專利名稱：：補(bǔ)體活化的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及因子D的專一抑制劑、以及使用此抑制劑來抑制補(bǔ)體系統(tǒng)活化和抑制補(bǔ)體旁路活化途徑。
背景技術(shù)：
：補(bǔ)體系統(tǒng)在清除免疫復(fù)合物及^j"感染物、外來抗原、病毒感染細(xì)胞及胂瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答中扮演中心角色。然而，補(bǔ)體也參與病理炎癥及自身免疫疾病。因此，抑制過度或失控的補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)活化可為有此疾病或癥狀的病人提供臨床益處。補(bǔ)體系統(tǒng)包含兩個(gè)不同活化途4圣，^皮稱為經(jīng)典途徑及旁路途徑(V.M.Holers,InClinicalImmunology:PrinciplesandPractice,ed.R.R.Rich,MosbyPress;1996,363-391)。經(jīng)典途徑為釣/鎂依賴的級聯(lián)反應(yīng)，該途徑一般由抗原-抗體復(fù)合物的形成而活化。旁路途徑為鎂依賴的級聯(lián)反應(yīng)，該途徑通過C3在特定易感表面(如酵母菌、細(xì)菌及特定生物多聚物的細(xì)胞壁多糖)沉積和活化而活化。補(bǔ)體途徑的活化產(chǎn)生補(bǔ)體蛋白的生物活性片段，如C3a、C4a及C5a過敏毒素及C5b-9膜攻擊復(fù)合物(MAC)，它們介導(dǎo)炎癥活性，包括白細(xì)胞趨化性、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板、肥大細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的活化、血管通透性、細(xì)胞裂解及組織傷害。因子D為補(bǔ)體活化的旁路途徑所需的高度專一絲氨酸蛋白酶。它可切割與C3b結(jié)合的因子B，產(chǎn)生C3b/Bb酶，這種酶是旁路途徑C3/C5轉(zhuǎn)換酶的活性成份。因子D可以是抑制的合適靶，因?yàn)樗谌祟愔械难獫{濃度非常低(l.8微克/毫升)，已經(jīng)顯示它是補(bǔ)體活化的旁路途徑中的限制酶(P.H.Lesavre及H.J.Muller-Eberhard.J.Exp,Med.,1978;148:1498—1510;J.E.Volanakis等人，NewEng.J.Med.，1985;312:395-401)。補(bǔ)體活化的下調(diào)已經(jīng)證明在動(dòng)物模型中及體外研究中可有效治療數(shù)個(gè)疾病，如系統(tǒng)性紅斑性狼癡癥及腎小球性腎炎(Y.Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.;1996,93:8563-8568)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Y.Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci，1995;92:8955-8959)、心肺分流及溶血癥(C.S.Rinder，J.Clin.Invest.，1995;96:1564-1572)、器官移植超急性排斥(T.J.Kroshus等人，Transplantation,1995;60:1194-1202)、心血管栓塞(J.W.Homeister等人，J.Immimol，1993;150:1055-1064;H.F.Weisman等人，Science,1990;249:146-151)、再灌流損傷(E.A.Amsterdam等人，Am.J.Physiol，1995;268:H448-H457)、及成人呼吸困難綜合征(R.Rabinovici等人，J.Immunol,1992;149:1744-1750)。此外，其它炎癥及自身免疫/免疫復(fù)合物疾病亦與補(bǔ)體活化密切相關(guān)(V.M.Holers,ibid.,B.P.Morgan.Eur.J.Clin.Invest,1994:24:219-228),這包括熱損傷、嚴(yán)重哮喘、過敏性休克、腸炎、蕁麻疹、血管水腫、脈管炎、多發(fā)性栓塞、重癥肌無力癥、膜增生性腎小球性腎炎、及Sjogren氏癥。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明包括因子D的抑制劑，它在補(bǔ)體活化的旁路途徑中與因子D結(jié)合并阻斷因子D的補(bǔ)體活化的功能活性。這種抑制劑包括抗體分子以及同源物、相似物及其修飾形式或衍生形式，這包括免疫球蛋白片段如Fab、F(ab。2及Fv。小分子包括肽、寡核苦酸、肽才莫擬物，能結(jié)合因子D并阻斷其功能活性的有機(jī)化合物也包含在本發(fā)明內(nèi)。已經(jīng)制備了一種單克隆抗體，它能與因子D結(jié)合并阻礙其補(bǔ)體活化功能，它被命名為166-32。產(chǎn)生此抗體的雜交瘤保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110-2209,保藏號碼為HB-12476。圖1顯示在ELISA中抗因子D的單克隆抗體(MAbs)與純化的人因子D結(jié)合。實(shí)心圓形標(biāo)記的線代表MAb166-11。實(shí)心三角形標(biāo)記的線代表MAb166-32。實(shí)心菱形標(biāo)記的線代表MAb166-188。實(shí)心正方形標(biāo)記的線代表MAb166-222。Y-軸表示MAbs與因子D的反應(yīng)性，它用450nm處的光密度(OD)表示，X-軸代表MAbs的濃度。圖2顯示MAb166-32在存在10%人血清的情況下，對未致敏的兔血紅細(xì)胞(RBCs)的旁路(AP)溶血的抑制作用。實(shí)心正方形標(biāo)記的線代表MAb166-32。實(shí)心圓形標(biāo)記的線代表無關(guān)的同種型匹配的對照MAbG3-519,后者對HIV包膜糖蛋白gpl20有專一性。如文中的進(jìn)一步介紹，Y-軸表示。/。的溶血抑制作用。X-軸表示MAbs的濃度。圖3顯示MAbl66-3卩在存在90。/。人血清的情況下，對未致^:的兔血紅細(xì)胞(RBCs)的旁路(AP)溶血的抑制作用。實(shí)心正方形標(biāo)記的線代表MAb166-32。實(shí)心圓形標(biāo)記的線代表無關(guān)的同種型匹配的對照MAbG3-519，后者對HIV包膜糖蛋白gpl20有專一'性。如文中的進(jìn)一步介紹，Y-軸表示y。的溶血抑制作用。X-軸表示MAbs的;農(nóng)度。圖4顯示MAb166-32不能抑制已致敏的雞RBCs的經(jīng)典途徑(CP)溶血，但陽性對照抗人C5MAb137-76能夠抑制。實(shí)心圓形標(biāo)記的線代表MAb137-76。實(shí)心菱形及實(shí)心正方形標(biāo)記的線分別代表MAb166-32及陰性對照MAbG3-519。Y-軸表示％溶血抑制作用。X-軸表示MAbs的濃度。圖5顯示MAb166-32對旁路途;fS(AP)溶血的抑制作用。溶血可通過在已使用抗因子DMAb166-222親合性層析清除其因子D的人血清中加入不同濃度的純化人因子D來增強(qiáng)。此分析在存在或無0.3微克/毫升的試驗(yàn)MAbs的條件下進(jìn)行。實(shí)心正方形標(biāo)i己的線代表不加抗體。實(shí)心圓形標(biāo)記的線代表MAb166-32。實(shí)心三角形標(biāo)i己的線代表無關(guān)同種型匹配的對照MAbG3-519。Y-軸代表。/。溶血抑制作用。X-軸代表因子D的濃度。圖6顯示MAb166-32對依賴因子的EAC3b細(xì)月包裂解的抑制作用。此旁路C3轉(zhuǎn)換酶通過與因子B、因子P及因子D溫育裝配于EAC3b細(xì)胞。在溫育緩沖液中加入不同濃度的MAb166-32以抑制因子D活性。實(shí)心正方形標(biāo)記的線代表MAb166-32。實(shí)心圓形標(biāo)記的線代表MAbG3-519。Y-軸代表％溶血抑制作用。X-軸代表MAbs的濃度。圖7顯示MAb166-32可抑制C3a由酵母聚糖生成。酵母聚糖可在存在于人血清中時(shí)活化補(bǔ)體旁路途徑。C3a的生成可使用ELISA試劑盒測量。實(shí)心正方形標(biāo)記的線代表MAb166-32。實(shí)心圓形標(biāo)記的線代表無關(guān)同種型匹配的對照MAbG3-519。Y-軸代表C3a產(chǎn)生的％抑制作用。X-軸代表MAbs的濃度。圖8顯示MAb166-32可抑制sC5b-9由酵母聚糖生成。酵母聚糖可在存在于人血清中時(shí)活化補(bǔ)體旁路途徑。sC5b-9的生成可使用ELISA試劑盒測量。實(shí)心正方形標(biāo)記的線代表MAb166-32。實(shí)心圓形標(biāo)記線代表無關(guān)同種型匹配的對照MAbG3-519。Y-軸代表sC5b-9生成的％抑制作用。X-軸代表MAbs的濃度。圖9顯示由MAb166-32及其Fab對未致敏的兔RBCs的旁路途徑溶血的抑制作用。實(shí)心圓形標(biāo)記的線代表MAb166-32(全I(xiàn)gG)。實(shí)心正方形標(biāo)記的線代表MAb166-32的Fab。Y-軸代表％溶血抑制作用。X-軸代表MAbs的濃度。圖10顯示MAb166-32對于來自不同動(dòng)物種屬的血清中的因子D對未致敏的兔RBCs的旁路途徑溶血的抑制作用。實(shí)心正方形標(biāo)記的線代表人血清。實(shí)心圓形標(biāo)記的線代表黑猩猩血清。實(shí)心三角形標(biāo)記的線代表恒河猴血清。實(shí)心倒三角形標(biāo)記的線代表狒狒血清。實(shí)心菱形標(biāo)記的線代表cynomlgus猴血清?？請A形標(biāo)記的線4戈表羊血清?？杖切螛?biāo)記的線代表狗血清。Y-軸代表。/。溶血抑制作用。X-軸代表MAb166-32的濃度。圖11顯示MAb166-32與不同的桿狀病毒表達(dá)的因子D("FD")突變體及雜合體在ELISA中的反應(yīng)力。實(shí)心正方形標(biāo)記的線代表人因子D-—FD/Hu。實(shí)心圓形標(biāo)記的線代表豬因子D—-FD/Pig。實(shí)心三角形標(biāo)記的線代表FD/Pighu。實(shí)心倒三角形標(biāo)記的線代表融合蛋白FD/Hupig。實(shí)心菱形標(biāo)記的線代表突變蛋白FDNDA?？請A形標(biāo)記的線代表突變蛋白FD/L?？杖切螛?biāo)記的線代表突變蛋白FD/RH?？樟庑螛?biāo)記的線代表無包被抗原的空白對照。重組蛋白將在文中進(jìn)一步介紹。圖12顯示用于嵌合體166-32Fab的表達(dá)載體質(zhì)粒的示意圖(A)pSV2dhfrFd及(B)pSV2neoK。實(shí)心盒代表編碼Fd或k基因的外顯子。斜線片段如下文所示代表源自HCMV的增強(qiáng)子及啟動(dòng)子元件(E-P)。空心盒如其標(biāo)記代表二氫葉酸還原酶(dhfr)及neo基因。pSV2質(zhì)粒含有來自以下不同來源的DNA片段pBR322DNA(窄線)包含pBR322歸的復(fù)制起始區(qū)域(pBRori)及內(nèi)酰胺酶---氨千青霉素抗性基因(Amp);SV40DNA用寬斜線代表及標(biāo)明，包含SV40DNA復(fù)制起始區(qū)域(SV40ori)、早期啟動(dòng)子(dhfr及neo基因的50、及聚腺苷酸化信號(dhfr及neo基因的30。源自SV40的聚腺苷酸化信號(pA)也置于Fd基因的。圖13顯示未致敏的兔RBCs的旁路途徑(AP)溶血的抑制作用。實(shí)心正方形標(biāo)記的線代表小鼠MAb166-32。實(shí)心圓形標(biāo)記的線代表嵌合體MAb166-32。實(shí)心三角形標(biāo)記的線代表同種型匹配的的陰性對照抗體G3-519。Y-軸代表溶血抑制作用(％)。X-軸代表抗體的濃度。圖14顯示未致敏的兔RBCs的旁路途徑(AP)溶血的抑制作用。實(shí)心正方形標(biāo)記的線代表嵌合體166-32IgG。實(shí)心圓形標(biāo)記的線代表cFab/9aa。實(shí)心三角形標(biāo)記的線代表cFab。Y-軸代表溶血抑制作用(％)。X-軸代表IgG及Fab的蛋白濃度。圖15顯示抗因子DMAb166-32在治療人血漿灌輸?shù)姆蛛x兔心臟的血?jiǎng)討B(tài)功能中的效果。左心室終舒張壓(LVEDP)用實(shí)心圓形(MAb166-32)及實(shí)心正方形(MAbG3-519)表示。左心室壓(LVDP)用空圓形(MAb166-32)及空方形(MAbG3-519)表示。MAbG3-519為無關(guān)的同種型匹配的對照。圖16是2個(gè)抗體群在分離的兔心臟研究中產(chǎn)生的左心室壓(LVDP)的典型代表。上圖代表用陰性對照抗體MAbG3-519處理的心臟，而下圖代表用MAb166-32處理的心臟。用MAbG3-519處理的心臟在用4%人血漿處理后，不能維持LVDP,而用MAb166-32處理的心臟在灌以4%人血漿60分鐘后仍維持近基線的LVDP。圖17顯示在用4%人血漿灌輸分離的兔心臟的過程中，在選擇的各時(shí)間點(diǎn)淋巴管流出液中的Bb濃度。MAb166-32處理的心臟樣品(空圓形)含有的Bb明顯比MAbG3-519處理的心臟(實(shí)心正方形)要低，p復(fù)05。圖18顯示血漿樣品的旁路途徑溶血活性，它們于不同時(shí)間點(diǎn)由MAb166-32(實(shí)心正方形)或MAbG3-519(實(shí)心圓形)處理的體外循環(huán)系統(tǒng)收集。圖19顯示血漿樣品的C3a濃度，它們于不同時(shí)間點(diǎn)由MAb166-32(實(shí)心正方形)或MAbG3-519(實(shí)心圓形)處理的體外循環(huán)系統(tǒng)收集。圖20顯示血漿樣品的sC5b-9濃度，它們于不同時(shí)間點(diǎn)由MAb166-32(實(shí)心正方形)或MAbG3-519(實(shí)心圓形)處理的體外循環(huán)系統(tǒng)收集。圖21顯示血漿樣品的Bb濃度，它們于不同時(shí)間點(diǎn)由MAb166-32(實(shí)心正方形)或MAbG3-519(實(shí)心圓形)處理的體外循環(huán)系統(tǒng)收集。圖22顯示血漿樣品的C4d濃度，它們于不同時(shí)間點(diǎn)由MAb166-32(實(shí)心正方形)或MAbG3-519(實(shí)心圓形)處理的體外循環(huán)系統(tǒng)收集。圖23顯示CDllb在中性粒細(xì)胞表面的表達(dá)水平，這些粒細(xì)胞于不同時(shí)間點(diǎn)由MAb166-32(實(shí)心正方形)或MAbG3-519(實(shí)心圓形)處理的體外循環(huán)系統(tǒng)收集。CDllb的表達(dá)量以由免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)器分析測得的平均熒光強(qiáng)度(MFI)而表示。圖24顯示血小+反表面的CD62P的表達(dá)水平，它們于不同時(shí)間點(diǎn)由MAb166-32(實(shí)心正方形)或MAbG3-519(實(shí)心圓形)處理的體外循環(huán)系統(tǒng)收集。CD62P的表達(dá)量以由免疫細(xì)胞計(jì)數(shù)器分析測得的平均熒光強(qiáng)度(MFI)而表圖25顯示血漿樣品中中性粒細(xì)胞特異的髓過氧化物酶(MPO)濃度，它們于不同時(shí)間點(diǎn)由MAb166-32(實(shí)心正方形)或MAbG3-519(實(shí)心圓形)處理的體外循環(huán)系統(tǒng)收集。序列表說明SEQIDNO:1為人因子D的核苷酸序列。SEOIDNO:2為人因子D的氨基酸序列。SEQIDNO:3為豬因子D的核苷酸序列。SEQIDNO:4為豬因子D的氨基酸序列。SEQIDNO:5為用以克隆MAb166-32Vk基因的引物。SEQIDNO:6為如下述用以克隆MAb166-32Vk基因的退火接頭(adaptor)，并用作引物。SEOIDNO:7為如下述用以克隆MAb166-32Vk基因的退火4妄失。SEQIDNO:8為如下述用以克隆MAb166-32Vh基因的引物。SEQIDNO:9為用以克隆MAb166-32Vh基因的引物。SEQIDNO:lO為用以克隆MAb166-32Vh基因的引物。SEQIDNO:11為用以PCR擴(kuò)增MAb166-32Fd基因的引物。SEQIDNO:12為用以PCR擴(kuò)增MAb166-32Fd基因的引物。SEQIDNO:13為用以PCR擴(kuò)增MAb166-32Fd基因的引物。SEQIDNO:14為用以PCR擴(kuò)增MAb166-32Fd基因的3'引物。SEQIDNO:15為用以加入Fd以獲^尋重組Fab的其它氨基酸序列。具體實(shí)施方式本發(fā)明的完成及其用途A.抗人因子D的單克隆抗體(MAbs)的制備在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗-因子D的MAbs可通過用純化自人血漿或尿的天然因子D免疫鼠類(例如小鼠，大鼠，倉鼠及豚鼠)或用真核或原核系統(tǒng)表達(dá)重組因子D或其片段來制備。亦可使用其它動(dòng)物進(jìn)行免疫，例如非人靈長類、表達(dá)人免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠及移植了人B淋巴細(xì)胞的嚴(yán)重結(jié)合免疫缺陷(SCID)小鼠。雜交瘤可用傳統(tǒng)方法制備，通過來自已免疫動(dòng)物的B淋巴細(xì)胞與黑瘤細(xì)胞(例如Sp2/0及NSO)的融合而獲得，如G.Kohler及C.Milstein(Nature,1975:256:495-497)所述。此外，抗因子D抗體亦可以通過在噬菌體展示系統(tǒng)中從人B淋巴細(xì)胞篩選重組單《連Fv或Fab文庫來獲得。MAbs對人因子D的專一'性可由ELISA、Western印跡、或其它免疫化學(xué)技術(shù)進(jìn)行^r測?？贵w對補(bǔ)體活化的抑制活性，對于旁路途徑可使用未致敏的兔或豚鼠紅血球細(xì)胞(RBCs)的溶血分析進(jìn)行評價(jià)，對于經(jīng)典途徑可使用未致敏的雞或羊RBCs進(jìn)行評價(jià)。陽性對照孔中的雜交瘤用限制稀釋進(jìn)行克隆純化抗體用于上面介紹的試驗(yàn)以分析對人因子D的專一性。如果用于治療人的炎癥或自身免疫，抗因子D抗體優(yōu)選以嵌合體、去免疫化、人源化或人抗體的形式使用。這樣的抗體可降低免疫性，因而避免人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)?？贵w優(yōu)選為IgG4、IgG2、或其它遺傳突變的IgG或IgM,它們不會(huì)增強(qiáng)依賴抗體的細(xì)胞毒性(S.M.Canfield及S.L.Morrison,J.Exp.Med.,1991:173:1483-1491)及補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞裂解(Y.Xu等人，J.BioLChem,,1994:269:3468-3474;V.L.Pulito等人，J.Immunol.,1996;156:2840-2850)。嵌合抗體由本領(lǐng)域熟知的重組技術(shù)制備，它含有動(dòng)物可變區(qū)及人恒定區(qū)。人源化抗體比嵌合抗體具有更高程度的人肽序列。在人源化抗體中，只有負(fù)責(zé)抗原結(jié)合及專一性的補(bǔ)體決定區(qū)域(CDRs)源自動(dòng)物并含有動(dòng)物抗體相應(yīng)的氨基酸序列，而基本上分子的所有剩余部份(除在某些例子中可變區(qū)內(nèi)框架區(qū)的小部份)源自人并相當(dāng)于人抗體的氨基酸序列。參見L.Riechmarm等人，Nature,1988;332:323-327;G,Winter,美國專利5225539;C.Queen等人,美國專利5530101。去免疫化抗體為已除去T及B細(xì)胞表位的抗體，如國際專利申請PCT/GB98/01473所述。當(dāng)其應(yīng)用于體內(nèi)時(shí)，沒有或具有降低的免疫性。人抗體可由數(shù)種方法制備，包括使用人免疫球蛋白表達(dá)文庫(StratageneCorp.>LaJolla,California)產(chǎn)生人抗體的片段(VH、VL、Fv、Fd、Fab或F(ab')2,并使用類似產(chǎn)生嵌合抗體的技術(shù)用這些片段構(gòu)建完整的人抗體。人抗體亦可在攜帶了人免疫球蛋白基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠中制備。此小鼠可/人Abgenix,Inc.,Fremont,California,及Medarex,Inc.,Annandale，NewJersey獲得。亦可構(gòu)建單肽鏈結(jié)合分子，其中重及輕鏈Fv區(qū)域相連。單鏈抗體(〃ScFv〃)及其構(gòu)建方法述于美國專利4946778。此外，F(xiàn)ab亦可以相似方法構(gòu)建及表達(dá)(M.J.Evans等人,J.I咖聽LMeth.,1995;184:123-138)。所有完整及部份的人抗體都比完整的小鼠區(qū)bs免疫性低，而且片段及單鏈抗體也具有較低的免疫性。因此所有這些類型的抗體相比較而言不會(huì)引發(fā)免疫或過敏反應(yīng)。同時(shí)，它們比完整的動(dòng)物抗體都更適于對人進(jìn)行體內(nèi)給藥，尤其在需要重復(fù)或長期給藥時(shí)。此外，抗體片段的較小的大小亦可促進(jìn)組織的生物利用，這對于急性病中的較佳劑量累積可能非常重要?；诳挂蜃覦抗體可變區(qū)的分子結(jié)構(gòu)，可使用分子模型及合理分子設(shè)計(jì)來制備和篩選能模擬抗體結(jié)合區(qū)域的分子結(jié)構(gòu)并抑制因子D活性的小分子。這些小分子可以是肽、肽模擬物、寡核苷酸或有機(jī)化合物。這種模擬用本領(lǐng)域常用的大規(guī)模篩選方法來;^組合化合物文庫中分離適當(dāng)?shù)男》肿?。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，一種具有動(dòng)物(小鼠)可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合體Fab被用于治療，因?yàn)樗韧暾庖咔虻鞍仔?，組織穿透性可能更好。B.抗因子D分子的運(yùn)用抗因子D結(jié)合分子、抗體、及本發(fā)明片段可以適當(dāng)制劑通過各種途徑給藥至病人，包括但不限于靜脈灌注、靜脈大量注射、及腹膜、皮膚、肌肉、皮下、鼻內(nèi)、支氣管、推管內(nèi)、顱內(nèi)及經(jīng)口給藥。這種給藥可使它們結(jié)合至內(nèi)源性因子D,并因而抑制C3b、C3a及C5a過敏毒素以及C5b-9的生成。這種抗體及分子的估計(jì)優(yōu)逸劑量為10及500微克/毫升血清之間。實(shí)際劑量可依臨床常用的測量最佳劑量的方法測得，即給予各種劑量并確定最有效的劑量?？挂蜃覦分子可抑制體內(nèi)補(bǔ)體活化及/或補(bǔ)體旁路途徑以及伴隨的炎癥，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板以及肥大細(xì)胞的吸引及活化、水胂及組織損傷?？墒褂眠@些抑制劑來治療因補(bǔ)體系統(tǒng)過度或不加控制地活化而介導(dǎo)的疾病或情況。它們包括但不限于(l)因心血管栓塞后缺血再灌流的組織傷害、動(dòng)脈瘤、中風(fēng)、出血休克、撞擊傷害、多處器官衰竭、血容積不足休克及腸缺血；(2)炎癥性失調(diào)如燒傷、內(nèi)毒素血癥及敗血性休克、成人呼吸困難癥、心肺分流、血液透析、過敏性休克、嚴(yán)重哞喘、血管水腫、局限性回腸炎、鐮刀性細(xì)胞貧血、后鏈球菌腎小球腎炎及胰炎；(3)移植排斥如超急性移植排斥；及(4)不良藥物反應(yīng)如藥物過敏、IL-2引發(fā)的血管滲漏癥及放射性造影介質(zhì)過敏。自身免疫異常包括但不限于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、早老性癡呆及多發(fā)性硬化，它們也可用本發(fā)明的抑制劑進(jìn)行治療。抗因子D分子亦可用于診斷以確定因子D在組織或體液樣品如血清、血漿、尿或骨髓中的存在或進(jìn)行定量。此申請書中，可使用熟知分析形式分別如免疫組織化學(xué)或ELISA。這種診斷試驗(yàn)可用于確定特定的個(gè)體是否缺乏或過度產(chǎn)生因子D。C.因子D抑制劑的治療有效性的動(dòng)物模型上面介紹的因子D抑制劑在各種疾病中的治療活性可使用能夠得到的患有各種炎癥及自身免疫的各種動(dòng)物進(jìn)行證明。下面實(shí)施例中介紹的體外試驗(yàn)足以闡明其有效性。與人的各種補(bǔ)體相關(guān)臨床疾病相當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型亦可用于證明因子D抑制劑的體內(nèi)有效性。它們包括但不限于心血管缺血再灌流損傷(H.F.Weisman等人，Science,1990;249:146-151)、心血管栓塞(J.W.Homeister等人，J.I咖unoL1993;150:1055-1064)、系統(tǒng)性紅斑狼癡及腎小球腎炎(S.K.Datta.Meth.EnzymoL，1988;162:385-442;D.J.Salvant及A.V.Cybulsky，Meth.EnzymoL，1988;162:421-461)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Y.Wang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,1995;92:8955-8959)、成人呼吸困難癥(R.Rabinovici等人，J.ImmunoL,1992;149:1744-1750)、超急性器官移植排斥(T.J.Kroshus等人，Transplantation,1995;60:1194—1202)、灼傷(M.S.Mulligan等人,J.ImmimoL,1992;148:1479-1485)、以及心肺分流(C.S.Rinder等人，丄Clin.Invest,1995;96:1564-1572)。下面介紹如何完成和使用本發(fā)明，以及證實(shí)其用途。實(shí)施例1:抗因子DMAbs的制備將8-12周齡的雄AIJ小鼠(Harlan,Houston,TX)皮下注射以25微克純化自人血清(AdvancedResearchTechnologies,SanDiego,CA)的因子D,該因子D溶于Freund氏完全佐劑(DifcoLaboratories,Detroit,Michigan)并溶于200微升磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)pH7.4中。此因子D制備物用+二硫烷基苯磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測為純度按2周的間隔對小鼠皮下注射以Freund氏不完全佐劑中的25微克人因子D兩次。然后在2周后和殺死前3天，對小鼠再由腹膜注射以PBS中的25微克相同抗原。在每次融合中，從每只免疫小鼠的脾臟制備單細(xì)胞懸液，并用來與Sp2/0黑瘤細(xì)胞融合。在含50。/。聚乙二醇(M.W.1450)(Kodak,Rochester,NY)及5%二甲基亞砜(SigmaChemicalCo.,St.Louis,M0)的培養(yǎng)液中將5x1(/的Sp2/0及5xl(f脾細(xì)胞融合。然后在補(bǔ)充了10%小牛血清、100單位/毫升青霉素、100微克/毫升鏈霉素、0.l毫摩爾次黃嘌呤、0.4微摩爾氨基喋呤以及16微摩爾胸腺嗜啶的lscove培養(yǎng)液中(Gibco，GrandIsland,NY)將細(xì)胞調(diào)至1.5x105脾細(xì)胞/200微升懸浮液的濃度。將200毫升細(xì)胞懸浮液加至約20個(gè)96孔微培養(yǎng)平板的孔中。約IO天后取出培養(yǎng)上清液，用于在ELISA中篩選能與純化的因子D反應(yīng)者。將Imimilon2(DynatechLaboratories,Chantilly,VA)微測試平板的孔通過加入50微升純化的人因子(50微毫克/毫升)在室溫下過夜進(jìn)行包被。低濃度的包被用因子D可篩選具高親合性的抗體。拍打平板除去包被溶液后，加入200微升PBS中的BLOTTO(脫脂奶粉)至各孔中1小時(shí)以封閉非專一性位點(diǎn)。l小時(shí)后，用緩沖液PBST(含O.05%Tween20的PBS)清洗孔，從各融合孔收集50微升的培養(yǎng)上清液，與50微升BLOTTO混合，再加至微測試平板各孔中。溫育1小時(shí)后，用PBST清洗孔。然后通過與用BL0TT0按1:2000稀釋的辣根過氧化物酶(服P)偶連的羊抗小鼠IgG(Fc專-~^性)(JacksonImmunoresearchLaboratories,WestGrove,PA)反應(yīng)來檢測結(jié)合的鼠抗體。將含O.1%的3，3,5，5四甲基聯(lián)苯胺(Sigma,St.Louis，M0)和0.0003%過氧化氫(sigma)的過氧化物酶底物溶液加至各孔中顯色30分鐘。加入50微升的2MH2S04至各孔中以中止反應(yīng)。使用BioTekELISA計(jì)數(shù)器(BioTekInstruments,Winooski，VM)在450nm處讀取反應(yīng)、液0D。然后將陽性對照孔的培養(yǎng)上清液用2個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行檢測i)按下面介紹的方法，檢測其在預(yù)測定濃度的人血清對未致敏的兔RBC的旁路途徑溶血中的抑制作用；及ii)按下面的方法，檢測其在用人血清處理的酵母聚糖誘導(dǎo)的C3a生成中的抑制作用。將陽性孔中的細(xì)胞通過限制稀釋進(jìn)行克隆。再次檢測MAbs在ELISA中與因子D的反應(yīng)性。將所選雜交瘤在轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清液，用蛋白A親合性柱層析純化抗體。用ELISA試驗(yàn)得到4個(gè)對人因子D具強(qiáng)烈反應(yīng)的MAbs。這些MAbs分別被命名為166-11、166-32、166-188、及166-222(圖1)。其中，MAb166-32(IgGl)按下面的介紹可強(qiáng)烈抑制未致敏的兔RBCs旁路途徑溶血。實(shí)施例2:用表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振方法測定抗因子DMAbs的動(dòng)力常數(shù)MAbs166-11、166-32、166-188、及166-22結(jié)合至人因子D的動(dòng)力常數(shù)可用基于表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振的測量方法，使用BIAcore儀器(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,Sweden)觀U尋。所有結(jié)合測量方法都在HEPES-緩沖鹽水(HBS)(10毫摩爾HEPES、pH7.4、150毫摩爾NaCl、3.4毫摩爾EDTA，0.005%表面活化劑P20)中在25。C進(jìn)行。為測量因子D結(jié)合至MAbs的結(jié)合率常數(shù)，將兔抗小鼠IgG(H+L)固定至CM5偵測板(sensorchip)，固定使用N-鞋基琥珀酰亞胺及N-乙基-N'-(3-二乙胺丙基)碳二亞胺通過胺偶聯(lián)來進(jìn)行。然后將每種區(qū)b先捕捉至已包被的偵測板，再注射以不同濃度的因子D。為測量締合率常數(shù)(Kass。丄按廠商指示的濃度制備因子D的5個(gè)稀釋濃度(2.5納摩爾，5納摩爾，10納摩爾，15納摩爾及20納摩爾)，以5微升/分的速率注射至孔中。為測量解離率常數(shù)(kdi,，)，以5微升/分的速率注射100納摩爾因子D至孔中。感測圖形式的數(shù)據(jù)可使用BIAcore系統(tǒng)中數(shù)據(jù)嵌合程序分析。因?yàn)镸Ab166-32有極快的Kas,由于大量輸入效應(yīng)的限制，它已超出該試驗(yàn)程序的置信度限制，因此可使用另一結(jié)合程序來測量其動(dòng)力速率常數(shù)。將因子D按上面的介紹通過胺偶聯(lián)固定至偵測板，同時(shí)將不同稀釋濃度的MAb166-32(5納摩爾，10納摩爾，15納摩爾，20納摩爾及25納摩爾用于測量Kass。e及200納摩爾用于測量ICh，。)以5微升/分的速率流至偵測板。感測圖形式的數(shù)據(jù)可按上面的介紹進(jìn)行分析。BIAcore上因子D結(jié)合至MAbs的動(dòng)力常數(shù)列于如下表1。MAbs166-32及166-222對因子D具極高親合性，其平衡解離常數(shù)(K。)小于0.1納摩爾。表lBIAcore上因子D結(jié)合至MAbs的動(dòng)力常數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>a在測定過程中，使用因子D為分析物，將其流至包被了抗因子DMAb的偵測板，抗因子DMAb用兔抗小鼠IgG俘獲。'M吏用MAb166-32為分析物，因子D通過胺偶聯(lián)方法交聯(lián)至偵測板。%),平衡解離常數(shù)，kdi瓶/ka纖實(shí)施例3:補(bǔ)體活化的溶血作用的抑制為研究抗因子DMAbs在體外抑制補(bǔ)體活化的功能活性，使用了2個(gè)溶血試驗(yàn)。對于旁路途徑，將未致敏的兔RBCs用明膠/巴比妥鈉緩沖鹽水(GVB/Mg-EGTA)清洗3次，該緩沖鹽水中含2毫摩爾MgCL及1.6毫摩爾EGTA。10毫摩爾的EGTA被用來抑制經(jīng)典途徑(K.Whaley等人，于A.W.Dodds(Ed.),Complement.APracticalApproach.OxfordUniversityPress,Oxford,1997,pp.19-47)。將清洗細(xì)胞按1.7x108細(xì)胞/毫升再懸浮于相同緩沖液。在圓底96孔微測試平板的各孔中，將50微升正常人血清(20%)與50微升GVB/Mg-EGTA或系列稀釋的試驗(yàn)MAb混合，然后將30微升已清洗的兔RBCs懸浮液加至含有混合物的孔中。將50毫升正常人血清(20%)與80微升GVB/Mg_EGTA混合，以得到血清顯色背景。陰性對照可使用同種型匹配的抗HIV-1gpl20MAb-—G3-519。最終混合物在37°C溫育30分鐘。然后將平板在微測試平板搖晃器上搖晃15秒。然后將平板以300xg離心3分鐘。收集上清液(80微升)，移至平底96孔微測試平板的孔中以測量405nm處的0D。溶血的抑制百分比定義為100x[(無MAb的0D-血清顯色背景0D)-(有MAb的0D-血清顯色背景0D)]/(無MAb的0D-血清顯色背景0D)。圖2顯示了如下數(shù)據(jù)，MAb166-32以依賴劑量方式，強(qiáng)烈抑制未致敏的兔RBCs在存在10%人血清時(shí)的旁路途徑溶血，而無關(guān)的同種型匹配對照(MAbG3-519)無此抑制作用。MAbG3-519對HIV包膜糖蛋白gpl20有專一性。在檢測MAb166-32在90%人血清中的抑制活性的試驗(yàn)中，將冷凍人血清融化，以終濃度為50毫摩爾的EGTA預(yù)處理。將10毫升系列稀釋的MAb166-32或G3-519加至90微升用EGTA處理的人血清，并在96孔微測試平板中進(jìn)行兩個(gè)重復(fù)的孔，在室溫下放置15分鐘。將30毫升已清洗的兔RBCs加至各孔。將平板在37°C溫育30分鐘。然后將平板在平板搖晃器上搖晃15秒，在300xg下離心3分鐘。收集上清液(80微升)，移至平底96孔微測試平板以測量405nm處的0D。各平板均有2個(gè)含100微升的90%人血清及30微升緩沖液作為血清顯色背景的孔，以及2個(gè)含有用100微升90。/。人血清在不存在單克隆抗體時(shí)裂解RBCs以代表完全裂解的孔。圖3顯示了如下數(shù)據(jù)，MAb166-32可以依賴劑量方式強(qiáng)烈抑制未致敏的兔RBCs在存在90%人血清時(shí)的旁路途徑溶血。對于經(jīng)典途徑，將含有0.5毫摩爾MgCl2及0.15毫摩爾CaCl2的明膠/巴比妥鈉緩沖鹽水&￥8++)中的雞RBCs(5x107細(xì)胞/毫升)用8微克/毫升的純化兔抗雞RBC免疫球蛋白(Inter-CellTechnologies,Hopewell,NJ)在4'C下致敏15分鐘。然后用GVB+十清洗細(xì)胞。所用人血清的終濃度為2%。圖4顯示了以下數(shù)據(jù)，MAb166-32及無關(guān)同種型匹配的對照(G3-519)不會(huì)抑制致敏雞RBCs的經(jīng)典途徑溶血，但陽性對照抗人C5MAb137-76會(huì)抑制。圖2、3及4的數(shù)據(jù)指出，MAb166-32可專一地抑制補(bǔ)體活化的旁路途徑。實(shí)施例4:MAb166-32對因子D的專一性按下面的介紹，使用2個(gè)溶血試驗(yàn)來證明MAb166-32對人因子D的專一性。(1)使用未致敏兔RBCs的因子D依賴的溶血試驗(yàn)抑制首先將人血清樣品去除因子D,這通過將其通過填充了偶聯(lián)有抗因子DMAb166-222的3MEmphazeBios卿ortMedium(Pierce,Rockford，IU的親合性柱來完成。流經(jīng)的血清經(jīng)檢測因完全去除因子D而無法活化旁路途徑溶血。此試驗(yàn)的過程類似上面實(shí)施例3中介紹的方法，除了將各濃度的純化因子D加至除去了因子D的血清以重組其溶血活性。在此情況下，兔RBCs的溶血依賴于因子D。重組溶血活性顯示對補(bǔ)充的因子D濃度呈線性比例(由O.01微克/毫升至2微克/毫升)(圖5)。圖5數(shù)據(jù)亦顯示，0.3微克/毫升的MAb166-32可在存在0.1微克/毫升補(bǔ)充的因子D情況下完全抑制未致敏兔RBCs的溶血，而陰4生對照MAbG3-519對依賴因子D的溶血無影響。這些數(shù)據(jù)說明，在摩爾比率為1:2時(shí)(MAbl66-32對因子D),MAb166-32可有效抑制人因子D的生物活性。因此MAb166-32對因子D來說是強(qiáng)效的高親合性抗體。這種抗體具有用于臨床治療由補(bǔ)體旁路途徑引起的疾病或情況的潛力。(2)EAC3b細(xì)胞上旁路C3轉(zhuǎn)化酶形成的抑制EAC3b細(xì)胞為包被了人C3b(購自NationalJewishCenterofImmimologyandRespiratoryMedicine,Denver,C0)的綿羊RBCs。在本試驗(yàn)中，通過加入因子B、因子P(備解素)及因子D,旁路C3轉(zhuǎn)換酶裝配于EAC3b細(xì)胞表面。然后EAC3b細(xì)胞(5x108)用DGVB"液(50。/。巴比妥鈉緩沖鹽水、pH7.2,包含O.075毫摩爾CaCh、0.25毫摩爾MgCL、0.1%明膠、2.5%(w/v)葡聚糖，及0.01%疊氮鈉)清洗3次。將清洗后的細(xì)胞懸浮于1.5亳升的DGVB++、因子P(30微克)及因子B(20微克)中。因子P及因子B濃度預(yù)先測定為過量。將50毫升細(xì)胞懸浮液加至圓底96孔微測試平板各孔中。然后將50微升因子D(1.2微毫克/毫升)與系列稀釋的MAb166-32或MAbG3-519的混合物加至含細(xì)胞的孔中，在3CTC溫育15分鐘。因子D的濃度(1.2微毫克/毫升)在此情況下預(yù)測能夠產(chǎn)生高于90%的溶血。溫育后，將細(xì)胞在GVB-EDTA培養(yǎng)液(含10毫摩爾EDTA的明膠/巴比妥鈉緩沖鹽水)中清洗2次。然后將細(xì)胞懸浮于30微升的GVB-EDTA培養(yǎng)液。為起始溶血，將100微升豚鼠血清(Sigma)(1:10稀釋于GVB-EDTA)加至各孔中。然后將混合物在37。C溫育30分鐘。然后將微測試平板于300xg離心3分鐘。收集上清液，測量405nm處的OD。圖6顯示了MAb166-32抑制EAC3b細(xì)胞裂解的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而無關(guān)的MAbG3-519不產(chǎn)生抑制。MAb166-32抑制因子D對因子B的切割，因而避免C3轉(zhuǎn)換酶在EAC3b細(xì)胞表面的形成。實(shí)施例5:MAb166-32對通過補(bǔ)體活化的酵母聚糖生成C3a的抑制為進(jìn)一步確定MAb166-32對因子D的功能專一性，檢測了MAb對酵母聚糖(活化的酵母顆粒)上的補(bǔ)體旁路活化作用的影響。將酵母聚糖A(來自啤酒酵母，Sigma)(1毫克/毫升)在GVB/Mg-EGTA中清洗3次，然后按1毫克/毫升懸浮于相同培養(yǎng)液。將25微升不同濃度的MAb166-32或G3-519與25微升人血清(l:5稀釋于GVB/Mg-EGTA)在微試管中混合，在室溫下溫育15分鐘。對照組不含抗體，但含培養(yǎng)液及血清。溫育后，將50微升清洗的酵母聚糖懸浮液加至各管中，在37°C溫育30分鐘。將微管于2000xg離心5分鐘，收集上清液，與等量的樣品穩(wěn)定液(Quidel,SanDiego,CA)混合。將樣品冷凍于-25。C直至分析。樣品中C3a及sC5b-9的濃度可用定量型ELISA試劑盒(Quidel)依廠商說明書進(jìn)行測定。圖7顯示，MAb166-32可抑制C3a自補(bǔ)體活化酵母聚糖的產(chǎn)生，而無關(guān)的MAbG3-519則無此效果。這些數(shù)據(jù)表明，MAb166-32可抑制因子D的C3轉(zhuǎn)換酶生成。MAb166-32對因子D的完全抑制可有效的阻礙C3轉(zhuǎn)換酶的產(chǎn)生，這可通過其不能產(chǎn)生C3a來顯示。這將導(dǎo)致補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)隨后步驟中的C5轉(zhuǎn)換酶的抑制，這可由sC5b-9(MAC)形成的抑制證明(圖8)。實(shí)施例6:MAb166-32的Fab對補(bǔ)體活化的溶血的抑制為檢測MAb166-32單價(jià)形式可否如親本雙價(jià)體MAb166-32—樣有效抑制補(bǔ)體旁路途徑，MAb166-32的Fab使用商品化的試劑盒(Pierce)通過木瓜蛋白酶消化進(jìn)行制備。然后按上面的介紹使用未致敏的兔RBCs來檢測Fab對旁路途徑溶血的抑制活性。圖9顯示了實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，全I(xiàn)gG及Fab都顯示相似的阻斷旁路補(bǔ)體活化的能力?？紤]到每一抗體分子上有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，這些結(jié)果表明，MAb166-32的單價(jià)形式具有活性，它保留了與其親本雙價(jià)抗體相似的拮抗因子D的能力。此性質(zhì)對于考慮使用Fab或單鏈Fv作為替代產(chǎn)品來說非常重要。使用后一單價(jià)形式的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，因?yàn)槠湫误w小而可能具有更好的組織滲透性。鑒于MAb166-32的Fab有活性，該MAb在因子D上識別的結(jié)合表位可能是其重要功能部份實(shí)施例7:MAb166-32對不同種類動(dòng)物血清的旁路途徑溶血的影響為研究MAb166-32與來自不同種類動(dòng)物的因子D的交叉反應(yīng)，使用不同種類動(dòng)物的血清進(jìn)行旁路途徑溶血分析。首先使用不同種類動(dòng)物的新鮮血清(人、恒河猴、黑猩猩、狒狒、cynomolgus猴、羊、狗、小鼠、田鼠、大鼠、兔、豚鼠及豬)檢測其CH50值，CH50值定義為能使未致敏的兔RBCs達(dá)到50%溶血的血清稀釋倍數(shù)。然后檢測并比較MAb166-32對每種血清的相同溶血活性(CH50)的抑制活性。圖10顯示MAb166-32對人、恒河猴、cynomolgus猴、狒狒及黑猩猩的血清具有強(qiáng)烈抑制活性，并對羊及狗的血清具有中度抑制活性。該抗體不能抑制小鼠、田鼠、大鼠、兔、豚鼠及豬的血清。這些數(shù)據(jù)表明，MAb166-32可結(jié)合人、恒河猴、黑猩猩、狒狒、cynomolgus猴、羊及狗的因子D的一個(gè)共有表位。實(shí)施例8:構(gòu)建人因子D突變體對MAb166-32進(jìn)行表位作圖為描繪MAb166-32所識別的人因子D的結(jié)合表位，首先檢測抗體與人因子D在Western印跡上的反應(yīng)性。MAb166-32不與固定在硝纖維素膜上的SDS變性的人因子D(還原或不還原)反應(yīng)。這個(gè)結(jié)果表明MAb166-32結(jié)合天然的而不是變性的因子D。因?yàn)镸Ab166-32如實(shí)施例7所示不抑制小鼠及豬因子D的溶血活性，因此MAb166-32極可能結(jié)合于人因子D中與小鼠及豬因子D具有高氨基酸序列差異的位點(diǎn)。根據(jù)這一點(diǎn)，按照下面的介紹，通過用豬的因子D的相應(yīng)氨基酸殘基取代人因子D中的氨基酸殘基制備各種因子D突變體及雜合體，用來進(jìn)行MAb166-32結(jié)合表^f主作圖。(l)構(gòu)建因子D突變體及雜合體人因子D基因片段通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)使用人脂細(xì)胞cDNA(Clontech,SanFrancisco,CA)為模板和適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋铽@得。擴(kuò)增的DNA片段用BamHI及EcoRI限制性切割，并將切割產(chǎn)物插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393(Ph翻ingen，SanDiego,CA)的BamHI及EcoRI位點(diǎn)，得到野生型pVL1393-因子D/Hu。人因子D命名為因子D/Hu。成熟的人因子D蛋白的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列示于SEQIDNOS:1及2(R.T.White等人,J.Biol.Chem.，1992;267:9210-9213;GenBank讀取號碼M84526)豬因子D的cDNA克隆pMon24909由內(nèi)布拉斯加大學(xué)J.L.Miner贈(zèng)送(GenBank讀取號碼U29948)。將pMon24909的BamHI-EcoRI片l殳克隆至PVL1393,得到pVL1393-因子D/pig。豬因子D命名為因子D/pig。成熟的豬因子D蛋白的核香酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列示于SEQIDNOS:3及4。三個(gè)人因子D的突變體使用適當(dāng)引物和重疊PCR進(jìn)行構(gòu)建。氨基酸突變被設(shè)計(jì)為用豬序列中的相應(yīng)氨基酸殘基取代人序列中的氨基酸基殘基，這種相應(yīng)是指人和豬的因子D的氨基酸序列對應(yīng)排列進(jìn)行同源比較時(shí)。第一個(gè)突變體為因子D/VDA，它具有三個(gè)氨基酸突變V113E、D116E及A118P。(這是命名突變的一種簡寫方法，例如其中V113E指人因子D第113位氨基酸基的纈氨酸變?yōu)樨i因子D的谷氨酸)。第二個(gè)突變體為因子D/RH,它具有兩個(gè)氨基酸突變R156L及H159Y。第三個(gè)突變體為因子D/L,它具有單——個(gè)氨基酸突變L168M。編石馬這些突變體的DNA序列用DNA測序進(jìn)行確認(rèn)。用適當(dāng)?shù)拿盖懈詈?，將DNA片段嵌入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393的BamHI及EcoRI位點(diǎn)，分別得到pVL1393-因子D/VDA、pVL1393-因子D/RH及PVL1393-因子D/L。兩個(gè)嵌合的人-豬因子D雜合體也由適當(dāng)引物以重疊PCR構(gòu)建得。第一個(gè)雜合體為因子D/Hupig,它含有位于于N-端的52個(gè)來源于人因子D的氨基酸，其余氨基酸來源于豬因子D。另一個(gè)雜合體為因子D/Pighu,它含有位于N-端的52個(gè)來源于豬因子D的氨基酸，其余氨基酸來源于人因子D。將BamHI及EcoRI消化的DNA片段嵌入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393的BamHI及EcoRI位點(diǎn)，得到PVL1393-因子D/H叩ig及PVL1393-因子D/Pighu。(2)因子D突變體及雜合體的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、重組桿狀病毒制備以及重組因子D蛋白在昆蟲細(xì)胞Sf9中制備的步驟都依廠商說明書施行(桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，Pharmingen)。(3)因子D突變體及雜合體的純化來自感染的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)上清的因子D突變體和雜合體蛋白，使用純化的羊抗人因子D多克隆抗體(TheBindingSiteLimited,SanDiego,CA)以親合性柱層析進(jìn)行純化。將3毫升羊抗人因子D抗體(13.2毫克/毫升)在偶聯(lián)緩沖液(O.1M硼酸鹽及0.75MNa2S04，pH9.0)中平衡，并與4毫升UltralinkBios叩portMedium(Pierce)在室溫下偶聯(lián)2小時(shí)。膠粒先用50毫摩爾二乙胺(pH11.5)清洗用以將所有殘余的未反應(yīng)部位飽和，再以含10毫摩爾Tris、0.15MNaCl、5毫摩爾EDTA、1%TritonX-100及0.02%NaN"pH8.O)的緩沖液清洗。將膠粒在緩沖液中于4'C下保存。將收集自100毫升旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的各桿狀病毒突變抹感染的Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，通過羊抗因子D親合性柱，其中羊抗因子D親合性柱事先已用PBS預(yù)平衡以去除保存緩沖液。結(jié)合的因子D蛋白用50毫摩爾二乙胺，pH11.5洗脫。收集的級份立即用1MH印es緩沖液中和至pH7.0。殘留的鹽使用Millipore膜超濾(M.W.cut-off:3，000)(MilliporeCorp.,Bedford,MA)用PBS進(jìn)行緩沖液置換來去除。蛋白濃度由BCA法(Pierce)測定。(4)因子D的ELISAMAb166-32與不同因子D突變體及雜合體的反應(yīng)活性可用EL工SA試驗(yàn)進(jìn)行檢測。將96孔微測試平板的不同孔用蛋白(因子D/Hu、因子D/pig、因子D/Hupig、因子D/Pighu、因子D/VDH、因子D/RH、及因于D/L)包被，包被通過加入100微升的PBS溶液中的各種蛋白(0.5纟數(shù)克/毫升)來完成。室溫溫育過夜后，將孔用PBSTB(PBST含2。/。BSA)處理，以飽和殘留的結(jié)合位點(diǎn)。將孔用PBST清洗。將100毫升系列稀釋的MAb166-32(1微克/毫升~0.5微毫克/毫升)加至孔中，置于室溫l小時(shí)。然后將孔用PBST清洗。結(jié)合抗體通過與稀釋的HRP-羊抗小鼠IgG(Fc)(JacksonImmunoresearch)在室溫溫育1小時(shí)進(jìn)行檢測。然后按上面的介紹將過氧化物酶受體溶液加入進(jìn)行顯色反應(yīng)。z使用ELISA讀取儀測定450nm處的0D。圖11顯示，MAb166-32與因子D/Hu、因子D/Pighu及因子D/VM反應(yīng)，但不與因子D/pig、因子D/H卯ig、因子D/RH及因子D/L反應(yīng)。ELISA結(jié)果顯示，人因子D的氨基酸殘基Argl56、His159及Leul68為MAb166-32結(jié)合所必需。這與MAb166-32在人因子D的C-端為豬的相應(yīng)部位取代時(shí)不與因子D/Hupig結(jié)合的事實(shí)相一致。氨基酸殘基Argl56、Hisl59及Leul68位于所謂〃甲硫氨酸環(huán)〃，該環(huán)由Cysl54及Cysl70之間的二硫鍵以及位于169位的甲硫氨酸組成(J.E.Volanakis等人，于TheHumanComplementSysteminHealthandDisease,J.E.Volanakis及M.M.Franks,eds.,MarcelDekker，1998，pp.49-81)。就結(jié)構(gòu)言，〃甲硫氨酸環(huán)〃為一種緊密的1型P轉(zhuǎn)角。根據(jù)X光晶體衍射圖i普研究的數(shù)據(jù)，人們發(fā)現(xiàn)它暴露于因子D分子表面(S.V.L.Narayana等人，J.Mol.Biol.,1994，235:695-708)。但〃甲硫氨酸環(huán)〃對受體專一性及因子D催化活性的貢獻(xiàn)則尚未有研究(J.E.Volanakis等人，ProteinSci.，1996:5:553-564)。此數(shù)據(jù)首次證明，〃甲硫氨酸環(huán)〃在因子D功能活性中扮演重要角色。MAb166-32及其Fab在結(jié)合至因子D的該區(qū)域時(shí)，可有效地抑制因子D的催化活性。實(shí)施例9:抗因子DMAb166-32可變區(qū)基因的克隆以及嵌合體166-32IgG及其Fab的構(gòu)建及表達(dá)為減低在人體中使用時(shí)MAb166-32的免疫原性，通過用人IgGl的恒定區(qū)取代小鼠恒定區(qū)制備了MAb166-32的嵌合體?？贵w的兩種Fab嵌合體形式也用人的相應(yīng)區(qū)域取代小鼠恒定區(qū)進(jìn)行制備。MAb166-32可變區(qū)基因的克隆以及嵌合型166-32抗體及其Fab的構(gòu)建及表達(dá)詳述于后。(l)抗因子D的MAb可變區(qū)基因的克隆從分泌抗因子D的MAb166-32的雜交瘤細(xì)胞分離總RNA，使用RNAzol按廠商說明書進(jìn)行分離(Biotech,Houston,TX)。cDNA的第一鏈以寡聚dT為引物從總RNA合成。PCR使用免疫球蛋白恒定(C)區(qū)衍生的3'引物以及衍生自前導(dǎo)肽或鼠Vh或Vic基因第一架構(gòu)區(qū)域的簡并(degenerated)引物組作為5'引物來進(jìn)行。雖然擴(kuò)增的DNA標(biāo)明為Vn,但對VK來說，沒有擴(kuò)增預(yù)期長度的DNA片段。Vn及VK基因都通過錨定PCR進(jìn)行克隆。嵌合錨定PCR可按Chen及Platsucas(Scand.J.Immunol.,1992;35:539-549)的介紹進(jìn)行。在克隆Vic基因時(shí)，將雙鏈cDNA使用NotI-MAKI引物(5，-TGCGGCCGCTGTAGGTGCTGTCTTT-3，SEQIDNO:5)進(jìn)行制備。將退火接頭AD1(5，-GGAATTCACTCGTTATTCTCGGA-3，SEQIDNO:6)及AD2(5，-TCCGAGAATAACGAGTG-3'SEQIDNO:7)連接至雙鏈cDNA的5'及3，端。3，端的接頭用NotI消化除去，消化產(chǎn)物作為模板用于PCR中，以AD1寡核苷酸為5'引物，以MAK2(5，-CATTGAAAGCTTTGGGGTAGAAGTTGTTC-3，SEQIDN0:8)為3'引物。將約500bp的DNA片段克隆至pUC19。挑選12個(gè)克隆用于進(jìn)一步分析。有7個(gè)克隆被發(fā)現(xiàn)含有對Sp2/0V信號有專一性的CDR3序列，并且很可能來自166-32雜交瘤細(xì)胞系融合部份的畸形k輕鏈信號。NotI-MAKI及MAK2寡核苷酸衍生自鼠Ck區(qū)域，并分別在Ck基因第一個(gè)bp下游的182及84bp。用DNA測序?qū)?個(gè)克隆進(jìn)行分析，得到的序列包括鼠Ck的一部分、全部vk以及前導(dǎo)肽。為克隆V基因，使用NotI-MAGI引物(5'-CGCGGCCGCAGCTGCTCAGAGTGTAGA-3'SEQIDNO:9)制備雙鏈cDNA。將退火接頭AD1及AD2連接至雙鏈cDNA的5'及3'端。接頭的3'端用NotI消化除去。將消化產(chǎn)物在PCR中用作模板，以AD1寡核苷酸及MAG2(5'-CGGTAAGCTTCACTGGCTCAGGGAAATA-31SEQIDN0:10)為引物。將長度為500~600bp的DNA片段克隆至pUC19。Notl-MAGl及MAG2寡核苷酸源自鼠Cy1區(qū)域，并且分別在Cyl基因第一個(gè)bp下游的180及93bp。用DNA測序?qū)?個(gè)克隆進(jìn)行分析，得到的序列包含鼠的Cy1的一部分、全部的VH以及前導(dǎo)肽。(2)構(gòu)建嵌合型166-32IgG及Fab的表達(dá)載體在PCR中使用Vh及VK基因?yàn)槟０?，以?，端加入Kozak序列和在3'端加入剪接供體。在分析序列確定無PCR錯(cuò)誤后，將Vh及Vk基因插入分別含有人Cy1及Cic的表達(dá)載體盒(cassette),得到pSV2neoVH-huCY1及pSV2neoV-huCK。將CsC梯度-純化的重鏈及輕鏈栽體的質(zhì)粒DNAs用電穿孔法感染COS細(xì)胞'48小時(shí)后，ELISA檢測培養(yǎng)上清液中含有約200微毫克/毫升的嵌合體IgG。收集細(xì)胞，制備總RNA。使用寡聚dT為引物從總RNA合成第一鏈cDNA。在PCR中將此cDNA用作模板，制備Fd及kDNA片段。對于Fd基因，使用(5，-AAGAAGCTTGCCGCCACCATGGATTGGCTGTGGAACT-3'SEQIDNO:11)為5'端引物及源自CH1的3，端引物(5，-CGGGATCCTCAAACTTTCTTGTCCACCTTGG-3，SEQIDNO:12)進(jìn)行PCR。DNA序列被證明含有完整的Vn及人IgGl的CHl結(jié)構(gòu)域。用適當(dāng)酶消化后，將FdDNA片段嵌入表達(dá)載體盒pSV2dhfr-TUS的HindIII及BamHl限制酶切位點(diǎn)，得到pSV2dhfrFd(圖12A)。對于k基因，PCR使用(5-AAGAAAGCTTGCCGCCACCATGTTCTCACTAGCTCT-3'SEQIDNO:13)為5'端引物及源自Ck的3'端引物(5'-CGGGATCCTTCTCCCTCTAACACTCT-3，SEQIDNO:14)來進(jìn)行。DNA序列被證明含有完整的Vk及人Ck區(qū)域.。用適當(dāng)?shù)南拗泼赶?，將kDNA片段嵌入表達(dá)載體盒pSV2腦-TUS的HindIII及BamHI限制酶切位點(diǎn)，得到pSV2neoK(圖126)。Fd及k基因的表達(dá)可由源自HCMV的增強(qiáng)子及啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。因Fd基因不含參與鏈間二硫鍵的色氨酸殘基，此重組嵌合體Fab含有非共價(jià)連接的重鏈及輕鍵。此嵌合體Fab名為cFab。為獲得帶有重鏈及輕鍵間二硫鍵的重組Fab，擴(kuò)展上述Fd基因，使其包含編碼另外9個(gè)來源于人IgGl鉸鏈區(qū)域的氨基酸的序列(EPKSCDKTHSEQIDNO:15)。將Fd基因3'端編碼30個(gè)氨基酸的BstEII-BamHIDNA片段用編碼擴(kuò)展Fd的DNA片段進(jìn)行取代。含有額外9個(gè)來源于人IgGl鉸鏈區(qū)氨基酸的擴(kuò)展Fd用DNA測序進(jìn)行證實(shí)。將此Fd/9aa基因插入表達(dá)載體盒pSV2dhfr-TUS，得到pSV2dhfrFd/9aa。此嵌合體Fab命名為cFab/9aa。(3)嵌合體166-32IgG及Fab的表達(dá)為獲得分泌嵌合體166-32IgG的細(xì)胞系，將NSO細(xì)胞用pSV2neoV,廠huCY1及pSV2neoV-huCK的純化質(zhì)粒DNAs通過電穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在存在0.7毫克/毫升G418下篩逸轉(zhuǎn)感染細(xì)胞。使用含血清培養(yǎng)液將細(xì)胞培養(yǎng)于250-毫升旋轉(zhuǎn)瓶。為獲得分泌嵌合體166-32Fab的細(xì)胞系，將CH0細(xì)胞用pSV2dhfrFd(或pSV2dhfrFd/9aa)及pSV2neoK的純化質(zhì)粒DNAs通過電穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在存在G418及氨甲喋呤下篩選轉(zhuǎn)感染細(xì)胞。將所篩選細(xì)胞系在增加氨甲喋呤的條件下進(jìn)行擴(kuò)增。通過限制稀釋對細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞亞克隆。然后使用含血清培養(yǎng)液將高產(chǎn)的單細(xì)胞亞克隆細(xì)胞系培養(yǎng)于100-毫升旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)液。(4)嵌合體166-32IgG的純化將100毫升旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)上清液上樣至10毫升PR0SEP-A柱(Bioprocessing,Inc.,Princeton,NJ)。將柱用10倍床體積的PBS清洗。結(jié)合的抗體用50毫摩爾檸檬酸鹽緩沖液、pH3.0進(jìn)行洗脫。將等量的1MH印es、pH8.0加至含純化抗體的級份以將pH調(diào)至7.0。殘留的鹽通過用PBS進(jìn)行緩沖液置換并使用Millipore膜超濾(M.W.cut-off:3000)來去除。純化抗體的蛋白濃度用BCA法(Pierce)測定。(5)嵌合體166-32Fab的純化嵌合體166-32Fab可通過親合性層析使用小鼠抗MAb166-32的抗獨(dú)特型MAb進(jìn)行純化。此抗獨(dú)特型MAb被命名為MAb172-25-3。它通過用與匙孔藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)的MAb166-32免疫小鼠，并篩選能與因子D竟?fàn)幮越Y(jié)合MAb166-32的特異性抗體來制備。親合性層析基質(zhì)的制備按如下方法進(jìn)行將25毫克MAb172-25-3與5毫升干燥的aziactone膠粒(UltraLinkBiosupportMedium,Pierce)在緩沖液(O.1M硼酸鹽及O.75MNa2S04、pH9.0)中及室溫下混合2小時(shí)。然后將殘余的未反應(yīng)位點(diǎn)用1M乙醇胺(pH9.O)在室溫下封閉2.5小時(shí)。然后將膠粒在含10毫摩爾Tris、0.15MNaCl、5毫摩爾EDTA、1%TritonX-100及0.02%NaN3、pH8.0)的緩沖液中清洗,并在4'C下保存。為進(jìn)行純化，將產(chǎn)cFab或cFab/9aaCH0細(xì)胞的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)物的100毫升上清液上樣至偶聯(lián)了MAb172-25-3的親合柱。將柱用PBS徹底清洗，然后用50毫摩爾二乙胺、pH11.5洗脫結(jié)合的Fab。殘留的鹽按上面的介紹通過緩沖液置換去除。純化Fab的蛋白質(zhì)濃度用BCA法(Pierce)測定。(6)SDS-PAGE嵌合體166-32IgG、cFab及cFab/9aa的SDS-PAGE純化的嵌合體166-32IgG、cFab及cFab/9aa用SDS-PAGE分析其純度及分子量。將蛋白質(zhì)用含或不含巰基乙醇的樣品緩沖液處理。然后將樣品與預(yù)先染色的分子量標(biāo)準(zhǔn)(低分子量范圍)(BIO-RADLaboratories,Hercules,CA)—起于子頁注膠(12.5%)(AmershamPharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)中電泳，電泳使用PhastSystem(AmershamPharmaciaBiotech)。然后將膠在考馬斯亮藍(lán)液(BI0-RAD)中染色5分鐘，再在含40%甲醇及10%乙酸的水溶液中脫色。CFab、cFab/9aa及嵌合體IgG在非還原及還原條件下的SDS-PAGE結(jié)果顯示，嵌合體IgG具有150kD的蛋白質(zhì)條帶以及兩個(gè)分別約為50kD及29kD的重鏈(HC)及輕鏈(LC)蛋白質(zhì)條帶。與預(yù)期的一樣，cFab/9aa在非還原條件下僅有1個(gè)約為40kD的蛋白質(zhì)條帶，這表明重鏈及輕鏈通過鏈間二硫鍵相連。另一方面，cFab在非還原條件下有2個(gè)蛋白質(zhì)條帶，這表明重鏈及輕鏈不通過鏈間二硫鍵相連。(7)測定嵌合體166-32IgG、cFab及cFab/9aa的活性嵌合體166-32IgG、cFab及cFab/9aa的活性可按上面的介紹使用補(bǔ)體旁路溶血試驗(yàn)進(jìn)行測定。圖13顯示，鼠及嵌合體形式的MAb166-32具有相同的抑制因子D的效力。圖14顯示，cFab及cFab/9aa具有基本上相同的抑制因子D的效力。更重要地是，兩種形式的嵌合體Fab的效力與嵌合體IgG相同，考慮到每個(gè)IgG分子有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)?？偠灾?，這些結(jié)果證明，嵌合體IgG、cFab及cFab/9aa保留了親本鼠區(qū)b166-32的效力。實(shí)施例10:在用人血漿灌注的兔心臟體外模型中，MAb166-32對由補(bǔ)體介導(dǎo)的組織損傷的保護(hù)作用補(bǔ)體系統(tǒng)的活化可造成超急性移植排斥。這可能是如下過程的結(jié)果能夠固定補(bǔ)體的抗體的結(jié)合、補(bǔ)體在外源細(xì)胞表面經(jīng)由旁路途徑直接活化、和/或外源器官不能調(diào)節(jié)補(bǔ)體(J.L.Platt等人，Transplantation,1991;52:937-947)。根據(jù)特殊的種與種之間的相互作用，補(bǔ)體活化可經(jīng)由占優(yōu)勢的經(jīng)典或旁路途徑，雖然有時(shí)這兩個(gè)途徑可同時(shí)運(yùn)作(T.Takahashi等人，ImmunoLRes.,1997;16:273-297)。先前的研究顯示，超急性排斥可在不存在抗供體抗體的情況下經(jīng)由旁路活化途徑發(fā)生(P.S.Johnston等人，Transplant.Proc.,1991;23:877-879)。為證明旁路補(bǔ)體途徑對組織傷害的重要性，使用一個(gè)體外模型來對抗因子D的MAb166-32進(jìn)行檢測，在該模型中分離的兔心臟用稀釋的人血漿灌注。此模型在先前的研究顯示可因補(bǔ)體旁路活化途徑對兔心肌造成傷害。(M.R.Gralinski等人，Imm聽pha皿cology，1996:34:79-88)。(1)由Langendorff灌注的兔心臟將雄性新西蘭白兔(2.2-2.4公斤)用斷頸推法致死?？焖偃〕鲂呐K，插管以通過主動(dòng)脈灌注。灌注培養(yǎng)液含有循環(huán)體積(250毫升)的修飾Krebs-Henseleit(K-H)緩沖液(pH7.4、37。C),以20-25毫升/分的恒定速率給予。緩沖液培養(yǎng)液的組成(毫摩爾/L)為NaCl,117;KC1，4.0;CaCl2.歸，2.4;MgCU6歸,1.2;Na跳,25;KH2P04,1.1;葡萄糖，5.0;L-谷氨酸單鈉，5.0;丙酮酸鈉，2,0;及BSA,0.25%(w/v)。此K-H緩沖液通過一個(gè)氣孔狀〃肺〃，該"肺"由SilasticTMLaboratoryGradeTubing(DowCorning,Midland,MI)組成,長度為55.49米，內(nèi)徑為1.47毫米及外徑為1.96毫米。將膜狀〃肺〃持續(xù)暴露在95%02/5%0)2下，使灌注培養(yǎng)液中氧分壓為500毫米米汞柱。在整個(gè)試驗(yàn)中，心臟通過連于右肺動(dòng)脈的電極進(jìn)行搏動(dòng)。由一臺(tái)實(shí)驗(yàn)室方形波發(fā)生器(GrassSD-5，Quincy,MA)傳送搏動(dòng)刺激(3Hz,4msec持續(xù)時(shí)間)。將肺動(dòng)脈用聚乙烯管插管以便于肺動(dòng)脈輸出液的收集，后者代表冠狀靜脈回流。將腔靜脈的外腔和內(nèi)腔以及肺靜脈結(jié)扎以防灌注液從被割斷的管流出。通過左動(dòng)脈插入一個(gè)左心室管、熱敏電阻探針以及橡膠球，并且定位于左心室。將充滿液體的橡膠球用硬管連接至壓力傳導(dǎo)器，以測量左心室的收縮壓及終舒張壓。左心室developed壓定義為左心室收縮壓及終舒張壓之間的差異。心室間球用蒸餾水?dāng)U張，以達(dá)到5毫米汞柱的起始基線的左心終舒張壓。冠狀灌注壓力用與心導(dǎo)管的側(cè)臂連接的壓力傳導(dǎo)器進(jìn)行測量。使用多頻道計(jì)數(shù)器(GrassPolygraph79D，Quincy,MA)連續(xù)監(jiān)測所有的血?jiǎng)討B(tài)變化。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，使分離的心臟維持在37°C,這通過將心臟置于調(diào)溫的雙層玻璃室，并通過加熱器及傳送器灌注培養(yǎng)液來實(shí)現(xiàn)。(2)抗體處理:使用兩個(gè)治療組來測定抗因子DMAb166-32在以人血漿灌注的分離兔心臟中抑制補(bǔ)體活化的能力。第1組同種型匹配的陰性對照，由在存在0.3微克/毫升對HIV-1gpl20有專一性的MAbG3-519的情況下用4%的人血漿灌注的心臟組成(11=6)。第2組治療組，由在存在0.3微克/毫升MAb166-32的情況下用4%的人血漿灌注的心臟組成(n=6)。人血漿可由新鮮收集的全血中分離，并貯存于-8CTC直到使用。使用此百分比的人血漿是因?yàn)樗稍诤侠黹L度的時(shí)間內(nèi)嚴(yán)重破壞心肌功能，并允許對治療有效性進(jìn)行評估。此系統(tǒng)中的高濃度人血漿可使心臟快速收縮，而低濃度下藥物的效用難以分析。初步研究已經(jīng)測定，0.3微克/毫升為能夠從補(bǔ)體活化的影響保護(hù)分離心臟的最低有效濃度。在將任何一種抗體加入灌注培養(yǎng)液之前，所有心臟在Langendorff器中平4舒10-15分鐘。加入抗體10分鐘后，將4%人血漿加入至灌注培養(yǎng)液(250毫升，再循環(huán))。血?jiǎng)討B(tài)變化包括冠狀動(dòng)脈灌注壓(CPP)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室終舒張壓(LVEDP)以及左心室壓(LVDP)在加入抗體前記錄(基線)，在加入4%人血漿前記錄，此后每10分記錄1次，共記錄60分鐘。在接觸4%人血漿時(shí)，與用MAbG3-519(0.3微克/毫升)處理的心臟相比，MAb166-32(0.3微克/毫升)可減少冠狀灌注壓(CPP)的增加。CPP的增加顯示冠狀血管抗性，該抗性通常與心肌組織傷害相關(guān)。用MAb166-32灌注的分離兔心臟可維持左心室終舒張壓(LVEDP),這與用MAbG3-519獲得的結(jié)果相反(圖15)。后一組心臟在接觸4%人血漿時(shí)可使LVEDP增加，這顯示心室在舒張時(shí)無法舒緩(圖15)。與用MAbG3-519處理的心臟相比，在接觸稀釋的人血漿后，MAb166-32亦可減少左心室壓(LVDP)的增加(圖15)。圖16描述了在存在4%人血漿時(shí)的灌注之前及10、30及60分鐘后心功能的代表性記錄。10分鐘后，用MAbG3-519處理的兔心臟有明顯的進(jìn)程性的LVEDP增加及LVDP降低，并且在隨后的50分內(nèi)，心室功能進(jìn)程性地惡化。另一方面，用MAb166-32處理的心臟在60分鐘后仍能保持心室功能?？偠灾?jiǎng)討B(tài)數(shù)據(jù)表明，抗因子DMAb166-32能保護(hù)分離的兔心臟，使之不受人補(bǔ)體-介導(dǎo)的損傷，這可用人血漿攻擊后仍能維持完全的心肌功能來說明。(3)補(bǔ)體Bb的ELISA:因子D催化結(jié)合狀態(tài)的因子B的切割，產(chǎn)生Ba及Bb片段。Bb存在的濃度可作為因子D活性的指標(biāo)。從分離兔心臟收集的淋巴液中的活化成份Bb的濃度可使用商業(yè)化的ELISA試劑盒(Quidel)測量。此分析使用針對人補(bǔ)體Bb的MAb在存在人血漿的條件下灌注兔心臟的過程中測量人補(bǔ)體系統(tǒng)的活化。淋巴管流出淋巴液可從心臟尖收集，速凍于液態(tài)氮，并|&于-70。C直到分析。記錄和說明淋巴管流出^_的流速，以將Bb濃度正常化。在用4%人血漿灌注10分后以及在各時(shí)間點(diǎn)，用MAb166-32處理的心臟與用MAbG3-519處理的心臟相比，淋巴管流出液存在明顯(p〈0.05)濃度低的Bb(圖17)。在用MAb166-32處理的兔心臟中補(bǔ)體活化產(chǎn)物Bb的產(chǎn)生減少，證明了該抗體對因子D的抑制劑活性。(4)C5b-9沉積物的免疫組化定位完成上述步驟后，從Langendorff裝置移出心臟，切成橫向切片，冷凍于液態(tài)氮。丟棄心尖及動(dòng)脈組織。4夸切片包埋于0.C.T.化合物包埋培養(yǎng)液(Miles,Inc.,Ekhart,IN)，切為3微米，置于聚-L-纈氨酸包被的載玻片。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)清洗后，將切片在室溫下與PBS中的4%多聚甲醛溫育。將心臟切片用PBS清洗并與1%BSA溫育15分鐘以降低非專一染色。用PBS清洗后，將切片與1:1000稀釋的鼠抗人C5b-9MAb(Quidel)一起在室溫下溫育l小時(shí)。將切片再用PBS清洗，在室溫下與羊抗鼠FITC偶聯(lián)抗體(Sigma,1:320稀釋)溫育1小時(shí)。最后用PBS清洗后，將切片用Fluoromount-G(ElectronMicroscopySciences,FortWashington,PA)固定，蓋以蓋玻片。對照包括不使用第一抗體處理的切片以及用同種型匹配的鼠抗體IgGl(Sigma)取代抗C5b-9MAb的切片。使用免疫焚光染色檢測用MAb166-32及MAbG3-519處理的心臟的心臟切片中的人MAC(或C5b-9)沉積。用MAb166-32處理的心臟與MAbG3-519處理的心臟相比，顯示MAC沉積減少?？偠灾眯呐K體外研究的數(shù)據(jù)證明了MAb166-32通過抑制旁路補(bǔ)體途徑在預(yù)防心組織損傷的效果。抑制補(bǔ)體活化已顯示可延長移植存活率(S.C.Makrides,PharmacologicalRev.,1998,50:59-87)。因此，MAb166-32有用作治療藥劑來保護(hù)移植物不受人血漿破壞的潛力。實(shí)施例11:在心肺分流的體外循環(huán)模型中，MAbl66-32對補(bǔ)體活化及炎癥反應(yīng)的抑制效應(yīng)進(jìn)行心肺分流(CPB)的病人經(jīng)常表現(xiàn)出系統(tǒng)性炎癥應(yīng)答癥。在臨床上，這些反應(yīng)可表現(xiàn)為術(shù)后白細(xì)胞增多、發(fā)熱、及血管外液體累積，這可導(dǎo)致恢復(fù)期延長，并偶而會(huì)造成嚴(yán)重的器官功能破壞(J.K.Kirklin等人，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.,1983;86845-857;Nilsson等人,Scand.J.Thorac.Cardiovasc.Surg.,1988;22:51—53;P.W.Weerwind等人，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.,1995;110:1633-1641)。這種炎癥反應(yīng)包括體液及細(xì)胞的變化，而造成組織損傷及止血功能被破壞。補(bǔ)體活化已被認(rèn)為是系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的首要原因(P,Haslam等人，Anaesthesia,1980;25:22-26;A.Salama等人,N.Eng.J.Med.,1980;318:408-414;J.Steinberg等人，J.Thorac.Caxdiovasc.Surg.,1993;106:1008-1016)。補(bǔ)體活化是引起血液與CPB體外循環(huán)機(jī)器的表面相互作用的原因(D.Royston,J.Cardiothorac.Vase.Anesth.,1997;11:341-354)原炎癥物質(zhì)在補(bǔ)體系統(tǒng)活化后生成，它們包括過敏毒素C3a及C5a、調(diào)理素C3b、及膜攻擊復(fù)合物C5b-9。C5a已顯示可在體外在多形核細(xì)胞P,(主要含中性粒細(xì)胞)中上調(diào)區(qū)C-1復(fù)合物中的CDllb(整合素)及CD18(整合素)(M.P.Fletcher等人，Am.J.Physiol.，1993;265:H1750-H1761),并誘導(dǎo)P,釋放溶酶體酶。C5b-9可誘導(dǎo)血小板上P-選擇素(CD62P)的表達(dá)(T.VViedmer等人，Blood,1991;78:2880-2886),而且C5a及C5b-9都誘導(dǎo)P-選擇素在內(nèi)皮細(xì)胞的表面表達(dá)(K.E.Foreman等人，J.Clin.Invest.,1994;94:1147-1155)。C3a及C5a可刺激人肥大細(xì)胞的趨化性(K.Hartmann等人，Blood，1997;89:2868-2870),并引發(fā)組織胺的釋放(Y.Kubota,J.Dermatol.,1992;19:19-26)，后者可誘導(dǎo)血管通透性(T.J.Williams,AgentsActions,1983;13:451-455)。全血在體外分流循環(huán)系統(tǒng)中的體外再循環(huán)已被廣泛用作在CPB中激活白細(xì)胞(J.Kappelamyer等人，Circ.Res.,1993;72:1075-1081;N.Moat等人，Ann.Thorac.Surg.，1993;56:1509-1514;C.S.Rinder等人，J.Clin.Invest.,1995:96:1564-1572)和血小板(V.L.Jr.Hennesy等人，Am.J.Physiol.，1977;2132:H622-H628;Y.Wachtfogel等人，J.Lab.Clin.Med.，1985;105:601-607;C.S.Rinder等人，ibid)以及補(bǔ)體活化(P.G.Loubser，Perfusion,1987;2:219-222;C.S.Rinder等人，ibid;S.T.Baksaas等人，Perfusion,1998;13:429-436)的模型。使用此CPB體外循環(huán)模型對抗因子D的MAb166-32在人全血中抑制細(xì)胞及補(bǔ)體活化的有效性進(jìn)行了研究。(l)體外循環(huán)系統(tǒng)的制備體外循環(huán)系統(tǒng)使用如下部件進(jìn)行裝配帶有一個(gè)嵌入式熱交換器的中空纖維兒科膜氧生成器(D901LILLPUT1;DIDEC0,Mirandola(M0)，Italy)、帶有一個(gè)嵌入式開心術(shù)濾器的兒科靜脈貯器(D752Venomidicard;DIDEC0)、一個(gè)灌注管道裝置(SodrinBiomedical,Inc.,Irvine,CA)以及多流旋轉(zhuǎn)泵(StockertInstrumentsGmbH,Munich,Germany),將血漿-Lyte148液(BaxterHealthcareCorp.,Deerfield,IL)注入氧生成器及循環(huán)器進(jìn)行啟動(dòng)。將此啟動(dòng)液用冷熱器回溫至32°C(Sarns;3MHealthCare,AnnArbor,MI),并按500毫升/分鐘進(jìn)行循環(huán)，將通氣流用100%氧維持于0.25升/分鐘。當(dāng)加入血至循環(huán)系后，將通氣流換成氧(95%)及0)2(5%)的混合氣體。在整個(gè)再循環(huán)期間連續(xù)監(jiān)測pH、PC02、P02以及灌注液溫度。在需要時(shí)加入碳酸氫鈉以將pH維持于7.25-7.40。(2)體外循環(huán)系統(tǒng)的操作及取樣從健康無服藥的自愿者在5-10分鐘內(nèi)抽450毫升血至轉(zhuǎn)移袋中(Haemo-Pak;Chartermed，Inc.,Lakewood,NJ)，轉(zhuǎn)移袋中含豬肝素(5單位/毫升，終濃度；Elkins-Sinn,CherryHill,NJ)及抗因子D的MAb166-32或同種型匹配的陰性對照MAbG3-519(18微克/ml;終濃度)?？贵w的這個(gè)濃度相當(dāng)于血中因子D摩爾濃度的約L5倍。在將血加入體外循環(huán)系統(tǒng)前,.從袋中取一個(gè)血樣品作為〃循環(huán)前〃樣品，命名為〃-10分鐘樣品〃。然后將血經(jīng)由已啟動(dòng)的通道加入貯器。同時(shí)將啟動(dòng)液抽至氧生成器遠(yuǎn)端出口，產(chǎn)生600毫升的最終循環(huán)體積以及25-28%的最終血細(xì)胞比容。將血與啟動(dòng)液一起循環(huán)，在3分鐘內(nèi)完成完全混合；抽出基線樣品，命名為0時(shí)間。為模擬體溫過低下外科手術(shù)的一般過程，將循環(huán)液冷卻至27°C70分鐘，再回溫至37'C50分鐘(總共再循環(huán)120分)。在再循環(huán)過程中，還在10、25、40、55、70、80及120分鐘抽取血液樣品。立即在2000xg及4。C下離心制備血漿樣品。分裝以用于旁路途徑溶血分析及中性粒細(xì)胞-專一的髓過氧化物酶分析，將分裝樣品冷凍于干冰，貯于-8CTC。立即將用于ELISA測量補(bǔ)體C3a、C4d、sC5b-9、及Bb的分裝樣品與等體積的樣品穩(wěn)定培養(yǎng)基(Quidel)混合，冷凍于干水，貯于-80°C。還收集全血樣品用于對中性粒細(xì)胞及血小板上活化的細(xì)胞表面標(biāo)記CDllb及CD62P進(jìn)行免疫染色。為防止染色過程中全血樣品的隨后的補(bǔ)體活化，將10微升的1MEDTA加入每毫升全血，使其終濃度為IO毫摩爾。(3)旁路途徑溶血分析如上所述使用兔紅血球細(xì)胞檢測MAb166-32處理的及MAbG3-519處理的循環(huán)在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)血漿樣品中的旁路補(bǔ)體活性。將50微升的每種樣品(20%)在加入30孩t升兔紅血球細(xì)胞(1.7x108細(xì)胞/亳升)之前與50微升GVB/Mg-EGTA緩沖液混合。在37°C下溫育30分鐘后，收集上清液。使用ELISA平板計(jì)數(shù)器讀取405nm處的0D。圖18顯示，用MAb166-32處理的循環(huán)系統(tǒng)中旁路補(bǔ)體活性可完全被該抗體抑制，而MAbG3-519在用于相當(dāng)?shù)难h(huán)系統(tǒng)時(shí)對補(bǔ)體活性無影響。這些結(jié)果表明，MAb166-32為旁路補(bǔ)體途徑的強(qiáng)力抑制劑。即使在摩爾比率僅為1.5:l(MAb:因子D)時(shí)，MAb166-32也可完全抑制旁路補(bǔ)體活性。(4)補(bǔ)體活化產(chǎn)物的分析除了上面介紹的溶血分析，還可檢測來自兩個(gè)體外循環(huán)系統(tǒng)的血漿樣品中的C3a、sC5b-9、Bb以及C4d的水平。這些物質(zhì)可使用商業(yè)化的ELISA試劑盒(Quidel)按廠商說明書進(jìn)行定量。與C5a—樣，sC5b-9是補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)中C5轉(zhuǎn)換酶活性的另一個(gè)標(biāo)記。C5a及sC5b-9皆為C5被C5轉(zhuǎn)換酶切割的產(chǎn)物。補(bǔ)體Bb為補(bǔ)體旁路活化途徑的專一標(biāo)記，而C4d為經(jīng)典活化途徑的專一標(biāo)記。圖19及20顯示，MAb166-32可分別有效地抑制C3a及sC5b-9產(chǎn)生，但同種型匹配的陰性對照MAbG3-519則不能抑制它們的產(chǎn)生。MAb166-32的專一性及效力進(jìn)一步在圖21及22中闡明。由補(bǔ)體旁路途徑產(chǎn)生的Bb可完全被MAb166-32抑制，而G3-519循環(huán)中的Bb水平在再循環(huán)過程中隨時(shí)間增加而增加。有趣地是，MAb166-32及G3-519循環(huán)中C4d的水平隨時(shí)間不會(huì)顯著變化。后面的有關(guān)Bb及C4d水平的結(jié)果強(qiáng)烈顯示，體外循環(huán)系統(tǒng)中的補(bǔ)體活化主要由旁路途徑介導(dǎo)?？偠灾?，這些結(jié)果表明，MAbl66-32為補(bǔ)體旁路途徑的強(qiáng)力抑制劑。因子D的抑制可終止級聯(lián)反應(yīng)的后續(xù)步驟的補(bǔ)體活化，這可由C3a及sC5b-9形成的減少來表現(xiàn)。(5)中性粒細(xì)胞及血小板活化的分析中性粒細(xì)胞及血小板的活化可分別通過測量中性粒細(xì)胞及血小板上CDllb及CD62P的細(xì)胞表面表達(dá)水平來定量。對于中性粒細(xì)胞的CDllb標(biāo)記，將100微升收集自循環(huán)系統(tǒng)的血立即在微量離心管中在室溫下與20微升的紅藻素(PE)-抗CDllb抗體(克隆D12,BectonDickinson,SanJose,CA)溫育10分鐘在室溫下加入1.4毫升的FACS裂解液(BectonDickinson)10分鐘以裂解紅細(xì)胞和固定白細(xì)胞。將微量離心管在300xg離心5分鐘。吸出上清液，將細(xì)胞懸浮于PBS進(jìn)行清洗。將微量離心管再離心一次，吸出上清液，在使用EPIC-XL流式細(xì)胞儀(CoulterCorp.,Miami,FL)進(jìn)行分析前，將細(xì)胞懸浮于0.5毫升的1%多聚甲醛過夜。為進(jìn)行雙標(biāo)記以同時(shí)鑒定中性粒細(xì)胞群，加入5微升的異硫氰酸焚光素(FITC)-抗CD15抗體(克隆畫A,BectonDickinson)以與PE-抗CDllb抗體一起溫育。對于血小板的CD62P標(biāo)記，將40孩i升收集自循環(huán)系統(tǒng)的血立即在微量離心管中在室溫下與20微升PE-抗CD62P抗體(克隆ACI.2,BectonDickinson)溫育10分鐘。將混合物按上面的介紹用FACS裂解液處理。將微量離心管在2000xg離心5分鐘。將血小板用PBS清洗，用1%多聚甲醛固定，再按上面的介紹進(jìn)行分析。為進(jìn)行雙標(biāo)記以同時(shí)鑒定血小板群，加入5微升的FITC-抗CD42a抗體以與PE-抗CD62P抗體一起溫育。為進(jìn)行流式細(xì)胞測量，P麗(主要含中性粒細(xì)胞)及血小板群分別用基于前對側(cè)散布參數(shù)的活動(dòng)門以及用FITC-抗CD15抗體及FITC-抗CD42a抗體專一染色進(jìn)行鑒定。背景染色使用同種型匹配的標(biāo)記抗體設(shè)定門。CDllb及CD62P的表達(dá)強(qiáng)度用平均焚光強(qiáng)度(MFI)表示。.圖23顯示，來自MAb166-32處理的體外循環(huán)系統(tǒng)的中性粒細(xì)胞，與來自MAbG3-519處理循環(huán)系統(tǒng)的中性粒細(xì)胞相比，顯示明顯低的CDllb表達(dá)。這些數(shù)據(jù)連同上述其他數(shù)據(jù)表明，MAb166-32對補(bǔ)體旁路活化的抑制可阻止中性粒細(xì)胞的活化與此類似，圖24顯示，來自MAb166-32處理的體外循環(huán)系統(tǒng)的血小板，與來自MAbG3-519處理的循環(huán)系統(tǒng)的血小板相比，顯示明顯低的CD62P表達(dá)。同樣，這些數(shù)據(jù)連同上述其他^t據(jù)顯示，MAb166-32對補(bǔ)體旁路活化的抑制可阻止血小板的活化。(6)中性粒細(xì)胞-專一的髓過氧化物酶(MPO)的分析中性粒細(xì)胞的活化程度亦可使用商業(yè)化的ELISA試劑盒(R&DSystems,Inc.,Minneapolis,,)進(jìn)行測量以測定來自體外循環(huán)系統(tǒng)的血漿樣品中的中性粒細(xì)胞專一的髓過氧化物酶(MPO)的數(shù)量。MP0主要貯于中性粒細(xì)胞的原粒(嗜苯胺藍(lán)細(xì)胞)中。它在中性粒細(xì)胞因活化而脫粒時(shí)釋放。因此MPO為中性粒細(xì)胞活化的可溶性標(biāo)記。分析可按廠商說明書施行。簡而言之，將樣品于微平板的孔中溫育，這些孔已用抗MPO的第一MAb包被將此MP0-MAB復(fù)合物用從羊MPO-抗血清中制備的一種與生物素偶聯(lián)的多克隆抗體標(biāo)記。此分析最后步驟基于生物素-親和素偶聯(lián)，其中親和素已與》成性磷酸酶共價(jià)連接。在加入底物4-硝苯基"粦酸鹽(pNPP)后，通過讀取405處的0D,以酶學(xué)的方法測得各樣品中MPO的量。圖25顯示，MAbl66-32處理的循環(huán)系統(tǒng)中的MPO水平比MAbG3-519循環(huán)系統(tǒng)中的水平明顯要低。這些結(jié)果與上面介紹的免疫焚光計(jì)數(shù)研究中的CDllb表達(dá)相吻合?？偠灾?，有關(guān)補(bǔ)體、中性粒細(xì)胞及血小板的數(shù)據(jù)支持如下論點(diǎn)，抗因子DMAb166-32對體外循環(huán)系統(tǒng)中補(bǔ)體旁路活化的有效抑制，可阻止炎癥物質(zhì)C3a、C5a及sC5b-9的形成，并因而降低中性粒細(xì)胞及血小板的活化?？梢灶A(yù)測，MAb166-32及其片段、同源物、相似物及其小分子部份可有效預(yù)防或降低因CPB所致的臨床炎癥反應(yīng)。例12:研究MAb166-32在患有缺血及灌注損傷的狗模型中的效果設(shè)計(jì)一研究以檢測MAb166-32是否可保護(hù)患有缺血及灌注狗的心肌組織不受傷害，雖然從一開始我們就i^識到，狗可能不是研究MAb166-32效用的理想動(dòng)物模型。在溶血試驗(yàn)中，MAbl66-32中和狗因子D的能力比中和人因子D的能力至少低10倍(參見例7)。因?yàn)槟菚r(shí)僅有有限量的MAb166-32，所以將MAb166-32經(jīng)由冠狀血管給藥至心臟。我們希望可在冠狀血中累積至少60微克/毫升的抗體濃度以完全抑制心臟中的狗因子D。計(jì)算劑量為3.15毫克/公斤/灌注，總共6次灌注。MAbG3-519用作同種型匹配的對照。簡而言之，將實(shí)驗(yàn)用獵犬麻醉。在第四肋間左位進(jìn)行胸廓切開術(shù)以露出心臟。分離近左圍旋冠狀動(dòng)脈，結(jié)扎90分鐘以誘導(dǎo)缺血，再灌注6小時(shí)。分別在缺血前30分鐘、灌注前10分鐘及灌注期間的75、150、225、300分鐘給藥抗體6次。在不同的時(shí)間點(diǎn)注入放射性微球以測量區(qū)域血流。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將心臟用伊凡藍(lán)染料及三苯四銼灌注以分別測量危險(xiǎn)面積及梗塞大小。在缺血前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)從頸靜脈收集冠狀淋巴液及血。使用這些樣品來測量注射抗體的濃度以及旁路途徑溶血活性。結(jié)果顯示，冠狀淋巴液中MAb166-32可達(dá)到的最高濃度約為30微克/毫升，這遠(yuǎn)低于在冠狀循環(huán)中完全抑制狗因子D所需的濃度。在系統(tǒng)循環(huán)中也檢測到抗體，這表明注射的抗體擴(kuò)散到心臟之外。溶血分析數(shù)據(jù)顯示，補(bǔ)體旁路活性沒有降低；這與抗體濃度較低的事實(shí)吻合。因此，由在狗中所作的這些實(shí)驗(yàn)無法對MAb166-32在灌注實(shí)驗(yàn)中的效應(yīng)下結(jié)論。上面的描述、術(shù)語、表達(dá)及例子僅為舉例而不是限制。本發(fā)明包括前面實(shí)施方案的所有等價(jià)物，不管是已知的還是未知的。本發(fā)明僅受后面專利要求的限制，并不受本文任何其他部分中的任何陳述或任何其他來源的限制。序列表〈110〉MichaelS.C.FungBillN.C.SunCecilyR.Y.Sun〈120〉補(bǔ)體活化的抑制劑〈130〉98-2<140>09/253,689〈141〉1999-02-20<150>60/075,328<151>1998-02-20〈歸15<170〉FastSEQforWindowsVersion4.0〈210>1<211>699〈212>DNA〈213>人<220〉〈221〉CDS<222〉(4)...(687)〈400〉1eggatectgggcggcagagaggccgaggcgcacgcgeggccctacatg48lieLeuGlyGlyArgGluAlaGluAlaHisAlaArgProTyrMet151015gcgtcgAlaSergtgValcagGinctgLeu20AsnggcGlygcgAlaHisctgLeu25tgcCysggcGlyggcGlygtcValctgLeu30gtgVal96gcggagAlaGlucagGintggTrp35gtgValctgLeuageSergcgAlagcgAla40cacHistgcCysctgLeugagGlugacAsp45gcgAlagccAla144g￡icAspgggGlyLys50gtgValcagGingttValetcLeuctgLeu55ggcGlygcgAlacacHistecSerctgLeu60tcgSercagGinccgPro192gagGlucccPro65tecSer幼gLyscgcArgctgLeutacTyr70gacAspgtgValetcLeucgcArggcaAla75gtgValcccProC3CHisccgPro240gacAsp80ageSercagGincccProgacAsp3CCThr85ateliegacAspcacHisgacAspetcLeu90ctgLeuctgLeuetaLeucagGinctgLeu95288tcgSergagGlu犯gLysgccAlaacaThr100ctgLeuggcGlycctProgetAlagtgVal105cgcArgcccProctgLeucccProtggTrp110C3gGin336cgcArggtgValAspcgcArg115AspgtgValgcaAlaccgProggaGly120actThretcLeutgcCysg3CAspgtgVal125gccAlaggcGly384tggggcatagtcaaccacgcgggccgccgcccggacagectgcagcac432TrpGlylieValAsnHisAlaGlyArgArgProAspSerUuGinHis130135140gtgetcValLeu145ttgLeuCC3ProgtgValctgLeugacAsp150cgcArggccaccAlaThrtgcaaceggCysAsnArg155cgcArgacgThrcacHis480C3Cg3CHisAsp160ggcGlygccAlaatelie3CCThr165gagGlucgcArgttgatgLeuMettgcgcggagCysAlaGlu170ageSeraatAsncgcArg175528egggacArgAspageSertgcCys犯gLys180ggtGlyAsptecSergggggcGlyGly185ccgctggtgProLeuVal'tgcCysgggGly190ggcGly576gtgetcValLeugagGluggcGly195gtgValgtcVal3CCThrtegSerggctegGlySer200cgcgtttgcArgValCysggcGly205aacAsncgciVrg624aagaagLysLyscccPro210gggGlyatelietacTyrgiccThrcgcArg215gtggcgValAlaagetatgcgSerTyrAla220gccAlatggTrpatelie672gacageAspSer225gtcctggcctagtaggaattcValLeuAla699〈210>2<211>228<212〉PRT<213>人<400>2lieLeu1SerValGluGinGlyLys50ProSer65SerGinGluLysValAspGlylie130LeuLeu145AspGlyGlyGlyArgGluAlaGluAlaHisAlaArgProTyrGinTrp35ValLeu20Val5AsnGlyAlaHisLeuSerAlaGinValLeuLysArgLeuProAspAlaArg115ValThr100AspThr85LeuTyr70lieLeu55AspAla40GlyLeu25His10CysGlyGlyValCysLeuGluAsp45SerLeu30AlaMetAla15ValAlaAlaAspAlaHisSerValLeuArgAspHisAspGlyProAlaValAlaProAsnHisAlaProValLeuAlalieAspSerCysLeuGluLysPro210SerVal225Gly195GlyLys180ValThr165GlyAsp150GluGly135ArgGly120ArgVal105ThrLeu90ArgAla75LeuLeu60ValGinProGluProHisLeuLeuGinProLeuProLeuCysAspArgProAspAlaThrCysArgLeuMetAspSerGlyValThrSerlieTyrThrArg215Gly200ValGly185SerCys170ProAsn155AlaSer140ArgVal125LeuTrp110AlaProAsp80LeuSer95GinArgGlyTrpGinHisValArgThrGluSerAsnLeuValCysArgValCysAlaSerTyrAla220Gly205AlaGly190AsnTrpHisHis160ArgArg175GlyValArgLyslieAspLeuAla〈210〉3<211>714〈212〉脆〈213〉豬〈220〉〈221〉<222>CDS(4)..(702)<400>3cggatclie1ctgLeuggtGlyggcGlyGln5gagGlugccAlaaagLystecSercacHis10gagGlu卿ArgcccProtacTyratgMet1548gcaAlatcgSergtgValcagGingtgVal20幼cAsnggcGly犯gLyscacHisgtgVal25tgcCysggaGlyggcGlyttcPhectgLeu30gtgVal96tctSerGlucagGintggTrp35gtgValctgLeu3gtSergcaAlagC3Ala40C3CHistgcCysctgLeugagGlugacAsp45gtgValgccAla144gagGlugggGly鄉(xiāng)Lys50ctgLeucagGingUValetcLeuctgLeu55ggtGlygcgAlaC3CHistecSerctgLeu60teaSercagGincccPro192gagGlucccPro65tcgSer鄉(xiāng)LyscgcArgctgLeutacTyr70g￡lCAspgtgValetcleucgcArggccAla75gtgValcccProcacHisCC3Pro240gacagecagcctgacaccategaccatgatetcetcctgctgaagetc288AspSerGinProAspThrlieAspHisAspLeuLeuLeuLeuLysLeu80859095tecgagSerGlusagLysgccAlagagGlu100ctgLeuggcGlycctProgccAlagtgVal105cagGincccProcttLeugccAlatggTrp110caaGin336cgagagArgGluAspC3CHis115gagGlugttValccgProgcaAlaggcGly120acgThretcLeutgcCysgacAspgtgVal125gccAlaggcGly384tggggaTrpGlygtgVal130gtcValagtSerceicHisactThrggcGly135cgcArgeggArgcccProgacAspcgtArg140ctgLeucagGincacHis432ctgetcLeuLeu145etaLeuccgProValctgLeugacAsp150cgcArgEiCCThr3CCThrtgcCysaacAsn155ctgLeucgcArgacaThrtacTyr■cacgatHisAsp160ggcGlyaccThratelieaccThr165gagGlucgcArgatgMetatgMettgcCys170gcgAlagagGluageSer犯cAsncgtArg175528egggacArgAspageSertgcCysaagLys180ggcGlygacAsptecSerggaGlyggcGly185ccgProctgLeugtgValtgcCysgggGly190ggtGly576gtggccValAlagagGluggaGly195gtgValgttValaccThrteaSerggcGly200tecSercgaArggtcValtgcCysggcGly205犯cAsncgcArg624aagaaacccggcatetacacgcgcttggcgagetacgtggcctggate672LysLysProGlylieTyrThrArgLeuAlaSerTyrValAlaTrplie210215220gacggagtgatggetgacagegcagccgcctagtaggaattc.714AspGlyValMetAlaAspSerAlaAlaAla225230〈210〉4〈211〉233〈212〉PRT<213>豬〈400〉4lieLeuGlyGlyGinGluAlaLysSerHisGluArgProTyrMetAla151015SerValGinValAsnGlyLysHisValCysGlyGlyPheLeuValSer202530GluGinTrpValLeuSerAlaAlaHisCysLeuGluAspValAlaGlu354045GlyLysLeuGinValLeuLeuGlyAlaHisSerLeuSerGinProGlu505560ProSerLysArgLeuTyrAspValLeuArgAlaValProHisProAsp65707580SerGinProAspThrlieAspHisAspLeuLeuLeuLeuLysLeuSer859095GluLysAlaGluLeuGlyProAlaValGinProLeuAlaTrpGinArg100105110GluAspHisGluValProAlaGlyThrLeuCysAspValAlaGlyTrp115120125GlyValValSerHisThrGlyArgArgProAspArgLeuGinHisLeu130135140LeuLeuProValLeuAspArgThrThrCysAsnLeuArgThrTyrHis145150155160AspGlyThrlieThrGluArgMetMetCysAlaGluSerAsnArgArg165170175AspSerCysLysGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysGlyGlyVal180185190AlaGluGlyValValThrSerGlySerArgValCysGlyAsnArgLys195200205LysProGlylieTyrThrArgLeuAlaSerTyrValAlaTrplieAsp210215220GlyValMetAlaAspSerAlaAlaAla225230〈210>5<211>25〈212〉DNA〈213〉人工序列<220><223〉引物〈400〉5tgcggccgctgtaggtgctgtcttt25<210>6<211>23〈212〉腿〈213〉人工序列<220〉<223>引物〈德6ggaattcactcgttattctcgga23<210>7〈211〉17<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<400>7tccgagaataacgagtg17<210>8〈211〉29〈212〉腿<213〉人工序列<220><223>引物<400〉8cattgaaagctttggggtagaagttgttc29<210>9<211>27<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<223〉引物<400>9cgcggccgcagctgctcagagtgtaga27<210>10<211〉28〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉引物<400〉10cggtaagcttcactggctcagggaaata28<210〉11<211〉37<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223〉引物〈400〉11aagaagcttgccgccaccatggattggctgtggaact37<210〉12〈211〉31<212>腿<213〉人工序列〈220〉〈223〉引物<400>12cgggatcctcaaactttcttgtccaccttgg31<210〉13<211〉36〈212>DNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉引物〈400>13aagaaagcttgccgccaccatgttctcactagctct36<210〉14<211〉26<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉〈223>引物〈400〉14cgggatccttctccctctaacactct26<210〉15<211>9<212>PRT〈213〉人〈400>15GluProLysSerCysAspLysThrHis1權(quán)利要求1.一種抗體，或其抗原結(jié)合片段，它特異性結(jié)合因子D，其中所述抗體在摩爾比低于80∶1(抑制劑∶因子D)時(shí)抑制補(bǔ)體活化和結(jié)合因子D。2.權(quán)利要求l的抗體，或其抗原結(jié)合片段，其在摩爾比約1.5:1(抑制劑因子D)時(shí)結(jié)合因子D。3.權(quán)利要求1或2的抗體，其中所述抗原結(jié)合片段為Fab、F(abOhFv或單鏈Fv。4.權(quán)利要求1或2的抗體，其中所迷抗體為嵌合的、去免疫的、人源化的、去免疫化的或人抗體。5.—種人源化抗體或其抗原結(jié)合片l爻，它與單克隆抗體166-32結(jié)合至因子D的相同表位，其中產(chǎn)生所述單克隆抗體166-32的雜交瘤保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號碼為HB-12476,其中所述抗原結(jié)合片段為Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv。6.權(quán)利要求5的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體為去免疫化的抗體。7.—種細(xì)胞系，它產(chǎn)生權(quán)利要求1-6的抗體或其抗原結(jié)合片段。8.—種組合物，它含有權(quán)利要求1-6的抗體或其抗原結(jié)合片段，以及任選藥學(xué)上可接受的載體。9.權(quán)利要求8的組合物，其用于改善與補(bǔ)體系統(tǒng)過度或失控活化有關(guān)的疾病或癥狀o10.權(quán)利要求8的組合物，其用于給藥予人。11.權(quán)利要求8的組合物，其用于人的體內(nèi)-體外用途。12.權(quán)利要求8的組合物，其中所迷藥物組合物給藥予進(jìn)行涉及心肺分流的手術(shù)的人。13.權(quán)利要求8的組合物，其中所迷藥物組合物加入到體外循環(huán)的血中以抑制補(bǔ)體活化。14.權(quán)利要求9的組合物，其中被所述藥物組合物改善的疾病或癥狀為因心血管栓塞后缺血再灌流的組織傷害、動(dòng)脈瘤、中風(fēng)、出血休克、撞擊傷害、多處器官衰竭、血容積不足休克或腸缺血。15.權(quán)利要求9的組合物，其中被所述藥物組合物改善的疾病或癥狀為炎癥性失調(diào)。16.權(quán)利要求9的組合物，其中被所述藥物組合物改善的疾病或癥狀為燒傷、內(nèi)毒素血癥、敗血性休克、成人呼吸困難癥、心肺分流、血液透析、過敏性休克、嚴(yán)重。孝喘、血管水腫、局限性回腸炎、鐮刀性細(xì)胞貧血、后鏈球菌腎小球腎炎或胰炎。17.權(quán)利要求9的組合物，其中被所述藥物組合物改善的疾病或癥狀為不良藥物反應(yīng)。18.權(quán)利要求9的組合物，其中被所迷藥物組合物改善的疾病或癥狀為IL-2引發(fā)的血管滲漏癥或放射性造影介質(zhì)過敏。19.權(quán)利要求9的組合物，其中被所述藥物組合物改善的疾病或癥狀為自身免疫異常。20.權(quán)利要求9的組合物，其中被所述藥物組合物改善的疾病或癥狀為系統(tǒng)性紅斑狼瘠、重癥肌無力、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、早老性癡呆或多發(fā)性硬化。21.權(quán)利要求9的組合物，其中被所述藥物組合物改善的疾病或癥狀為移植排斥。22.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備用于改善與補(bǔ)體系統(tǒng)過度或失控活化有關(guān)的疾病或癥狀的藥物中的用途。23.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備用于給藥予人的藥物中的用途。24.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備藥物中的用途，其中所述藥物給藥予進(jìn)行涉及心肺分流的手術(shù)的人。25.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備藥物中的用途，其中所述藥物加入到體外循環(huán)的血中以抑制補(bǔ)體活化。26.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備藥物中的用途，其中所述藥物，其中所述藥物改善因心血管栓塞后缺血再灌流的組織傷害、動(dòng)脈瘤、中風(fēng)、出血休克、撞擊傷害、多處器官衰竭、血容積不足休克或腸缺血。27.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備藥物中的用途，其中所述藥物改善炎癥性失調(diào)。28.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備藥物中的用途，其中所述藥物改善燒傷、內(nèi)毒素血癥、敗血性休克、成人呼吸困難癥、心肺分流、血液透析、過敏性休克、嚴(yán)重哞喘、血管水腫、局限性回腸炎、鐮刀性細(xì)胞貧血、后鏈球菌腎小球腎炎或胰炎。29.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備藥物中的用途，其中所述藥物改善不良藥物反應(yīng)。30.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備藥物中的用途，其中所述藥物改善IL-2引發(fā)的血管滲漏癥或放射性造影介質(zhì)過敏。31.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備藥物中的用途，其中所述藥物改善自身免疫異常。32.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備藥物中的用途，其中所述藥物改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡、重癥肌無力、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、早老性癡呆或多發(fā)性硬化。33.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的抗體或其抗原結(jié)合片段在制備藥物中的用途，其中所述藥物改善移植排斥。全文摘要本發(fā)明涉及補(bǔ)體活化的抑制劑。本發(fā)明涉及因子D的抑制劑，它結(jié)合因子D并阻斷因子D在補(bǔ)體活化中的功能活性。此抑制劑包括抗體分子，以及同源物、相似物及它們的修飾形式或衍生形式，包括免疫球蛋白片段如Fab、F(ab′)₂及Fv；小分子包括肽、寡核苷酸、肽模擬物及有機(jī)化合物。獲得了一株單克隆抗體，它能結(jié)合因子D并阻斷其補(bǔ)體活化功能，該抗體被命名為166-32。產(chǎn)生此抗體的雜交瘤保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801UniversityBlvd.，Manassas，VA20110-2209，保藏號為HB-12476。文檔編號C12N9/99GK101298481SQ20071030021公開日2008年11月5日申請日期1999年2月19日優(yōu)先權(quán)日1998年2月20日發(fā)明者B·N·C·孫,C·R·Y·孫,M·S·C·馮申請人:吉寧特有限公司