P—lycii序歹llS17開始。因此，本文所用的位置數(shù)與WO99/49022的位置數(shù)相差16(見WO99/49022第14頁26行和圖1)。由此可見，例如本文的SI等同于(equivalentto)WO99/49022的S17，并且本文的F8等同于WO99/49022的F24。序列SEQIDNO:2含有WO99/49022的圖6所示序列的氨基酸-14-409,對應其圖1所示P—lycii序列的氨基酸16-439。因此本上下文以從S1開始到E423終止的SEQIDNO:2作為編號位置的基礎。親代肌醇六磷酸酶，以及變體肌醇六磷酸酶，可含有與SEQIDNO:2相比的延伸(extension),即在其N末端和/或C末端。如果存在延伸，此延伸的氨基酸將按本領域通常地來編號，即對于C末端延伸424，425,426以此類推，而對于N末端延伸-1,-2,-3以此類推。改變，如取代，缺失，插入本文中，下述為多種途徑的實施例，其中至少理i侖上，即在文獻(paper)中的肌醇六磷酸酶變體可來自親代氨基酸序列氨基酸可被另一氨基酸取代；可缺失氨基酸；可插入氨基酸；以及任何數(shù)量的這些改變的任何組合。為本發(fā)明目的，術語取代指包括任何數(shù)量任何種類的此種改變。這是個合理限定，因為例如缺失可為氨基酸，AA,在已知位置nn為空白()取代。可命名此取代為AAnn()。類推，僅在氨基酸，AA下游的已知位置nn插入一個氨基酸，BB,可被命名為()nnaBB.并且如果將兩個氨基酸，BB和CC在位置nn插入氨基酸AA的下游，可命名該取代(兩個取代的結合)為()nnaBB+()nnbCC，因此在親代序列氨基酸nn和皿+1之間產(chǎn)生的所述缺口被指定小寫(lowercase)或腳標字母a、b、c等給前面的位置號，這里為nn。取代基之間的逗號(，)，如例如在A327S，F(xiàn),I,L的取代中指"或"，即A327被S，或F,或I，或L取代。取代間的加號(+),如例如在29S+125D+324A中的取代指"和"，即這三個單個取代在一個相同的肌醇六磷酸酶變體中組合。此限定氨基酸改變的命名也基本如WO99/49022(見其16頁)所述。或者，在不同限定術語取代時，本發(fā)明涉及親代肌醇六磷酸酶的變體,包含在選自本文所指的多組區(qū)域的至少一個位置的改變，其中所述改變在占據(jù)所述位置的氨基酸下游獨立插入至少一個氨基酸；缺失占據(jù)所述位置的氨基酸；和/或用不同氨基酸取代占據(jù)所述位置的氨基酸；其中所述變體具有肌醇六磷酸酶活性，并且每個位置對應于具有SEQIDNO:2氨基酸序列的酶的氨基酸序列的一個位置，并且所述變體與SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并附帶如本文(d)所限。本文中，術語"取代"指至少一個取代。至少一個指一或多個，例如一個，或兩個，或三個，或四個，或五個，或六個，或七個，或八個，或九個，或十個，或十二個，或十四個，或十五個，或十六個，或十/\個，或二十個，或二十二個，或二十四個，或二十五個，或二十八個，或三十個等等，以在大體上包括任何數(shù)量的取代。然而，本發(fā)明變體仍必須，例如與SEQIDNO:2至少75%相同，此百分比是用上述程序測定的。可將所述取代應用到在權利要求1所提到的任何區(qū)域所包括的任何位置，并且也包括包含任何數(shù)量和種類此類取代的組合的變體。本文所用的取代也包括缺失以及延伸，或插入，其可增加對應于SEQIDNO:2的所述序列的長度。在具體實施方案中，取代的數(shù)目最多為200,或175,或150,或125，或120，或110，或106，或105，或100,或90，或80,或70,或60,或50,或40,或30,或25。而且，術語"取代"包括取代為其他十九個天然氨基酸中的任一個，或其他氨基酸，如非天然氨基酸。例如在位置20氨基酸Q的取代包括下述取代中的每一個20A,20C,20D，20E,20F,20G,20H,201,20K,20L，20M,20N，20P,20R,20S，20T，20V，20W，或20Y。附帶地，這是名稱20X的等效物(equivalent),其中X指任何氨基酸。這些取代也能被命名為Q20A,Q20C,Q20X等。以此類推本文提到的每個位置，來具體包括任一本文的此類取代。鑒定相應的位置編號對于尸e"/o一ora(yc"CBS686.96的親代肌醇六磷酸酶，所述位置編號涉及SEQIDNO:2的編號。對于在另一肌醇六磷酸酶的已知位置，無論它是親代還是變體肌醇六磷酸酶，總能在SEQIDNO:2中發(fā)現(xiàn)對應位置。或者，在可選方案中，總能發(fā)現(xiàn)一個位置對應于包含(或具有)所述SEQIDNO:2氨基酸序列的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列上的一個位置。將除了Pem'op/zoraCBS686.96的肌醇六磷酸酶以外的親代肌醇六磷酸酶的氨基酸序列，或反過來將(inturn)變體肌醇六磷酸酶的氨基酸序列命名為SEQ-X。發(fā)現(xiàn)對應SEQIDNO:2的位置N的位置如下親代或變體肌醇六磷酸酶氨基酸序列SEQ-X與上面氨基酸同源性部分所述的SEQIDNO:2序列比對。用下述原理，可以清楚無誤地從所述序列對比得到序列SEQ-X上對應于SEQIDNO:2的位置N的位置。僅作為例子，參照WO99/49022的圖1,假設出于簡單性(simplicity),序歹寸A_pediades,A—fumigatus或T—lanuginosus是例嗦口已與我們々支i殳只于應于本文所述的SEQIDNO:2的P—lycii肌醇六磷酸酶序列比對的變體肌醇六磷酸酶(為本發(fā)明目的它們應該與SEQIDNO:2序列比對)問題1:A_pediades的何位置對應于P—lycii的S17(為本發(fā)明目的，該位置被命名為S1)該答案是A15。問題2:在命名為A—fumigatus的肌醇六磷酸酶的何位置對應于P_lycii的55b()(為本發(fā)明目的，該位置被命名為39b())該答案是S63。問題3:A_pediades的何位置對應于P—lycii的L31(為本發(fā)明目的，該位置被命名為L15)該答案是()30d。問題4:P—lycii的何取代對應于具有取代G3L的假設的(imaginative)T—lanuginosa肌醇六磷酸酶變體？該答案是()-6L(為本發(fā)明目的，該取代被命名為0-22L)。SEQ-X可以是所述(inquestion)肌醇六磷酸酶的成熟部分，或它也可包括信號肽部分，或它可以是所述具有肌醇六磷酸酶活性的成熟肌醇六磷酸酶的片段，例如SEQIDNO:2相同長度的片段，或如本文所迷與SEQIDNO:2進行序列比對時從SI延伸到E423的片段。區(qū)域和位置本文中，術語區(qū)域指親代肌醇六磷酸酶氨基酸序列的至少一個位置，術語位置指此氨基S吏序列的氨基酸殘基。一實施方案中，區(qū)域指親代肌醇六磷酸酶氨基酸序列的一或多個連續(xù)位置，例如所述序列的一個，兩個，三個，四個，五個，六個，七個，八個等等到任何數(shù)目的連續(xù)位置。因此，區(qū)域可僅由一個位置組成，或它可由任何數(shù)目的連續(xù)位置，如例如，位置37，38和39;或位置37，38,39,40和41;或位置37,38,39,40,41,42,43,44,45，46，47和48組成。為本發(fā)明目的，后三個區(qū)域分別被命名為37-39，37-41和37-48。這些區(qū)域或范圍的邊界都^皮包括在所述區(qū)域中。SEQIDNO:2是優(yōu)選的親代肌醇六磷酸酶氨基酸序列的實施例。區(qū)域具體包括每個和每個它所包含(embrace)的位置。例如區(qū)域37-48具體包括所述位置37，38，39,40,41,42，43，44，45,46，47和48中的每個。以此類推應用到本文提到的其它區(qū)域。熱穩(wěn)定性為本發(fā)明目的，在某種多肽上下文所用的術語熱穩(wěn)定的涉及該多肽的熔解溫度Tm，其通過在pH5.5用差示掃描量熱法(DSC)來測定對于熱穩(wěn)定多肽，所述Tm為至少61°C。在具體實施方案中，所述Tm為至少62,63,64,65,66，67，68，69，70，71,72，73,74，75，76,77,77.5,78，79,80,81,82，83,84，85，86，87,88,89，90,91，92，93,94，95,96，97,98，99或100。C。在可選方案中，所述術語熱穩(wěn)定涉及用DSC在pH7.0測定的至少49°C，優(yōu)選至少50，51，52,53，54,55,56，57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68，69,70,71,72,73,74,75,76,77，77.5，78,79，80,81，82,83,84,85,86,87，88,89,或90°C的熔解溫度。在另一可選方案中，所述術語熱穩(wěn)定涉及用DSC在pH3.0測定的至少51°C,優(yōu)選至少52,53,54，55,56,57,58，59，60,61,62，63,64,65,66,67，68,69，70，71,72,73，74，75，76,77,77.5，78,79，80,81,82,83,84,85,86，87,88,89,或90°C的熔解溫度。在另一可選方案中，所述術語熱穩(wěn)定涉及用DSC在pH2.5測定的至少37°C,優(yōu)選至少38,39，40,41，42，43，44,45,46,47,48,49,50,51，52，53,54，55,56,57,58,59,60,61,62，63,64，65，66,67,68,69，70,71,72,73,74,75,76，77,77.5,78,79,80,81，82,83，84,85，86,87,88,89,或90°C的熔解溫度。為測定Tm，可使用通過SDS-PAGE測定純度為至少90%(或91,92,93,94，95,96,97或98%)的多肽樣本。另夕卜，才艮據(jù)在吸光度280nm所測并且基于所述酶的氨基酸序列來計算的消光系數(shù)，所述酶樣本濃度可為0.5-2.5mg/ml蛋白質(或0.6-2.4,或0.7-2.2,或0.8-2.0mg/ml蛋白質)。在所需pH(例如pH5.5,7.0，3.0或2.5)并以恒定加熱速度，例如1,1.5,2,3，4，5，6，7,8,9或10。C/min進行DSC。適宜緩沖液的實施例如實驗部分所述。在使用如本文實施例2所述的設備時優(yōu)選加熱速度的實施例是1.0,1.5或2.0°C/min。對于其他樣品體積較小的其他類型的儀器來說，可用例如3,4，5,6,7，8，9或甚至10°C/min的加熱速度來得到對Tm的可靠估計。在具體實施方案中，本發(fā)明所述肌醇六磷酸酶變體比所述親代肌醇六磷酸酶更加熱穩(wěn)定。此目的優(yōu)選的親代肌醇六磷酸酶是Pe"/op/7ora/yc"CBS686.96肌醇六磷酸酶。比活性術語比活性高，增高或提高指用同種方法測定，比活性是親代肌醇六磷酸酶比活性的至少105%。在具體實施方案中，相對比活性為用同種方法測定為所述親代肌醇六磷酸酶比活性的至少110,115,120,125,130，140,145，150,160,170,180,190，200，220，240,260,280,300，350或甚至400%?；蛘呖蛇x，術語高比活性指比活性為至少200FYT/mg酶蛋白質(EP)。在具體實施方案中，所述比活性為至少300，400,500，600,700，800，900,1000:1100,1200,1300，1400,1500,1600,1700,1800,1900,2000，2100,2200，2300,2400，2500,2600,2700，2800,2900或3000FYT/mgEP。用高純度樣品測定比活性(SDS聚丙烯酰胺凝膠應該顯示存在只有一種成分)。所述酶蛋白質濃度應通過氨基酸分析測定，并且所述肌醇六磷酸酶活性單位為FYT。比活性是所述特定肌醇六磷酸酶變體的性質，它通過每mg酶肌醇六磷酸變體酶蛋白質以單位FYT測定的肌醇六磷酸酶活性來計算。更多細節(jié)見實施例3。'本發(fā)明所述肌醇六磷酸酶變體為熱穩(wěn)定的和/或比活性高。在具體實施方案中它是熱穩(wěn)定的。在另一具體實施方案中它的比活性高。在第三種具體實施方案中它是熱穩(wěn)定的，并且比活性高。在其它具體實施方案中(a)它比親代肌醇六磷酸酶熱穩(wěn)定；(b)比親代肌醇六磷酸酶比活性高；或(c)比親代肌醇六磷酸酶熱穩(wěn)定并且比活性高。低變應原(Low國allergenic)變體具體實施方案中，本發(fā)明所述肌醇六磷酸酶變體(也)是低變應原變體，它被設計用來引發(fā)(invoke)與動物，包括人接觸后下降的免疫應答?？衫斫庑g語免疫應答為由接觸該肌醇六磷酸酶變體的動物免疫系統(tǒng)引起的任何反應。一種免疫應答是在接觸動物內的造成IgE水平升高的變應原反應。低變應原變體可用本領域已知技術制備。例如所述肌醇六磷酸酶變體可與屏蔽(shielding)參與免疫應答的所述肌醇六磷酸酶變體的部分或表位的聚合物部分(moieties)偶聯(lián)。與聚合物偶聯(lián)可能涉及聚合物與所述肌醇六磷酸酶變體的體外化學偶連，例如如W096/17929,WO98/30682,WO98/35026,和/或WO99/00489所述。偶連還可或另外可替換地涉及聚合物與所述肌醇六磷酸酶變體的體內偶連。實現(xiàn)該偶連可通過編碼所述肌醇六磷酸酶變體的核苷酸序列的遺傳工程化，在所述肌醇六磷酸酶變體中插入編碼附加糖基化位點的共有序列，并在能夠糖基化所述肌醇六磷酸酶變體的宿主表達此肌醇六磷酸酶變體，見例如WO00/26354。另一種提供低變應原變體的方法是遺傳工程化編碼所述肌醇六磷酸酶變體的核苷酸序列從而造成所述肌醇六磷酸酶變體自身-寡聚體化(sdf-oligomerize)，結果為肌醇六磷酸酶變體單體可屏蔽其它肌醇六磷酸酶變體單體的表位并因而降低所述寡聚體的抗原性。該產(chǎn)物及它們的制備物例如見WO96/16177所述。參與免疫應答的表位可用多種方法鑒定如WO00/26230和WO01/83559所述的噬菌體展示方法，或EP561907所述的隨機途徑。一旦鑒定了表位，就可改變其氨基酸序列來生產(chǎn)免疫性質改變的所述肌醇六磷酸酶變體，它所用的是已知基因操縱技術如定點誘變(見例如WO00/26230，WO00/26354和/或WO00/22103)和/或可足夠接近所述聚合物的表位來進行聚合物偶連以屏蔽該表位。核酸序列和構建體本發(fā)明也涉及包含編碼本發(fā)明肌醇六磷酸酶變體的核酸序列的核酸序列。術語"分離的核酸序列"指基本無其他核酸序列的核酸序列，例如，通過瓊脂糖凝膠電泳測定純度至少約20%,優(yōu)選純度至少約40%，更優(yōu)選純度至少約60%，甚至更優(yōu)選純度至少約80%,并且最優(yōu)選純度至少約90%。例如可通過遺傳工程中應用的標準克隆方法，以將所述核酸序列從其天然位置重新定位到它將被復制的不同位置而獲得分離的核S臾序列。所述克隆方法可涉及剪切分離包含編碼所述多肽的核酸序列的所需核酸片段，將所述片段插入載體分子，并將所述重組載體并入復制所述核酸序列的多拷貝或克隆的宿主細胞。所述核酸序列可來自基因組，cDNA,RNA，半合成的，合成的來源，或其任何組合。制備本發(fā)明核酸序列可通過向親代肌醇六磷酸酶編碼序列或其亞序列引入至少一個突變，其中所述突變核酸序列編碼變體肌醇六磷酸酶。向所述核酸序列引入突變來將一個核香酸變換為另一個核苷酸，這可用任一本領域已知方法通過定點i秀變，例如通過定點i秀變，通過隨4幾i秀變，或通過4參雜(doped),摻入(spiked),或定域(localized)隨機誘變來完成。隨機誘變適合作為定域或區(qū)域特異的隨機誘變來操作，所述的誘變位于翻譯成所述氨基酸序列的基因的至少三個部分，或在整個基因內。當用寡核苷酸進行所述誘變時，在待改變位置上合成所述寡核苷酸的過程中可將三個非-親代核苷酸摻雜或摻入所述寡核苷酸?？蛇M行摻雜或摻入以避免不必需氨基酸的密碼子?？蓪⑺鰮诫s或摻入的寡核苷酸并入如編碼所述肌醇六磷酸酶的DNA,通過應用認為合適的例如，PCR，LCR或任何DNA聚合酶和連接酶的任何技術。優(yōu)選，用"恒定(constant)隨機摻雜"進行所述摻雜，其中每個位置的野生型和突變的百分比都被預先限定。并且，該摻雜可針對引入某種核苷酸的偏好，并進而優(yōu)先引入一或多個特定氨基酸殘基?？蛇M行摻雜，例如，從而在每個位置允許引入90%野生型和10%突變。選擇摻雜方案時另外的考慮是基于遺傳和蛋白質-結構限制因素。所述隨機誘變可有利位于所述親代肌醇六磷酸酶的一部分。當所述酶的某些區(qū)域已經(jīng)被鑒定為對所述酶的給定性質特別重要時，這，例如可以是有利的。提供本發(fā)明變體的可選方法包括例如，如W095/22625或WO96/00343所述的基因改組，和如EP897985所述的共有衍生(consensusderivation)方法。核酸構建體核酸構建體含有本發(fā)明核酸序列，其可操縱連接到一或多個控制序列，所述控制序列在與所述控制序列相容的情況下在合適宿主細胞中指導(direct)所述編碼序列的表達。表達將被理解為包括任何涉及生產(chǎn)所述多肽的方法，包括但不限于轉錄，轉錄后修飾，翻譯，翻譯后修飾和分泌。表達載體編碼本發(fā)明肌醇六磷酸酶變體的核酸序列可使用表達載體表達，所述的表達載體通常包括編碼啟動子，操縱子，核糖體結合位點，翻譯起始信號和可選抑制子基因或多種激活子(activator)基因的控制序列。所述攜帶編碼本發(fā)明葡萄糖淀粉酶(glucoamylase)變體的DNA序列的重組表達載體可以為任何載體，其可方便地用重組DNA方法處理，并且選擇載體通常依賴于它所引入的宿主細胞。此載體可以在引入宿主細胞時整合到所述宿主細胞基因組并與它所整合到的染色體一起復制。所述肌醇六磷酸酶變體也可與至少一種動物飼料所需的其它酶共表達,如木聚糖酶，內切葡聚糖酶(endoglucanase),內切-1，3(4)-(3-葡聚糖酶(endo-l，3(4)-beta匿glucanase),禾口/或蛋白酶。it酶可乂人不同載體，乂人一個載體，或混合使用兩種技術共表達。當用不同載體時，該載體可有不同選擇性標記和不同的復制起點。當只使用一種載體時，該基因可從一或多個啟動子表達。如果在單啟動子(二或多順反子)調節(jié)下克隆，所述基因克隆的順序會影響所述蛋白質的表達水平。所述肌醇六磷酸酶變體也可作為融合蛋白質表達，即編碼所述肌醇六磷酸酶變體的基因已經(jīng)按讀碼框融合到編碼其他蛋白質的基因。此蛋白質可以是另一種酶或來自其它酶的功能域。宿主細胞本發(fā)明也涉及重組宿主細胞，包含在多肽重組生產(chǎn)中有利使用的本發(fā)明核酸序列。包含本發(fā)明核酸序列的載體是引入宿主細胞所以保持所述載體作為染色體整合體或自身復制染色體外載體。術語"宿主細胞"包括任何由于復制過程中出現(xiàn)突變而不等同于親代細胞的親代細胞后代。選擇宿主細胞很大程度上依賴于編碼所述多肽的基因及其來源。所述宿主細胞可以是單細胞微生物，例如，原核細胞，或非單細胞微生物，例如，真核細胞如動物，哺乳動物，昆蟲，植物，或真菌細胞。優(yōu)選動物細胞是非人動物細胞。在優(yōu)選實施方案中，所述宿主細胞是真菌細胞，或酵母細胞，如念珠菌屬(Candida),漢森氏酵母屬(Hansenula)，克魯維酵母屬(Kluyveromyces),畢赤酵母屬(Pichia)，酵母菌屬(Saccharomyces)，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，或西洋蓍霉(Yarrowia)纟田月包。所述真菌的宿主細月包可以是絲狀真菌細胞，如一種細胞，包括但不限于，枝頂孢屬(Acremonium),曲霉屬(Aspergillus),鐮孑包菌屬(Fusarium)，腐質霉屬(Humicola),毛霉屬(Mucor)，Myceliophthora,鏈孢霉屬(Neurospora),青霉菌屬，梭孑包殼屬(Thielavia),Tolypocladium,或木霉屬(Trichoderma)?？捎玫膯渭毎羌毦毎绺锾m氏陽性細菌，包括但不限于芽孢桿菌(Bacillus)細胞，或鏈霉菌細胞，或乳酸細菌細胞；或革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌和假單胞菌(Pseudomonassp)。乳酸細菌包括但不限于乳球菌屬(Lactococcus),乳酉吏才干菌屬(Lactobacillus)，白耳關i朱菌屬(Leuconostoc),4連3求菌屬，片3求菌屬(Pediococcus),和腸5求菌屬(Enterococcus)的菌種。生產(chǎn)方法
技術領域：
：本發(fā)明也涉及生產(chǎn)本發(fā)明肌醇六磷酸酶的方法包含(a)在有助于生產(chǎn)所述肌醇六磷酸酶變體條件下培養(yǎng)宿主細胞；和(b)回收所述肌醇六磷酸酶變體。本發(fā)明生產(chǎn)方法中，在適合生產(chǎn)所述多肽的營養(yǎng)培養(yǎng)基中用本領域已知方法培養(yǎng)所述細胞。例如可在合適培養(yǎng)基中，在允許所述多肽表達和/或分離的條件下，在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐里用搖瓶培養(yǎng)，小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)，分批(batch)，補料分批(fed-batch)，或固態(tài)(solidstate)發(fā)酵)培養(yǎng)所述細胞。所述培養(yǎng)在包含碳和氮源和無機鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基，用本領域已知方法進行。合適培養(yǎng)基可商購或可根據(jù)公開組分(例如，見美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)來制備。如果所述肌醇六磷酸酶分泌入所述營養(yǎng)培養(yǎng)基，可從所述培養(yǎng)基直接回收它。如其為不分泌型，可從細胞裂解物回收它。所得肌醇六磷酸酶可用本領域已知方法回收。例如可用常用方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基回收它，所述方法包括但不限于，離心，過濾，提取，噴霧干燥(spray-drying),蒸發(fā)，或沉淀。本發(fā)明肌醇六磷酸酶可用多種本領域已知方法純化，所述方法包括但不限于，層析(chromatography)(例如，離子交換，親和，疏水，色語聚焦(chromatofocusing),和尺寸才非阻(sizeexclusion))，電〉永方法(例^口，制備等電聚焦)，差別溶解度(differentialsolubility)(例如，硫酸銨沉淀)，SDS-PAGE，或才是取法(見例如，ProteinPurification,J.-C.JansonandLarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發(fā)明也涉及用編碼具有本發(fā)明肌醇六磷酸酶活性多肽的核酸序列轉化的轉基因植物，植物部分，或植物細胞從而表達和產(chǎn)生回收量(recoverablequantities)的所述多肽。所述多肽可從植物或植物部分回收。或者，含有所述重組多肽的植物或植物部分可被如此應用來提高食物或銅料的質量，例如，提高營養(yǎng)價值，可口性(payability)和流變學(rheological)性質，或石皮壞抗營養(yǎng)(antinutritive)因子。在具體實施方案中，所述多肽靶向種子中的胚乳貯藏泡(endospermstoragevacuoles)。可以通過合成帶有合適信號肽的前體來得到它，見Horvath等PNAS，F(xiàn)eb.15,2000，vol.97,no.4,p.1914-1919。所述轉基因植物可為雙子葉植物或單子葉植物或其工程化變體。單子葉才直#勿實施i"列為草,^口草i也早4禾(meadowgrass)(莓系牧草(bluegrass)，Poa)，牧草(foragegrass)如羊茅屬(festuca),黑麥草屬(lolium)，溫帶草(temperategrass)，如禾草屬(Agrostis)，和谷物，例如，小麥，燕麥，黑麥(rye)，大麥，稻，高粱(sorghum),和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實施例為煙草，豆類(legume),如羽扇豆(lupin)，馬鈴薯，甜菜，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean),和十字花科植物(十字花(Brassicaceae)科)，如花椰菜，油菜籽，和緊密相關的模型生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。例如美國專利5,689,054和美國專利6,111,168所述的低肌醇六磷酸鹽植物是工程化植物的實施例。植物部分的實施例是莖，愈傷組織(callus)，葉，根，果實，種子和塊莖。特定植物組織如葉綠體，質外體，線粒體，液泡，過氧化物酶體和胞質也被認為是植物部分。并且，任何植物細胞，無論來源于何種組織都被認為是植物部分。本發(fā)明范圍也包括此種植物，植物部分和植物細胞的后代。表達本發(fā)明多肽的轉基因植物或植物細胞可以根據(jù)本領域已知方法構建。筒言之，構建所述植物或植物細胞是通過引入一或多個編碼本發(fā)明多肽的表達構建體到植物宿主基因組并將所得被修飾植物或植物細胞增殖(propagate)到轉基因植物或植物細胞。方便地，所述表達構建體為含有編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的核酸構建體，其可操縱地連接到在優(yōu)選的植物或植物部分表達所述核酸序列所需的合適調控序列。并且，所述表達構建體可含有用于鑒定已整合入表達構建體的的DNA引入方法)的選擇性標記。例如基于需要表達所述多肽的時間地點和方式來確定調控序列的選擇,如啟動子和終止子序列及可選信號或運輸(transit)序列。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因表達可以是組成型的(constitutive)或誘導型的(inducible),或可以是發(fā)育特異性的(developmental),階段特異性的(stage)或組織特異性的，并且所述基因產(chǎn)物可以靶向特定組織或植物部分如種子或葉子。調控序列，例如見Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所述。對于組成型表達，可用所述35S-CaMV啟動子(Franck等，1980,Cell21:285-294)。器官特異性啟動子可為，例如來自儲藏(storage)累積(sink)組織如種子，馬鈴薯塊莖和果實的啟動子(Edwards&Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或來自代謝累積組織如分生組織的啟動子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863-878),種子特異性啟動子如來自稻的谷蛋白，醇溶谷蛋白，球蛋白，或白蛋白啟動子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885-889),來自豆球蛋白B4的蠶豆(Viciafaba)啟動子和來自蠶豆的未知種子蛋白質基因(Conrad等，1998,JournalofPlantPhysiology152:708-711)，來自種子油(oil)體蛋白質(bodyprotein)的啟動子(Chen等，1998,PlantandCellPhysiology39:935-941)，來自Brassicanapus的貯藏蛋白質napA啟動子，或任何其它本領域已知的種子特異性啟動子，例如，如WO91/14772所述。另外，所述啟動子可以是葉子特異性啟動子如來自稻或西紅柿的rbcs啟動子(Kyozuka等，1993,PlantPhysiology102:991-1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤曱基轉移酶基因啟動子(MitraandHiggins,1994,PlantMolecularBiology26:85-93),或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等,1995，MolecularandGeneralGenetics248:668-674)，或創(chuàng)傷誘發(fā)(woundinducible)啟動子如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993,PlantMolecularBiology22:573-588)。也可用啟動子增強子元件來使所述酶在植物中較高表達。例如，所述啟動子增強子元件可為位于所述啟動子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間的內含子。例如，Xu等，1993，見上文公開了稻肌動蛋白l基因的首個內含子在增強表達中的用途。又及，所述密碼子用途可根據(jù)所述植物種最優(yōu)化來提高表達(參照上面Horvath等)。所述表達構建體的可選標記基因和任何其它部分可從本領域選擇。根據(jù)本領域常用技術將所述核酸構建體整合入所述植物基因組，包括土壤桿菌-介導的轉化，病毒-介導的轉化，顯微注射，粒子轟擊，基因槍(biolistic)轉化和電穿孑L(Gasser等，1990,Science244:1293;Potrykus，1990,Biol/Technology8:535;Shimamoto等，1989,Nature338:274)。現(xiàn)在根癌土壤桿菌-介導的基因轉移是產(chǎn)生轉基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(綜述可見HooykasandSchilperoort，1992,PlantMolecularBiology19:15-38)。然而它也可用于轉化單子葉植物，盡管其它轉化方法通常對于這些植物優(yōu)選?，F(xiàn)在產(chǎn)生轉基因單子葉植物優(yōu)選方法是胚胎愈傷組織或發(fā)育中胚芽的粒子轟擊(用轉化DNA包被的顯微金或鎢粒子)(Christou,1992，PlantJournal2:275-281;Shimamoto,1994,CurrentOpinionBiotechnology5:158-162;Vasil等，1992，Bio/Technology10:667-674)。轉化單子葉植物的替代方法是基于如Omirulleh等，1993,PlantMolecularBiology21:415-428所述的原生質體轉化。根據(jù)本領域熟知方法在轉化后，選擇已引入了表達構建體的轉化體并再生(regenerate)入完整才直物。本發(fā)明也涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，其包含(a)在有助于生產(chǎn)所述肌醇六磷酸酶變體的條件下，培養(yǎng)包含編碼本發(fā)明肌醇六磷酸酶變體的核酸序列的轉基因植物或植物細胞；和(b)回收所述肌醇六磷酸酶變體。作為表達宿主的動物本發(fā)明也涉及轉基因，非人動物，和其產(chǎn)物或元件，其實施例是體液如奶和血，器官，肉和動物細胞。表達蛋白質的技術，例如在哺乳動物細胞中在本4貞i或已4口,見侈'B口手冊ProteinExpression:APracticalApproach,HigginsandHames(eds)，OxfordUniversityPress(1999)及三本其他的系列手冊涉及基因轉錄，RNA加工作用，和翻譯后加工作用。通常制備轉基因動物，用編碼本發(fā)明肌醇六磷酸酶變體的核酸序列轉化選定動物的選定細胞從而表達并產(chǎn)生該力/L醇六^l酸酶變體?？?人所述動物，例如/人)難性動物的奶回收所述肌醇六磷酸酶變體，或可能其表達對動物自身有利，例如輔助動物的消化。為產(chǎn)生為從該動物的奶回收所述肌醇六磷酸酶變體的轉基因動物，可將編碼所述肌醇六磷酸酶變體的基因插入所述動物的受精卵，例如通過使用含有合適奶蛋白質啟動子的轉基因表達載體，及編碼所述肌醇六磷酸酶變體的基因。將所述轉基因表達載體顯微注射到受精卵，并優(yōu)選永久整合到所述染色體。一旦所述卵開始生長并分裂，將所述可能的(potential)胚胎植入替代(surrogate)母體，并鑒定出攜帶所述轉基因的動物。然后可用常用飼養(yǎng)方法(breeding)繁殖所得動物。可從所述動物的奶純化肌醇六磷酸酶變體，見例》口Meade,H.M.等(1999):ExpressionofRecombinantProteinsinthemilkoftransgenicanimal,GeneExpressionsystems:UsingnaturefortheartofExpression.J.M.FernandezandJ.RHoeffler(eds.)，AcademicPress?；蛘撸瑸楫a(chǎn)生在其體細胞和/或生殖細胞基因組中攜帶核酸序列的轉基因非人動物，該核酸序列包括的異源轉基因構建體包括編碼所述肌醇六磷酸酶變體的轉基因，可將所述轉基因可操作連接到首個調控序列用于唾液腺來特異性表達所述肌醇六磷酸酶變體，如WO2000064247所公開。動物飼料和動物飼料添加劑為本文目的，術語動物包括所有動物，包括人。在具體實施方案中，所述肌醇六磷酸酶變體和本發(fā)明組合物可用作非人動物的飼料添加劑。動物實施例為非反芻動物和反芻動物，如牛，羊和馬。在具體實施方案中，所述動物為非反芻動物。非反芻動物包括單胃的(mono-gastric)動物，例如豬(包括但不限于小豬，生長(growing)豬和母豬)；家禽如火雞和雞(包括但不限于肉用仔雞(broilerchicks),下蛋的母雞)；小牛犢；和魚(包括但不限于鮭魚)。術語祠料或飼料組合物指任何適合或為了動物攝入的化合物，制備物，混合物，或組合物。將所述飼料喂給動物可在進食之前，之后或同時。優(yōu)選后者。本發(fā)明組合物，在為了添加到動物飼料中時，可被稱為動物飼料添加劑。此添加劑常含有所述的肌醇六磷酸酶變體，優(yōu)選以穩(wěn)定(stabilized)液體或干燥組合物的形式。所述添加劑可含有其他動物飼料的組分或成分。所述動物飼料的預混合物(pre-mix)為此動物飼料添加劑的具體實施例。預混合物可含有所述的酶，及另外至少一種維生素和/或至少一種礦物質。因此，在具體實施方案中，除了多肽組分，本發(fā)明組合物可含有或包含至少一種脂溶性維生素，和/或至少一種水溶性維生素，和/或至少一種痕量礦物質。也可包括至少一種常量(macro)礦物質。脂肪可溶性維生素的實施例是維生素A,維生素D3，維生素E，和維生素K,例如維生素K3。水溶性維生素的實施例是維生素B12,生物素和膽堿，維生素B1，維生素B2，維生素B6，維生素PP(niacin),葉酸和泛酸鹽(panthothenate)，例如D-泛酸釣。痕量礦物質的實施例是錳，鋅，鐵，銅，碘，硒和鈷。常量礦物質的實施例是鈣，磷和鈉。另夕卜，可選的伺料添加成分是著色劑(colouringagents)，芳香化合物，穩(wěn)定劑，附加酶，和抗微生物肽。本發(fā)明組合物的附加酶成分包括至少一種具有木聚糖酶活性的多肽；和/或至少一種具有內切葡聚糖酶活性的多肽；和/或至少一種具有內切_1,3(4)-(3-葡聚糖酶活性的多肽；和/或至少一種具有蛋白酶活性的多肽?？捎萌魏卧囼灉y定木聚糖酶活性，其中所用底物包括木聚糖中的1，4-卩-D-木糖苷內部連接(endo-linkage)。可得到用于測定木聚糖酶活性的不同類型的底物，例如Xylazyme交聯(lián)的阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)片劑(來自MegaZyme)，或偶氮(azo)-染色的阿拉伯木聚糖的不可溶粉末分散體(dispersion)和溶液?？捎萌魏伪绢I域已知內切葡聚糖酶試驗測定內切葡聚糖酶活性。例如可用多種含纖維素或p-葡聚糖的底物。內切葡聚糖酶試驗可用AZCL-大麥卩-葡聚糖，或優(yōu)選(l)AZCL-HE-纖維素，或(2)偶氮-CM-纖維素作為底物。在兩種情況，所述底物降解后在OD595分光光度計測量(見對于AZCL-多糖用于內(endo)-水解酶試-險在http:〃www.megazvme.com/booklets/AZCLPOL.pdf的Megazyme方法)?？捎萌魏伪绢I域已知的內切-1，3(4)-(3-葡聚糖酶試驗測定內切-1，3(4)-(3-葡聚糖酶活性。測定內切-1,3(4)-(3-葡聚糖酶活性的優(yōu)選底物是交聯(lián)的偶氮染色的(3-葡聚糖大麥底物，其中所述測定是基于分光光度計測量的測定原理?？捎萌魏卧囼灉y定蛋白酶活性，其中所用底物包括與所述蛋白酶特異性有關的肽鍵。蛋白酶底物的實施例是酪蛋白，和pNA-底物，如Suc-AAPF-pNA(例如購自SigmaS-7388)。另一實施例是ProtazymeAK(MegazymeT-PRAK制備為片劑的天青精(azurine)染色的叉聯(lián)酪蛋白)。WO01/58276的實施例2描述了適合的蛋白酶試驗。優(yōu)選試驗為實施例2D的Protazyme試驗(如上通常所述按所述蛋白酶調節(jié)所述pH和溫度)。為試驗木聚糖酶，內切葡聚糖酶，卩-l,3(4)-葡聚糖酶和蛋白酶的活性，按所述酶調節(jié)試驗pH和試驗溫度(優(yōu)選接近最適pH的pH,和接近最適溫度的溫度)。優(yōu)選試驗pH在2-10,優(yōu)選3-9的范圍，更優(yōu)選pH3或4或5或6或7或8，例如pH3或pH7。優(yōu)選試驗溫度在20-80°C,優(yōu)選30-80。C,更優(yōu)選40-75°C，甚至更優(yōu)選40-60°C的范圍，優(yōu)選40或45或50°C。參照合適遮蔽物(blind),例如緩沖遮蔽物限定所述酶活性?？刮⑸镫膶嵤├?AMP's)是CAP18,亮殺菌素A(LeucocinA),Tritrpticin,內源性抗微生物多肽-1(Protegrin-1)，Thanatin,乳鐵蛋白(Lactoferrin)，Lactoferricin和Ovispirin長口Novispirin(RobertLehrer，2000),及其保留抗微生物活性的變體或片段。其他實施例是抗真菌的多肽(AFP's),如來自巨大曲霉(^^e^/〃wg/g朋few)和黑曲霉的那些多肽，及其保留抗真菌活性的變體和片段，見WO94/01459和PCT/DK02/00289所公開。在具體實施方案中，本發(fā)明動物飼料添加劑預期以0.0010-12.0%，或0.0050-11.0%,或0.0100-10.0%;更特別0.05-5.0%;或0.2-1.0%(%指每100克伺料中的克添加劑)的水平包括(或處方認為必須包括的)在動物飲食或伺料中。對于預混合物特別是這種情況。因此，通過乘以同種組分在最終伺料內(in-feed)的濃度，分別為10-10000;20-2000;或100_500(指上述三個百分比所包括的間隔)可得到所述動物飼料添加劑，例如所述預混合物的單組分濃度。重要飼料組分的最終飼料內濃度可反映所述動物的營養(yǎng)需要，其通常為有經(jīng)驗的營養(yǎng)學家所知，并且在如下公開文獻中提供NRC，Nutrientrequirementsinswine，ninthrevisededition1988，subcommitteeonswinenutrition,committeeonaminalnutrition,boardofagriculture,nationalresearchcouncil.NationalAcademyPress,Washington,D.C.1988;和NRC,Nutrientrequirementsofpoultry,ninthrevisededition1994,subcommitteeonpoultrynutrition,committeeonaminalnutrition,boardofagriculture,nationalresearchcouncil,NationalAcademyPress,Washington,D.C.，1994。所述肌醇六磷酸酶變體當然應該以有效量，即以足以提高所述飼料營養(yǎng)價值的量應用到動物飼料中?，F(xiàn)在預期它以下述劑量范圍給藥0.01-200;或0.01-100;或0,05-100;或0.05-50;或0.10-10-所有這些范圍均以每千克伺料毫克酶蛋白質(ppm)表示。為測定每千克飼料或飼料添加劑的毫克肌醇六磷酸酶蛋白質，從所述飼料組合物或所述飼料添加劑純化所述酶，并且用相關試驗測定所述純化酶的比活性。也用相同試驗測定所述飼料組合物或所述飼料添加劑的肌醇六磷酸酶活性，并且基于這兩項測定，計算每千克飼料的毫克肌醇六磷酸酶蛋白質劑量。當然，如果存在用于制備所述飼料添加劑或所述飼料的肌醇六磷酸酶變體樣品，就從此樣品測定比活性(不需要從所述飼料組合物或添加劑純化該酶)?？筛鶕?jù)本領域已知方法制備本發(fā)明組合物，例如通過將所述肌醇六磷酸酶變體與附加成分(如果有)混合。動物飼料組合物或飲食的蛋白質含量相對較高。根據(jù)本發(fā)明的動物飼料組合物具有的粗制(crude)蛋白質含量為50-800，或75-700，或100-600,或110-500,或120-490g/kg,并還含有本發(fā)明組合物。另外，或可替換地(對于上述粗制蛋白質的含量)，本發(fā)明動物飼料組合物代謝能量(metabolisableenergy)含量為10-30,或11-28,或11-26,或12-25MJ/kg;和/或4丐含量為0.1-200，或0.5-150,或1-100,或4-50g/kg;和/或可利用的(available)磷含量為0.1-200,或0.5-150,或1-100,或1-50，或1-25g/kg;和/或曱硫氨酸含量為0.1-100,或0.5-75，或1-50,或1-30g/kg;和/或曱硫氨酸加半胱氨酸含量為0.1-150，或0.5-125,或1-80g/kg;和/或賴氨酸含量為0.5-50，或0.5-40，或l-30g/kg。粗制蛋白質以氮(N)乘因子6.25來計算，即如AnimalNutrition,4thedition,Chapter13(Eds.P.McDonald,R.A.Edwards和J.F.D.Greenhalgh,LongmanScientificandTechnical,1988,ISBN0-582-40903-9)所述，粗制蛋白質(g/kg)=N(g/kg)x6.25。此氮含量可用凱氏(Kjeldahl)方法(A.O.A.C.，1984,OfficialMethodsofAnalysis14thed.，AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)測定。而且可用其他方法，如所謂的Dumas方法，在該法中所述樣品在氧中燃燒并將所形成的氮氣量作為氮來分析并重新計算。i十算^i射能量可基于NRCpublicationNutrientRequirementsofSwine(1988)pp.2-6，禾口theEuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs,Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension,7361DABeekbergen,TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&looijenbv,Wageningen.ISBN90-71463-12-5。在一具體實施方案中，本發(fā)明所述動物伺料組合物包含至少一種植物蛋白質或蛋白質源。植物蛋白質或蛋白質源的實施例為來自豆科(leguminosae)和芥科(brassica)的大豆，豌豆和油菜籽，以及谷物如大麥，玉蜀黍(玉米)，燕麥，稻，黑麥，高粱和小麥。在另一具體實施方案中，本發(fā)明所述動物祠料組合物包含0-80%玉蜀黍；和/或0-80。/。高粱；和/或0-70°/。小麥；和/或0-70%大麥；和/或0-30%燕麥；和/或0-40%大豆粉(meal);和/或0-10%魚粉(fishmeal);和/或0-20%乳清。動物飲食可以例如被生產(chǎn)為糊狀(mash)飼料(無顆粒(non-pelleted))或顆粒飼料。通常，混合所碾磨的(milled)飼料-原料(stuff)并根據(jù)所述種類的說明書來添加足夠量的必需維生素和礦物質。本發(fā)明所述肌醇六磷酸酶變體可以固體或液體酶制劑的形式，或飼料添加劑的形式，如預混合物來添加。通常在混合步驟前或之中添加固體組合物；并且通常在造粒(pellet)步驟后添加液體組合物。當將本發(fā)明所述肌醇六磷酸酶變體添加到動物飼料時，會導致所述飼料的營養(yǎng)價值提高，例如所述動物的生產(chǎn)率(growthrate)和/或體重增加和/或如]料轉化(conversion)(即攝取飼料重量相對體重增加)提高。這些結果可以反過來由于一或多個下述作用所述肌醇六磷酸的磷酸鹽部分螯合二價和三價陽離子如金屬離子，即必需營養(yǎng)離子鈣，鐵，鋅和鎂以及所述痕量礦物質錳，銅和鉬。除外，所述肌醇六磷酸也在某種程度上通過靜電作用結合蛋白質。在所述蛋白質等電點，pI以下的pH時，帶正電荷的蛋白質直接結合所述肌醇六磷酸鹽。在pI以上的pH時，帶負電荷的蛋白質通過金屬離子結合到肌醇六磷酸鹽。肌醇六磷酸及其鹽，肌醇六磷酸鹽通常不會被代謝(metabolized),因為它們不從胃腸系統(tǒng)吸收，即從其中的磷，所述螯合金屬離子，和所結合的蛋白質營養(yǎng)上都不可利用(nutritionallyavailable)。因此，因為磷是所有有機體生長的必需元素，食物和飼料制劑需要補充無機磷酸鹽。通常也必須補充營養(yǎng)必需離子如鐵和鉤。并且另外，因為通過肌醇六磷酸結合了蛋白質，已知飲食的營養(yǎng)價值降低。在具體實施方案中所述體重增加為所述對照的至少101，102,103，104,105,106,107,108,109，或至少110%(無酶添加)。在另一具體實施方案中所述飼料轉化為與所述對照相比最多(或不超過)99,98，97,96,95，94,93,92，91或最多卯％(無酶添加)。所述本發(fā)明組合物也可體外使用，例如來處理植物蛋白質。本文所用的術語植物蛋白質涉及任何化合物，組合物，制劑或混合物，其包括至少一個衍生自或來自植物的蛋白質，包括修飾的蛋白質和蛋白質衍生物。在具體實施方案中所述植物蛋白質的蛋白質含量為至少10,20，30，40，50,或60%(w/w)。植物蛋白質或蛋白質源的實施例為谷物如大麥，小麥，黑麥，燕麥，玉蜀黍(玉米)，稻和蜀黍。其它實施例為來自豆科和芥科的大豆粉，豌豆和油菜籽粉。所述植物蛋白質或蛋白質源通常在溶劑，例如水性溶劑如水中懸浮，并由所述肌醇六磷酸酶變體及附加酶(如果有)的性質適當注意調節(jié)所述pH和溫度值。繼續(xù)所述酶反應直到達到所需效果，之后可通過滅活所述酶，例如通過熱處理步驟，來使反應可能停止或可能不停止。在本發(fā)明處理方法的另一具體實施方案，維持所述酶作用指，例如將所述酶組合物加入植物蛋白質或蛋白質源，但如此來說所述酶活性不被改變(switched)直到后面，一旦建立適當?shù)姆磻獥l件，或一旦滅活任何酶抑制物，或無論應用什么其他途徑來推遲所述酶的作用所需要時。產(chǎn)生肌醇六磷酸酶變體的方法另一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生親代肌醇六磷酸酶的變體的方法，其中所述變體比所述親代肌醇六磷酸酶熱穩(wěn)定性和/或比活性更高，所述方法包含(d)隨機誘變編碼所述親代肌醇六磷酸酶的DNA序列；(f)篩選表達肌醇六磷酸酶變體的宿主細胞，該變體比所述親代肌醇六磷酸酶熱穩(wěn)定性和/或比活性更高。本發(fā)明上述方法的步驟(d)如實驗部分所述，優(yōu)選用摻雜引物(dopedprimer)進行。在優(yōu)選實施方案中，上述方法包括下述在上述步驟(d)-(f)前的附加步驟(a)建立親代肌醇六磷酸酶的3D結構；(b)在升高的溫度下對(a)的3D結構進行MD模擬；(c)鑒定在所述高流動性(各向同性波動)親代肌醇六磷酸酶的氨基酸序列中的區(qū)域并建議隨機誘變這些，其中至少一個步驟(c)中鑒定的區(qū)域在步驟(d)中被耙向(targeted)。所述(a)的結構可用同源建模(modelling)建立。優(yōu)選模型是圖1的結構。高溫的實施例是一或多個下述溫度300K,350K,400K,450K,500K,和550K。本發(fā)明這方面，所述親代肌醇六磷酸酶可以是野生型親代肌醇六磷酸酶，或其等位變體，或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段，或其成熟部分，或其變體，或在其基礎上設計的遺傳工程化或合成的多肽。下述為優(yōu)選野生型親代肌醇六磷酸酶的實施例真菌的肌醇六磷酸酶，如絲狀真菌的肌醇六磷酸酶，或酵母肌醇六磷酸酶。酵母肌醇六磷酸酶實施例是US5830732所述的許旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)肌醇六磷酸酶。絲狀真菌的肌醇六磷酸酶實施例是來自子嚢菌門或擔子菌門的肌醇六磷酸酶(分別為子嚢菌肌醇六磷酸酶，或擔子菌肌醇六磷酸酶)。子嚢菌肌醇六磷酸酶實施例是那些來自曲霉屬的菌抹，例如泡盛曲霉PHYA(SWISSPROTP34753,Gene133:55-62(1993))，黑曲霉(無花果曲霉)PHYA(SWISSPROTP34752,EP420358,Gene127:87-94(1993)),泡盛曲霉PHYB(SWISSPROTP34755,Gene133:55-62(1993》，黑曲霉PHYB(SWISSPROTP34754,Biochem.Biophys.Res.Commun.195:53-57(1993));或翹孢霉屬的菌抹，例如構巢棵孢殼PHYB(SWISSPROT000093,Biochim.Biophys.Acta1353:217-223(1997》；或嗜熱霉屬(腐質霉屬)的菌抹，例如WO97/35017所述的細毛嗜熱霉肌醇六磷酸酶。其他子嚢菌肌醇六磷酸酶的實施例7>開在EP684313(例如來自煙曲霉，土曲霉，和嗜熱毀絲霉的菌抹；JP11000164(來自青霉菌屬菌抹的肌醇六磷酸酶)；US613"02(來自曲霉菌抹的肌醇六磷酸酶)，及WO98"3480(MW70SCWS肌醇六磷酸酶)中。擔子菌肌醇六磷酸酶的實施例是所述來自巻邊枉蒜CPaxz7/ws/wvo/由力，絨毛檢菌(rramefes戸Z)esce"力，々raqy6e/eAWM和戶em'o;/7ora/yc"(見WO98/28409)的肌醇六磷酸酶。也為本發(fā)明這方面的目的，最優(yōu)選所述擔子菌肌醇六磷酸酶，并且很優(yōu)選的親代肌醇六磷酸酶是來自PeniphoralyciiCBS686.96的肌醇六磷酸酶(以及上面通常所述的其等位變體，片段等，以及同源肌醇六磷酸酶)。也為本發(fā)明這方面的目的，WO00/43503的下述肌醇六磷酸酶和肌醇六磷酸酶序列是優(yōu)選合成的親代肌醇六磷酸酶的實施例SEQIDNO:22(擔子(basidio)共有)，SEQIDNO:24(共有肌醇六磷酸酶-10的成熟部分)；SEQIDNO:26(共有肌醇六磷酸酶-10);SEQIDNO:27(共有肌醇六磷酸酶-11),SEQIDNO:31(共有肌醇六磷酸酶-10-熱(thermo)(3)-Q50T-K91A)，SEQIDNO:3《共有肌醇六磷酸酶-12),SEQIDNO:91(共有肌醇六磷酸酶-孓熱(11)-Q50T)，SEQIDNO:93(共有肌醇六磷酸酶-3-熱(ll)-Q50T-K91A),SEQIDNO:95(共有肌醇六磷酸酶-10-熱(5)-Q50T);和SEQIDNO:97(共有肌醇六磷酸酶-10-熱(5)-Q50T-K91A)，共有肌醇六磷酸酶-10-熱(3),共有-肌醇六磷酸酶-10-熱C3)-QS0T,共有-肌醇六磷酸酶-10-熱(3)-KWA,共有肌醇六磷酸酶-10-熱(3)的氨基酸27_467，共有肌醇六磷酸酶-10-熱("-QS0T的氨基酸27-467，共有肌醇六磷酸酶-10-熱(3)-K91A的氨基酸27-467。其他優(yōu)選合成的親代肌醇六磷酸酶的實施例是在EP897010公開的煙曲霉肌醇六磷酸酶變體，在EP897985公開的真菌的共有肌醇六磷酸酶及其變體，在WO00/43503公開的煙曲霉肌醇六磷酸酶變體，和命名為共有肌醇六磷酸酶-7的肌醇六磷酸酶，以及共有肌醇六磷酸酶-1的變體。篩選熱穩(wěn)定的^L醇六磷酸酶變體的優(yōu)選方法是實施例1所述的初次(primary)篩選在適宜固體培養(yǎng)基(例如SC-葡萄糖平板)培養(yǎng)候選菌落(例如酵母文庫)適當?shù)臅r間(例如30。C3天)，用硝化濾膜(filter)將平板復制到新平板，溫育適當時間(例如30°C1天)，在適宜pH(例如pH5.5和53°C)將濾膜轉移到預熱的肌醇六磷酸鈉平板，在升高的溫度溫育適當?shù)臅r間(例如在53°C過夜)，移去(remove)濾膜，并倒入含Ca離子的溶液(例如0.5MCaCl2溶液)，選出比所述親代肌醇六磷酸酶具有更大的清楚邊界(clearingzones)菌落。另一優(yōu)選篩選方法是如實施例1所述的二次(secondary)篩選(浸沒(submerse)培養(yǎng)，建立上清的肌醇六磷酸酶活性對比溫度的曲線，選擇比所述親代肌醇六磷酸酶操作更好的候選(在較高溫度活性越高越好))。對這兩個實驗，在熱穩(wěn)定性部分指出那些可選溫度。可如實施例1所述在結合/連續(xù)中應用所述兩種方法。優(yōu)選隨機誘變方法是摻雜的，及摻入寡改組(oligoshuffling)。上述產(chǎn)生肌醇六磷酸酶變體方法甚至更優(yōu)選實施方案中，所述方法可重復(iterative)，指在第一步，所述親代肌醇六磷酸酶是上述肌醇六磷酸酶之一，例如所述隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶，在第二步所述親代肌醇六磷酸酶是比其熱穩(wěn)定更高的變體X,第三步中所述親代肌醇六磚酸酶是比X熱穩(wěn)定性甚至更高的變體Y,以此類推。比活性提高的優(yōu)選篩選方法是實施例1所指的初次篩選方法。另一比活性提高的優(yōu)選篩選方法是實施例1所指的二次篩選方法。本發(fā)明也涉及生產(chǎn)可得到的或通過上述產(chǎn)生肌醇六磷酸酶變體的方法可得到的肌醇六磷酸酶變體的方法，包含(a)培養(yǎng)宿主細胞來生產(chǎn)包含所述變體的上清；并(b)回收所述變體。進一步通過下述實施例描述本發(fā)明，其不應作為限制本發(fā)明范圍。具體實施方案本發(fā)明一方面是在隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶骨架通過與其他骨架，優(yōu)選同源骨架的同源性序列對比，轉移所選的(陽性，就是說例如熱穩(wěn)定性和/或比活性提高)突變。此概念可如下描述在如下面所列舉的那些權利要求和附加具體實施方案中的每一個，用"來自Peni叩horalyciiCBS686.96的肌醇六磷酸酶，，取代"親代肌醇六磷酸酶"并加入下述權利要求與來自PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶同源的肌醇六磷酸酶變體，該變體包含在對應于那些在附加實施方案所要求并列舉的至少一個位置的取代,通過將所述同源的肌醇六磷酸酶與如上SEQIDNO:2序列比對推導出所述對應位置。要求了本發(fā)明所述肌醇六磷酸酶變體的多種具體實施方案，并且在如下列舉了附加具體實施方案。本發(fā)明也涉及下述實施方案的下述方面分離的核酸序列；核酸構建體；重組表達載體；重組宿主細胞；生產(chǎn)方法；轉基因植物，或植物部分；轉基因非人動物，或產(chǎn)品，或其組分/元素(元件)；組合物如飼料添加劑，和動物飼料；使用的方法和過程；及用途(如本文所要求的)。本文具體包括的組合物包含至少一個任何所述權利要求或任何上述實施方案的肌醇六磷酸酶變體。所述動物飼料優(yōu)選含有至少一種植物蛋白質或蛋白質源。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含在至少一個選自如下的位置的取代20;26;28;29;30;31;37;38;39;40;41;42;43;44;45;46;47;48;55;56;57;58;59;60;61;62;63;64;65;66;67;68;69;73;74;75;76;77;78;79;80;81;82;83;91;92;93;94;95;96;97;98;99;100;101;102;103;104;105;106;107;108;109;110;111;112;113;114;115;116;117;118;119;123;124;125;126;135;136;137;138;139;140;141;142;152;153;154;155;156;157;158;159;160;161;162;163;169;170;171;172;173;174;175;176;177;178;179;180;183;184;185;186;187;188;189;190;191192;193;194;195;196199;204;205;206;207;208;209;210;211212;213;214;215;216219;220;221;222;229;230;231;232;233234;235;236;237;238250;251;252;253;254;255;256;257;258259;260;261;262;263266;284;285;286;287;288;289;300;301302;303;304;305;306321;322;323;324;325;326;327;328;329330;331;332;333;334344;345;346;347;348;349;350;384;385386;387;388;389;390393;394;395;396;397;398;407;408;409410;411;412;419;420其中禾:口181;182;197;198;217;218;248;249;264;265;307;308;335;343;391;392;421;422;423;424;425;426;427;428;429;430;(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個位置對應于SEQIDNO:2的位置(c)所述變體與SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體不是選自如下的PeniophoralyciiCBS686.%肌醇六磷酸酶的變體G26S;Y28N;D29S;F31Y;E42D,K,A;T45R;V46I;W59F;S62D;A64K;R65Q,E,QA;S66T;R67A，I,Q,K;Q68Y，V,I;K74R，A;A99N;D100S;L102V;P103E;F104L;N107T,Q;S109M;H110S,V;Q111E,N;T112A:S;M116F，I,L;A135S;D137Y;Q138D，S,G;D142A;()154fH;S155N;G156P;E157Q,S;E169S;E170A,P;G171A;()171aS;T174P,A;N177S;N178S,T;M179T,V,L;N182A,V;V184G;D185E;()185eT;G186S,A;D187R，K，S;()187aV，T;E188Q,S,A,V;S189E;V195L;N199A，P;L204N;A207D,H;S216T;D217E;L219Y,T;T220Y,N;L221F;M222L;L230V;()235eE,Q;V248R，I;S249Q,A;E251D;Y254A,L,G;D255N;D257K;Y259F;T262H;P264A;G286R,H;Q287K，S;A288P;T321Q,S,G;M322I;V323I;P324A;A327S,F,IL;F332Y;N333P;E344R;R346P;W348F;V349L,A,S;D350S,V;G388A;V393R;E395K,T;和L396R。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含在選自如下區(qū)域的至少一個區(qū)域的至少一個位置的取代20;26;28-31;37-48;55-69;73-83;91-119;123-126;135-142152-163;169-199;204-222;229-238;248-266;284-289;300-308;321-335;343-350;384-398;407-412;和419-430;其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；并且(b)每個位置對應于SEQIDNO:2的一個位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且其中在位置26;28;29;31;42;45;46;59;62;64;65;66;67;68;74;99;100;102;103;104;107;109;110;111;112;116;135;137;138;142;154f;155;156;157;169;170;171;171a;174;177;178;179;182;184;185;185e;186;187;187a;188;189;195;199;204;207;216;217;219;220;221;222;230;235e;248;249;251;254;255;257;259;262;264;286;287;288;321322;323;324;327;332;333;344;346;348;349;350;388;393;395;和396的所述變體選自26A,C，D，E,F,H,I,K,L，M，N,P，Q，R,T，V,W，Y;28A,C，D,E,F，GH，I,K,L，M,P，Q，R,S，T，V，W;29A,C,E,F，G，H，I，K，L,M,N,P，Q，R，T，V，W,Y;31A，C，D,E,G,H，I，K,L,M,N,P,Q,R，S，T,V,W;42C,F,GH,I,L,M，N，P,Q,R,S，T,V，W,Y;45A,C，D,E,F，G，H，I,K，L，M，N，P，Q,S，V，W,Y;46A，C，D,E,F,GH,K,L,M,N，P,Q,R,S，T,W，Y;59A，C，D,E，G,H，I,K,L,M，N，P,Q,R,S，T，V,Y;62A,C,E,F，G，H，I,K,L,M,N,P,Q，R,T,V,W,Y;64C，D，E，F(xiàn)，G，H,I,L,M，N,P,Q,R,S,T，V,W，Y;65C,D,F,H,I,K，L,M,N，P，S，T，V,W,Y;66A,C，D，E,F，G，H，I,K,L，M,N,P，Q，R,V,W,Y;67C,D,E,F,QH,L，M,N,P，S,T,V，W,Y;68A，C,D,E,F,GH,K,L，M，N，P,R,S,T,W;74C,D，E,F，G,H，I,L，M，N,P,Q，S,T,V，W,Y;99C,D,E,F,GH,I，K,L,M,P,Q，R,S,T，V,W，Y100A,C，E,F,GH，I，K，L,M，N，P,Q，R，T，V，W，Y;102A,C，D，E，F(xiàn)，朋，I,K，M,N,P，Q,R,S,T，W，Y;103A,C,D,F，GH,I,K,L,M,N,Q，R，S,T,V,W,Y;104A,C,D,E，GH,I,K,M,N,P，Q,R，S,T，V，W,Y;107A,C，D,E,F，GH,I,K，L，M,P，R，S，V,W,Y;109A,C，D,E,F,G,H，I,K,L,N,P,Q,R，T，V,W,Y;110A，C，D,E,F,G,I，K，L,M,N,P,Q，R，T,W,Y;111A,C，D，F(xiàn),GH,I,K,L,M，P，R,S，T,V,W，Y;112C，D,E,F,G,H，I，K,L,M,N，P,Q，R，V，W，Y;116A,C，D,E，G,H,K,N，P，Q，R，S，T,V,W,Y;135C,D,E，F(xiàn),G,H，I，K，L，M，N，P，Q，R，T,V,W,Y;137A，C，E，F(xiàn),G,H,I,K，L,M,N，P,Q,R,S,T,V,W;138A,C,E,F,H,I,K，L,M,N,P,R,T,V,W,Y;142C,E，F(xiàn)，G，H,I,K，L，M,N，P,Q,R，S,T，V,W,Y;154fA，C,D,E，F(xiàn),GI，K,L,M，N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;155A,C,D，E,F,GH，I,K,L，M，P,Q，R，T,V,W,Y;156A，C,D,E,F,H,I，K,L,M，N,Q,R,S，T,V，W,Y;157A,C，D,F，G，H,I,K，L，M,N,P,R,T，V,W，Y;169A,C,D，F(xiàn)，GH，I,K,L,M，N,P，Q，R，T，V，W,Y;170C，D,F,GH,I，K，L，M,N，Q,R,S,T,V,W，Y;171C,D，E，F(xiàn),H,I，K，L，M,N，P,Q,R,S，T,V,W,Y;171aA,C，D，E,F，GH，I，K,L，M,N,P,Q,R，T，V,W,Y;174C,D,E,F,GH,I,K，L，M,N，Q,R,S,V,W,Y;177A,C，D，E,F，G，H,I,K,L,M,P，Q,R，T，V，W,Y;178A,C,D,E,F,G,H，I,K,L,M,P,Q,R，V,W，Y;179A,C,D,E,F,GH,I，K,N，P,Q，R，S,W，Y;182C，D,E,F,G,H,I,K，L，M，P,Q，R,S,T，W，Y;184A，C，D，E,F,H,I,K，L，M,N,P,Q,R,S,T,W,Y;185A,C，F(xiàn),G，H,I，K,L,M，N，P,Q,R,S,T,V,W,Y;185eA,C,D，E,F，G，H,I,K,L,M,N,P,Q，R,S,V,W,Y;186C,D，E，F(xiàn),H，I，K，L,M,N，P,Q,R,T,V,W，Y;187A，C，E,F,GH,I,L，M，N，P，Q,T,V，W,Y;187aA,C,D，E，F(xiàn),G,H,I，K，L，M，N，P,Q，R，S,W，Y;188C,D,F，G,H,I,K，L，M,N,P,R,T,W,Y;189A,C,D，F(xiàn)，GH,I，K，L，M，N，P，Q，R,T,V,W,Y;195A，C,D,E,F,GH,I,K,M，N,P,Q，R,S,T,W，Y;199C,D,E,F，G，H,I，K,L，M，Q，R,S，T,V,W，Y;204A,C，D，E，F(xiàn),GH,I，K,M,P,Q,R，S，T,V,W,Y;207C,E,F，G,I，K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V，W,Y;216A,C,D,E,F,QH,I，K，L,M，N，P,Q,R,V，W,Y;217A,C，F(xiàn),GH,I,K,L，M，N,P,Q,R,S,T，V,W,Y;219A，C，D,E，F(xiàn),G,H,I,K,M,N,P,Q，R，S,V,W;220A,C，D,E,F，G，H,I,K,L,M,P,Q,R,S，V，W;221A,C,D,E,G，H，I，K,M,N,P，Q，R，S，T,V,W，Y;222A,C，D，E,F,G，H,I，K，N，P,Q，R,S,T,V,W,Y;230A，C，D,E,F,GH，I，K，M,N,P,Q,R,S,T,W,Y;235eA，C,D，F(xiàn),G,H,I,K,L,M,N,P,R，S,T,V，W,Y;248A,C，D,E,F,G,H,K，L,M，N,P,Q,S,T,W，Y;249C，D，E，F(xiàn),G,H,I,K,L,M,N，P,R,T，V，W,Y;251A，C，F(xiàn)，G,H，I，K,L，M,N,P,Q,R，S,T，V，W，Y;254C,D,E,F,H,I,K,M，N,P,Q，R,S,T,V，W;255A,C,E,F,G,H,I,K,L，M，P,Q,R,S,T，V，W，Y;257A,C，E,F,G,H，I,L，M,N,P，Q，R,S，T，V,W,Y;259A,C,D，E,G，H,I,K,L,M，N，P，Q，R,S，T,V，W;262A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P，Q,R,S，V,W,Y;264C,D,E,F,G，H,I，K,L,M，N，Q,R，S,T，V，W,Y;286A,C，D，E,F,I，K，L，M，N，P,Q，S，T,V，W,Y;287A,C，D，E,F,QH,I,L，M,N，P,R,T，V，W,Y;288C,D，E,F，G,H,I，K，L,M,N，Q，R,S,T,V,W，Y;321A,C,D,E,F,H,I,K,L，M,N,P,R,V,W,Y;322A,C，D，E,F,QH,K，L，N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;323A，C,D,E,F,G，H,K,L，M，N,P,Q，R，S,T,W,Y;324C,D,E,F,QH,I,K，L,M,N，Q，R,S,T,V,W,Y;327C,D,E,GH,K,M，N,P,Q,R,T,V,W,Y;332A，C，D,E,G，H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S，T,V，W;333A,C,D，E,F，G,H,I,K,L,M，Q,R,S，T，V，W,Y;344A,C，D,F,QH，I,K,L,M，N,P,Q,S,T,V,W,Y;346A,C，D,E，F(xiàn),G,H,I,K,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y;348A，C,D,E,G,H，I，K，L，M，N，P，Q,R，S,T,V，Y;349C,D，E,F,G，H，I,K,M，N,P，Q，R,T,W，Y;350A,C,E，F(xiàn),GH,I，K，L,M，N,P，Q,R，T,W，Y;388C，D，E，F(xiàn),H,I，K,L，M，N,P，Q,R,S,T,V,W,Y;393A,C,D,E,F，G,H,I,K,L，M,N，P,Q,S,T，W，Y;395A,C,D,F，GH,I，L,M,N,P，Q,R,S，V,W,Y;和396A,C，D,E,F，QH，I,K，M,N，P，Q，S,T，V，W，Y;親代肌醇六磷酸酶的變體，包含在選自如下區(qū)域的至少一個區(qū)域的至少一個位置的取代20;28-31;37-48;55-69;91-119;123-126;152-163;169-199;204-222;229-238;248-266;284-289;321-335;343-350;384-398;407-412;和419-430;其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；并且(b)每個位置對應于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體不是選自如下的PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體Y28N;D29S;F31Y;E42D，K,A;T45R;V46I;W59F;S62D;A64K;R65Q,E,G,A;S66T;R67A,I，Q，K;Q68Y，V,I;A99N;D100S;L102V;P103E;F104L;N107T，Q;S109M;H110S，V;Q111E,N;T112A,S;M116F，I,L;()154fH;S155N;G156P;E157Q,S;E169S;E170A,P;G171A;()171aS;T174P，A;N177S;N178S,T;M179T，V,L;N182A,V;V184G;D185E;()185eT;G186S，A;D187R，K，S;()187aV,T;E188Q,S,A,V;S189E;V195L;N199A,P;L204N;A207D，H;S216T;D217E;L219Y,T;T220Y，N;L221F;M222L;L230V;()235eE,Q;V248R,I;S249Q,A;E251D;Y254A,L，G;D255N;D257K;Y259F;T262H;P264A;G286R,H;Q287K，S;A288P;T321Q,S,G;M322I;V323I;P324A;A327S，F(xiàn),I，L;F332Y;N333P;E344R;R346P;W348F;V349L,A,S;D350S,V;G388A;V393R;E395K，T;和L396R。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含在選自如下的至少一個位置的取代20;29;45;63;69;92;93;95;97;98;99;102;110;114;118;125;152;156;157;160;163;183;185;187;190;191;194;199;205;210;218;222;234;248;286;321;323;324;328;330;334;343;344;345;347;349;350;384;395;398;409;421;422;423;424;425;426;427;428;429;430;其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個位置對應于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體不是選自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體D29S;T45R;A99N;L102V;H110S,V;G156P;E157Q,S;D185E;()185eT;D187R,K,S;()187aV,T;N199A,P;M222L;V248R，I;G286R,H;T321Q，S,G;V323I;P324A;E344R;V349L，A,S;D350S,V;和E395K,T。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下的至少一個位置的取代20;29;45;63;69;92;93;95;97;98;99;102;110;114;118;125;152;156;157;160;163;183;185;187;190;191;194;199;205;210;218;222;234;248;286;321;323;324;328;330;334;343;344;345;347;349;350;384;395;398;409;421;422;423;424;425;426;427;428;429;430;其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個位置對應于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)其中在位置29;45;99;102;110;156;157;185;185e;187;187a;199;222;248;286;321;323;324;344;349;350;和395的所述變體選自29A,C，E，F(xiàn)，G,H,I,K,L,M,N，P，Q,R,T，V，W，Y;45A,C,D,E，F(xiàn),G,H，I，K,L,M,N,P,Q,S,V,W,Y;99C,D,E，F(xiàn)，G,H，I,K,L,M,P,Q,R,S，T,V,W,Y;102A，C，D,E,F，G，H，I，K,M，N，P,Q,R，S,T,W,Y;110A,C，D，E,F,G，I,K,L，M，N,P,Q，R,T,W,Y;156A,C，D，E,F,H，I，K,L,M,N,Q,R,S,T,V，W,Y;157A,C，D，F(xiàn),GH,I，K,L,M,N,P，R，T,V,W,Y;185A，C,F，G，H,I，K,L,M，N,P,Q,R,S，T，V，W,Y;185eA，C，D,E,F,GH，I,K,L,M，N,P,Q,R,S,V,W，Y;187A，C，E，F(xiàn),GH,I,L,M,N，P，Q,T,V,W,Y;187aA，C,D,E,F,GH，I,K，L,M,N，P,Q,R,S,W,Y;199C，D，E,F,GH，I，K,L，M,Q，R,S，T，V,W,Y;222A,C，D，E，F(xiàn)，QH,I，K，N，P,Q,R，S,T,V,W，Y;248A,C，D,E，F(xiàn),GH,K,L,M，N，P，Q,S,T,W,Y;286A,C,D，E,F，I，K,L,M，N,P，Q，S,T，V，W,Y;321A,C，D,E，F(xiàn)，H,I，K，L,M，N,P，R，V,W,Y;323A，C,D,E，F(xiàn),G,H,K，L，M，N,P，Q,R，S，T，W,Y;324C,D,E,F，G,H，I，K,L，M,N，Q，R,S,T,V,W，Y;344A,C，D，F(xiàn),G，H，I，K，L,M，N,P，Q，S,T,V,W,Y;349C,D,E,F,G,H,I,K，M,N,P,Q,R，T，W,Y;350A，C,E,F,GH,I,K，L,M，N，P,Q,R,T,W,Y;和395A,C,D,F，QH,I,L,M，N，P,Q,R,S，V，W，Y。所述權利要求或任何上述實施方案的變體，其含有至少一個選自如下的取代20R;29N,C，T;45A;63N;69A;92L;931;95R,H,M，N,S,T;97V;98G;99D;1021;110Y，R，W;114A;118A;125D;152A;156C，R;157K;160R;163P;183K,A，W，G;185A,H,N,P，K;187G;190S，K;191L,R，S;194R;199S;205S;210G;218T;2221;234K,S;248A,C,D,E，QH,S,T;286S;321A;323A;324S,L;328T;330R;334E,D,G;343N;344A,V，S;345D，H;347Q,P;349M,K;D350T，M，I,L;384S，A;395G;398T;409S;421R,S;422R;423N;424S;425L;426E;427G;428R;4291;和430M。所述權利要求或任何上述實施方案的變體，其中所述親代肌醇六磷酸酶i)具有的核酸序列與SEQIDNO:2的氨基酸序列有至少約60%,優(yōu)選至少60%的同一性；ii)在低嚴格條件與SEQIDNO:1的核苦酸49-1320或其互補鏈雜交的氨基酸序列所編碼；iii)為真菌的肌醇六磷酸酶，優(yōu)選擔子菌肌醇六磷酸酶或混合的子嚢菌/擔子菌肌醇六磷酸酶，如隔孢伏革菌肌醇六磷酸酵，例^口來自Peniophoralycii，例^口PeniophoralyciiCBS686.96的月幾醇六石粦酸酶。所述權利要求或任何上述和下述實施方案的肌醇六磷酸酶變體，其為熱穩(wěn)定的和/或比活性高，優(yōu)選比所述親代肌醇六磷酸酶熱穩(wěn)定性和/或比活性更高。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下區(qū)域的至少一個區(qū)域的至少一個位置的取代20;29;37-48;63;69;73-83;91-119;123-126;154-157;163;183;187;194;199;204-218;229-238;248;284-289;300-308;323-335;343-350;384;395;398;407-412;和419-430;其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個位置對應于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體丕是選自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體D29S;E42D,K，A;T45R;V46I;K74R,A;A99N;D100S;L102V;P103E;F104L;N107T,Q;S109M;H110S，V;Q111E，N;T112A，S;M116F,I,L;S155N;()154fH;G156P;E157Q,S;D187R,K,S;()187aV，T;N199A,P;L204N;A207D，H;S216T;D217E;L230V;()235eE,Q;V2綴，I;G286R,H;Q287K，S;A288P;V323I;P324A;A327S,F,I，L;F332Y;N333P;E344R;R346P;W348F;V349L,A,S;D350K,A;和E395K,T。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下至少一個位置的取代20;29;37;38;39;40;41;42;43;44;45;46;47;48;63;69;73;74;75;76;77;78;7980;81;82;83;91;92;93;94;95;96;97;98;99;IOO;IOI;102;103;104;105106;107;108;109;110;111;112;113;114;115;116;117;118;119;123;124125;126;154;155;156;157;163;183;187;194;199;204;205;206;207;208209;210;211,212;213;214;215;216;217;218;229;230;231;232;233;234235;236;237;238;248;300;301;302;303;304;305;306;307;308;323;324325;326;327;328;329;330;331;332;333;334;335;343;344;345;346;347348;349;350;384;395;398;407;408;409;410;411;412;419;420;421;422423;424;425;426;427;428;429;430;其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個位置對應于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體丕是選自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體D29S;E42D,K，A;T45R;V46I;K74R,A;A99N;D100S;L102V;P103E;F104L;N107T,Q;S109M;H110S,V;Q111E,N;T112A，S;M116F，I，L;S155N;()154fH;G156P;E157Q,S;D187R,K，S;()187aV，T;N199A,P;L204N;A207D,H;S216T;D217E;L230V;()235eE,Q;V248R,I;G286R，H;Q287K,S;A288P;V323I;P324A;A327S,F,I,L;F332Y;N333P;E344R;R346P;W348F;V349L,A，S;D350K，A;和E395K,T。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下區(qū)域的至少一個區(qū)域的至少一個位置的取代20;29;37-48;63;69;73-83;91-119;123-126;154-157;163;183;187;194;199;204-218;229-238;248;284-289;300-308;323-335;343-350;384;395;398;407-412;和419-430;其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個位置對應于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且其中在位置29,42,45,46，74，99,100,102,103,104,107,109，110,111,112，116,155，154,156,157,187,187a,199,204,207，216,217,230，235e,248,286,287，288，323,324,327，332,333,344,346,348，349,350,395的所述變體選自:29A，C,E,F,G，H,I，K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y;42C,F,H,I，L，M，N，P,Q,R,S，T,V,W,Y;45A,C,D,E,F,G，H，I，K,L，M，N，P，Q,S,V，W，Y;46A，C，D，E,F,GH，K，L，M,N，P，Q,R,S,T,W，Y;74C，D,E,F,G，H，I,K,L,M,N，P，Q,S,T,V,W，Y;99C,D，E,F，G,H,I,K,L,M,P，Q,R,S,T,V，W,Y;IOOA,C,E,F，QH,I,K,L，M，N,P,Q,R,T,V,W，Y;102A，C，D,E,F，G,H,I，K，M,N，P,Q,R，S,T,W,Y;103A,C,D,F,GH,I,KL,M，N,Q，R，S，T,V，W，Y;104A，C，D，E，QH,I,K,M，N，P,Q,R，S，T，V,W,Y;107A,C，D,E，F(xiàn),G，H，I,K,L,M，P,R，S，V,W,Y;109A,C，D,E,F，GH,I,K，L，N,P,Q,R，T,V，W，Y;110A，C,D，E,F，GI,K,L，M,N,P,Q，R,T，W,Y;111A，C，D,F，GH,I,K，L，M,P,R，S，T，V，W，Y;112C,D，E，F(xiàn),GH，I，K,L,M，N，P,Q，R，V，W,Y;116A，C，D，E,GH，K，N,P，Q,R，S，T，V,W,Y;155C,D，E,F，G，H,I，K,L,M,P,Q，R,T，V，W，Y;154fA，C，D,E，F(xiàn)，G，I，K，L，M,N,P,Q,R，S，T,V,W，Y;156A，C,D,E,F，H,I,K，L，M，N，Q，R,S，T，V,W，Y;157A,C,D,F，G,H,I，K,L，M,N,P,R,T,V，W,Y;187A，C，E,F,GH，I，L，M，N,P,Q，T，V,W,Y;187aA，C，D,E,F，GH,I，K,L,M,N,P,Q,R,S,W,Y;199C,D,E,F，GH,I,K,L,M，Q，R,S,T,V，W，Y;204A,C,D，E,F,QH，I,K，M，P,Q,R,S，T，V,W，Y;207C,E,F，G,I，K,L，M，N,P,Q,R，S,T,V，W,Y;216A，C,D，E,F,G，H，I，K，L，M,N,P，Q，R,V，W,Y;217A,C，F(xiàn)，G,H，I，K,L，M,N,P，Q,R，S,T,V，W，Y;230A，C,D,E,F,GH,I,K，M,N,P,Q,R，S,T，W，Y;235eA，C，D，F(xiàn),G，H，I,K,L,M，N,P，R,S,T，V,W,Y;248A,C，D，E,F，G,H，K，L,M，N,P,Q,S,T，W,Y;286A,C,D，E，F(xiàn),I,K,L,M，N，P,Q,S，T，V,W，Y;287A，C,D,E，F(xiàn),G,H，I,L，M，N，P,R,T，V,W，Y;288C,D,E,F,GH,I,K，L,M，N，Q,R，S,T,V，W,Y;323A,C,D，E,F,G,H,K，L,M，N,P,Q,R,S，T,W,Y;324C,D,E,F,G，H，I,K,L,M，N,Q,R,S,T,V，W，Y;327C,D,E，G,H,K,M,N，P,Q,R，T，V,W,Y;332A，C,D，E,G,H，I,K,L,M,N,P，Q,R，S,T,V,W;333A,C，D,E,F,G，H,I,K，L,M,Q,R，S,T,V,W，Y;344A,C，D,F，GH，I,K,L,M，N,P，Q,S,T，V，W，Y;346A，C，D，E,F，G，H,I,K，L,M,N，Q,S，T,V,W，Y;348A,C，D,E，GH,I,K,L，M,N,P,Q,R，S，T，V,Y;349C,D,E,F,GH,I,K,M,N，P,Q，R,T,W,Y;350C，E，F(xiàn)，GH,I,L,M，N，P,Q,R,S,T，V，W，Y;和395A,C，D,F,G,H,I,L,M:N，P,Q，R，S，V,W，Y。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下至少一個位置的取代20;29;45;63;69;95;97;98;99;102;114;118;125;163;183;187;194;199;205;218;234;248;323;324;328;330;334;343;344;345;347;349;350;384;395;398;421;422;423;424;425;426;427;428;429;430;其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個位置對應于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述變體與SEQIDN0:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體丕是選自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體D29S;T45R;A99N;L102V;D187R,K,S;()187aV，T;N199A，P;V248R，I;V3231;P324A;E344R;V349L，A，S;D350K,A;和E395K，T。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下區(qū)域的至少一個區(qū)域的至少一個位置的取代20;29;37-48;63;69;73-83;91-119;123-126;154-157;163;183;187;194;199;204-218;229-238;248;284-289;300-308;323-335;343-350;384;395;398;407-412;和419-430;其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個位置對應于SEQIDN0:2的位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且其中在位置29,45，99,102,187，187a,199,248,323,324,344,349,350,和395的所述變體選自:29A,C,E，F(xiàn),G,H,I，K,L,M，N,P，Q，R，T，V,W,Y;45A，C，D，E，F(xiàn),GH,I，K，L，M,N，P,Q，S，V，W，Y;99C,D，E，F(xiàn),GH，I，K,L,M，P,Q，R,S，T,V,W,Y;102A,C，D,E，F(xiàn),G，H，I，K,M,N,P，Q,R,S,T，W，Y;187A，C,E,F，G,H,I,L,M,N,P,Q，T,V,W,Y;187aA,C，D,E,F,GH，I，K,L，M,N,P，Q，R,S，W,Y;199C，D,E，F(xiàn),G,H，I,K,L，M，Q,R，S,T，V,W,Y;248A，C,D，E，F(xiàn),G，H,K，L,M，N，P，Q，S，T，W,Y;323A，C,D，E，F(xiàn),G，H,K，L,M,N,P，Q,R，S,T,W，Y;324C,D，E,F,G，H,I,K，L，M,N,Q,R，S，T,V,W，Y;344A,C,D，F(xiàn),GH，I,K,L,M,N，P,Q,S,T,V,W，Y;349C,D，E,F，G，H,I,K,M,N,P,Q，R,T,W,Y;350C，E,F,QH，I,L,M,N，P，Q,R，S,T，V,W,Y;和395A，C,D，F(xiàn),G,H，I,L，M，N,P,Q,R，S,V,W,Y。上述任何實施方案的變體含有選自如下的至少一個取代20R;29N,C,T;45A;63N;69A;92L;931;95R;97V;98G;99D;1021;110Y;114A;118A;125D;163P;183K;187G;194R;199S;205S;218T;234K,S;248A;323A;324S，L;328T;330R;334E,D，G;343N;344A，V，S;345D，H;347Q，P;V349M;D350V,T;384S，A;395G;398T;409S;421R，S;422R;423N;424S;425L;426E;427G;428R;4291;和430M。上述任何實施方案的變體，該變體含有一個選自如下取代或取代組合的耳又代或取代組合20R+95R+97V+98G;29N+102I;29N+118A;29N+234S;29N+324S;29N+163P+324S;29N+163P+324S+395G;29S;29S+205S;29S+125D+324A;29S+324A+350V;29S+125D+324A+350V;29S+125D+324A+234K+330R;29S+125D+324A+330R+395G;29S+99D+125D+324A+334E+350V;29S+125D+324A+218T+344S+350V;29S+125D+324A+234K+330R+395G;29S+324A+125D+350V+63N+218T+334E+183K+421S;29S+324A+125D+350V+45A+69A+99D+110Y+334E+344S;9I+430M;69A+334E;99D+398T;114A+187G+194R+324S;114A+187G+194R+324S;218T+334G;323A+324S;324S;324S+328T;324S+395G;324S+345D+347Q;330R;334E+344A;334D+343N+344V;345H+347P+350V;和350V。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下區(qū)域的至少一個區(qū)域的至少一個位置的取代20;29;37-40;45;47-48;63;69;73-83;91-98;99;102;103110;113-119;123-125;154-157;163;183;187;194;199;204-218;229-238248;284-289;300-308;323-324;328-335;343-347;349;350;384;395;398407-412;和419-430;其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個位置對應于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體丕是選自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌S享六磷酸酶的變體D29S;T45R;K74R，A;A99N;L102V;P103E;H110S,V;M116F,I，LS155N;()154fH;G156P;E157Q,S;D187R,K,S;()187aV,T;N199A，PL204N;A207D,H;S216T;D217E;L230V;()235eE,Q;V248R,I;G286R,HQ287K,S;A288P;V323I;P324A;F332Y;N333P;E344R;R346P;V349L，A,SD350K，A;和E395K,T。親代月幾醇六磷酸酶的變體，包含選自如下區(qū)域的至少一個區(qū)域的至少一個位置的取代20;29;37-48;63;69;73-83;91-119;123-126;152-163;183-199;204-218;229-238;248;284-289;300-308;323-335;343-350;384;395;398;407-412;和419-430;其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個位置對應于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體丕是選自如下PeniophoralyciiCBS686.%肌醇六磷酸酶的變體D29S;E42D,K,A;T45R;V46I;K74R,A;A99N;D100S;L102V;P103E;F104L;N107T，Q;S109M;H110S,V;QlllE,N;T112A，S;M116F，I,L;()154fH;S155N;G156P;E157Q,S;V184G;D185E;()185eT;G186S，A;D187R，K,S;()187aV,T;E188Q,S,A，V;S189E;V195L;N199A，P;L204N;A207D，H;S216T;D217E;L230V;()235eE，Q;V2微，I;G286R，H;Q287K,S;A288P;V323I;P324A;A327S,F,I,L;F332Y;N333P;E344R;R346P;W348F;V349L，A,S;D350S，V;和E395K，T。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下至少一個位置的取代20;29;37;38;39;40;41;42;43;44;45;46;47;48;63;69;73;74;75;76;77;78;79;80;81;82;83;91;92;93;94;95;96;97;98;99;100;101;102;103;104;105;106;107;108;109;110;111;112113;114;115;116;117;118;119;123;124;125;126;152;153;154;155;156;157;158;159;160;161;162;163;183;184;185;186;187;188;189;190;191;192;193;194;195;196;197;198;199;204;205;206;207;208;209;210;211，212;213;214;215;216;217;218;229;230;231;232;233;234;235;236;237;238;248;284;285;286;287;288;289;300;301;302;303;304;305;306;307;308;323;324;325;326;327;328;329;330;331;332;333;334;335;343;344;345;346;347;348;349;350;384;395;398;407;408;409;410;411;412;419;420;421;422;423;424;425;426;427;428;429;430;其中(a)所述變體具有肌醇六磷！度酶活性；每個位置對應于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體丕是選自如下Peni叩horalyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體D29S;E42D,K，A;T45R;V46I;K74R,A;A99N;D100S;L102V;P103E;F104L;N107T，Q;S109M;H110S，V;Q111E，N;T112A,S;M116F,I,L;()154fH;S155N;G156P;E157Q，S;V184G;D185E;()185eT;G186S，A;D187R,K，S;()187aV，T;E188QSAV;S189E;V195L;N199A,P;L204N;A207D，H;S216T;D217E;L230V;()235eE,Q;V248R,I;G286R,H;Q287K，S;A288P;V323I;P324A;A327S，F(xiàn)，I，L;F332Y;N333P;E344R;R346P;W348F;V349L，A，S;D350S,V;和E395K,T。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下區(qū)域的至少一個區(qū)域的至少一個位置的取代20;29;37-48;63;69;73-83;91-119;123-126;152-163;183-199;204-218;229-238;248;284-289;300-308;323-335;343-350;384;395;398;407-412;和419-430;其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個位置對應于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且其中在位置29,42,45，46,74,99,100，102,103,104,107,109,110,111,112,116，154,155，156，157,184,185,185e,186，187,187a，188，189,195,199，204，207，216，217，230，235e,248，286,287，288，323,324,327,332,333,344，346，348,349,350,395的所述變體選自:29A,C,E，F(xiàn)，QH,I,K,L,M,N,P,Q，R，T，V，W,Y;42C,F,G，H,I，L,M，N,P，Q，R,S,T，V，W,Y;45A,C,D，E，F(xiàn),G，H,I,K,L,M,N，P,Q,S,V，W,Y;46A,C，D,E,F,GH,K,L,M,N,P，Q，R，S，T,W，Y;74C，D，E,F,GH，I,K,L，M,N,P，Q,S，T,V，W，Y;99C，D，E，F(xiàn)，G，H，I，K，L,M,P，Q,R，S，T,V,W,Y;100A,C，E，F(xiàn)，G,H，I,K，L,M,N,P,Q,R，T,V,W，Y;102A，C,D,E,F，GH,I,K，M,N,P,Q,R，S,T，W,Y;103A,C,D，F(xiàn)，G，H，I,K,L,M,N,Q，R,S,T,V,W,Y;104A,C，D,E,G，H，I,K，M,N，P，Q,R,S,T,V，W,Y;107A,C，D,E，F(xiàn)，G，H,I,K，L，M，P，R,S,V,W，Y;109A,C,D,E，F(xiàn),G,H,I,K，L,N,P,Q，R,T,V，W,Y;lIOA，C，D,E，F(xiàn),G，I,K,L，M，N,P,Q，R,T，W,Y;111A,C,D,F，G，H，I,K，L，M,P,R，S,T,V,W,Y;112C,D,E，F(xiàn)，G,H,I，K,L，M,N,P,Q,R,V,W,Y;116A，C，D,E,G,H，K,N，P,Q,R，S,T,V,W,Y;154fA,C，D，E,F，G,I，K,L,M,N，P,Q,R，S,T,V,W,Y;155A，C，D,E,F，QH,I,K,L，M，P，Q,R,T，V，W,Y;156A，C,D,E,F,H，I，K,L，M，N,Q,R，S,T，V，W,Y;157A，C,D,F,QH,I，K,L,M,N，P,R，T,V,W,Y;184A,C,D,E,F，H，I,K，L,M,N,P,Q，R,S,T，W,Y;185A,C,F,GH,I，K,L，M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;185eA,C，D，E,F,QH，I,K,L,M,N，P，Q,R,S，V,W,Y;186C,D,E,F,H,I,K,L，M，N,P,Q,R,T,V,W，Y;187A,C,E，F(xiàn),G,H,I，L，M，N,P，Q，T,V,W,Y;187aA，C，D,E,F，G,H,I,K,L,M,N,P，Q,R,S，W,Y;188C,D,F，G,H，I,K,L,M,N,P，R，T，W,Y;189A，C,D,F，G，H,I,K，L,M,N，P,Q，R，T，V,W，Y;195A,C,D,E，F(xiàn)，GH,I,K，M，N，P，Q，R，S，T，W，Y;199C,D,E,F，G,H,I,K，L,M,Q,R,S，T,V,W，Y;204A，C，D,E，F(xiàn)，G,H,I，K,M,P,Q，R，S，T,V,W，Y;207C,E,F,G,I,K,L,M,N，P，Q,R，S,T,V,W,Y;216A,C,D，E,F，QH,I,K，L，M,N,P，Q,R,V,W,Y;217A,C,F,QH,I，K,L，M,N，P,Q,R,S,T，V,W,Y;230A,C,D，E,F,G,H,I，K,M，N,P,Q,R,S,T,W,Y;235eA,C,D,F,朋，I,K,L,M，N,P，R，S，T，V,W，Y;248A,C,D,E,F,GH，K，L，M,N,P，Q,S,T,W,Y;286A，C,D,E,F,I,K，L,M,N,P,Q,S，T，V,W,Y;287A,C，D,E,F,G,H，I,L,M，N,P，R，T，V,W，Y;288C，D，E，F(xiàn)，QH，I,K，L,M，N,Q，R，S，T,V，W，Y;323A,C,D,E,F,GH,K,L，M,N,P,Q,R,S,T,W，Y;324C,D，E,F,G，H，I，K,L，M,N,Q，R,S,T，V，W,Y;327C，D,E,GH,K，M,N:P，Q,R，T,V，W,Y;332A,C，D,E，GH，I，K,L,M,N,P，Q,R,S,T,V，W;333A，C,D,E,F，G，H，I，K，L,M，Q,R，S,T,V，W,Y;344A,C，D，F(xiàn),G,H，I,K,LM，N,P,Q,S,T,V,W,Y;346A,C，D，E,F,G，H,I,K，L，M，N,Q,S，T,V,W,Y;348A,C，D，E,G,H，I,K,L,M,N,P,Q,R,S，T，V,Y;349C,D，E，F(xiàn)，GH，I,K，M，N，P,Q，R，T，W,Y;350A,C，D，E，F(xiàn),G，H，I，K，L，M,N,P,Q,R，T,W,Y;和395A,C,D,F,G,H,I,L，M,N,P,Q,R,S，V,W,Y。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下至少一個位置的取代20;29;45;63;69;92;93;95;97;98;99;102;110;114;118;125;152;156;157;160;163;183;185;187;194;199;205;218;234;248;286;323;324;328;330;334;343;344;345;347;349;350;384;395;398;409;421;422;423;424;425;426;427;428;429;430;其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個位置對應于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且(d)附帶所述變體丕是選自如下PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶的變體D29S;T45R;A99N;L102V;H110S，V;G156P;E157Q，S;D185E;()185eT;D187R,K,S;()187aV,T;N199A,P;V248R，I;G286R,H;V323I;P324A;E344R;V349L,A，S;D350S,V;和E395K，T。親代肌醇六磷酸酶的變體，包含選自如下至少一個位置的取代20;29;45;63;69;92;93;95;97;98;99;102;110;114;118;125;152;156;157;160;163;183;185;187;194;199;205;218;234;248;286;323;324;328;330;334;343;344;345;347;349;350;384;395;398;409;421;422;423;424;425;426;427;428;429;430;其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；(b)每個位置對應于SEQIDNO:2的位置；并且(c)所述變體與SEQIDNO:2具有至少75%的百分比同一性；并且其中在位置29,45,99,102,110;156;157;185;185e;187，187a,199,248,286;323,324，344，349，350，和395的所述變體選自:29A，C，E，F(xiàn)，QH，I,K，L,M，N,P,Q，R,T,V,W,Y;45A,C,D,E,F，GH,I,K,L，M，N,P，Q,S,V,W，Y;99C,D，E,F,G,H,I，K,L,M，P,Q,R,S，T，V,W,Y;102A,C,D，E,F,G,H,I，K,M,N，P,Q,R,S,T,W,Y;lIOA,C,D,E,F,G,I，K，L，M，N,P,Q，R,T,W,Y;156A，C,D，E，F(xiàn),H，I，K，L,M,N,Q，R，S,T,V,W，Y;157A,C,D，F(xiàn),G，H，I,K，L，M，N，P，R，T，V,W，Y;185A,C,F,G，H,I,K，L,M,N,P，Q，R,S，T，V,W,Y;185eA,C,D,E,F,G，H，I，K，L,M，N，P，Q，R,S,V,W,Y;187A，C,E，F(xiàn)，GH,I，L，M,N，P,Q,T，V,W，Y;187aA，C，D,E,F，G,H，I,K,L,M,N,P,Q,R,S,W，Y;199C,D,E,F,G，H，I,K,L,M，Q,R，S，T,V,W,Y;248A，C,D,E,F，GH,K,L,M,N,P,Q，S,T,W,Y;286A，C,D,E,F,GI,K，L，M，N,P,Q,S，T,V，W,Y;323A,C,D,E,F，GH,K,L,M,N，P,Q，R,S，T，W,Y;324C,D,E,F,QH,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y;344A，C，D，F(xiàn),G，H,I,K,L,M，N,P，Q，S,T,V,W,Y;349C,D,E，F(xiàn)，QH，I,K，M,N，P，Q,R,T,W,Y;350A,C，D,E,F,G，H，I,K,L,M，N，P,Q,R，T,W，Y;和395A,C,D,F,G，H，I,L,M,N，P,Q,R,S,V,W，Y。任何上述實施方案的所述變體，其含有至少一個選自如下的取代20R;29N,C,T;45A;63N;69A;92L;931;95R，H，M,N,S，T;97V;98G;99D;1021;11OY,R，W;114A;118A;125D;152A;156C,R;160R;163P;183K,A,W,G;185A,H,N,P;187G;191L;194R;199S;205S;218T;234K,S;248A,C,D，E，G，H，S;286S;323A;324S，L;328T;330R;334E,D,G;343N;344A,V,S;345D,H;347Q,P;V349M;D350T;384S，A;395G;398T;409S;421R,S;422R;423N;424S;425L;426E;427G;42眠429I;和430M。任何上述實施方案的所述變體，其含有一個選自如下取代或取代組合的取代或取代組合20R+95R+97V+98G;29N+102I;29N+118A;29N+163P+324S;29N+163P+324S+395G;29N+234S;29N+324S;29S;29S+45A+69A+99D+110Y+125D+324A+334E+344S+350V;29S+63N+125D+183K+218T+324A+334E+350V+421S;29S+95H+110W+183W+324A+350V;29S+95M+110W+183W+324A+350V;29S+95N+110R+183W+324A+350V;29S+95R+110W+183W+324A+350V;29S+95S+110R+183W+324A+350V;29S+95S+110W+183W+324A+350V;29S+95T+110R+183W+324A+350V;29S+95T+110Y+125D+183W+286S+324A+350V;29S+95T+110Y+152A+156C+157Q+160R+183W+324A+350V;29S+95T+110Y+156R+157Q+183W+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+l85A+248A+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+185A+248C+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+185A+248E+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+185A+248H+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+185H+248G+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+185P+248G+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+l85P+248S+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+191L+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+248D+324A+350V;29S+95T+110Y+183W+324A;29S+95T+110Y+183W+324A+350V;29S+99D+125D+324A+334E+350V;29S+110Y+183W+185N+324A+350V;29S+125D+218T+324A+344S+350V;29S+125D+234K+324A+330R;29S+125D+234K+324A+330R+395G;29S+125D+324A;29S+125D+324A+330R+395G;29S+125D+324A+350V;29S+183A+324A+350V;29S+183G+324A+334E+344S+350V;29S+183W+324A+350V;29S+205S;29S+324A+350V;29T+324L;69A+334E;99D+398T;114A+187G+194R+324S;218T+334G;323A+324S;324S;324S+328T;324S+345D+347Q;324S+395G;330R;334D+343N+344V;334E+344A;345H+347P+350V;和350V。實施例所用化學品至少是試劑級別的商品。實施例l:制備PE-變體，篩選并分離熱穩(wěn)定性和/或比活性提高的變體一般原理用PeniophoralyciiCBS686.96肌醇六磷酸酶作為親代肌醇六磷酸酶，基于本文所述目標區(qū)域，構建多個肌醇六磷酸酶變體文庫并在酵母(摻雜文庫，及摻入的寡聚物改組文庫，下述其實施例)中表達。提高熱穩(wěn)定性的篩選將所述酵母文庫如下進行初次篩選(復制，單濾膜)來選擇在53。C顯示活性的那些菌落。將在53。C顯示活性的菌落也如下轉到二次篩選(24孔板培養(yǎng))來建立每個菌落的溫度曲線(在可用的37。C,60°C,62°C，64°C,66°C，68°C,70°C，72。C等的活性)。對于比野生型親代隔孢伏革菌親代肌醇六磷酸酶表現(xiàn)更好的菌落，將所述質粒分離并重新轉化如酵母，并重復所述溫度曲線試驗。從所述溫度曲線試驗計算得到下圖"60°C/37°C的相對活性"，和/或"62°C/37°C的相對活性"，和/或"65°C/37°C的相對活性"，和/或"68°C/37°C的相對活性"，和/或"70°C/37°C的相對活性，，，和/或"72°C/37°C的相對活性"，等等。在這些比率中，可將首次提及的溫度命名為"優(yōu)選的高溫"?；趶亩魏Y選方法(溫度曲線測定)的上清所獲得的肌醇六磷酸酶活性值，將這些術語限定為所述肌醇六磷酸酶在高溫(例如60或62。C)的活性相對在較低溫度(37。C)的肌醇六磷酸酶活性的比率。選擇相對活性中的一個活多個比所述親代肌醇六磷酸酶提高的菌落，測序所述質粒并將相應變體鑒定為本發(fā)明改進的肌醇六磷酸酶變體。在第二輪篩選中，選擇熱穩(wěn)定的肌醇六磷酸酶變體作為新的親代肌醇六磷酸酶(骨架)并重復上述(基于新骨架的性能適當調節(jié)溫度)。另外，構建組合變體，并隨機化一些可能的熱突變點(hotspot)，并檢測變體。在第三輪篩選中，選擇進一步改進的新的熱穩(wěn)定的肌醇六磷酸酶變體作為新的骨架并重復上述(再次上(upward)調溫度)，例如現(xiàn)在將所述第一輪篩選溫度升高到63°C。另外，還分析(construed)—些新的組合變體，并且將其他明顯令人感興趣的位點隨機化來發(fā)現(xiàn)取代的最佳配對。通常如上述制備其它變體。提高比活性的篩選在初次篩選中，將所述酵母文庫涂布在含肌醇六磷酸4丐的SC-葡萄糖平板上，并在30。C培養(yǎng)3天。選擇暈圈(halo)較大的克隆并在含YPD培養(yǎng)基的24孔板中培養(yǎng)。在二次篩選中，相對地檢查所述孔中上清的活性并且選擇活性較高的克隆。在80。C，pH4培養(yǎng)30分鐘來去消選擇(deselect)熱穩(wěn)定性較低的變體后，檢查平板上所選克隆的剩余活性。選擇熱穩(wěn)定性較高的克隆并再次在24孔板培養(yǎng)來進行半純化(semi-purification)。進行半純化通過將肌醇六磷酸酶結合到conA-sepharose4B(ConcanavalinA在Amershambioscience,Cat.No.17-0440-01的Sepharose4B凝膠基質中)并用0.5M曱基-a-D-甘露吡喃糖苷(mannopyranoside)在PBS+0.1%tween20(PBS為8g/lNaCl,0.2g/lKCl,2.68g/lNa2HP04-7H20，0.24g/lKH2P04(pH7.4)中洗脫；tween20商業(yè)上可由Bio-Rad,Cat.no.170-6531得到)。然后在已經(jīng)調節(jié)所述活性到30FYT/ml后將所述半純化上清上樣到火箭免疫電泳分析中。在火箭免疫電泳中使用兔中產(chǎn)生的(raised)的抗-純化隔孢伏革菌肌醇六磷酸酶的多克隆抗體。選擇所述信號較小的克隆作為比活性較高的變體(所述火箭電泳(rocket)的面積與所述抗原(肌醇六磷酸酶)的濃度成比例，即面積越小，肌醇六磷酸酶蛋白質越少，所述比活性越高)。改進的變體實施例見下表1-5所示。這些變體比所述隔孢伏革菌親代肌醇六磷酸酶顯示出更高的比活性和/或熱穩(wěn)定性更高。具體地，就熱穩(wěn)定性而言，所述變體顯示"60°C/37°C的相對活性"，和/或"62°C/37°C的相對活性"，和/或"65°C/37°C的相對活性"，和/或"68°C/37°C的相對活性"，和/或"70°C/37°C的相對活性"，和/或"72。C/37。C的相對活性"，和/或"74°C/37°C的相對活性，，等的值更高。(這些結果見表6-1和6-2所示)。由比活性篩選方法得到的選擇變體見下表6-3所示。所有這些變體都期望比表8中命名為"N"的所述變體具有甚至更高的比活性。在公開于WO97/35956的米曲霉IFO4177中表達選擇的變體并在培養(yǎng)基MDU-2Bp在25°C以220rpm培養(yǎng)所述轉化的細胞。從發(fā)酵液(fermentationbroth)純化所述肌醇六磷酸酶變體并進一步如實施例2所述依照熱穩(wěn)定性和/或比活性來定性，顯示于表7-8。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>表5<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>表6-1<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>表6-3<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>菌抹和質粒將大腸桿菌DH12S(得自GibcoBRL)用于酵母質粒挽救(rescue)。pTMPP2ver2為在TPI啟動子控制下的釀酒酵母(S.cerevisiae)和大腸軒菌穿梭(shuttle)載體，從WO00/10038所述的pJC039構建。將它用于文庫構建，酵母表達，篩選和測序。酉良酒酵母YNG318:將MATaDpep4[cir+]ura3-52,leu2-D2，his4-539用于構建酵母文庫并表達所述肌醇六磷酸酶變體。見J.Biol.Chem.272(15)，9720-9727，1997)所述。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>用孔徑0.20pm的濾膜滅菌上述溶液。瓊脂和水(大約761ml)在一起高壓滅菌，并且將分開滅菌的SC-葡萄糖溶液加入所述瓊脂溶液。YPD20g/lBacto蛋白胨10g/l酵母提取物100ml/l20%葡萄糖(分開滅菌)肌醇六磷酸鈉平板100ml/11M醋酸鈉緩沖液(pH5.5)5g/l肌醇六磷酸鈉30g/l瓊脂PEG/LiAc溶液50ml40%PEG4000(通過高壓滅菌1ml5M醋酸鋰(通過高壓滅菌)痕量金屬溶液FeS04x7H2013.90g/1MnS04x5H2013.60g/lZnCl26.80g/1CuS04x5H202.50g/lNiCl2x6H200.24g/1檸檬酸xH203.00g/lMDU隱2Bp麥芽糖xH2045g/1酵母提取物7*1MgS04x7H20lg/1NaCllg/1K2S042g/lKH2P0412g/l痕量金屬溶液0.5ml/l方法月幾醇六磷酸酶活性，初次篩選在SC-葡萄糖平板涂布酵母文庫并在30°C溫育3天。用硝化濾膜通過使用絲絨布將其復制到新的SC-葡萄糖平板。在30。C溫育所述平板1天(或20°C過周末)轉移所述濾膜到預熱的0.5。/。肌醇六磷酸鈉平板(pH5.5)上。在設定的(prescribed)溫度，例如53°C,過夜(0/N)溫育所述平板。移去所述濾膜并且倒入0.5MCaCl2溶液。發(fā)現(xiàn)具有清楚區(qū)域的所述酵母克隆。從所述主(master)平板分離候選克隆并接種到新的SC-葡萄糖平板和24孔板中l(wèi)mlYPD培養(yǎng)基。二次篩選方法在24孔板在25°C以180rpm培養(yǎng)YPD培養(yǎng)基3天。離心所述平板/或僅使它們靜置1小時。將5|il和10^1上清加到肌醇六磷酸鈉平板。在37°C和53°C溫育所述平板過夜。檢測清楚區(qū)域的直徑。用在下面實施例2描述的(如設定的試驗溫度)所述肌醇六磷酸酶試驗，檢測那些在53。C保留活性的克隆的上清的溫度曲線。構建酵母文庫的方法混合0.5|il載體(用EcoRI-NotI消化)和1piPCR片段。在冰上解凍YNG318感受態(tài)細胞。在12ml聚丙烯試管(Falcon2059)混合100^1所述細胞，所述DNA混合物和10|xl載體DNA(Clontech)。加入0.6mlPEG/LiAc溶液并輕柔地混合。在30°C和200rpm溫育30分鐘。在42°C(熱休克(heatshock))溫育30分鐘。轉移到eppendorf管并離心5秒。去除所述上清并在3mlYPD中溶解。在30°C以200rpm溫育所述細胞懸液45分鐘。將所述懸液倒在SC-葡萄糖平板來得到約300克隆/平板。文庫構建通過SOE方法構建摻雜文庫(通過重疊(Overlap)延伸來剪接，見"PCR:Apracticalapproach",p.207-209，OxfordUniversitypress,eds.McPherson，Quirke,Taylor),之后是酵母重組。其他方法通過電穿孑L(BIO-RADGenePulser)進行大腸桿菌轉化用于構建文庫和進行亞克隆。通過堿法(MolecularCloning,ColdSpringHarbor)或用所述Qiager^質粒試劑盒制備DNA質粒。用Qiagen凝膠提取試劑盒從瓊脂糖凝膠回收DNA片段。通過PTC-200DNAEngine進行PCR。用ABIPRISM310遺傳分析儀來確定所有DNA序列。用醋酸鋰方法進行酵母轉化。通過Nucleicacidsresearchvol.20，No.14(1992)3790所述的Robzyk和Kassir's方法提取酵母總DNA。擴增和測序的通常引物用下述引物通過所述SOE方法制備含任何突變片段的DNA片段，或使用下述引物只擴增整個肌醇六磷酸酶基因。SEQIDNO:3:620AM34GAGTACTATCTTGCATTTGTACTAGGAGTTTAGTGAACTTGCSEQIDNO:4:680AM35ATGGTTATGGATTTCGGGGATTCTTCGAGCGTCCCAAAACCSEQIDNO:5:AM34TAGGAGTTTAGTGAACTTGCSEQIDNO:6:AM35TTCGAGCGTCCCAAAACCSEQIDNO:7:620GAGTACTATCTTGCATTTGTACSEQIDNO:8:680ATGGTTATGGATTTCGGGGAT構建摻雜文庫的引物實施例區(qū)域229-236與現(xiàn)有實踐一致，在下面詳明的核苷酸序列中，使用特定的核苷酸編碼。從例如，1^0:〃麗\￥丄5"^.6(111/-￥&皿11^/皿.1^1111)可清楚;(尋到這些。例如K指G或T;Y指C或T;R指A或G;并且N指A,C,G或T。T229V麗核芬酸L230INMKR氨基酸S231TVN氨基酸S232VNN核苷酸G233VNN核香酸N234VNN核苷酸A235VNN核芬酸S236AMK氨基酸或只L230INMKR的核芬酸分布:核苷酸堿基1堿基2堿基3G0.03.046.6A12.56.57.7T0.090.445.7C87.50.00.0在區(qū)域T229-S236靶向下述引物SEOIDNO:9:摻雜1(62mer):GATATGTGCCCGTTCGAC12K(11)(12)(13)(14)(15)T42K33K11532K5CCCCCTTCTGTGACCTATTTACSEOIDNO:10:摻雜1R(18mer):GTCGAACGGGCACATATC1:A91G3T3C32:C91G3A3T33:G91C3A3T34:T91G3A3C35:T95G511:C88A1212:T90G3A713:G47A8T4514:G9A9115:G83A4T9C4構建摻入的寡聚物改組文庫的引物SEOIDNO11:L102TI(43mer):AGTTCGGCGTCGCCGATCTGAYCCCGTTCGGGGCTAACCAATCSEOIDNO12:VE248+251X(53mer):CGACAAGSEOIDNO13:V271AI(45mer):CCGGGAACGCTCTCGGTCCTRYCCAGGGCGTCGGATACGTCAATGSEOIDNO14:G286X(42mer):ATGAGCTGCTTGCACGCTTGACCVNNCAAGCCGTTCGAGACG通過摻雜構建肌醇六磷酸酶變體用下述PCR反應系統(tǒng)和條件，用2個引物對，620AM34及摻雜1R,和摻雜1和上述核香酸混合物及680AM35進行第一個PCR反應PCR反應系統(tǒng)<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>約10嗎DNA/250pl與0.8nlDNaseI(GibcoBRL18068-015)及30^110x緩沖液在25°C溫育7-10min。加入終濃度10mM的EDTA來終止所述反應。用Whatman玻璃濾膜純化正確大小的DNA片l殳(50-150bp)。然后用下述PCR反應系統(tǒng)和條件重新裝配所述DNase處理的片^殳<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>實施例2:肌醇六磷酸酶變體的純化和定性純化肌醇六磷酸酶變體表達選自上表1-5的數(shù)個變體的米曲霉(Asperillusoryzae)的發(fā)酵培養(yǎng)肉湯(用大寫字母A-M命名)，先用一系列Millipore的GF-濾膜然后用0.45HA-濾膜(Millipore)過濾。然后將硫酸銨(AMS)以濃度L35M加入過濾液，并調節(jié)pH到pH6。再次過濾所述樣品(如上0.45HA-濾膜)并將其上樣到70ml(體積取決于上樣)在1.35MAMS,20mM琥珀酸鹽，pH6平衡的PhenylSepharose柱(XK26,Pharmacia)。用1.35MAMS，20mM琥珀酸鹽，pH6洗滌所述柱后，以線性梯度1.35-0MAMS在20mM琥珀酸鹽，pH6用10個柱體積洗脫所述肌醇六磷酸酶。將流速設定在6ml/min并收集10ml級分(fraction)。匯集含活性并具有足夠純度(通過SDS-PAGE評估)的級分并用50mM醋酸鈉，pH5.5過夜透析。然后向所述含肌醇六磷酸酶的匯集物加入20mMTris-醋酸(aceticacid),pH7.5并在用20mMTris-醋酸，pH7.5平衡的8mlMonoQ或較大Q-Sepharose柱(Pharmacia)中進行陰離子交換層析。以線性梯度0-0.5MNaCl在20mMTris-醋酸，pH7.5用10個柱體積洗脫所述肌醇六磷酸酶。根據(jù)柱子刻度調節(jié)流速和級分大小。匯集含肌醇六磷酸酶活性并且具有足夠純度的級分并在用50mM醋酸鈉，pH5.5透析前在AmiconYMlO膜上濃縮。SDS-PAGE用Novex4-20Tris-甘氨酸根據(jù)生產(chǎn)商說明進行SDS-PAGE。如從米曲霉純化的所述肌醇六磷酸酶變體具有分子量，MW,大約65kDa，對應于大約25%碳水化合物(carbohydrate)。肌醇六磷酸酶活性試驗，pH和溫度曲線，溫度穩(wěn)定性檢測將10|il稀釋的酶樣品(在0.1M醋酸鈉，0.01%Tween20,pH5.5稀釋)加入0.1M醋酸鈉，0.01%Tween20,pH5.5(在溶解所述力幾醇六磷酸鈉后調節(jié)pH;預熱所述底物)中的250^15mM肌醇六磷酸鈉(Sigma)并在37°C溫育30分鐘。通過加入250|al10%TCA來終止所述反應并通過加入500|il100ml鉬酸鹽(molybdate)試劑中的7.3gFeS04(將8mlH2S04中2.5g(NH4)6Mo7024.4H20稀釋到250ml)來測量游離(free)磷酸鹽。測量96孔孩史滴板中20(Hil樣品在750nm的吸光度。包括底物和酶空白。也包括磷酸鹽標準曲線(0-2mM磷酸鹽)。1FYT等于在給定條件釋放1pmol磷酸鹽/min的酶量。通過在50mM數(shù)個pH值pH3(甘氨酸-HCl)，pH4-5.5(醋酸鈉)，pH6(MES)，pH7-8(Tris-HCl)的緩沖液進行上述試驗來獲得所述pH-曲線。在不同溫度(預熱所述底物)進行所述試驗獲得溫度曲線。可通過在測量所述殘基活性前，在O.IM磷酸鈉，pH5.5在不同溫度預溫育肌醇六磷酸酶來研究溫度穩(wěn)定性。所述純化的變體與所述i3/少cz'z'親代肌醇六磷酸酶顯示類似的pH-曲線(所有均具有大約pH4-5的最適pH)。差示掃描量熱法(DSC)在不同pH值用MicroCal.的VP-DSC進行DSC。從20-90°C以恒定掃描速率1.5。C/min進行掃描。在進行DSC之前，用在適當緩沖液(例如0.1M甘氨酸-HCl,pH2.5或3.0;0.1M醋酸鈉，pH5.5;0.1MTris-HCl，pH7.0)中平衡的NAP-5柱(Pharmacia)將所述肌醇六磷酸酶脫鹽。用MicroCalOrigin軟件進行數(shù)據(jù)處理。所得溶解溫度，Tm's,見下表7所示。所述變體的熱穩(wěn)定性比所述隔孢伏革菌親代肌醇六磷酸酶顯著提高。所述熱穩(wěn)定性顯示為pH依賴性的。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>實施例3:比活性用在20mM乙酸鈉，pH5.5透析的高純度樣品測定選自表1-5的變體(在此命名為N,O和P)的比活性。事前在SDS聚丙烯酰胺凝膠上一企測所述純度，顯示只存在一種成分。通過如下氨基酸分析測定所述蛋白質濃度在110。C在6NHCl，0.1%苯酚中在抽空(evacuated)的玻璃管中水解一等份(aliquot)樣品16小時。用AppliedBiosystems420A氨基酸分析系統(tǒng)根據(jù)制造商的說明定量所得氨基酸。從所述氨基酸的量，可計算出水解的等份中的蛋白質總質量，并由此也得到所述蛋白質的濃度。以單位FYT測定所述肌醇六磷酸酶活性，并用每mg肌醇六磷酸酶變體酶蛋白質中以單位FYT測定的肌醇六磷酸酶活性來計算比活性。所述結果見下表8所示。所述具體比活性數(shù)值是相對于設定為100%的所述隔孢伏革菌親代肌醇六磷酸酶的比活性。表8肌醇六磷酸酶變體比活性(％)隔孢伏革菌親代肌醇六磷酸酶100N147O117P114實施例4:包含肌醇六磷酸酶變體的動物飼料和動物飼料添加劑動物伺^+添加劑'將10g1938號肌醇六磷酸酶變體(以肌醇六磷酸酶酶蛋白質計算)力口入下述預混合物(premix)(每千克預混合物):5000000正維生素A1000000正維生素D313333mg維生素E1000mg維生素K3750mg維生素Bl2500mg維生素B21500mg維生素B67666mcg維生素B1212333mg煙酸(Niacin)33333mcg生物素300mg葉酸3000mgCa-D-Panthothenate(D-泛酸4丐)1666mg銅16666mg鐵16666mg鋅23333mg錳133mg鈷66mg碘66mg石西5.8%4丐25%鈉動物銅料這是動物飼料的實施例，所述動物飼料包含0.03g/kg(30ppm)的肌醇六磷酸酶變體E(以肌醇六磷酸酶酶蛋白質計算)74.0%小麥20.7%烤豆(roastedsoy)蛋糕5.0%豆油0.3%上述預混合物。混合所述成分，并且在所需溫度，例如65,75,80，或甚至85。C將所述飼料制粒。本文公開的具體實施方案不會從范圍上限制在此描述和權利要求的發(fā)明，因為這些實施方案是為了闡述本發(fā)明的各個方面。任何等同實施方案都應在本發(fā)明范圍。事實上，對于本領域技術人員，從前述說明書得到在那些本文所示和描述之外的本發(fā)明的多種改進是顯而易見的。這些改進也應落入所附的(appended)權利要求的范圍。如有沖突，以包括限定的本文公開為準。本文引用多個文件，全文引入其公開作為參考。序列表<110>諾維信公司(NovozymesA/S)<120>肌醇六磷酸酶變體<130>10261<160>14<170>PatentInversion3.2<210><211><212><213>11320DMPeniophoralycii<220><221><222>sig—peptide(1)…(48)<220><221><222>CDS(49)..(1320)<400>1tgatgtcgagtcttget57SerLeuAla1etacctatecccgca105LeuProlieProAla15atggtttcttcggcattcgc3ccttccatcctacttagctttgageacgcagttcagetttgttgcggcgcagLeuSerThrGinPheSerPheValAlaAlaGin510caaaacacaagtaattgggggcctUcgatcccttctttcccgtcgaa153GinAsnThrSerAsnTrpGlyProTyrAspProPhePheProValGlu20253035ccgUtgcagetccgccggaagggtgcacagtgacacaggtcaacctg201ProTyrAlaAlaProProGluGlyCysThrValThrGinValAsnLeu404550attcagaggcacggcgcgcgttggcccacatecggcgcgeggtcgegg249lieGinArgHisGlyAlaArgTrpProThrSerGlyAlaArgSerArg556065caggtcgccgccgtagcgaagatacaaatggcgcgaccattcacggat297GinValAlaAlaValAlaLyslieGinMetAlaArgProPheThrAsp707580cccaagtatgagttcetcaacgacttcgtgtacaagttcggcgtcgcc345ProLysTyrGluPheLeuAsnAspPheValTyrLysPheGlyValAla859095gatctgetaccgUcggggetaaccaatcgcaccaaaceggcaccgat393AspLeuLeuProPheGlyAlaAsnGinSerHisGinThrGlyThrAsp100105110115atgtatacgcgctacagtacactatttgagggcggggatgtacccttt441MetTyrThrArgTyrSerThrLeuPheGluGlyGlyAspValProPhe120125130gtgcgcgcggetggtgaccaacgcgtcgttgactectcgacgaactgg489ValArgAlaAlaGlyAspGinArgValValAspSerSerThrAsnTrp135140145acggcaggctttggcgatgettctggcgagactgttetcccgacgetc537ThrAlaGlyPheGlyAspAlaSerGlyGluThrValLeuProThrLeu150155160caggttgtgcttcaagaagaggggaactgcacgetctgcaataatatgGinValValLeuGinGluGluGlyAsnCysThrLeuCysAsnAsnMet165170175585tgcccgaatgaagtggatggtgacgaatecacaacgtggctgggggtcCysProAsnGluValAspGlyAspGluSerThrThrTrpLeuGlyVal180185190195633UtgcgccgaacateaccgcgcgattgaacgetgetgcgccgagtgecPheAlaProAsnlieThrAlaArgLeuAsnAlaAlaAlaProSerXla200205210681aacetcteagacagegacgcgetcactetcatggatatgtgcccgUcAsnLeuSerAspSerAspAlaLeuThrLeuMetAspMetCysProPhe215220225729gacactetcagetecgggaacgecagecccUctgtgacetatttaccAspThrLeuSerSer6lyAsnAlaSerProPheCysXspLeuPheThr230235240777gcggaggagtatgtgtegtaxgagtactactatgacetcgacaagtacAla6luGluTyr^alSerTyrGluTyrTyrTyrAspLeuAspLysTyr245250255825tatggcacgggccccgggaacgetetcggtcctgtccagggcgtcggaTyrGlyThrGlyProGlyAsnAlaLeuGlyProValGinGlyValGly260265270275873tacgtcaatgagctgcttgcacgcUgaccggccaagecgttcgagacTyrValAsnfiluLeuLeuXlaArgLeuThrGlyGinAlaValArgAsp280285290921gagacgcagacgaaccgcacgetcgacagegaccctgcaacattcccgGluThrGinThrAsnArgThrLeuAspSerAspProAlaThrPhePro■295300305969ctgaaccgtacgUctacgecgacUctegcatgataacaccatggtgLeuAsnArgThrPheTyrAlaAspPheSerHisAspAsnThrMetVal3103153201017cccateUtgcggcgetcgggetcUcaacgecaccgecetcgacccgProliePheAlaAlaLeuGlyLeuPheAsnAlaThrXlaLeuAspPro3253303351065ctgaagcccgacgagaacaggUgtgggtggactctaagctggUccgLeuLysProAspfiluAsnArgLeuTrpValAspSerLysLeuValPro3403453503551113Uctctgg￡icatatgacggtcgagaagctggcatgttctgggaaggagPheSerGlyHisMetThrValGluLysLeuAlaCysSerGlyLysGlu3603653701161gcggtcagggtgetcgtgaacgacgcggtgcagccgctggagUctgcAlaValArgValLeuValAsnAspAlaValGinProLeuGluPheCys3753803851209ggaggtgttgatggggtgtgcgagcttteggetttcgUgagagecagGlyGlyValAspGlyValCysGluLeuSerAlaPheValGluSerGin3903954001257acgUtgcgegggagaatgggcaaggcgacttcgecaagtgcggcUtThrTyrAlaArgGluAsnGlyGinGlyAspPheAlaLysCysGlyPhe4054104151305gttccgteggaatagValProSerGlu4201320<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>LeuPheThrAlaGluGluTyrValSerTyrGluTyrTyrTyrAspLeu245250255AspLysTyrTyrGlyThrGlyProGlyAsnAlaLeuGlyProValGin260265270GlyValGlyTyrValAsnGluLeuLeuAlaArgLeuThrGlyGinAla275280285ValArgAspGluThrGinThrAsnArgThrLeuAspSerAspProAla290295300ThrPheProLeuAsnArgThrPheTyrAlaAspPheSerHisAspAsn305310315320ThrMetValProliePheAlaAlaLeuGlyLeuPheAsnAlaThrAla325330335LeuAspProLeuLysProAspGluAsnArgLeuTrpValAspSerLys340345350LeuValProPheSerGlyHisMetThrValGluLysLeuAlaCysSer355360365GlyLysGluAlaValArgValLeuValAsnAspAlaValGinProLeu370375380GluPheCysGlyGlyValAspGlyValCysGluLeuSerAlaPheVal385390395400GluSerGinThrTyrAlaArgGluAsnGlyGinGlyAspPheAlaLys405CysGlyPheValProSerGlu420<210〉3<211>42<212>DM<213〉人工序列<220><223〉引物620AM34<220><221>misc—feature<223>引物<400>3gagtacUtcttgcatttgtactagg3gtttagtgaacttgc<210〉4<211>4141041542<212〉DNA<213>人工序列<220><223>引物680AM35<220><221〉misc—feature<223>引物<400>4atggttatggatttcggggattcttcgagcgtccc333axc41<210><211><212><213>520腿人工序列<220〉<223>引物AM34<220〉<221>misc—feature<223>引物<400>5taggagtttagtgaacttgc20<210>6<211〉18<212>腿<213〉人工序列<220><223〉引物AM35<220〉<221>misc—feature<223>引物<400>6ttcgagcgtcccaaaacc18<210><211><212><213>722DNA人工序列<220〉<223>引物620<220><221>misc-feature<223>引物<400>7gagtactatcttgcatttgtac22<210>8<211>21<212>DNA<213〉人工序列<220><223>引物680<220〉<221>misc—feature<223〉引物<400>8atggttatggatttcggggat21<210>9<211>62<212>應<213>人工序列<220><223〉引物Dopel<220><221>misc—feature<222>(19)..(19)<223>N在位點19是91°/A，3°/。G，3訂，3°/C<220〉<221>misc—feature<222〉(20)..(20)<223〉N在位點20是91°/。C,3%G,3%\,3CT<220〉<221〉misc—feature<222>(21).■(21)<223>N在位點21是G或T<220><221〉misc-feature<222>(22).(22)<223>N在位點is88%C,12%A<220><221〉misc—feature<222>(23)..(23)<223>N在位點23是90。/。T，3%G,7°M<220><221>misc—feature<222>(24)..(24)<223>N在位點24是47W,8%A，45CT<220〉<221>misc—feature<222>(25)..(25)<223>N在位點25是9。/。G，91°/A<220><221>misc—feature<222>(26),.(26)<223〉N在位點26是83W;，4%A,9%T,4%C<220〉<221〉misc—feature<222>(27)..(27)<223>N在位點27是T<220><221〉misc—feature<222〉(28)..(28)<223>N在位點28是911T，3°/G,3M,3°/。C<220><221〉misc—feature<222〉(29)..(29)<223>N在位點29是91。/。C,3°/。G,3°/A，3°/T<220><221>misc—feature<222>(30)..(30)<223〉N在位點30是G或T<220><221>misc—feature<222>(31)..(31)<223>N在位點31是91%G,3°/C,3'/。A,3%T<220〉<221>misc—feature<222〉(32)..(32)<223〉N在位點32是9WG，3%C,3%A,3%T-<220><221>misc_feature<222>(33)..(33)<223>N在位點33是G或T<220><221>misc—feature<222>(34)..(34)<223>N在位點34是9iy。A,3%G，3%T，3°/。C<220><221>misc—feature<222〉(35)..(35)<223>N在位點35是91。/。A,3°/G,3%T,3%C<220><221>misc—feature<222>(36).(36)<223>N在位點36是95%T，5°/。G<220〉<221>misc—feature<222>(37).(37)<223〉N在位點37是9iy。G，3°/C,3%A,3%T<220><221〉misc—feature<222>(38)(38)<223>N差&點38是91%C,3%G，3°/。A,3%T<220><221>misc—feature<222>(39)..(39)<223>N在位點39是G或T<220〉<221>misc—feature<222〉(40)..(40)<223〉N在位點4Q是95'/。T,5%G<400>9gatatgtgcccgUcgacnnnrmnrmtrmnrmnrmrmnrmcccccttctgtgaccUUt60<210〉<211><212〉<213>1018腿人工序列<220><223>引物DopelR<220><221>misc—feature<223〉引物<400>10gtcgaacgggcscatatc18<210><211><212><213>1143DNA人工序列<220><223>引物L102TI<220><221><222〉<223〉misc—feature(22).(22)N在位點22是C或T<400>11agttcggcgtcgccgatctgancccgttcggggctaaccaatc43<210〉<211〉<212><213〉1253謹人工序列<220><223>引物VE248+251X<220><221><222><223〉<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221〉<222〉<223〉<220><221〉<222><223>misc—feature(21)..(21)N在位點21是A或C或Gmisc-feature(22)..(22)N在位點22是A或C或G或Tmisc—feature(23)..(23)N在位點23是A或C或G或Tmisc—feature(30)..(30)N在位點30是A或C或Gmisc—feature(31)..(31)N在位點31是A或C或G或T<220><221〉misc—feature<222〉(32)..(32)<223>N在位點32是A或C或G或T<權>12tatttaccgcggaggagtatnnntcgtacnnntactactatgacctcgacaag53<210〉<211><212><213>1345DNA人工序列<220><223>引物V271AI<220><221><222〉<223>misc—feature(21)..(21)N在位點21是<220><221><222><223〉misc—feature(22).,(22)N在位點22是<楊>13A或G.C或Tccgggaacgctctcggtcctrmccagggcgtcggatacgtcaatg45<210><211><212〉<213〉<220><223〉<220><221><222〉<223〉<220〉<221><222><223>1442DNA人工序列引物G286Xmisc_feature(24)..(24)N在位點24是A或C或Gmisc—feature(25)..(26)N在位點25和26獨立地是A或C或G或T<400>14atgagctgcttgcacgcttgaccnrmcaagccgttcgagaeg4權利要求1.親代肌醇六磷酸酶的變體，包含在位置125的取代，其中(a)所述變體具有肌醇六磷酸酶活性；和(b)每個位置對應于SEQIDNO2的位置；和(c)所述變體與SEQIDNO2具有至少75％的百分比同一性。2.權利要求1的變體，其包含取代125D,其與Pem'oj^ora(y"7CBS686.96肌醇六磷酸酶相比具有改進的熱穩(wěn)定性和/或比活性。3.權利要求1或2的變體，其含有的取代或取代的組合選自下述取代和耳K氣的組合(ii〕(iii)29S+99D+125D+324A+334E+350V;(vi)29S+125D+218T+324A+344S+350V;(v)29S+125D+234K+324A+330R;(vi)29S+125D+234K+324A+330R+395G;(vii)29S+125D+324A;(viii)29S+125D+324A+330R+395G;(ix)29S+125D+324A+350V。4.分離的核S交序列，其包含編碼權利要求l-3任一變體的核酸序列。5.核酸構建體，其包含權利要求4的核酸序列，所述核酸序列與一或6.重組表達載體，其包含權利要求5的核酸構建體。7.重組宿主細胞，其包含權利要求5的核酸構建體和/或權利要求6的表達載體。8.生產(chǎn)權利要求l-3任一的變體的方法，其包含(a)培養(yǎng)權利要求7的宿主細胞來生產(chǎn)包含所述變體的上清；和(b)回收所述變體。9.轉基因植物，或植物部分，其能表達權利要求l-3任一的肌醇六磷酸酶變體，所述植物部分不是繁殖材料且其選自莖，愈傷組織，葉，根，塊莖，葉綠體，質外體，線粒體，液泡，過氧化物酶體，胞質和植物細胞。10.轉基因非人動物，或產(chǎn)物，或其元件，其能表達權利要求1-3任一的肌醇六磷酸酶變體，所述產(chǎn)物或元件選自體液，器官，肉和動物細胞。11.權利要求10所述的轉基因非人動物，或產(chǎn)物，或其元件，其中所述的體液選自奶和血。12.組合物，其包含至少一種權利要求1-3中任一的肌醇六磷酸酶變體，和(a)至少一種脂肪可溶維生素；(b)至少一種水溶維生素；和/或(c)至少一種痕量礦物質。13.權利要求12的組合物，所述的痕量礦物質選自鎂，鋅，鐵，銅，石典，石西和鈷。14.權利要求12或13的組合物，其還包含至少一種選自下述酶的酶木聚糖酶，葡聚糖內切酶，內切-1，3(4)-(3葡聚糖酶，和蛋白酶。15.權利要求12-14任一的組合物，其為動物飼料添加劑。16.動物飼料組合物，其粗制蛋白質含量為50-800g/kg，并包含權利要求1-3任一的變體或權利要求12-15任一的組合物。17.提高動物飼料營養(yǎng)價值的方法，其中將權利要求1-3任一的變體或權利要求12-15任一的組合物加到所述飼料。18.降低動物糞便中肌醇六磷酸/鹽水平的方法，包含喂給動物有效量的權利要求16的飼料。19.處理植物蛋白質的方法，包含將權利要求l-3任一的變體或權利要求12-15任一的組合物加到至少一種植物蛋白質或蛋白質源中的步驟。20.權利要求1-3任一的變體或權利要求12-15任一的組合物在如下的用途在動物飼料中；在動物伺料制備中；用于提高動物飼料營養(yǎng)價值；降低動物糞便中肌醇六磷酸/鹽水平；處理植物蛋白質；或從肌醇六磷酸酶底物釋放磷。全文摘要本發(fā)明涉及的肌醇六磷酸酶變體來自與Peniophoralycii肌醇六磷酸酶同源的親代肌醇六磷酸酶，并包括在對應于Peniophoralycii肌醇六磷酸酶位置的數(shù)個位置中的至少一個上的至少一個取代。所述變體的性質改進，具體為比活性和/或熱穩(wěn)定性比親代肌醇六磷酸酶高，例如通過DSC測定，在pH5.5Tm最多為82℃，和/或雙倍比活性。本發(fā)明也涉及編碼所述肌醇六磷酸酶變體的DNA，它們的生產(chǎn)方法，及其，例如在動物飼料和動物飼料添加劑中的用途。文檔編號C12N9/16GK101177675SQ20071019628公開日2008年5月14日申請日期2003年2月4日優(yōu)先權日2002年2月8日發(fā)明者克勞斯·C·富格爾桑,松井知子,福山志朗,阿倫·斯文德森申請人:諾維信公司