專利名稱：：Psod表達(dá)單元的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的核酸序列的用途、新啟動(dòng)子及其表達(dá)單元、用于改變或影響基因轉(zhuǎn)錄速率和/或表達(dá)速率的方法、包含該表達(dá)單元的表達(dá)盒、具有改變的或受影響的轉(zhuǎn)錄速率和/或表達(dá)速率的基因修飾微生物及通過(guò)培育該基因修飾微生物制備生物合成產(chǎn)物的方法。
背景技術(shù)：
：多種生物合成產(chǎn)物，例如精細(xì)化學(xué)品(尤其例如氛基酸、維生素)及蛋白質(zhì)是通過(guò)天然代謝過(guò)程在細(xì)胞中產(chǎn)生的，并用于包括化妝品、飼料、食品及醫(yī)藥業(yè)的許多工業(yè)領(lǐng)域中。這些物質(zhì)統(tǒng)稱為精細(xì)化學(xué)品/蛋白質(zhì)，其尤其包含有機(jī)酸、生蛋白氨基酸和非生蛋白氨基酸(proteinogenicandnon國(guó)proteinogenicaminoacid)、核脊酸和核香、類月旨類和月旨肪酸、二醇、糖類、芳香化合物、維生素和輔因子以及蛋白質(zhì)和酶。通過(guò)培養(yǎng)為了產(chǎn)生及分泌大量特定目的物質(zhì)而開(kāi)發(fā)出的細(xì)菌，這些物質(zhì)的生產(chǎn)以工業(yè)規(guī)^莫上最有利的方式進(jìn)行。特別適于該目的的生物為棒桿菌(coryneformbacteria),其為革蘭氏陽(yáng)性非病原菌。已知通過(guò)棒桿菌菌林的發(fā)酵，尤其是谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)菌抹的發(fā)酵來(lái)制備氨基酸。由于其重要性，在其生產(chǎn)過(guò)程的改良上進(jìn)行了不懈的努力。該過(guò)程改良可與以下事宜相關(guān)發(fā)酵技術(shù)的手段，例如攪拌與供氧；或營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的組成，例如發(fā)酵中的糖濃度；或用于獲得產(chǎn)物的處理，例如通過(guò)離子交換層析或噴霧干燥；或微生物自身的內(nèi)在性能特性。通過(guò)擴(kuò)增個(gè)別基因并研究其對(duì)精細(xì)化學(xué)品/蛋白質(zhì)的生產(chǎn)的作用，重組DNA技術(shù)已在產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品/蛋白質(zhì)的棒桿菌菌林的菌林改良中應(yīng)用了許多年。用于發(fā)展生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品、氬基酸或蛋白質(zhì)的方法，或用于增加或提高已存在的生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品、氨基酸或蛋白質(zhì)的方法的生產(chǎn)率的其他方式是增加或改變一種或多種基因的表達(dá)，和/或用合適的多核苷酸序列影響mRNA的翻譯。就此而言，影響可包括基因表達(dá)的增加、減少或其他限制因素,例如時(shí)序表i^^式(chronologicalexpressionpattern),對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，細(xì)菌調(diào)節(jié)序列的各種組分是已知。對(duì)于以下結(jié)合位點(diǎn)已作出了區(qū)分調(diào)節(jié)物結(jié)合位點(diǎn)，也稱為操縱基因；RNA聚合酶全酶結(jié)合位點(diǎn)，也稱為-35與-10區(qū)及核糖體16SRNA結(jié)合位點(diǎn)，也稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)或Shine-Dalgarno序列?；诒景l(fā)明的目的，也稱為Shine-Dalgarno序列的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列是指位于翻譯起始密碼子上游高達(dá)20個(gè)堿基處的多核苷酸序列。據(jù)文獻(xiàn)(E.coli和S.typhimurium，NeidhardtF.C.1995ASMPress)報(bào)導(dǎo)，Shine-Dalgarno序列的多核苷酸序列的組成和堿基序列串及存在于Shine-Dalgarno序列中的多核苷酸序列的距離均對(duì)翻譯起始速率具有顯著影響。具有啟動(dòng)子活性的核酸序列可以多種方式影響mRNA的形成。其活性不依賴于生物的生理生長(zhǎng)期的啟動(dòng)子稱為組成型。而其他啟動(dòng)子響應(yīng)外部的化學(xué)及物理刺激，例如氧、代謝物、熱、pH等。而其他啟動(dòng)子在不同生長(zhǎng)期中顯示出對(duì)其活性的強(qiáng)依賴性。例如，文獻(xiàn)中描述的在微生物的指數(shù)生長(zhǎng)期中或恰好在孩支生物生長(zhǎng)的穩(wěn)定期中顯示特別顯著的活性的啟動(dòng)子。根據(jù)代謝途徑，啟動(dòng)子的兩種特征可對(duì)精細(xì)化學(xué)品及蛋白質(zhì)的生產(chǎn)率具有有益的作用。例如，在生長(zhǎng)過(guò)程中關(guān)閉基因表達(dá)，但在最佳生長(zhǎng)后又啟動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)子可用于調(diào)節(jié)控制代謝物產(chǎn)生的基因。于是，修飾的菌抹顯示與起始菌^M目同的生長(zhǎng)參數(shù)，但每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生更多產(chǎn)物。該種類型的修飾可增加滴度(產(chǎn)物的克^t/升)及c產(chǎn)率(產(chǎn)物的克數(shù)/c源的克數(shù))。已經(jīng)可以從棒桿菌菌種中分離出那些可用于增強(qiáng)或減弱基因表達(dá)的核苷酸序列。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)部和/或外部條件，這些受調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子可提高或降低基因轉(zhuǎn)錄的速率。在某些情況下，被稱為誘導(dǎo)物的特定因子的存在可刺激從啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄速率。誘導(dǎo)物可直接或間接影響從啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。被稱為抑制物的另一類因子能夠降低或抑制從啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。類似于誘導(dǎo)物，該抑制物也可直接或間接地起作用。另一方面，溫度調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子也為已知的。因此，例如，可通過(guò)將生長(zhǎng)溫度增至高于細(xì)胞的正常生長(zhǎng)溫度來(lái)增強(qiáng)或減弱這類啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平。至今已描述了少量源自谷氨酸棒桿菌的啟動(dòng)子。DE4440118中描述了源自谷氨酸棒桿菌的蘋(píng)果酸合酶基因的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子被插入到編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的上游。這種構(gòu)建物轉(zhuǎn)化進(jìn)入棒桿菌之后，對(duì)該啟動(dòng)子下游的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。一旦在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)物，就誘導(dǎo)該結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。Reinscheid等人在Microbiology145:503(1999)中描述了源自谷氨酸棒桿菌的pta-ack啟動(dòng)子與報(bào)道基因(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)之間的轉(zhuǎn)錄融合作用。包含這種轉(zhuǎn)錄融合作用的谷氨酸棒桿菌細(xì)胞在含有乙酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，呈現(xiàn)報(bào)道基因的增強(qiáng)表達(dá)。與此相比，在葡萄糖上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞未顯示該報(bào)逸基因的增強(qiáng)表達(dá)。Pa，tek等人在Microbiology142:1297(1996)中描述了能夠增強(qiáng)報(bào)道基因在谷氨酸棒桿菌細(xì)胞中表達(dá)的某些源自谷氨酸棒桿菌的DNA序列。將這些序列在一起進(jìn)行比較以便確定谷氨酸棒桿菌啟動(dòng)子的共有序列。專利WO02/40679中已經(jīng)描述了可用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)的其他源自谷氨酸棒桿菌的DNA序列。這些分離的多核普^現(xiàn)為可用于增加或降低基因表達(dá)的源自谷氨酸棒桿菌的表達(dá)單元。該專利還描述了重組質(zhì)粒，在這些重組質(zhì)粒上源自谷氨酸棒桿菌的表達(dá)單元與異源基因連接在一起。本文所描述的將源自谷氨酸棒桿菌的啟動(dòng)子與異源基因融合的方法，尤其可用于調(diào)節(jié)氨基酸生物合成的基因。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有利特性的其他啟動(dòng)子和/或表達(dá)單元。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用具有啟動(dòng)子活性的核酸可實(shí)現(xiàn)該目的，該核酸包含以下用于基因轉(zhuǎn)錄的序列A)核^列SEQ.ID.NO.1，或B)通過(guò)核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.l衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.1具有至少卯％同一性的序列，或C)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.l雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段(functionallyequivalentfragment)。根據(jù)本發(fā)明，"轉(zhuǎn)錄"是指從DNA模板開(kāi)始產(chǎn)生互補(bǔ)RNA分子的過(guò)程。該過(guò)程涉及例如RNA聚合酶、所謂的o因子及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的蛋白質(zhì)。接著，合成的RNA用作翻譯過(guò)程中的模板，其隨后產(chǎn)生生物合成活性蛋白質(zhì)。產(chǎn)生生物合成活性蛋白質(zhì)的形成速率是轉(zhuǎn)錄速率與翻譯速率的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明，兩種速率均可改變，且因此改變微生物中產(chǎn)物的形成速率。根據(jù)本發(fā)明，"啟動(dòng)子"或"具有啟動(dòng)子活性的核酸"是指以與待轉(zhuǎn)錄的核酸功能性連接的方式調(diào)節(jié)該核酸轉(zhuǎn)錄的核酸。就此而言，"功能性連接"是指，例如一種具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸和待轉(zhuǎn)錄的核酸序列以及適當(dāng)條件下的其他調(diào)節(jié)元件(例如，確保核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列及終止子)的順序排列，這種方式使得各調(diào)節(jié)元件均可在該核酸序列的轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮其功能。因此，化學(xué)意義上的直接連接并非絕對(duì)必要。例如增強(qiáng)子序列的遺傳控制序列能夠?qū)ι踔凛^遠(yuǎn)位置，或甚至其他DNA分子的耙序列執(zhí)行其功能。優(yōu)選待轉(zhuǎn)錄的核酸序列位于本發(fā)明的啟動(dòng)子序列之后(即，在3，末端)的排列，以便兩個(gè)序列共價(jià)連接在一起。就此而言，啟動(dòng)子序列與待轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核*列之間的距離優(yōu)選小于200個(gè)堿基對(duì)，特別優(yōu)選小于100個(gè)堿基對(duì)，進(jìn)一步優(yōu)選小于50個(gè)堿基對(duì)。根據(jù)本發(fā)明，"啟動(dòng)子活性"是指在特定時(shí)間內(nèi)由啟動(dòng)子形成的RNA量，即指轉(zhuǎn)錄速率。根據(jù)本發(fā)明，"特異啟動(dòng)子活性"是指各啟動(dòng)子在特定時(shí)間內(nèi)由啟動(dòng)子形成的RNA的量。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"野生型"是指合適的起始微生物。視上下文而定，術(shù)語(yǔ)"微生物"是指起始微生物(野生型)或本發(fā)明的遺傳修飾微生物或其兩者。優(yōu)選地，尤其是在不能明確歸類微生物或野生型的情狀下，"野生型"是指在為了改變或影響啟動(dòng)子活性或轉(zhuǎn)錄速率、為了改變或影響表達(dá)活性或表達(dá)速率及為了增加生物合成產(chǎn)物的含量的各個(gè)情況下的參考生物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該參考生物為谷氨酸棒桿菌ATCC13032。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所用的起始微生物已能夠產(chǎn)生所要精細(xì)化學(xué)品。就棒桿菌屬細(xì)菌的特別優(yōu)選微生物及特別優(yōu)選的精細(xì)化學(xué)品L-賴氨酸、L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸而言，特別優(yōu)選那些已能夠產(chǎn)生L-賴氨酸、L-甲硫氨酸和/或L-蘇氨酸的起始微生物通常。這些起始微生物特別優(yōu)選為其中(例如)編碼天冬氨酸激酶的基因(ask基因)已去調(diào)節(jié)或反饋抑制作用已消除或降低的棒桿菌。這類細(xì)菌具有，例如在ask基因中導(dǎo)致反饋抑制作用降低或消除的突變，例如T311I突變。因此，在與野生型相比，基因相關(guān)的"影響啟動(dòng)子活性"或轉(zhuǎn)錄速率的情況下，導(dǎo)致與野生型相比在野生型中不以該方式存在的RNA的形成。因此，在與野生型相比，基因相關(guān)的改變的啟動(dòng)子活性或轉(zhuǎn)錄速率的情況下，與野生型相比特定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的RNA的量改變。就此而言，"改變"優(yōu)選指增加或降低。例如，這可通過(guò)增加或降低本發(fā)明的內(nèi)源啟動(dòng)子的特異啟動(dòng)子活性進(jìn)行，例如通過(guò)使該啟動(dòng)子突變，或通過(guò)刺激或抑制該啟動(dòng)子。實(shí)現(xiàn)啟動(dòng)子活性或轉(zhuǎn)錄速率增加的另一種可能性是，例如通過(guò)具有啟物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中這些基因相對(duì)于這些具有啟動(dòng)子活性的核酸是異源的。通過(guò)具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸或具有增加的特異啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄優(yōu)選是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)將一種或多種具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸的控制下進(jìn)^f亍一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄；或?qū)⒁环N或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在具有啟動(dòng)子活性、適^或多種導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄;或、'^L二\'將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸及與功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸包含A)核絲列SEQ.ID.NO.l，或B)通過(guò)核苦酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.l衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.1具有至少卯％同一性的序列，或C)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.l雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段。核酸序列SEQ.ID.NO.l代表源自谷氨酸棒桿菌的超氧化物歧化酶(Psod)的啟動(dòng)子序列。SEQ.ID.NO.l對(duì)應(yīng)于野生型的啟動(dòng)子序列。本發(fā)明還涉及具有啟動(dòng)子活性的核酸，其包含通過(guò)核苷酸的取代、插入或缺失從SEQ.ID.NO.l序列衍生的，且在核酸水平上與SEQ.ID.NO.1序列具有至少90%同一性的序列。通過(guò)來(lái)自數(shù)據(jù)庫(kù)的核酸序列與上述序列SEQIDNO:1的同一性比較，本發(fā)明的啟動(dòng)子的本發(fā)明的其他天然實(shí)例可容易地從例如基因組序列已知的多種生物中發(fā)現(xiàn)。從序列SEQIDNO:l開(kāi)始通itA工變異及突變(例如，通過(guò)核苷酸的取代、插入或缺失)可容易地得到本發(fā)明的人工啟動(dòng)子序列。本文中術(shù)語(yǔ)"取代"是指由一種或多種核苷酸置換一種或多種核苷酸。"缺失"是指通過(guò)直接連接來(lái)置換核苷酸。"插入"是指將核苷酸插入核,列中，伴隨一種或多種核苷酸對(duì)直接連接的形式置換，兩種核酸間的同一性是指在各情況下核酸完整長(zhǎng)度上的核苷酸同一性，具體地，同一性通過(guò)借助Informax(美國(guó))的VectorNTISuite7.1軟件，使用Clustal方法(HigginsDG，SharpPM.Fastandsensitivemultiplesequencealignmentsonamicrocomputer.ComputAppl.Biosci.1989年4月；5(2):151-l)進(jìn)行比較計(jì)算出來(lái)的，其中參數(shù)設(shè)定如下多序列比對(duì)參數(shù)缺口開(kāi)方文罰分10缺口拓展罰分10缺口分離罰分范圍8缺口分離罰分關(guān)比對(duì)延遲同一性％40殘基特定缺口關(guān)親水性殘基缺口關(guān)過(guò)渡權(quán)重(transitionweighing)0雙序列比對(duì)參數(shù)FAST算法開(kāi)K-數(shù)組尺寸(tuplesize)1缺口罰分3窗口尺寸5最佳對(duì)角線數(shù)目(Numberofbestdiagonal)5因此，與序列SEQIDNO:1具有至少卯％同一性的核酸序列是指當(dāng)其序列與序列SEQIDNO:1比對(duì)時(shí)顯示至少90%同一性的核酸序列，所述比對(duì)具體指根據(jù)具有以上參數(shù)設(shè)定的上述程序設(shè)計(jì)的算法。特別優(yōu)選的啟動(dòng)子顯示與核酸序列SEQ.ID.NO.1的91%同一性，進(jìn)一步優(yōu)選為92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%同一性，特別優(yōu)選為99%同一性。此外，以本身已知方式，通過(guò)雜交技術(shù)可容易地發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子的其他天然實(shí)例來(lái)源于上述核酸序列，尤其是來(lái)源于來(lái)自基因組序列未知的多種生物的序列SEQ.IDNO:1。因此，本發(fā)明的另一方面涉及具有啟動(dòng)子活性的核酸，其包含在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.No.l雜交的核酸序列。該核酸序列包含至少I(mǎi)O個(gè)核苷酸，更優(yōu)選多于12、15、30、50個(gè)核苷酸或特別優(yōu)選多于150個(gè)核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交。這種雜交條件描述于例如S雄brook，J.，F(xiàn)ritsch，E.R，Maniatis,T.在MolecularCloning(ALaboratoryManual),第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989,第9.31-9.57頁(yè)或者CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。嚴(yán)格雜交條件具體是指在由50。/。曱酰胺、5xSSC(750mMNaCl、75mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5xDenhardt溶液、10%硫酸葡聚糖及20g/ml已變性、剪切的蛙精DNA組成的溶液中于42。C孵育過(guò)夜，隨后在65。C下用0.1xSSC洗滌濾膜。"功能等效片段"是指具有與起始序列大體相同或更高的特異啟動(dòng)子活性的啟動(dòng)子活性片段的核酸序列。"基本上一致"是指呈現(xiàn)起始序列的特異啟動(dòng)子活性的至少50%、優(yōu)選60%、更優(yōu)選70%、更優(yōu)選80%、更優(yōu)選90%、特別優(yōu)選95%的特異啟動(dòng)子活性。"片段"是指實(shí)施方案A)、B)或C)描述的具有啟動(dòng)子活性的核酸的部分序列。這些片段優(yōu)選具有多于10個(gè)、更優(yōu)選多于12、15、30、50個(gè)或特別優(yōu)選多于150個(gè)核酸序列SEQ.ID.NO.1中的相連核苷酸。特別優(yōu)選使用核酸序列SEQ.ID.NO.l作為啟動(dòng)子，即用于基因的轉(zhuǎn)錄。'Genbank條目AP005283已在未說(shuō)明功能的情況下描述了SEQ.ID.NO.1。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的新的具有啟動(dòng)子活性的核酸序列。具體地，本發(fā)明涉及具有啟動(dòng)子活性的核酸，其包含A)核,列SEQ.ID.NO.1，或B)通過(guò)核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.l衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.1具有至少90%同一性的序列，或C)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.l雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段，其前體條件是排除包含序列SEQ.ID.NO.l的核酸。另外，可以本身已知方式，通過(guò)從核苷酸結(jié)構(gòu)單位進(jìn)行化學(xué)合成來(lái)制備上述具有啟動(dòng)子活性的所有核酸，例如通過(guò)雙螺;旋的單個(gè)重疊互補(bǔ)核酸結(jié)構(gòu)單位的片段縮合。例如，通過(guò)亞磷酰胺方法(Voet,Voet，第2版，WileyPressNewYork,第896-897頁(yè))由已知方式進(jìn)行寡核苷酸的化學(xué)合成。Sambrook等人(1989),Molecularcloning:Alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress中描述了使用DNA聚合酶的Klenow片段和連接反應(yīng)以及通用克隆方法加入合成的寡核苷酸及補(bǔ)平缺口。本發(fā)明進(jìn)一步涉及表達(dá)單元的用途，該表達(dá)單元包含一種具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸及另外功能性連接的核酸序列，該核酸序列確保用以基因表達(dá)的核糖核酸的翻譯。根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)單元是指具有表達(dá)活性的核酸，即以與待表達(dá)核酸功能性連接的方式調(diào)節(jié)表達(dá)的核酸或基因，其中所述表達(dá)即指該核酸或該基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯。就此而言，"以功能性連接"是指，例如一種本發(fā)明的表達(dá)單元與待轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核,列以及適當(dāng)條件下的其他調(diào)節(jié)元件(如終止子)的順序排列，這種方式使得各調(diào)節(jié)元件均可在該核酸序列的轉(zhuǎn)基因表達(dá)中發(fā)揮其功能?；瘜W(xué)意義上的直接連接對(duì)此而言并非絕對(duì)必要。例如增強(qiáng)子序列的遺傳控制序列能夠?qū)^遠(yuǎn)位置，或甚至不同DNA分子的目標(biāo)序列執(zhí)^f亍其功能。優(yōu)選待轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核酸序列位于本發(fā)明的表達(dá)單元序列后(即，在3，末端)的排列，以i更這兩個(gè)序列共價(jià)連接在一起。在這種情況下，表達(dá)單元序列與待轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核^列之間的距離優(yōu)選小于200個(gè)堿基對(duì)，特別優(yōu)選小于100個(gè)堿基對(duì)，進(jìn)一步優(yōu)選小于50個(gè)g對(duì)。根據(jù)本發(fā)明，"表達(dá)活性"是指在特定時(shí)間內(nèi)由表達(dá)單元產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量，即表達(dá)速率。根據(jù)本發(fā)明，"特異表達(dá)活性"是指各表達(dá)單元在特定時(shí)間內(nèi)由表達(dá)單元產(chǎn)生的的蛋白質(zhì)的量。因此，在與野生型相比，基因相關(guān)的"影響表達(dá)活性"或表^J4率的情況下，導(dǎo)致與野生型相比在野生型中不以該方式存在的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。因此，在與野生型相比，基因相關(guān)的"改變的表達(dá)活性"或表iiJi率的情況下，與野生型相比特定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量改變。就此而言，"改變"優(yōu)選指增加或降低。例如，這可通過(guò)增加或降低內(nèi)源表達(dá)單元的特異活性進(jìn)行，例如通過(guò)使該表達(dá)單元突變或通過(guò)刺激或抑制該表達(dá)單元。另外，例如通過(guò)本發(fā)明的表達(dá)單元或具有增加的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)可以實(shí)現(xiàn)增加表達(dá)活性或表達(dá)速率，其中這些基因相對(duì)于這些表達(dá)單元是異源的。通過(guò)本發(fā)明的表達(dá)單元或具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)優(yōu)選是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)將一種或多種適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入孩走生物基因組中，以便在導(dǎo)入的適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元的控制下進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)；或?qū)⒁环N或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元的控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)；或?qū)⒁环N或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元以及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。本發(fā)明的表達(dá)單元包含具有啟動(dòng)子活性的上述本發(fā)明的核酸及另外功能性連接的核酸序列，該核酸序列確保核糖核酸的翻譯。確保核糖核酸翻譯的該核酸序列優(yōu)選包含核酸序列SEQ.ID.NO.42作為核糖體結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)單元包含E)核餅列SEQ.ID.NO,2，或F)通過(guò)核普酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.2衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.2具有至少90%同一性的序列，或G)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.N0.2雜交的核酸序列，或H)E)、F)或G)序列的功能等效片段。核酸序列SEQ.ID.NO.2表示源自谷氨酸棒桿菌的超氧化物歧化酶(Psod)的表達(dá)單元的核酸序列。SEQ.ID.NO.2對(duì)應(yīng)于野生型的表達(dá)單元的序列。本發(fā)明還涉及表達(dá)單元，其包含通過(guò)核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.2衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.2具有至少卯％同一性的序列。通過(guò)來(lái)自數(shù)據(jù)庫(kù)的該核酸序列與上述序列SEQIDNO:2的同一性比較，本發(fā)明的表達(dá)單元的本發(fā)明的其他天然實(shí)例可容易地從例如基因組序列已知的各種生物中發(fā)現(xiàn)。可容易地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的表達(dá)單元的人工序列是通過(guò)人工變異及突變(例如，通過(guò)核苷酸的取代、插入或缺失)來(lái)源于序列SEQIDNO:2。因此，與序列SEQIDNO:2具有至少卯％同一性的核酸序列是指當(dāng)其序列與序列SEQIDNO:2比對(duì)時(shí)顯示至少90%同一性的核酸序列，所述的比對(duì)具體指根據(jù)具有以上參數(shù)設(shè)定的上述程序設(shè)計(jì)的算法。特別優(yōu)選的表達(dá)單元顯示與核酸序列SEQ.ID.NO.2的91%同一性，進(jìn)一步優(yōu)選為92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%同一性，特別優(yōu)選為99%同一性。此外，以本身已知方式，通過(guò)雜交技術(shù)可容易地發(fā)現(xiàn)表達(dá)單元的其他天然實(shí)例來(lái)源于上述核酸序列，尤其是來(lái)源于來(lái)自基因組序列未知的各種生物的序列SEQ.IDNO:2。因此，本發(fā)明的另一方面涉及包含在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.No.2雜交的核酸序列的表達(dá)單元。該核酸序列包含至少10個(gè)核苷酸，更優(yōu)選多于12、15、30、50個(gè)核苷酸或特別優(yōu)選多于150個(gè)核苷酸。"雜交作用"是指在嚴(yán)格條件下多核苷酸或寡核苷酸結(jié)合至實(shí)際互補(bǔ)序列，同時(shí)在這種條件下不進(jìn)行非互補(bǔ)配對(duì)之間的非特異性結(jié)合的能力。就此而言，序列應(yīng)當(dāng)優(yōu)選為90-100%互補(bǔ)。例如，在Northern或Southern印跡技術(shù)或在PCR或RT-PCR引物結(jié)合中使用這種互補(bǔ)序列能夠彼此特異結(jié)合的特性。根據(jù)本發(fā)明，在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交。此種雜交條件描述于例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F"Maniatis，T.在MolecularCloning(ALaboratoryManual),第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989,第9.31-9.57頁(yè)或者CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。嚴(yán)格雜交條件具體是指在由50%甲酰胺、5xSSC(750mMNaCl、75mM杵檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5xDenhardt溶液、10%石危酸葡聚糖及20g/ml已變性、剪切的蛙精DNA組成的溶液中于42。C孵育過(guò)夜，隨后在65。C下用0.1xSSC洗滌濾膜。本發(fā)明的核苷酸序列還可能產(chǎn)生可用于識(shí)別和/或克隆其他細(xì)胞類型及微生物中的同源序列的探針及引物。這類探針及引物通常包含在嚴(yán)格條件下，與本發(fā)明的核酸序列的有義鏈或?qū)?yīng)反義鏈上至少約12個(gè)、優(yōu)選至少約25個(gè)(例如約45、50或75個(gè))連續(xù)核苷酸雜交的核酸序列區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明，包含所謂的沉默突變的核酸序列，或與具體涉及的序列相比，根據(jù)具體起始生物或宿主生物的密碼子選擇進(jìn)行修飾的核酸序列及其天然存在的變體，如其剪接變體或等位變體也包含在本發(fā)明中。"功能等效片段"是指具有與起始序列大體相同或更高的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元片段。"基本上一致"是指呈現(xiàn)起始序列的特異表達(dá)活性的至少50%、優(yōu)選60%、更優(yōu)選70%、更優(yōu)選80%、更優(yōu)選90%、特別優(yōu)選95%的特異表達(dá)活性。"片段"是指實(shí)施方案E)、F)或G)描述的表達(dá)單元的部分序列。這些片段優(yōu)選具有多于10個(gè)、更優(yōu)選多于12、15、30、50個(gè)或特別優(yōu)選多于150個(gè)核酸序列SEQ.ID.NO.l中的相連核苷酸。特別優(yōu)選使用核酸序列SEQ.ID.NO.2作為表達(dá)單元，即用于基因的表達(dá)。Genbank條目AP005283已在未說(shuō)明功能的情況下描述了SEQ.ID.NO.2。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的新的表達(dá)單元。具體地，本發(fā)明涉;M^達(dá)單元，其包含具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸及另外功能性連接的核酸序列，該核酸序列確保核糖核酸的翻譯。本發(fā)明特別優(yōu)選涉及表達(dá)單元，其包含E)核絲列SEQ.ID.N0.2，或F)通過(guò)核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.2衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.2具有至少90%同一性的序列，或G)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.2雜交的核酸序列，H)E)、F)或G)序列的功能等效片段，其前體條件是排除包含序列SEQ.ID.NO.2的核酸。本發(fā)明的表達(dá)單元包含一種或多種以下遺傳元件負(fù)10("-10")序列、負(fù)35("-35")序列、轉(zhuǎn)錄序列起點(diǎn)、增強(qiáng)子區(qū)域及操齓基因區(qū)域。這些遺傳元件優(yōu)選是棒桿菌種特異的，尤其是谷氨酸棒桿菌特異的。另外，可以本身已知方式，通過(guò)從核苷酸結(jié)構(gòu)單位進(jìn)行化學(xué)合成來(lái)制備上述所有表達(dá)單元，例如通過(guò)雙螺旋的單獨(dú)重疊互補(bǔ)核酸結(jié)構(gòu)單位的片段縮合。例如，通過(guò)亞磷酰胺方法(Voet，Voet，第2版，WileyPressNewYork,第896-897頁(yè))由已知方式進(jìn)行寡核苷酸的化學(xué)合成。Sambrook等人(1989),Molecularcloning:Alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress中描述了使用DNA聚合酶的Klenow片段和連接反應(yīng)以及通用克隆方法加入合成的寡核苷酸及補(bǔ)平缺口。本申請(qǐng)中用于本發(fā)明的方法及技術(shù)是熟悉微生物及重組DNA技術(shù)的本領(lǐng)域才支術(shù)人員所知的。用于培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞、將分離的DNA分子插入宿主細(xì)胞中并分離，及分離的核酸分子的克隆及測(cè)序等的方法與技術(shù)為這類技術(shù)與方法的實(shí)例。許多標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)資料描述了這些方法Davis等人，BasicMethodsInMolecularBiology(1986);J.H.Miller,ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork(1972);J.H.Miller,AShortCourseinBacterialGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork(1992);M.Singer與P.Berg，Genes&Genomes,UniversityScienceBooks,MillValley,California(1991);J.Sambrook，E.F.Fritsch與T.Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork(1989);P.B.Kaufmann等人,HandbookofMolecularandCellularMethodsinBiologyandMedicine,CRCPress,BocaRaton,Florida(1995);MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,B.R.Glick與J.E.Thompson編著，CRCPress,BocaRaton，F(xiàn)lorida(1993)及P.RSmi仇國(guó)Keary，MolecularGeneticsofEscherichiacoli，TheGuilfordPress,NewYork,NY(1989)。本發(fā)明所有的核酸分子優(yōu)選為分離的核酸分子的形式。"分離的"核酸分子是分離自存在于該核酸的天然來(lái)源中的其他核酸分子，另外，如果其是由重組技術(shù)制備的，則可基本上不含有其他細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或者如果其是經(jīng)化學(xué)合成的，則可基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物。另夕卜，本發(fā)明包括與具體描述的核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子或其部分。例如，如下所述，本發(fā)明的啟動(dòng)子和/或表達(dá)單元可特別有利地用于通過(guò)下述發(fā)酵來(lái)制備生物合成產(chǎn)物的改進(jìn)方法中。具體地，本發(fā)明的啟動(dòng)子和/或表達(dá)單元的優(yōu)點(diǎn)在于其是通過(guò)應(yīng)激(stress)在微生物中誘導(dǎo)的?？赡芡ㄟ^(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行適當(dāng)控制來(lái)控制該特別用于增加目的基因的轉(zhuǎn)錄/表達(dá)速率的應(yīng)激誘導(dǎo)。具體地，在L-賴氨酸產(chǎn)生中，極早達(dá)到該應(yīng)激階段，以便在這種情況下極早達(dá)到目的基因的增加的轉(zhuǎn)錄/表iiit率。與野生型相比，具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸可用于改變(即提高或降低)或影響微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率。與野生型相比，本發(fā)明的表達(dá)單元可用于改變(即提高或降低)或影響微生物中基因的表達(dá)速率。具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸及本發(fā)明的表達(dá)單元也可用于調(diào)節(jié)及增強(qiáng)微生物中(尤其是在棒桿菌菌種中)例如精細(xì)化學(xué)品、蛋白質(zhì)(尤其為氨基酸)的各種生物合成產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，與野生型相比，本發(fā)明涉及通過(guò)以下方式改變或影響孩1生物中基因轉(zhuǎn)錄速率的方法a)與野生型相比，改變^t生物中具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的內(nèi)源核酸的特異啟動(dòng)子活性，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或b)以具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸，或以具有實(shí)施方案a)所述的改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸來(lái)調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中所述基因與所述具有啟動(dòng)子活性的核酸是異源的。根據(jù)實(shí)施方案a)，與野生型相比，可通過(guò)改變(即增加或降低)微生物中特異啟動(dòng)子的活性來(lái)改變或影響的微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率。例如，這可通過(guò)具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸序列的定向突變(即通過(guò)核苷酸的定向取代、缺失或插入)來(lái)進(jìn)行?？赏ㄟ^(guò)置換RNA聚合酶全酶結(jié)合位點(diǎn)(本領(lǐng)域的技術(shù)人員也稱其為-10區(qū)與-35區(qū))中的核苷酸來(lái)達(dá)到增加或降低啟動(dòng)子的活性。此外，通過(guò)缺失核普酸或插入核苷酸來(lái)縮小或擴(kuò)大所述RNA聚合酶全酶結(jié)合位點(diǎn)彼此之間的距離。另外通過(guò)將調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(本領(lǐng)域的技術(shù)人員也稱其為阻抑蛋白及激活蛋白)的結(jié)合位點(diǎn)(本領(lǐng)域的技術(shù)人員也稱其為操縱基因)插入RNA聚合酶全酶的結(jié)合位點(diǎn)的空間相鄰區(qū)域,使得在結(jié)合至啟動(dòng)子序列后，這些調(diào)節(jié)物減弱或增強(qiáng)RNA聚合酶完全酶的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄活性或使其處于新的調(diào)節(jié)影響下。核酸序列SEQ.ID.NO.44優(yōu)選代表本發(fā)明的表達(dá)單元的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，且序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43代表本發(fā)明的表達(dá)單元的-IO區(qū)。在這些區(qū)域中核酸序列的改變導(dǎo)致特異表達(dá)活性的改變。因此，本發(fā)明涉及核酸序列SEQ.ID.NO.44在表達(dá)單元中作為核糖體結(jié)合位點(diǎn)的用途，所述表達(dá)單元能使基因在棒桿菌屬或短桿菌(Brevibacterium)屬細(xì)菌中表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及核酸序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43在表達(dá)單元中作為-10區(qū)的用途，所述表達(dá)單元能使基因在棒桿菌菌或短桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)。具體地，本發(fā)明涉及能^^因在棒桿菌屬或短桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)的表達(dá)單元，其包含核酸序列SEQ.ID.N0.44。在這種情況下，核酸序列SEQ.ID.NO.44優(yōu)選用作核糖體結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及能使基因在棒桿菌屬或短桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)的表達(dá)單元，其包含核^列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43。在這種情況下，核酸序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43優(yōu)選用作-10區(qū)。就"特異啟動(dòng)子活性，，而言，與野生型相比的增加或降低是指與野生型的具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸相比(即，例如與SEQ.ID.NO.l相比)，特異活性的增加或降低。根據(jù)實(shí)施方案b),微生物中基因轉(zhuǎn)錄速率與野生型相比的改變或影響，可通過(guò)以具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸或以具有根據(jù)實(shí)施方案a)的改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸來(lái)調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)進(jìn)行，其中這些基因與這些具有啟動(dòng)子活性的核酸是異源的。此優(yōu)選通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)bl)將一種或多種具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)^f亍一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或b2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的內(nèi)源核酸控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入的基因的轉(zhuǎn)錄，或b3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸以及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。因此，可能通過(guò)以下方式改變(即提高或降低)野生型內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄速率根據(jù)實(shí)施方案bl)，將一種或多種具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或根據(jù)實(shí)施方案b2),將一種或多種內(nèi)源基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的內(nèi)源核酸控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或根據(jù)實(shí)施方案b3),將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸以及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄內(nèi)源核酸。因此，另外可能通過(guò)以下方式影響與野生型相比的外源基因的轉(zhuǎn)錄速率根據(jù)實(shí)施方案b2)，將一種或多種內(nèi)源基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的內(nèi)源核酸控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入的外源基因的轉(zhuǎn)錄，或根據(jù)實(shí)施方案b3)，將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸以及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄外源核酸。此外，可通過(guò)將基因整合至編碼區(qū)或非編碼區(qū)中來(lái)進(jìn)行如實(shí)施方案b2)的基因插入。優(yōu)選插入至非編碼區(qū)中。此夕卜，可在染色體上或染色體外進(jìn)行如實(shí)施方案b3)的核酸構(gòu)建物的插入。優(yōu)選核酸構(gòu)建物的染色體插入。"染色體"整合是將外源DNA片段插入至宿主細(xì)胞的染色體中。該術(shù)語(yǔ)也用于外源DNA片段與宿主細(xì)胞染色體上適當(dāng)區(qū)域之間的同源重組。在實(shí)施方案b)中，優(yōu)選也使用具有如實(shí)施方案a)的改變的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸。在實(shí)施方案b)中，如實(shí)施方案a)中所述，這些核酸可在微生物中存在或制備，或?qū)⑵湟苑蛛x的形式導(dǎo)入微生物中。"內(nèi)源，，是指已存在于野生型基因組中的遺傳信息，例如基因。"外源"是指不存在于野生型基因組中的遺傳信息，例如基因。與具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"基因"優(yōu)選是指核酸，其包含待轉(zhuǎn)錄的區(qū)域(即，例如調(diào)節(jié)翻譯的區(qū)域)及編碼區(qū)，且適當(dāng)條件下進(jìn)一步包含例如終止子的調(diào)節(jié)元件。如下所述，與本發(fā)明的表達(dá)單元進(jìn)行的表達(dá)調(diào)節(jié)有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"基因"優(yōu)選是指核酸，其包含編碼區(qū)，且適當(dāng)條件下進(jìn)一步包含例如終止子的調(diào)節(jié)元件。"編碼區(qū)"是指編碼蛋白質(zhì)的核^列。相對(duì)于具有啟動(dòng)子活性的核酸M因而言的"異源性"是指所用基因在具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸的調(diào)節(jié)下，在野生型中不轉(zhuǎn)錄，但是產(chǎn)生了在野生型中不存在的新的功能性連接及在野生型中不存在的具啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸與特定基因的功能性組合。相對(duì)于表達(dá)單元及基因而言的"異源性，，是指所用基因在具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的表達(dá)單元的調(diào)節(jié)下，在野生型中不表達(dá)，但是產(chǎn)生了在野生型中不存在的新的功能性連接及在野生型中不存在的本發(fā)明的表達(dá)單元與特定基因的功能性組合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，與野生型相比，本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)以下方式提高或影響4效生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率的方法ah)與野生型相比，增加具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的內(nèi)源核酸在微生物中的特異啟動(dòng)子活性，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或bh)以具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸，或以具有實(shí)施方案a)所述的增加的特異啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中的基因的轉(zhuǎn)錄，其中所述基因相對(duì)于具有啟動(dòng)子活性的核酸而言是異源的。以具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸，或以增加才艮據(jù)實(shí)施方案ah)的具有的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸進(jìn)行的微生物中基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)優(yōu)選是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)bhl)將一種或多種具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸控制下進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或bh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的內(nèi)源核酸控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入的基因的轉(zhuǎn)錄，或bh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸以及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，與野生型相比，本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)以下方式降低;微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率的方法ar)與野生型相比，降低具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的內(nèi)源核酸在微生物中的特異啟動(dòng)子活性，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或br)將具有實(shí)施方案a)所述的降低的特異啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有降低的啟動(dòng)子活性的核酸的控制下進(jìn)行內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄。與野生型相比，本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)以下方式改變或影響微生物中基因表iiit率的方法c)與野生型相比，改變本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性，所迷內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，或d)以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實(shí)施方案c)所述的改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中所述基因相對(duì)于所述表達(dá)單元而言是異源的。根據(jù)實(shí)施方案C)，與野生型相比，可通過(guò)改變(即增加或降低)微生物中的特異表達(dá)活性來(lái)改變或影響微生物中基因的表達(dá)速率。例如，這可通過(guò)具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸序列的定向突變(即，通過(guò)核苷酸的定向取代、缺失或插入)來(lái)進(jìn)行。例如，延長(zhǎng)Shine-Dalgarno序列與翻譯起始密碼子之間的距離通常導(dǎo)致變化，該變化為特異表達(dá)活性的減弱或增強(qiáng)。也可通過(guò)缺失或插入核苷酸來(lái)縮短或延長(zhǎng)Shine-Dalgarno區(qū)(核糖體結(jié)合位點(diǎn))的序列與翻譯起始密碼子之間的距離，從而實(shí)現(xiàn)特異表達(dá)活性的改變。但是，還可通過(guò)使其與互補(bǔ)的3，端16SrRNA的同源性增強(qiáng)或減弱方式改變Shine-Dalgarno區(qū)的序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。就"特異表達(dá)活性"而言，與野生型相比的增加或降低是指與野生型的本發(fā)明的表達(dá)單元相比(即，例如與SEQ.ID.N0.2相比)，特異活性的增加或降低。根據(jù)實(shí)施方案d)，可通過(guò)本發(fā)明的表達(dá)單元，或具有根據(jù)實(shí)施方案c)的改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，從而改變或影響微生物中與野生型相比的基因的表達(dá)速率，其中這些基因相對(duì)于這些表達(dá)單元而言是異源的。該優(yōu)選通過(guò)以下方式達(dá)到dl)將一種或多種適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物的基因組中，以便在導(dǎo)入的表達(dá)單元控制下進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或d2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锏幕蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元的控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入的基因的表達(dá)，或d3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元以及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。因此，可能通過(guò)以下方式改變(提高或降低)野生型內(nèi)源基因的表達(dá)速率根據(jù)實(shí)施方案dl)，將一種或多種適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物的基因組中，以便在導(dǎo)入的表達(dá)單元控制下進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或根據(jù)實(shí)施方案d2)，將一種或多種基因?qū)胛⑸锏幕蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元的控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入的基因的表達(dá)，或根據(jù)實(shí)施方案d3)，將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元以及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。因此，另外可能通過(guò)以下方式影響與野生型相比的內(nèi)源基因的表達(dá)速率根據(jù)實(shí)施方案d2)，將一種或多種基因?qū)胛⑸锏幕蚪M中，以便在行一種或多種導(dǎo)入的基因的表達(dá)，或根據(jù)實(shí)施方案d3)，將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元以及功能性連接的一種或多種待表達(dá)外源核酸。此外，可通過(guò)將基因整合至編碼區(qū)或非編碼區(qū)中來(lái)進(jìn)行根據(jù)實(shí)施方案d2)的基因插入。優(yōu)選插入至非編碼區(qū)中。此夕卜，可在染色體上或染色體外進(jìn)行如實(shí)施方案d3)的核酸構(gòu)建物的插入。優(yōu)選核酸構(gòu)建物的染色體插入。在下文中，核酸構(gòu)建物也稱作表達(dá)盒。在實(shí)施方案d)中，優(yōu)選也使用具有根據(jù)實(shí)施方案c)的改變的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元。在實(shí)施方案d)中，如實(shí)施方案c)中所述，這些表達(dá)單元可在^:生物中存在或制備，或以分離的形式導(dǎo)入微生物中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，與野生型相比，本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)以下方式提高或影響微生物中基因表達(dá)速率的方法ch)與野生型相比，增加本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元在孩i生物中的特異表達(dá)活性，所述表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh)以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實(shí)施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元來(lái)調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中所述基因相對(duì)于所述表達(dá)單元而言是異源的。以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實(shí)施方案c)所述的增加的特異表達(dá)活dhl)將一種或多種適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的，適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元控制下進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或dh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元以及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。與野生型相比，本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)以下方式降低微生物中基因表達(dá)速率的方法cr)與野生型相比，降低本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性，所述內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，或dr)將實(shí)施方案cr)所述的具有降低的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有降低的表達(dá)活性的表達(dá)單元的控制下進(jìn)行內(nèi)源基因的表達(dá)。在用于改變或影響微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率和/或表達(dá)速率的上述本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這些基因選自編碼來(lái)自精細(xì)化學(xué)品的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸，其中這些基因任選包含其他調(diào)節(jié)元件。在用于改變或影響微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率和/或表達(dá)速率的上述本發(fā)明方法的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些基因選自核酸編碼來(lái)自蛋白型與非生蛋白氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自核苷酸與核苷的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自有機(jī)酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自二醇的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自糖類的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自維生素的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自輔因子的酸，其中這些基因任選包含其他調(diào)節(jié)元件。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，來(lái)自氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二^Jt羧酶、二氫吡咬二羧酸(dihydrodipicolinate)合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysRl、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2、蘋(píng)果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶、胱硫醚Y合酶、胱硫醚P裂合酶、絲氨酸羥曱基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氬解酶(O-acetylhomoserinesulfhydrylase)、亞甲基四氬葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶、蘇氨酸輸出子載體(exportercarrier)、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出子、生物素連接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶亞基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、RXA00655調(diào)節(jié)物、RXN2910調(diào)節(jié)物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸排出蛋白(effluxprotein)、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、果糖-l，6-二磷酸酶、石危酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248、」琉酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247、蛋白質(zhì)OpcA、1-磷!及6-磷薛優(yōu)選的蛋白質(zhì)及編碼源自氨基酸生物合成途徑的上述這些蛋白質(zhì)的優(yōu)選蛋白質(zhì)的核酸分別為微生物來(lái)源的蛋白質(zhì)序列及核酸序列，優(yōu)選源自棒桿菌屬或短桿菌屬細(xì)菌，優(yōu)選源自棒桿菌，特別優(yōu)選源自谷氨酸棒桿菌。這些蛋白質(zhì)的相應(yīng)核酸序列的實(shí)例、其參考文獻(xiàn)及其在參考文獻(xiàn)中的編號(hào)列于表l中<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>l-磷酸果糖激酶2pfk2WO0100844DNA:57蛋白質(zhì)586-磷酸果糖激酶l6誦pfklEP1108790DNA:1383蛋白質(zhì)48836-磷酸果糖激酶26畫(huà)pfk2DE10112992DNA:1蛋白質(zhì)2果糖-l，6-二磷酸酶lfbrlEP1108790DNA:1136蛋白質(zhì)4636丙酮酸氧化酶poxBWO0100844DNA:85蛋白質(zhì)86RXA00655調(diào)節(jié)物RXA655US2003162267.2DNA:1蛋白質(zhì)2RXN02910調(diào)節(jié)物RXN2910US2003162267.2DNA:5蛋白質(zhì)66-磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶RXA2735WO0100844DNA:1蛋白質(zhì)2特別優(yōu)選的來(lái)自氨基酸生物合成途徑的蛋白質(zhì)序列及編碼該蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的核酸序列的其他實(shí)例為果糖-l，6-二磷酸酶2(也稱作fbr2)的序列(SEQ.ID.NO.41)及對(duì)應(yīng)的編碼果糖-l，6-二磷酸酶2(SEQ.ID.NO.40)的核,列。特別優(yōu)選的來(lái)自氨基酸生物合成途徑的蛋白質(zhì)序列及編碼該蛋白質(zhì)的對(duì)應(yīng)核酸序列的其他實(shí)例為硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)(也稱作RXA077)的序列(SEQ.ID.NO.4)及對(duì)應(yīng)的編碼硫酸鹽還原作用中的蛋白質(zhì)的核酸序列(SEQ.ID.NO.3)。均具有該蛋白質(zhì)在表1中所示的氨基^列，其中表2/第2列中所示的每個(gè)蛋白質(zhì)的氨基酸序列的氨基酸位置中的至少一個(gè)上具有與表2/第3列同一行中所示的各M酸不同的生蛋白M酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表2/第2列中所示的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的氨基酸位置中的至少一個(gè)上具有表2/第4列同一行中所示的氨基酸。表2中所示的蛋白質(zhì)是氨基酸生物合成途徑的突變蛋白，其具有特別有益的特性并因此特別適合通過(guò)本發(fā)明的啟動(dòng)子表達(dá)對(duì)應(yīng)的核酸，并產(chǎn)生氨基酸。例如，T311I突變導(dǎo)致ask的反饋抑制-故中止。編碼表2中的上述突變蛋白的對(duì)應(yīng)核酸可以通過(guò)常規(guī)方法制備。用于制備編碼突變蛋白的核酸序列的適合出發(fā)點(diǎn)是，例如以保藏號(hào)ATCC13032獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的谷氨酸棒桿菌菌林的基因組，或表l中提及的核,列。為了將突變蛋白的氨基,列逆翻譯成編碼這些蛋白質(zhì)的核酸序列，最好使用該核酸序列將被導(dǎo)入的生物的密碼子選擇，或該核酸序列存在于其中的生物的密碼子選擇。例如，就谷氨酸棒桿菌而言，最好使用谷氨酸棒桿菌的密碼子選擇?？梢员旧硪阎姆绞綇臄?shù)據(jù)庫(kù)或?qū)＠暾?qǐng)中確定具體生物的密碼子選擇，所述專利申請(qǐng)描述了目的生物中的至少一種蛋白質(zhì)及一種編碼這種蛋白質(zhì)的基因。以如下方式理解表2中的信息第l列"符號(hào)"中指明與表l有關(guān)的各序列的明確名稱。第2列"AA位置"中，各數(shù)字是指來(lái)自表1的對(duì)應(yīng)多肽序列的M酸位置。因此，"AA位置"列中"26"是指對(duì)應(yīng)的所示多肽序列的氛基酸的第26位。位置的編號(hào)是由N末端+1起始。第3列"AA野生型"中各個(gè)字母表示表l中相應(yīng)野生型菌林序列上在第2列所示位置上的氨基酸，其以單字母代碼表示。第4列"AA突變型"中各字母表示對(duì)應(yīng)突變型菌林中第2列中所示位置上的氨基酸，其以單字母代碼表示。第5列"功能"中指明對(duì)應(yīng)多肽序列的生理功能。就具有特定功能(第5列)及特定起始M酸序列(表l)的突變蛋白而言，笫2、3及4列描述了至少一個(gè)突變及某些序列的多個(gè)突變。該多個(gè)突變始終是指在各情況下最接近的上述起始氨基酸序列(表l)。術(shù)語(yǔ)特定氨基酸序列的"M酸位置中的至少一個(gè)"優(yōu)選是指該M酸序列在第2、3及4列中所述的至少一個(gè)突變。生蛋白氨基酸的單字母代碼:A丙氨酸C半胱氨酸D天冬氨酸E谷氨酸F苯丙氨酸G甘氨酸H組氨酸I異亮氨酸K賴氨酸亮氨酸M曱硫氨酸N天冬酰胺P脯氨酸Q谷氨酰胺R精氨酸S絲氨酸T蘇氨酸V纈氨酸W色氨酸Y酪氨酸表2<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>在用于改變或影響微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率和/或表達(dá)速率的上述本法及用于產(chǎn)生生物合成產(chǎn)物的下述方法中，優(yōu)選以SacB方法將具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸、本發(fā)明的表達(dá)單元、上述基因及上述核酸構(gòu)建物或表達(dá)盒導(dǎo)入微生物中，具體地，將它們導(dǎo)入棒桿菌中。SacB方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知道的，且描述于，例如SchSferA，TauchA，JSgerW，KalinowskiJ,ThierbachGPtihlerA.;Smallmobilizablemulti-purposecloningvectorsderivedfromtheEscherichiacoliplasmidspK18andpK19:selectionofdefineddeletionsinthechromosomeofCorynebacteriumglutamicum,Gene.1994年7月22日；145(1):69-73及BlomfieldIC，VaughnV，RestRF，EisensteinBI.;AllelicexchangeinEscherichiacoliusingtheBacillussubtilissacBgeneandatemperature-sensitivepSC101replicon;MolMicrobiol.1991年6月；5(6):1447-57中。在上述本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)將具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物中來(lái)改變或影響微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率和/或表ilii率。在上述本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)將上述核酸構(gòu)建物或表達(dá)盒導(dǎo)入微生物中來(lái)改變或影響微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率和/或表達(dá)速率。因此，本發(fā)明也涉及表達(dá)盒，其包含至少一種本發(fā)明的表達(dá)單元，至少一種其他待表達(dá)核酸序列，即待表達(dá)基因，及適當(dāng)條件下的其他遺傳控制元件，例如終止子。其中至少一種表達(dá)單元與其他待表達(dá)核酸序列功能性連接在一起，且所述的其他待表達(dá)核酸序列相對(duì)于該表達(dá)單元而言是異源的。待表達(dá)核酸序列優(yōu)選為編碼來(lái)自精細(xì)化學(xué)品生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸中的至少一種。待表達(dá)核^列特別優(yōu)選選自編碼來(lái)自蛋白型與非生蛋白g酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自核苷酸與核香的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自有機(jī)酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自二醇的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自糖類的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自維生素的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自輔因子的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸及編碼來(lái)自酶的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸。來(lái)自氨基酸的生物合成途徑的優(yōu)選蛋白質(zhì)描述如上，且其實(shí)例描述于表1與2中。選擇本發(fā)明的表達(dá)盒中表達(dá)單元相對(duì)于待表達(dá)基因的物理位置，以便表達(dá)單元調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，并優(yōu)選也調(diào)節(jié)待表達(dá)基因的翻譯，且因此能夠產(chǎn)生一種或多種蛋白質(zhì)。就此而言，"能夠產(chǎn)生"包括產(chǎn)生過(guò)程中的組成型增加、在特定條件下產(chǎn)生的減少或阻斷和/或在特定條件下產(chǎn)生的增加。就此而言，"條件，，包含(l)向培養(yǎng)基中添加組分，(2)從培養(yǎng)基移除組分，(3)以另一種成份置換培養(yǎng)基中的一種組分，(4)提高培養(yǎng)基的溫度，(5)降低培養(yǎng)基的溫度及(6)調(diào)節(jié)大氣條件，例如，培養(yǎng)基所處的氧或氮濃度。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含上述本發(fā)明的表達(dá)盒的表達(dá)載體。載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知且可在"CloningVectors"(PouwelsP.H.等人，編者，Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)中發(fā)現(xiàn)。除質(zhì)粒以外，載體也指本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的所有其他載體，例如噬菌體、轉(zhuǎn)座子、IS元件、噬粒、粘粒及線性或環(huán)狀DNA。這些載體可在宿主生物中自主復(fù)制或進(jìn)行染色體復(fù)制。適合且特別優(yōu)選的質(zhì)粒為那些在棒桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒。例如pZl(Menkel等人，AppliedandEnvironmentalMicrobiology(1989)64:549-554)、pEKExl(Eikmanns等人，Gene102:93-98(1991))或pHS2畫(huà)l(Soimen等人，Gene107:69-74(1991))的眾多已知質(zhì)粒載體基于隱蔽性質(zhì)粒pHM1519、pBLl或pGAl?？捎孟嗤绞绞褂闷渌|(zhì)粒載體，例如pCLiK5MCS或那些基于pCG4(US-A4，489，160)或pNG2(Serwold-Davis等人，F(xiàn)EMSMicrobiologyLetters66，119-124(1990))或pAGl(US-A5，158，891)的質(zhì)粒載體。借助于染色體整合的基因擴(kuò)增方法的那些質(zhì)粒載體也同樣適合用于復(fù)制及擴(kuò)增hom-thrB操縱子，所述質(zhì)粒載體，例如Reinscheid等人(AppliedandEnvironmentalMicrobiology60，126-132(1994))所述。在該方法中，完整基因克隆至質(zhì)粒載體中，該質(zhì)粒載體能在宿主(通常為大腸桿菌(E.coli))中復(fù)制而不能在谷氨酸棒桿菌中復(fù)制。合適載體的實(shí)例為pSUP301(Sirnon等人，Bio/Technology1,784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(Schafer等人，Gene145,69-73(1994)，Bernard等人,JournalofMolecularBiology,234:534-541(1993))、pEMl(Schrumpf等人，1991，JournalofBacteriology173:4510-4516)或pBGS8(Spratt等人，1986，Gene41:337-342)。隨后通過(guò)轉(zhuǎn)化，將包含待擴(kuò)增基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入目的谷氨酸棒桿菌菌林中。用于轉(zhuǎn)化的方法是，例如Thierbach等人(AppliedMicrobiologyandBiotechnology29,356-362(1988》、Dunican與Shivnan(Biotechnology7，1067-1070(1989))及Tauch等人(FEMSMicrobiologicalLetters123，343-347(1994))中描述的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉4因修飾微生物，其中該基因修飾作用導(dǎo)致與野生型相比，改變或影響至少一種基因的轉(zhuǎn)錄速率，且其取決于a)改變至少一種第1項(xiàng)所述的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源核酸在^:生物中的特異啟動(dòng)子活性，該內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)至少一種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或b)以第l項(xiàng)所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸，或以具有實(shí)施方案a)所迷的改變的特異啟動(dòng)子活性的第l項(xiàng)所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)孩i生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中這些基因相對(duì)于這些具有啟動(dòng)子活性的核酸而言是異源的。就上述方法而言，以第l項(xiàng)所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸，或以具有實(shí)施方案a)所述的改變的特異啟動(dòng)子活性的第l項(xiàng)所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸進(jìn)行的微生物中基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)bl)將一種或多種第l項(xiàng)所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的第l項(xiàng)所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸的控制下進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或b2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在第l項(xiàng)所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的內(nèi)源核酸的控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄，或b3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含第1項(xiàng)所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)^H牛下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及與野生型相比，具有至少一種基因的轉(zhuǎn)錄速率已提高或影響的基因修飾微生物，其中ah)與野生型相比，第l項(xiàng)所述的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源核酸在微生物中的特異啟動(dòng)子活性是增加的，這些內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄，或bh)以第l項(xiàng)所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸，或以具有實(shí)施方案ah)所述的增加的特異啟動(dòng)子活性的核酸調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中這些基因相對(duì)于這些具有啟動(dòng)子活性的核酸而言是異源的。就上述方法而言，以第l項(xiàng)所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸，或以具有實(shí)施方案a)所述的增加的特異啟動(dòng)子活性的第l項(xiàng)所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸進(jìn)行的微生物中基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)bhl)將一種或多種第l項(xiàng)所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動(dòng)子活性的核酸的控制下進(jìn)^f亍一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或bh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在第l項(xiàng)所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動(dòng)子活性的內(nèi)源核酸的控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄，或bh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含第l項(xiàng)所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動(dòng)子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及與野生型相比，具有至少一種基因的轉(zhuǎn)錄速率已降低的基因修飾微生物，其中ar)與野生型相比，至少一種第l項(xiàng)所述的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源核酸在孩t生物中的特異啟動(dòng)子活性是降低的，該內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)至少一種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或br)將一種或多種實(shí)施方案a)所迷的具有已降低的啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入樣先生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有已降低的啟動(dòng)子活性的核酸的控制下進(jìn)行至少一種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明進(jìn)一步涉M因修飾微生物，其中該基因修飾導(dǎo)致與野生型相比，改變或影響至少一種基因的表達(dá)速率，且其取決于c)與野生型相比，改變至少一種第2或3項(xiàng)所述的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性，該內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)至少一種內(nèi)源基因的表達(dá)，或d)以第2或3項(xiàng)所述的表達(dá)單元，或以具有實(shí)施方案a)所述的改變的特異表達(dá)活性的第2或3項(xiàng)所迷的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中這些基因相對(duì)于這些表達(dá)單元而言是異源的。就上述方法而言，以第2或3項(xiàng)所述的表達(dá)單元，或以如實(shí)施方案a)的具有改變的特異表達(dá)活性的第2或3項(xiàng)所述的表達(dá)單元進(jìn)行的微生物中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)dl)將一種或多種適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的第2或3項(xiàng)所述的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的第2或3項(xiàng)所述的表達(dá)單元的控制下進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或d2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的第2或3項(xiàng)所述的內(nèi)源表達(dá)單元控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或d3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的第2或3項(xiàng)所述的表達(dá)單元及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及與野生型相比，具有至少一種基因的表達(dá)速率已提高或受影響的基因修飾微生物，其中ch)與野生型相比，至少一種第2或3項(xiàng)所述的內(nèi)源表達(dá)單元在孩史生物中的特異表達(dá)活性是增加的，該內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)，或dh)以第2或3項(xiàng)所述的表達(dá)單元，或以具有實(shí)施方案a)所迷的增加的特異表達(dá)活性的第2或3項(xiàng)所述的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中這些基因相對(duì)于這些表達(dá)單元而言是異源的。就上述方法而言，以第2或3項(xiàng)所述的表達(dá)單元，或以具有實(shí)施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的第2或3項(xiàng)所述的表達(dá)單元進(jìn)行的微生物中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)dhl)將一種或多種適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的第2或3項(xiàng)所述的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的第2或3項(xiàng)所述的表達(dá)單元控制下進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的第2或3項(xiàng)所述的內(nèi)源表達(dá)單元的控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或dh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的第2或3項(xiàng)所述的表達(dá)單元及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。本發(fā)明進(jìn)一步涉及與野生型相比，具有至少一種基因的表達(dá)速率已降低的基因修飾微生物，其中cr)與野生型相比，至少一種第2或3項(xiàng)所述的內(nèi)源表達(dá)單元在^:生物中的特異表達(dá)活性是降低的，該內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)至少一種內(nèi)源基因的表達(dá)，或dr)將一種或多種具有已降低的表達(dá)活性的第2或3項(xiàng)所述的表達(dá)單元導(dǎo)入孩i生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有已降低的表達(dá)活性的第2或3項(xiàng)所述的表達(dá)單元的控制下進(jìn)行至少一種內(nèi)源基因的表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及基因修飾微生物，其包含第2或3項(xiàng)所述的表達(dá)單元及功能性連接的待表達(dá)基因，其中該基因相對(duì)于表達(dá)單元而言是異源的。該基因修飾孩史生物特別優(yōu)選包含本發(fā)明的表達(dá)盒。本發(fā)明特別優(yōu)選涉及包含載體的基因修飾微生物，具體地是包含載體的棒桿菌，所述載體具體地是穿梭載體或質(zhì)粒載體，該載體錨定至少一種如本發(fā)明所定義的重組核酸構(gòu)建物。在基因修飾孩t生物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述基因?yàn)榫幋a來(lái)自精細(xì)化學(xué)品的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸中的至少一種。在基因修飾;微生物的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述基因選自編碼來(lái)自蛋白型與非生蛋白氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自核苷酸與核苷的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自有機(jī)酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自二醇的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自糖類的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自維生素的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼的蛋白質(zhì)的核酸，其中這些基因可任選包含其他調(diào)節(jié)元件。來(lái)自氨基酸的生物合成途徑的優(yōu)選蛋白質(zhì)選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二H^庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡咬二羧酸還原酶、甘油搭-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysRl、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2、蘋(píng)果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶、胱硫醚Y合酶、胱硫醚P裂合酶、絲氨酸羥曱基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶、蘇氨酸輸出子載體、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出子、生物素連接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶亞基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氬酶、RXA00655調(diào)節(jié)物、RXN2910調(diào)節(jié)物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸排出蛋白、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、果糖-l，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247、蛋表i;M^2中。優(yōu)選的微生物或基因修飾微生物為細(xì)菌、藻類、真菌或酵母菌。具體地，特別優(yōu)選的微生物為棒桿菌。優(yōu)選的棒桿菌為棒桿菌屬細(xì)菌，尤其為谷氨酸棒桿菌菌種、乙酰谷氨酸棒扦菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)菌種、嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)菌種、熱產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterhimthermoaminogenes)菌種、棲糖蜜棒桿菌(Corynebacteriummelassecola)菌種及有效棒桿菌(Corynebacteriumefficiens)菌種；或短桿菌屬細(xì)菌，尤其為黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)菌種、乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)菌種及叉開(kāi)短桿菌(Brevibacteriumdivaricatum)菌種。特別優(yōu)選的棒桿菌屬與短桿菌屬細(xì)菌選自谷氨酸棒桿菌ATCC13032、乙酰谷氨酸棒桿菌ATCC15806、嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870、熱產(chǎn)氨棒桿菌FERMBP-1539、棲糖蜜棒桿菌ATCC17965、有效棒桿菌DSM44547、有效棒桿菌DSM44548、有效棒桿菌DSM44549、黃色短桿菌ATCC14067、乳糖發(fā)酵短桿菌ATCC13869、叉開(kāi)短桿菌ATCC14020、谷氨酸棒桿菌KFCC10065及谷氨酸棒桿菌ATCC21608?？s寫(xiě)KFCC是指韓國(guó)聯(lián)邦菌物保藏中心(KoreanFederationofCultureCollection)，縮寫(xiě)ATCC是指美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心及縮寫(xiě)DSM是指德國(guó)微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikrorganismen)。其他特別優(yōu)選的棒桿菌屬與短桿菌屬細(xì)菌列于表3中:<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>這些縮寫(xiě)具有以下含義ATCC:美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD，美國(guó)FERM:發(fā)酵研究所，Chiba，曰本NRRL:ARS保藏中心，北方農(nóng)業(yè)研究所(NorthernRegionalResearchLaboratory)，Peoria,IL，美國(guó)CECT:西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(ColeccionEspanoladeCultivosTipo)，Valencia,西班牙NCIMB:國(guó)立工業(yè)和海洋微生物保藏有卩艮公司，Aberdeen,英國(guó)CBS:真菌菌種保藏中心(CentraalbureauvoorSchimmelcultures)，Baarn，荷蘭NCTC:國(guó)立典型培養(yǎng)物保藏中心，London,英國(guó)DSMZ:德國(guó)微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen)，Braunschweig,德國(guó)。通過(guò)具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸及本發(fā)明的表達(dá)單元，可能借助產(chǎn)物的代謝路徑?；诖四康?，例如通過(guò)影響或提高某生物合成途徑的基因轉(zhuǎn)錄速率或表達(dá)速率來(lái)增強(qiáng)產(chǎn)生特定生物合成產(chǎn)物的這個(gè)代謝路徑，其中增加的蛋白質(zhì)的量導(dǎo)致目的生物合成途徑的這些蛋白質(zhì)的總活性增加，且因此導(dǎo)致通向目的生物合成產(chǎn)物的代謝通量增加。此外，可通過(guò)降低某分支生物合成途徑的基因轉(zhuǎn)錄速率或表達(dá)速率來(lái)減弱從特定生物合成產(chǎn)物分支的代謝路徑，其中降低的蛋白質(zhì)的量導(dǎo)致非目的生物合成途徑的那些蛋白質(zhì)的總活性降低，且因此額外導(dǎo)致通向目的生物合成產(chǎn)物的增加。本發(fā)明基因修飾微生物能夠產(chǎn)生，例如來(lái)自葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素的生物合成產(chǎn)物或來(lái)自甘油與乙醇的生物合成產(chǎn)物。因此，本發(fā)明涉及通過(guò)培育本發(fā)明的基因修飾微生物來(lái)產(chǎn)生生物合成產(chǎn)物的方法?；谀康纳锖铣僧a(chǎn)物，必須提高或降低多種基因的轉(zhuǎn)錄速率或表達(dá)速率。通常，最好改變多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄速率或表iiit率，即，提高基因組合的轉(zhuǎn)錄速率或表達(dá)速率和/或降低基因組合的轉(zhuǎn)錄速率或表達(dá)速率。在本發(fā)明的基因修飾微生物中，至少一種基因的改變的(即提高的或降低的)轉(zhuǎn)錄速率或表達(dá)速率是歸因于具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的表達(dá)單元。另夕卜，基因修飾微生物中其他基因的額外改變的(即額外提高的或額外降低的)轉(zhuǎn)錄速率或表達(dá)速率可(但不是必需)來(lái)自具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸或本發(fā)明的表達(dá)單元。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)培育本發(fā)明的基因修飾微生物來(lái)產(chǎn)生生物合成產(chǎn)物的方法。優(yōu)選的生物合成產(chǎn)物為精細(xì)化學(xué)品。術(shù)語(yǔ)"精細(xì)化學(xué)品"為本領(lǐng)域所知并且包括由生物產(chǎn)生且用于多種工業(yè)領(lǐng)域中的化合物，所述工業(yè)領(lǐng)域例如(但不限于)醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、化妝品業(yè)、食品業(yè)及祠料業(yè)。這些化合物包括例如酒石酸、衣康酸及二氨基庚二酸的有機(jī)酸及蛋白型與非生蛋白氨基酸、嘌呤堿與嘧咬堿、核普與核普酸(例如,Kuninaka，A.(1996)在Nucleotidesandrelatedcompounds,第561誦612頁(yè)，Biotechnology第6巻，Rehm等人，編者，VCH:Weinheim中及其中所出現(xiàn)的參考文獻(xiàn)中所述的)、類脂類、飽和與不飽和脂肪酸(例如花生四烯酸)、二醇(例如丙二醇及丁二醇)、糖類(例如透明質(zhì)酸及海藻糖)、芳香化合物(例如芳香胺、香草醛及龍藍(lán))、維生素與輔因子(如Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,第A27巻，"Vitamins",第443-613頁(yè)(1996)VCH:Weinheim及其中所出現(xiàn)的參考文獻(xiàn)中及Ong，A.S.，Niki，E.^SjPacker，L.(1995)"Nutrition,Lipids,HealthandDisease"ProceedingsinMalaysiaandtheSocietyforFreeRadicalResearch-Asia,1994年9月1-3日于馬來(lái)西亞檳城舉行，AOCSPress(1995)中所述的)、由Gutcho(1983)在ChemicalsbyFermentation,NoyesDataCorporation,ISBN:0818805086及其中所述的參考文獻(xiàn)中所述的酶及所有其他化學(xué)品，某些精細(xì)化學(xué)品的代謝及用途進(jìn)一步解釋如下。I.氨基酸的代謝及用途氛基酸包含所有蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位且因此是正常細(xì)胞功能所必需的。術(shù)語(yǔ)"M酸"在本領(lǐng)域中是已知的。作為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單位的生蛋白M酸有20種，其中它們通過(guò)肽鍵連接在一起，而非生蛋白氛基酸(其中數(shù)百種是已知的)通常不在蛋白質(zhì)中出現(xiàn)(參閱Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,第A2巻，第57-97頁(yè)VCH:Weinheim(1985))。雖然L-氨基酸通常是天然存在的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的僅有類型，但是氨基酸可以是D或L型。20種生蛋白氨基酸中每一種的生物合成和降解途徑已經(jīng)在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中進(jìn)行了很好表征(例如參閱Stryer,L.Biochemistry,第三版，笫578-590頁(yè)(1988))。由于其生物合成的復(fù)雜性，因此所謂的"必需"氨基酸(組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸及纈氨酸)必須由飲食攝取，它們通過(guò)簡(jiǎn)單生物合成途徑轉(zhuǎn)化為其他ll種"非必需，，氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸及酪氨酸)。高等動(dòng)物具有合成這些氨基酸中的一些氨基酸的能力，然而必需氨基酸必須與食物一起攝入來(lái)進(jìn)行正常的蛋白質(zhì)合成。除了它們?cè)诘鞍踪|(zhì)生物合成中的作用以外，這些氨基酸本身是令人感興趣的化合物，且已發(fā)現(xiàn)它們?cè)谑称?、飼料、化學(xué)品、化妝品、農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥業(yè)中的多種用途。賴氨酸不僅是人類營(yíng)養(yǎng)的重要氨基酸，也是例如家禽及豬的單胃物種的重要氨基酸。谷氨酸最常用作調(diào)味添加劑(谷氨酸單鈉，MSG)并且廣泛用于食品業(yè)，天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸及半胱氨酸同樣如此。甘氨酸、L-甲硫氨酸及色氨酸皆用于醫(yī)藥業(yè)中。谷氨酰胺、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸、絲氨酸及丙氨酸用于醫(yī)藥業(yè)及化妝品工業(yè)中。蘇氨酸、色氨酸及D/L-甲硫氨酸廣泛用作飼料添加劑(Leuchtenberger,W.(1996)Aminoacids國(guó)technicalproductionanduse,第466-502頁(yè)，Rehm等人，(編者)Biotechnology第6巻，第14a章，VCH:Weinheim)。已發(fā)現(xiàn)這些氨基酸也適用于作為合成以下合成氨基酸及蛋白質(zhì)的前體例如，N-乙酰半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羥色氨酸及Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,第A2巻，第57-97頁(yè)，VCH，Weinheim，1985中所述的其他物質(zhì)。已經(jīng)很好地表征了這些天然氛基酸在能夠產(chǎn)生它們的生物(例如細(xì)菌)中的生物合成(回顧細(xì)菌氨基酸的生物合成及其調(diào)節(jié)，參閱Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47:533-606)。通過(guò)a-酮戊二酸(檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物)的還原性胺化作用合成谷氨酸。由谷氨酸相繼分別產(chǎn)生谷氨酰胺、脯氨酸及精氨酸。絲氨酸的生物合成是由一個(gè)3個(gè)步驟的方法進(jìn)行，起始于3-磷酸甘油酸(糖酵解的中間產(chǎn)物)，且在氧化、轉(zhuǎn)M及水解步驟之后得到該氨基酸。由絲氨酸分別產(chǎn)生半胱氨酸及甘氨酸，前者通過(guò)高胱氨酸與絲氨酸的縮合得到，且后者通過(guò)在由絲氨酸轉(zhuǎn)羥甲基酶催化的反應(yīng)中將側(cè)鏈P-碳原子轉(zhuǎn)移至四氫葉酸得到。苯丙氨酸及酪氨酸是在9個(gè)步驟的生物合成途徑中，由糖酵解及戊糖磷酸途徑的前體(赤蘚糖4-磷酸及磷酸烯醇丙酮酸)合成，兩者僅在預(yù)苯酸合成后的最后兩個(gè)步驟不同。色氨酸同樣是由這兩種起始分子產(chǎn)生，然而其合成在ll個(gè)步驟的途徑中進(jìn)行。也可在由苯丙氨酸羥化酶催化的反應(yīng)反應(yīng)中，由苯丙氨酸產(chǎn)生酪氨酸。丙氨酸、纈氨酸及亮氨酸分別為丙酮酸(糖酵解的最終產(chǎn)物)的生物合成產(chǎn)物。天冬氨酸由草酰乙酸(檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物)形成。通過(guò)天冬氨酸的轉(zhuǎn)化分別產(chǎn)生天冬酰胺、甲硫氨酸、蘇氨酸及賴氨酸。異亮氨酸由蘇氨酸形成。組氨酸在復(fù)雜的9個(gè)步驟的途徑中由5-磷酸核糖l-焦磷酸(活化糖)形成。超過(guò)細(xì)胞中蛋白質(zhì)生物合成所需量的氨基酸無(wú)法被儲(chǔ)存，而是被分解，以便提供細(xì)胞的主要代謝路徑的中間產(chǎn)物(回顧，參閱Stryer，L.，Biochemistry,第三版，第21章，"AminoAcidDegradationandtheUreaCycle";第495-516頁(yè)(1988))。雖然細(xì)胞能夠?qū)⒉恍枰陌被徂D(zhuǎn)化為有用的代謝中間產(chǎn)物，然而就其合成所需的能量、前體分子及酶而言，氨基酸產(chǎn)生作用成^M艮高。因此，通過(guò)反饋抑制調(diào)節(jié)氛基酸的生物合成并不令人驚訝，其中具體氛基酸的出現(xiàn)減慢或完全終止其自身的產(chǎn)生(回顧氨基酸生物合成途徑中的反饋機(jī)制，參閱Stryer，L.，Biochemistry,第三版，第24章，"BiosynthesisofAminoAcidsandHeme",第575-600頁(yè)(1988》。因此，具體氨基酸的產(chǎn)量受細(xì)胞中該氨基酸量的限制。II.維生素、輔因子及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品(Nutraceutical)的代謝及用途維生素、輔因子及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品包含另一類分子。雖然它們易于由其他生物(如細(xì)菌)合成，高等動(dòng)物已喪失了合成它們的能力，因此需要攝取它們。這些分子本身為生物活性分子或在眾種代謝路徑中作為電子載體或中間產(chǎn)物的生物活性物質(zhì)的前體。除了其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，這些化合物還具有作為著色劑、抗氧^f匕劑及催化劑或其他加工助劑的明顯工業(yè)價(jià)值。(回顧這些化合物的結(jié)構(gòu)、活性及工業(yè)應(yīng)用，例如參閱Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,"Vitamins",第A27巻，第443-613頁(yè)，VCH:Weinheim,1996)。術(shù)語(yǔ)"維生素"為本領(lǐng)域所知并且包括生物體正常機(jī)能所必需的營(yíng)養(yǎng)物，然而其不能由生物體自身合成。維生素類可包括輔因子及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品化合物。術(shù)語(yǔ)"輔因子"包括正常酶活性的出現(xiàn)必需的非蛋白質(zhì)化合物。這些化合物可以是有機(jī)或無(wú)機(jī)的；本發(fā)明的輔因子分子優(yōu)選為有機(jī)的。術(shù)語(yǔ)"營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品"包括在植物和動(dòng)物、特別是人中具有健康促進(jìn)作用的食物添加劑。這些分子的實(shí)例為維生素、抗氧化劑及某些類脂類(例如多不飽和脂肪酸)。這些分子在能夠生產(chǎn)它們的生物(如細(xì)菌)中的生物合成已被詳細(xì)地表征("Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,"Vitamins",第A27巻，第443-613頁(yè)，VCH:Wdnheim，1996，Michal，G.(1999)BiochemicalPathways:AnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology,JohnWiley&Sons;Ong，A.S.，Niki，E.與Packer,L.(1995)"Nutrition,Lipids,HealthandDisease"ProceedingsoftheUNESCO/ConfederationofScientificandTechnologicalAssociationsinMalaysiaandtheSocietyforfreeRadicalResearch-亞洲，1994年9月1-3日于馬來(lái)西亞檳城舉行，AOCSPress,Champaign,ILX，374S)。通過(guò)嘧啶與噻唑單元的化學(xué)偶合形成硫胺素(維生素B,)。核黃素(維生素B2)是由5，-三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)與5-磷酸核糖合成。核黃素接著用于合成黃素單核苷酸(FMN)與黃素-腺嘌呤二核苷酸(FAD)。此化合物家族統(tǒng)稱為"維生素B6"(例如吡噴醇、吡,胺、吡,醛5，-磷酸和商業(yè)l吏用的鹽酸吡,醇)，其皆為共同結(jié)構(gòu)單元5-羥基-6-甲基吡啶的衍生物?？赏ㄟ^(guò)化學(xué)合成或通過(guò)發(fā)酵來(lái)產(chǎn)生泛酸(Pantothenate)(泛酸(pantothenicacid),R-(+)-N-(2，4-二羥基-3，3-二曱基-1-氧代丁基)-p-丙氨酸)。泛酸生物合成中的最后步驟由ATP-驅(qū)動(dòng)的p-丙氨酸與泛解酸縮合組成。在轉(zhuǎn)化成泛解酸、轉(zhuǎn)化成P-丙氨酸及縮合成泛酸的生物合成步驟中發(fā)揮作用的酶是已知的。泛酸的代謝活性形式為輔酶A，其生物合成通過(guò)5個(gè)i^l步驟進(jìn)行。泛酸、5-磷酸吡,醛、半胱氨酸及ATP為輔酶A的前體。這些酶不僅催化泛酸的形成，而且也催化(R)-泛解酸、(R)-泛解酸內(nèi)酯、(R)-泛醇(維生素原Bs)、泛酰巰基乙胺(及其衍生物)及輔酶A的產(chǎn)生。已詳細(xì)研究了微生物中自前體分子庚二酰-輔酶A進(jìn)行的生物素的生物合成，且已經(jīng)確定了幾個(gè)有關(guān)基因。已發(fā)現(xiàn)許多對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)參與Fe簇(Fecluster)合成中且屬于nifS蛋白質(zhì)類。硫辛酸源自辛酸并且作為能量代謝中的輔酶，它成為丙酮酸脫氫酶復(fù)合物和oc-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的組成成分。葉酸類為全部衍生自葉酸的一類物質(zhì)，而葉酸依次從L-谷氨酸、對(duì)氨基苯甲酸和6-甲基喋呤(methylpterin)衍生而來(lái)。已在某些微生物中詳細(xì)研究了起始自代謝中間產(chǎn)物5，-三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)、L-谷氨酸及對(duì)氨基苯曱酸的葉酸及其衍生物的生物合成。類咕啉(例如鈷胺素，特別是維生素B^)及P卜啉屬于以四吡咯環(huán)系統(tǒng)為特征的一類化學(xué)品。維生素Bu的生物合成是太過(guò)復(fù)雜以至于尚未完全了解，然而其涉及的大多數(shù)酶及底物如今是已知的。煙酸(nicotinicacid)(煙酸(nicotinate))及煙酰胺為吡咬衍生物，也將其稱作"尼克酸(niacin)"。尼克酸是重要的輔酶NAD(煙堿酰氨-腺嘌呤二核苷酸)及NADP(煙堿酰氨-腺嚆呤二核苷酸辨酸)及其還原形式的前體。雖然這些化合物中的一些已通過(guò)大M^莫培養(yǎng)微生物來(lái)生產(chǎn)，例如核黃素、維生素B。泛酸及生物素，但是這些化合物在工業(yè)規(guī)模上的生產(chǎn)主要基于無(wú)細(xì)胞的化學(xué)合成。只有維生素812由于其合成的復(fù)雜性而只能通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)。體外方法需要相當(dāng)大的材料花費(fèi)和時(shí)間，并且成本常常很高。III.嘌呤、嘧啶、核苷與核苷酸的代謝及用途嘌呤與嘧咬代謝的基因及其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)是腫瘤疾病及病毒感染治療的重要目標(biāo)。術(shù)語(yǔ)"嘌呤"或"嗜啶"包含含氮堿基，其是核酸、輔酶及核苷酸的組分。術(shù)語(yǔ)"核苷酸"包含核酸分子的基本結(jié)構(gòu)單位，其包括含氮堿基、戊糖(RNA中該糖為核糖，且DNA中該糖為D-脫氧核糖)及磷酸。術(shù)語(yǔ)"核苷"包含作為核苷酸前體的分子，但與核普酸相比，其不具有磷酸單元。通過(guò)抑制用于形成核酸分子的這些分子的生物合成或其活動(dòng)來(lái)抑制RNA與DNA的合成是可能的；該活動(dòng)在致癌細(xì)胞中的靶向抑制則能夠抑制腫瘤細(xì)胞分裂和復(fù)制的能力。還存在不形成核酸分子但作為能量?jī)?chǔ)存物(AMP)或作為輔酶(即FAD與NAD)的核苷酸。許多出版物已描迷了這些化學(xué)品在那些嘌呤和/或嘧啶代謝受影響的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥中的用途(例如，Christopherson，R.I.和Lyons,S.D.(19卯)"Potentinhibitorsofdenovopyrimidineandpurinebiosynthesisaschemotherapeuticagents",Med.Res.Reviews10:505-548)。嘌呤及嘧咬代的開(kāi)發(fā)中，例如可用作免疫抑制劑或抗增殖劑(Smith,J丄."EnzymesinNucleotideSynthesis"Curr.Opin.Struct.Biol.5(1995)752-757;Biochem.Soc.Transact.23(1995)877-卯2)。然而，噪呤堿基及嘧咬堿基、核苷及核苷酸也具有其他可能的用途作為各種精細(xì)化學(xué)品的生物合成的中間產(chǎn)物(例如疏胺素、S-腺苷甲硫氨酸、葉酸或核黃素)；作為細(xì)胞的能量載體(例如ATP或GTP)及作為化學(xué)品本身，其通常用作調(diào)p未增強(qiáng)劑(例如IMP或GMP)，或用于許多醫(yī)學(xué)用途中(例如參閱Kuninaka，A.，(1996)"NucleotidesandRelatedCompounds"inBiotechnology,第6巻，Rehm等人，編者，VCH:Weinheim，第561畫(huà)612頁(yè))。噤呤、吡啶、核苷或核苷酸代謝中所涉及的酶也日益成為開(kāi)發(fā)用于保護(hù)莊稼的化學(xué)品的目標(biāo)，這些化學(xué)品包括殺真菌劑、除草劑及殺蟲(chóng)劑。這些化合物在細(xì)菌中的代謝已被表征(回顧，例如參閱Zalkin，H.與Dixon，J.E.(1992)"Denovopurinenucleotidebiosynthesis"inProgressinNucleicAcidsResearchandMolecularbiology,第42巻，AcademicPress,第259-287頁(yè)和Michal，G.(1999)"NucleotidesandNucleosides";第8章，BiochemicalPathways:AnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology,Wiley，NewYork)。作為大量研究的主題的嘌呤代謝是細(xì)胞正常機(jī)能所必需的。高等動(dòng)物中損噤呤代謝受損可引起例如痛風(fēng)的嚴(yán)重疾病。通過(guò)許多步驟從核糖5-磷酸經(jīng)由中間化合物肌苷5'-磷酸(IMP)合成噤呤核苷酸，，從而導(dǎo)致5，-單磷酸鳥(niǎo)苷(GMP)或5，-單磷酸腺苷(AMP)的產(chǎn)生，自此可易于制備作為核苷酸使用的其三磷酸鹽形式。這些化合物也用作能量?jī)?chǔ)存物，以便它們的降解作用為在細(xì)胞中許多不同生物化學(xué)過(guò)程提供能量。通過(guò)從5-磷酸核糖形成5，-單磷酸尿苷(UMP)來(lái)進(jìn)行嘧啶的生物合成。接著UMP轉(zhuǎn)化為5，-三磷酸胞苷(CTP)。所有核苷酸的脫氧形式皆由核苷酸的二磷酸核糖形式在一步還原反應(yīng)中制備而產(chǎn)生核苷酸的二磷酸脫氧核糖形式。在磷酸化作用之后，這些分子能夠參于DNA的合成。IV.海藻糖的代謝及用途食品業(yè)中用作甜味劑、在干燥或冷凍食品及飲料中作為添加劑。然而，其也用于醫(yī)藥業(yè)、化妝品業(yè)及生物工程業(yè)中(例如參閱Nishimoto等人，(1998)美國(guó)專利第5759610號(hào);Singer，M.A.與Lindquist，S.TrendsBiotech.16(1998)460-467;Paiva，C丄.A.與Panek，A.D.BiotechAim.Rev.2(1996)293畫(huà)314及Shiosaka，M.FFIJ.Japan172(1997)97-102)。海藻糖由多種微生物的酶產(chǎn)生且以天然方式釋放至周?chē)慕榛?，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法將其從中分離。特別優(yōu)選的生物合成產(chǎn)物選自有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、核苷酸與核苷、蛋白型與非生蛋白氨基酸、類脂類與脂肪酸、二醇、糖類、芳香化合物、維生素與輔因子、酶及蛋白質(zhì)。優(yōu)選的有機(jī)酸為酒石酸、衣康酸及二氨基庚二酸。優(yōu)選的核苷與核苷酸描述于，例如Kuninaka，A.(1996)Nucleotidesandrelatedcompounds,第561-612頁(yè),Biotechnology,第6巻,Rehm等人，編者，VCH:Weinheim及其中所出現(xiàn)的參考文獻(xiàn)中。其他優(yōu)選的生物合成產(chǎn)物是的類脂類、飽和及不飽和脂肪酸(例如花生四烯酸)、例如丙二醇及丁二醇的二醇、例如透明質(zhì)酸及海藻糖的糖類、例如芳香胺、香草醛及龍藍(lán)的芳香化合物、例如Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,第A27巻，"Vitamins",第443-613頁(yè)(1996)VCH:Weinheim與其中所出現(xiàn)的參考文獻(xiàn)及Ong,A.S.，Niki，E.與Packer，L.(1995)"Nutrition,Lipids,HealthandDisease"ProceedingsoftheUNESCO/ConfederationofScientificandTechnologicalAssociationsinMalaysiaandtheSocietyforFreeRadicalResearch-Asia,1994年9月1-3日于馬來(lái)西亞檳城舉行，AOCSPress(1995))中描述的維生素及輔因子、酶、聚酮化合物(Cane等人(1998)Science282:63-68)及所有其他由Gutcho(1983)描述于ChemicalsbyFermentation,NoyesDataCorporation,ISBN:0818805086及其中所出現(xiàn)的參考文獻(xiàn)中的化學(xué)品。特別優(yōu)選的生物合成產(chǎn)物為氛基酸，特別優(yōu)選必需"ll基酸，具體地為L(zhǎng)-甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-曱硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-組氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸及L-蘇氨酸、L-高絲氨酸，尤其為L(zhǎng)-賴氨酸、L-曱硫氨酸及L國(guó)蘇氨酸。例如賴氨酸、甲硫氨酸及蘇氨酸的氨基酸在下文的各種情況下均是指氨基酸的L及D型，優(yōu)選為L(zhǎng)型，即例如L-賴氨酸、L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸。具體地，本發(fā)明涉及通過(guò)培養(yǎng)與野生型相比，具有至少一種基因的表達(dá)速率是提高的或受影響的基因修飾微生物來(lái)產(chǎn)生賴氨酸的方法，其中ch)與野生型相比，至少一種本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性是增加的，該內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh)以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實(shí)施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中的基因的表達(dá)，其中這些等基因相對(duì)于這些表達(dá)單元而言是異源的，且其中這些基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼二氨基庚二酸脫氫酶的核酸、編碼二氨基庚二酸脫羧酶的核酸、編碼二氫吡啶二羧酸合成酶的核酸、編碼二氫吡咬二羧酸還原酶的核酸、編碼甘油^3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysRl的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2的核酸、編碼蘋(píng)果酸-醌氧化還原酶的核酸、編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核酸、編碼6-磷酸葡糖酸脫氬酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)酮酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)醛酶的核酸、編碼賴氨酸輸出子的核酸、編碼生物素連接酶的核酸、編碼精氨酰-tRNA合成酶的核酸、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、編碼果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、編碼蛋白質(zhì)OpcA的核酸、編碼l-磷酸果糖激酶的核酸及編碼6-磷酸果糖激酶的核酸。就上述方法而言，以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實(shí)施方案ch)所述的調(diào)節(jié)是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)dhl)將一種或多種適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元的控制下進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh2)將這些基因中的一種或多種導(dǎo)入微生物基因組中，以便在適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元的控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或dh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。用于制備賴氨酸的上述方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，該活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、二氨基庚二酸脫氫酶活性、二氨基庚二酸脫羧酶活性、二氫吡啶二羧酸合成酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構(gòu)酶活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR的活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysRl的活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2的活性、蘋(píng)果酸-醌氧化還原酶活性、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、6-磷酸葡糖酸脫氬酶活性、轉(zhuǎn)酮酶活性、轉(zhuǎn)醛酶活性、賴氨酸輸出子活性、精氨酰-tRNA合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、果糖-l，6-二磷酸酶活性、蛋白質(zhì)OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性及生物素連接酶活性。用于制備賴氨酸的上述方法的另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，該活性選自蘇氨酸脫水酶活性、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、O-乙酰高絲氨酸^/f匕氫解酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、高絲氨酸激酶活性、高絲氨酸脫氫酶活性、蘇氨酸輸出子活性、蘇氨酸排出蛋白活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脫羧酶活性及蘇氨酸合酶活性?？捎?但不是必需)具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸和/或本發(fā)明的表達(dá)單元引起上述這些額外增加或降低的活性中的至少一種。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)培養(yǎng)與野生型相比，具有至少一種基因的表達(dá)速率已提高的或受影響的基因修飾微生物來(lái)產(chǎn)生甲硫氨酸的方法，其中Ch)與野生型相比，至少一種本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性是增加的，該內(nèi)源表達(dá)單元可調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh)以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實(shí)施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中這些基因相對(duì)于這些表達(dá)單元而言是異源的，且其中這些基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼高絲氨酸脫氬酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的核酸、編碼高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼胱硫醚Y合酶的核酸、編碼胱硫醚P裂合酶的核酸、編碼絲氨酸羥曱基轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶的核酸、編碼亞甲基四氫葉酸還原酶的核酸、編碼磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼磷酸絲氨酸磷酸酶的核酸、編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼半胱氨酸合酶I的核酸、編碼半胱氨酸合酶II的核酸、編碼輔酶B12依賴型甲石克氨酸合酶的核酸、編碼非輔酶B12依賴型曱硫氨酸合酶的核酸、編碼硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼磷酸腺苷磷酰硫酸還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白NADPH-還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白的核酸、編碼硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077的核酸、編碼硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248的核酸、編碼石克酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247的核酸、編碼RXA0655調(diào)節(jié)物的核酸及編碼RXN2910調(diào)節(jié)物的核酸。就上述方法而言，以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實(shí)施方案ch)所迷的調(diào)節(jié)是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)dhl)將一種或多種適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元的控制下進(jìn)行這些內(nèi)源基因中的一種或多種的表達(dá),或dh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或dh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。用于制備甲硫氨酸的上述方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，該活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、高絲氨酸脫氫酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構(gòu)酶活性、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、胱>5克醚^合酶活性、胱硫醚P裂合酶活性、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性、O-乙酰高絲氨酸硫化氬解酶活性、亞甲基四氫葉酸還原酶活性、磷酸絲氨酸氬基轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸絲氨酸磷酸酶活性、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、半胱氨酸合酶I活性、半胱氨酸合酶II活性、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶活性、鐵氧還蛋白-亞疏酸鹽還原酶活性、鐵氧還蛋白NADPH-還原酶活性、鐵氧還蛋白活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077的活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248的活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247的活性、RXA655調(diào)節(jié)物的活性及RXN2910調(diào)節(jié)物的活性。上述用于制備甲硫氨酸的方法的另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，該活性選自高絲氨酸激酶活性、蘇氨酸脫水酶活性、蘇氨酸合酶活性、內(nèi)消旋二氨基庚二to-脫氫酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氫吡-定二羧酸合酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性及二氨基吡啶曱酸脫羧酶活性?？捎?但不是必需)具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸和/或本發(fā)明的表達(dá)單元引起上述這些額外增加或降低的活性中的至少一種。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)培養(yǎng)與野生型相比，具有至少一種基因的表達(dá)速率已提高或影響的基因修飾微生物來(lái)制備蘇氨酸的方法，其中Ch)與野生型相比，至少一種本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元在孩t生物中的特異表達(dá)活性是增加的，該內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh)以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實(shí)施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中這些基因相對(duì)于這些表達(dá)單元而言是異源的，且其中這些基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖砩酸異構(gòu)酶的核酸、編碼高絲氨酸激酶的核酸、編碼蘇氨酸合酶的核酸、編碼蘇氨酸輸出子載體的核酸、編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)醛酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)酮酶的核酸、編碼蘋(píng)果酸-醌氧化還原酶的核酸、編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的核酸、編碼賴氨酸輸出子的核酸、編碼生物素連接酶的核酸、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、編碼蘇氨酸排出蛋白的核酸、編碼果糖-l,6-二磷酸酶的核酸、編碼OpcA蛋白質(zhì)的核酸、編碼l-磷酸果糖激酶的核酸、編碼6-磷酸果糖激酶的核酸及編碼高絲氨酸脫氫酶的核酸。就上述方法而言，以本發(fā)明的表達(dá)單元，或以具有實(shí)施方案ch)所述的增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元調(diào)節(jié)微生物中這些基因的表達(dá)通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)dhl)將一種或多種適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元的控制下進(jìn)行這些內(nèi)源基因中一種或多種的表達(dá)，或dh2)將這些基因中的一種或多種導(dǎo)入微生物基因組中，以便在適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的內(nèi)源表達(dá)單元的控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或dh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的本發(fā)明的表達(dá)單元及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。上述用于制備蘇氨酸的方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，該活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氬酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構(gòu)酶活性、蘇氨酸合酶活性、蘇氨酸輸出子載體活性、轉(zhuǎn)醛酶活性、轉(zhuǎn)酮酶活性、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、蘋(píng)果酸-醌氧化還原酶活性、高絲氨酸激酶活性、生物素連接酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、蘇氨酸排出蛋白活性、蛋白質(zhì)OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、6-磷酸葡糖酸脫氫酶活性及高絲氨酸脫氬酶活性。上述用于制備蘇氨酸的方法的另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，該活性選自蘇氨酸脫水酶活性、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶活性、內(nèi)消旋二M庚二酸D-脫氫酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氬吡咬二羧酸合成酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脫羧酶活性、賴氨酸輸出子活性、乙酰乳酸合酶活性、乙酮醇-酸還原異構(gòu)酶活性、支鏈氨基轉(zhuǎn)移酶活性、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、二羥基-酸脫水酶活性及二氨基吡咬甲酸脫羧酶活性。可用(但不是必需)具有啟動(dòng)子活性的本發(fā)明的核酸和/或本發(fā)明的表達(dá)單元引起上述這些額外增加或降低的活性中的至少一種。術(shù)語(yǔ)蛋白質(zhì)的"活性"在酶的情況下是指對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的酶活性，且在其他蛋白質(zhì)，如結(jié)構(gòu)蛋白或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的情況下是指蛋白質(zhì)的生理活性。酶通常能將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，或催化該轉(zhuǎn)化步驟。因此，酶的"活性"是指在特定時(shí)間內(nèi)由酶轉(zhuǎn)化的底物的量，或所形成的產(chǎn)物的量。因此，當(dāng)與野生型相比活性增加時(shí)，在特定時(shí)間內(nèi)由酶所轉(zhuǎn)化的底物的量或所形成的產(chǎn)物的量與野生型相比是增加的。就本文中所述的所有活性而言，"活性"的增加優(yōu)選達(dá)到"野生型活性"的至少5%、進(jìn)一步優(yōu)選為"野生型活性"的至少20%、進(jìn)一步優(yōu)選為"野生型活性，，的至少50%、進(jìn)一步優(yōu)選為"野生型活性，，的至少100%、更優(yōu)選為"野生型活性"的至少300%、更進(jìn)一步優(yōu)選為"野生型活性，，的至少500%、特別優(yōu)選為"野生型活性"的至少600%。因此，當(dāng)與野生型相比活性降低時(shí)，在特定時(shí)間內(nèi)由酶轉(zhuǎn)化的底物的量或形成的產(chǎn)物的量與野生型相比是減少的。降低的活性優(yōu)選是指微生物中此酶功能性會(huì)基于多種細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制而部分或基本上完全抑制或阻斷?；钚缘慕档桶笖?shù)量的減少至酶基本上完全沒(méi)有(即，缺乏對(duì)應(yīng)活性的可檢測(cè)性或缺乏酶的免疫可檢測(cè)性)。與野生型相比，微生物中活性優(yōu)選降低至少5%，進(jìn)一步優(yōu)選降低至少20%，進(jìn)一步優(yōu)選降低至少50%,進(jìn)一步優(yōu)選降低100%。具體地，"降低"也是指對(duì)應(yīng)的活性的完全失去。通過(guò)已知的方法，例如酶分析法可測(cè)定基因修飾微生物及野生型中特定酶的活性，且由此測(cè)定酶活性的增加或降低。例如，丙酮酸羧化酶是指表現(xiàn)將丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸的酶活性的蛋白質(zhì)。因此，丙酮酸羧化酶活性是指在特定時(shí)間內(nèi)由丙酮酸羧化酶蛋白轉(zhuǎn)化的丙酮酸的量或形成的草酰乙酸的量。因此，當(dāng)與野生型相比丙酮酸羧化酶活性增加時(shí)，在特定時(shí)間內(nèi)由丙酮酸羧化酶蛋白轉(zhuǎn)化的丙酮酸的量或形成的草酰乙酸的量與野生型相比是增加的。丙酮酸羧化酶活性的這種增加優(yōu)選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少5%、進(jìn)一步優(yōu)選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少20%、進(jìn)一步優(yōu)選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少50%、進(jìn)一步優(yōu)選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少100%、更優(yōu)選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少300%、更進(jìn)一步優(yōu)選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少500%、特別優(yōu)選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少600%。此外，例如烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性是指烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的酶活性。烯醇丙酮酸磷酸羧激酶是指表現(xiàn)將草酰乙酸轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇丙酮酸的酶活性的蛋白質(zhì)。因此，烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性是指在特定時(shí)間內(nèi)由烯醇丙酮酸磷酸羧激酶蛋白轉(zhuǎn)化的草酰乙酸的量或形成的磷酸烯醇丙酮酸的量。因此，當(dāng)與野生型相比烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性降低時(shí)，在特定時(shí)間內(nèi)由烯醇丙酮酸磷酸羧激酶蛋白轉(zhuǎn)化的草酰乙酸的量或形成的磷酸烯醇丙酮酸的量與野生型相比是降低的。烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性的降低包含烯醇丙酮酸磷酸羧激酶數(shù)量的降低至烯醇丙酮酸磷酸羧激醉基本上完全沒(méi)有(即，缺乏烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性的可檢測(cè)性或缺乏烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的免疫可檢測(cè)性)。與野生型相比，烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性優(yōu)選降低至少5%、進(jìn)一步優(yōu)選降低至少20%、進(jìn)一步優(yōu)選降低至少50%、進(jìn)一步優(yōu)選降低100%。具體地，"降低"也是指烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性的完全失去?？梢远喾N方式額外增加活性，例如通過(guò)在表達(dá)及蛋白質(zhì)水平上關(guān)閉抑制調(diào)節(jié)4幾制，或通過(guò)增加與野生型相比的編碼上述蛋白質(zhì)的核酸的基因表達(dá)。同樣地，可以多種方式增加與野生型相比的編碼上述蛋白質(zhì)的核酸的基因表達(dá)，例如通過(guò)激活物誘導(dǎo)該基因，或如上所述，通過(guò)增加啟動(dòng)子活性或增加表達(dá)活性或通過(guò)將一種或多種基因拷貝導(dǎo)入微生物中。根據(jù)本發(fā)明，增加編碼蛋白質(zhì)的核酸的基因表達(dá)也是指操縱微生物內(nèi)在的內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達(dá)。如上所述，這可通過(guò)例如改變啟動(dòng)子和/或基因的表達(dá)單元序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可通過(guò)缺失或插入DNA序列來(lái)進(jìn)行這種改變，這種改變導(dǎo)致基因表達(dá)速率提高。如上所述，通過(guò)施加外源刺激來(lái)改變內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達(dá)是可能的。這可通過(guò)特定的生理?xiàng)l件進(jìn)行，即通過(guò)外源物質(zhì)的使用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可借助于其他不同的方法(單獨(dú)或組合)來(lái)實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的增加。因此，例如可增加合適基因的拷貝數(shù)，或可使啟動(dòng)子及調(diào)節(jié)區(qū)或位于結(jié)構(gòu)基因上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)突變。另外，可能通過(guò)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中增加表達(dá)。延長(zhǎng)mRNA存在時(shí)間的方法可同樣增加表達(dá)。通過(guò)防止酶蛋白的降解同樣也可增強(qiáng)酶活性。基因或基因構(gòu)建物可以不同拷貝數(shù)存在于質(zhì)粒中，或整合到染色體中并擴(kuò)增?；蛘撸部赏ㄟ^(guò)改變培養(yǎng)基的組成及對(duì)培養(yǎng)的管理來(lái)達(dá)到相關(guān)基因的過(guò)表達(dá)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可尤其在Martin等人(Biotechnology5，137-146(1987))、Guerrero等人(Gene138，35-41(1994))、Tsuchiya與Morinaga(Bio/Technology6，428-430(1988))、Eikmanns等人(Gene102，93-98(1991))、歐洲專利第0472869號(hào)、美國(guó)專利第4，601，893號(hào)、Schwarzer與Ptihler(Biotechnology9，84-87(1991))、Reinscheid等人(AppliedandEnvironmentalMicrobiology60，126-132(1994》、LaBarre等人(JournalofBacteriology175，1001-1007(1993))、專利申請(qǐng)WO96/15246、Malumbres等人(Gene134，15-24(1993))、日^^開(kāi)的說(shuō)明書(shū)JP-A曙10國(guó)229891、Jensen與Hammer(BiotechnologyandBioengineering58，191-195(1998》、Makrides(MicrobiologicalReviews60:512-538(1996))及眾所周知的遺傳與分子生物學(xué)教科書(shū)中發(fā)現(xiàn)對(duì)此的指導(dǎo)。此外，除了基因的表達(dá)或增強(qiáng)作用，消除有害的副反應(yīng)對(duì)產(chǎn)生生物合成產(chǎn)物，尤其是L-賴氨酸、L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸是有利的(Nakayama:"BreedingofAminoAcidProducingMicroorganisms",OverproductionofMicrobialProducts,Krumphanzl,Sikyta，Vanek(編者)，AcademicPress,London,英國(guó)，1982)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)將至少一種編碼對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的核酸導(dǎo)入微生物中來(lái)增加編碼上述蛋白質(zhì)之一的核酸的基因表達(dá)。可在染色體上或染色體外進(jìn)行核酸導(dǎo)入，即通過(guò)增加染色體上的拷貝數(shù)和/或增加在宿主微生物中復(fù)制的質(zhì)粒上的基因的拷貝。核酸的導(dǎo)入(例如，以包含該核酸的表達(dá)盒形式)優(yōu)選在染色體上進(jìn)行，具體地，通過(guò)上述SacB方法進(jìn)行。原則上，為了這個(gè)目的可能使用任何編碼上述蛋白質(zhì)之一的基因。在真核來(lái)源的包含內(nèi)含子的基因組核^列的情況下，若宿主微生物不能表ii^t應(yīng)蛋白質(zhì)或不能使其表i^t應(yīng)蛋白質(zhì)，則優(yōu)選使用已經(jīng)處理過(guò)的核酸序列，例如對(duì)應(yīng)的cDNA。對(duì)應(yīng)基因的實(shí)例列于表i;M^2中。優(yōu)選通過(guò)以下方法中的至少一種降低孩i生物中的上述活性導(dǎo)入至少一種用于誘導(dǎo)共抑制的有義核糖核酸序列或確保其表達(dá)的表達(dá)盒導(dǎo)入至少一種針對(duì)對(duì)應(yīng)基因、RNA或蛋白質(zhì)的DNA或蛋白質(zhì)結(jié)合因子或確保其表達(dá)的表達(dá)盒導(dǎo)入至少一種引起RNA降解的病毒核酸序列或確保其表達(dá)的表達(dá)盒導(dǎo)入至少一種產(chǎn)生功能缺失的構(gòu)建物，所述功能缺失是例如通過(guò)在基因中產(chǎn)生插入、缺失、倒置或突變?cè)陂喿x框內(nèi)產(chǎn)生例如終止密碼子或移位?？赡懿?yōu)選通過(guò)同源重組來(lái)靶向插入至目的靼基因中，或?qū)脶槍?duì)把基因的序列特異性核酸酶來(lái)產(chǎn)生敲除突變體。導(dǎo)入具有降低的啟動(dòng)子活性的啟動(dòng)子或?qū)刖哂薪档偷谋磉_(dá)活性的表達(dá)單元。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道在本發(fā)明的范疇內(nèi)還可使用其他方法來(lái)降低其活性或功能。例如，導(dǎo)入蛋白質(zhì)的顯性失活變體或確保其表達(dá)的表達(dá)盒也可是可4亍的。此外，這些方法中的每一個(gè)均可能引起蛋白質(zhì)的量、mRNA的量和/或蛋白質(zhì)的活性降低。也可以想到這些方法的組合使用。其他方法對(duì)為本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是已知的，其包含阻止或抑制蛋白質(zhì)的加工、蛋白質(zhì)或其mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制染色體附著、抑制RNA剪接、誘導(dǎo)降解RNA的酶和/或抑制翻譯延伸或終止。在用于產(chǎn)生生物合成產(chǎn)物的本發(fā)明方法中，優(yōu)選在培養(yǎng)基因修飾孩吏生物的步驟之后從微生物和/或自發(fā)酵肉湯中分離生物合成產(chǎn)物。這些步驟可同時(shí)和/或優(yōu)選在培育步驟之后進(jìn)行。可用分批法(分批培育)或補(bǔ)料分批法或重復(fù)補(bǔ)料分批法培養(yǎng)本發(fā)明的基因修飾孩吏生物，連續(xù)或間斷地產(chǎn)生生物合成產(chǎn)物，特別是L-賴氨酸、L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸。已知培育方法的概述可在Chmiel(Bioprozefitechnik1.EinfiihrungindieBioverfahrenstechnik(GustavFischerVerlag，Stuttgart,1991))的教科書(shū)或Storhas(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen(ViewegVerlag，Braunschweig/Wiesbaden,1994))的教科書(shū)中發(fā)現(xiàn)。待使用的培養(yǎng)基必須以適當(dāng)?shù)胤绞綕M足每個(gè)菌林的要求。在"ManualofMethodsforGeneralBacteriology"oftheAmericanSocietyforBacteriology(WashingtonD.C.，美國(guó)，1981)手冊(cè)中描述了用于各種微生物的培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明，這些可使用的培養(yǎng)基通常包含一種或多種碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、維生素和/或#:量元素。優(yōu)選的碳源為例如單糖、二糖或多糖的糖。非常好的碳源的實(shí)例為葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纖維素。也可以例如糖蜜的復(fù)合化合物或糖精制的其他副產(chǎn)物將糖置于培養(yǎng)基中。添加各種碳源的混合物也是有益的。其他可能的碳源為油及脂肪，例如大豆油、葵花子油、花生油及椰子脂肪；脂肪酸，例如棕櫚酸、硬脂酸或亞油酸；醇，例如甘油、曱醇或乙醇以及有機(jī)酸，例如乙酸或乳酸。氮源通常為有機(jī)或無(wú)機(jī)氮化合物或含有這些化合物的物質(zhì)。氮源的實(shí)例包括氨氣或例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨或硝酸銨的銨鹽、硝酸鹽、尿素、氨基酸或例如玉米漿、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏及其他物質(zhì)的復(fù)合氮源。氮源可單獨(dú)使用或作為混合物使用。可存在于培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽化合物包含4丐、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅及鐵的氯化物、磷酸鹽或硫酸鹽。為了產(chǎn)生精細(xì)化學(xué)品，尤其是甲硫氨酸，可能使用以下物質(zhì)作為硫源例如硫酸鹽、亞石克酸鹽、連二亞硫酸鹽、四硫酸鹽、硫代石危酸鹽、硫化物的無(wú)機(jī)化合物及例如硫醇及某硫醇(thiol)的有機(jī)硫化合物。可能使用以下物質(zhì)作為磷源磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或?qū)?yīng)的含鈉鹽。為了使溶液中存在金屬離子，可將螯合劑添加到培養(yǎng)基中。尤其適合的螯合劑包含例如兒茶酚或原兒茶酸鹽的二羥基酚類(dihydroxyphenol)，或例如檸檬酸的有機(jī)酸。根據(jù)本發(fā)明，所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基通常也包含例如維生素或生長(zhǎng)促進(jìn)劑的其他生長(zhǎng)因子，其包括，例如生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸及吡,醇。生長(zhǎng)因子及鹽常常來(lái)自例如酵母提取物、糖蜜、玉米漿及其類似物的培養(yǎng)基的復(fù)合成份。也可將合適的前體添加至培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中化合物的精確組成很大程度上視具體實(shí)驗(yàn)而定，且將由各具體狀況分別確定。最優(yōu)化的培養(yǎng)基的信息獲自教科書(shū)"AppliedMicrobiol.Physiology,APracticalApproach"(編者為P.M.Rhodes,P.F.Stanbury，IRLPress(1997)第53-73頁(yè)，ISBN0199635773)。也可從例如Standardl(Merck)或BHI(腦心浸出液，DIFCO)等商業(yè)供應(yīng)商購(gòu)得生長(zhǎng)培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基的所有成分通過(guò)加熱(1.5巴和121'C下20分鐘)或無(wú)菌過(guò)濾滅菌?？蓪⒊煞忠黄饻缇蛞曅枰珠_(kāi)滅菌。所有培養(yǎng)基成分可在培養(yǎng)開(kāi)始即存在或任選連續(xù)或分批加入。培養(yǎng)物的溫度通常在15。C與45。C之間，優(yōu)選在25。C至40。C，且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可保持恒定或變化。培養(yǎng)基的？11值應(yīng)處于5至8.5的范圍內(nèi)，優(yōu)選為約7.0。在培養(yǎng)期間可通過(guò)添加例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水的堿性化合物或例如磷酸或疏酸的酸性化合物來(lái)控制培養(yǎng)需要的pH值?？赏ㄟ^(guò)使用例如脂肪酸聚二乙醇酯的防泡劑來(lái)控制泡沫的形成。可通過(guò)向培養(yǎng)基中添加具有選棒作用的合適物質(zhì)，例如抗生素來(lái)維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。通過(guò)向培養(yǎng)基中導(dǎo)入氧或含氧氣體混合物(例如周?chē)目諝?來(lái)維持需氧條件。培養(yǎng)物的溫度通常為20。C至45。C。培養(yǎng)持續(xù)進(jìn)行到目的產(chǎn)物的形成達(dá)到最大量。通常在10小時(shí)至160小時(shí)內(nèi)達(dá)到該目標(biāo)。以該方式得到的發(fā)酵肉湯的干物質(zhì)含量通常為7.5至25重量％。此外，最好至少還在發(fā)酵末期進(jìn)行糖限制(sugarlimitation),但具體地，在超過(guò)經(jīng)發(fā)酵時(shí)間的至少30%時(shí)進(jìn)行。這是指在這段時(shí)間內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基中可利用的糖濃度保持在0至3g/l或是降低的。根據(jù)目的生物合成產(chǎn)物及該生物合成的副產(chǎn)物的物理/化學(xué)特性，以本身已知方式從發(fā)酵肉湯和/或微生物中分離生物合成產(chǎn)物。例如，可接著進(jìn)一步處理發(fā)酵肉湯。視需要而定，可用分離方法(例如離心、過(guò)濾、傾析或這些方法的組合)從發(fā)酵肉湯中全部或部分移除生物質(zhì)或?qū)⑵淙勘Ａ粲谄渲小＝又捎靡阎椒饪s發(fā)酵肉湯，例如借助于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、薄膜蒸發(fā)器、降膜式蒸發(fā)器濃縮發(fā)酵肉湯通過(guò)逆滲透或納米過(guò)濾，。然后通過(guò)冷凍干燥、噴霧干燥、噴霧造?；蚱渌椒▉?lái)處理該濃縮的發(fā)酵肉湯。另外，也可能進(jìn)一步純化生物合成產(chǎn)物，尤其是L-賴氨酸、L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸?；诖四康模诔ド镔|(zhì)之后，使用適合的樹(shù)脂對(duì)含有產(chǎn)物的肉湯進(jìn)行層析，目的產(chǎn)物或雜質(zhì)全部或部分地保留于層析樹(shù)脂上。若需要，則可使用相同或不同層析樹(shù)脂重復(fù)進(jìn)行這些層析步驟。本領(lǐng)域的技術(shù)人員精通于選擇適合的層析樹(shù)脂及其最有效的使用方法。純化的產(chǎn)物可通過(guò)過(guò)濾或超濾來(lái)濃縮，并保存于產(chǎn)物的穩(wěn)定性最大的溫度下。生物合成產(chǎn)物可以各種形式得到，例如以其鹽或酯的形式?？捎矛F(xiàn)有技術(shù)測(cè)定分離的化合物的特性及純度。這些現(xiàn)有技術(shù)包含高效液相層析法(HPLC)、光鐠法、染色法、薄層層析法、NIRS、酶測(cè)定或微生物測(cè)定。這些分析方法概述于Patek等人(1994)App1.Environ.Microbiol.60:133-140;Malakhova等人(1996)Biotekhnologiya1127-32及Schmidt等人(1998)BioprocessEngineer.19:67-70.Ulmann，sEncyclopediaoflndustrialChemistry(1996)第A27巻，VCH:Weinheim,第89國(guó)卯頁(yè)、第521-540頁(yè)、第540-547頁(yè)、第559-566頁(yè)、575-581頁(yè)及第581-587頁(yè)；Michal，G(1999)BiochemicalPathways:AnAtlasofBiochemistryandMolecularBiology,JohnWileyandSons;Fallon，A.等人(l987)ApplicationsofHPLCinBiochemistryin:LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,第17巻中。實(shí)施方案現(xiàn)通過(guò)以下非限定性實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明實(shí)施例l質(zhì)粒pCISlysC的構(gòu)建在菌林構(gòu)建的第一個(gè)步驟中，在谷氨酸棒桿菌ATCC13032中進(jìn)行l(wèi)ysC野生型基因的等位基因交換。在這種狀況下，在lysC基因中進(jìn)行核苷酸交換以便在所得到的蛋白質(zhì)中位置311上的^J^酸Thr被Ile替換。從作為PCRA應(yīng)模板的來(lái)自ATCC13032的染色體DNA起始，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)借助于Pfu-TurboPCR系統(tǒng)(StratageneUSA)并4吏用寡核苷酸引物SEQIDNO:5和SEQIDNO:6擴(kuò)增lysC。SEQIDNO:55,陽(yáng)GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3，SEQIDNO:65，-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG國(guó)3，如Tauch等人(1995)Plasmid33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology140:1817-1828所述從谷氨酸棒桿菌ATCC13032制備染色體DNA。在擴(kuò)增片段的5'端為SalI限制性位點(diǎn)且其3'端為MluI限制性位點(diǎn)?？寺≈?，以這兩種限制性酶消化所擴(kuò)增的片段并使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia,Freiburg)純化。通過(guò)Sail和Mlul限制性位點(diǎn)將所得的多核苷酸克隆至下文中稱為pCIS的pCLIK5MCS整合型SacB(SEQIDNO:7)并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌XL-lblue中。通過(guò)涂布于含有卡那霉素(20照/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology,l:l卯)上對(duì)含有質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行篩選。分離質(zhì)粒且通過(guò)測(cè)序來(lái)證實(shí)預(yù)期核苷酸序列。通過(guò)多種方法并使用來(lái)自Qiagen的材料制備質(zhì)粒DNA。如Sanger等人(1977)ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA74:5463-5467所述進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。使用ABIprism377(PEAppliedBiosystems，Weiterstadt)對(duì)測(cè)序反應(yīng)進(jìn)行分離和測(cè)定。將所得到的質(zhì)粒pCISlysC列為SEQIDNO:8。實(shí)施例2來(lái)自谷氨酸棒桿菌的lysC基因的誘變按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用Quickchange試劑盒(kit)(來(lái)自Stratagene/美國(guó))將來(lái)自谷氨酸棒桿菌的lysC基因定向誘變。在質(zhì)粒pCISlysC(SEQIDNO:25)中進(jìn)行資變。為了通過(guò)Quickchange方法(Stratagene)由thr311交換成311ile,合成以下寡核苷酸引物SEQIDNO:95，醫(yī)CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG國(guó)3，SEQIDNO:105，國(guó)CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG-3'這些寡核苷酸引物在Quickchange反應(yīng)中的使用導(dǎo)致在lysC基因SEQIDNO:11中932位上核苷酸的交換(由C交換成T)。在轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌XLl-blue中并制備質(zhì)粒之后，通過(guò)測(cè)序反應(yīng)證實(shí)了lysC基因中發(fā)生氨基酸交換Thr311Ile。所得到的質(zhì)粒命名為pCISlysCthr311ile并列于SEQIDNO:12。如Liebl等人(1989)FEMSMicrobiologyLetters53:299-303所述，通過(guò)電穿孔將質(zhì)粒pCISlysCthr311ile轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌ATCC13032中。對(duì)該方案的修改描述于DE10046870中。使用如Sambrook等人(1989)，Molecularcloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，通過(guò)Southern印跡及雜交來(lái)檢查各個(gè)轉(zhuǎn)化體lysC基因座上的染色體排列。此舉確保轉(zhuǎn)化體已通過(guò)同源重組在lysC基因座上整合了所轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。此類菌落在不含抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜之后，將細(xì)胞涂布于蔗糖CM瓊脂培養(yǎng)基(IOg/1蛋白胨、5g/1牛肉膏、5g/1酵母提取物、2.5g/1NaCl、2g/l尿素、1%葡萄糖、10%蔗糖，pH6.8)上并于30。C下培養(yǎng)24小時(shí)。由于載體pCISlysCthr311ile中所存在的sacB基因?qū)⒄崽寝D(zhuǎn)化為有毒產(chǎn)物，因此能夠生長(zhǎng)的菌落僅僅為通過(guò)野生型lysC基因與所突變lysCthr311ile基因之間的第二個(gè)同源重組步驟而缺失sacB基因的那些菌落。在同源重組過(guò)程中，或者是野生型基因或者是突變的基因與sacB基因一起缺失。SacB基因與野生型基因的缺失導(dǎo)致產(chǎn)生突變的轉(zhuǎn)化體。挑取生長(zhǎng)菌落并研究其卡那霉素敏感性表型。缺失SacB基因的菌落必須同時(shí)顯示出卡那霉素敏感性生長(zhǎng)行為。在搖瓶中研究此類卡那霉素敏感性克隆的賴氨酸生產(chǎn)力(見(jiàn)實(shí)施例6)。培養(yǎng)未經(jīng)處理的谷氨酸棒桿菌ATCC13032以用于對(duì)照。選擇與對(duì)照組相比賴氨酸生產(chǎn)提高的菌落，分離染色體DNA,通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增lysC基因的相應(yīng)區(qū)并測(cè)序。將具有增加的賴氨酸合成特性且在lysC的932位上具有所證實(shí)突變的該克隆稱作ATCC13032lysCftr。實(shí)施例3用于借助于異源表達(dá)單元Psod(SEQ.ID.2)使lysC基因過(guò)表達(dá)整合型質(zhì)粒的制備定義以下寡核苷酸用于擴(kuò)編碼超氧化物歧化酶的基因的啟動(dòng)子。SEQID13:sod8:5'-accctggcggaaaccctgagtcg-3'SEQID14:sodl:5'-tacgaccagggccacgggtaaaaaatcctttcgtaggtttccgcaccgagcatatacatcttttg-3，該引物與來(lái)自谷氨酸棒桿菌ATCC13032的染色體DNA—起用于PCR反應(yīng)。4吏用該方法可以擴(kuò)增對(duì)應(yīng)于預(yù)期大小(約657bp)的DNA片段。定義以下寡核苷酸用于擴(kuò)增編碼天冬氨酸激酶的基因。SEQID15:lysC2:5'-cctacgaaaggattttttacccgtggccctggtcgtacag-3'SEQID16:lysC6:5'-gattagtggaacctcgtcgtc-3，引物與來(lái)自谷胺酸棒狀桿菌ATCC13032lysC"""的染色體DNA—起用于PCR^應(yīng)中?？赡苡么朔绞綌U(kuò)增對(duì)應(yīng)于預(yù)期大小(1638bp)的DNA片段。引物sodl及ask2含有重疊序列且于5'末端彼此同源。將以上所得的PCR產(chǎn)物用作下一個(gè)PCR的模板，在該P(yáng)CR中使用以下引物。SEQID17:sod4:5'-gcggcgcaggattttctaa國(guó)3，SEQID18:lysC4:5'-tcggttgcctgagtaatgtctt-3'以該方式擴(kuò)增相當(dāng)于預(yù)期大小(1811bp)的DNA片段是可能的。接著，將該P(yáng)sod/lysC融合體克隆至載體pCR2.1(獲自InvitrogenGmbH，Karlsruhe,Germany)中。在接下來(lái)的步驟中，來(lái)自質(zhì)粒pCR2.1(獲自InvitrogenGmbH,Karlsruhe,Germany)的該P(yáng)sod/lysC融合體作為1773bp的EcoRI片段克隆至已經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切核酸酶EcoRI切割的整合載體pK19mobsacBSEQIDNO19中。將得到的質(zhì)粒稱作pk19mobsacBPsod/lysC。為了擴(kuò)增lysC基因的5，區(qū)域，定義以下寡核苷酸SEQID20:lysC23:5'-caccgcggctttggacatcactgctac國(guó)3'SEQID21:lysC24:5，-cctggggctttagcggatgcgtctca-3'該引物與來(lái)自谷氨酸棒桿菌的染色體DNA—起用于PCRA應(yīng)中?？梢栽摲绞綌U(kuò)增相當(dāng)于預(yù)期大小(674bp)的DNA片段。將該DNA片段克隆至載體pCR2.1(獲自InvitrogenGmbH,Karlsruhe,Germany)中。隨后，接著將787bp的Spel/Xbal片段克隆至已經(jīng)過(guò)限制酶Nhel消化的載體pK19mobsacBPsodlysC中。將得到的質(zhì)粒稱作pK19mobsacBPsodlysC+US(SEQ.ID.NO.22)。至該步驟，所有的克隆均在大腸桿菌XL-1Blue(獲自Stratagene，Amsterdam,Netherlands)中進(jìn)行。接著，如Liebl等人(1989)FEMSMicrobiologyLetters53:299-303所述，使用轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pK19mobsacBPsodlysC+US與質(zhì)粒pTcl5AcglM—起轉(zhuǎn)化大腸桿菌Mn522(獲自Stratagene，Amsterdam,Netherlands)。根據(jù)谷氨酸棒桿菌的甲基化模式(DE10046870)，質(zhì)粒pTcl5AcglM使得DNA能夠甲基化。隨后該步驟使谷氨酸棒桿菌與整合質(zhì)粒pK19mobsacBPsodlysC十US—起經(jīng)受電穿孔。該電穿孔及隨后在含有卡那霉素(25jtg/ml)的CM平板上的選擇產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)接合子。為了對(duì)導(dǎo)致載體與lysC啟動(dòng)子及l(fā)ysC基因缺失的第二個(gè)同源重組步驟進(jìn)行選擇，將這些轉(zhuǎn)接合子在不含卡那霉素的CM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，接著涂布在含有10。/。蔗糖的CM平板上進(jìn)行選擇。載體pK19mobsacB中所存在的sacB基因編碼酶levansucrase，并導(dǎo)致生長(zhǎng)在蔗糖上的微生物合成果聚糖。由于果聚糖對(duì)谷氨酸棒桿菌有毒，因此能夠生長(zhǎng)在含蔗糖的培養(yǎng)基上的谷氨酸棒桿菌細(xì)胞僅僅是那些通過(guò)第二個(gè)同源重組步驟缺失整合質(zhì)粒的細(xì)胞(J3ger等人，JournalofBacteriology174(1992)5462-5466)。檢查IOO個(gè)抗蔗糖克隆的卡那霉素敏感性?？梢宰C明57個(gè)所檢測(cè)的克隆不僅對(duì)蔑糖具有抗性且對(duì)卡那霉素具有敏感性。使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢查Psod表達(dá)單元置換天然表達(dá)單元的期望置換是否發(fā)生。從起始菌抹及用于該分析的20個(gè)克隆中分離染色體DNA?；诖四康?，以牙簽將各個(gè)克隆自瓊脂平板上移出，懸浮于100jtlH20中，并于95。C下煮沸10分鐘。10pl所得溶液在PCR中用作才莫板。所用引物是與Psod表達(dá)單元及l(fā)ysC基因同源的寡核苷酸。PCR條件選擇如下95。C預(yù)變性5分鐘；95。C變性30秒；55。C雜交30秒；72。C擴(kuò)增2分4中；30個(gè)循環(huán)；72。C最終延伸5分鐘。在具有起始菌林的DNA的混合物中，由于寡核苷酸的選擇不可能產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。只有其中第二個(gè)同源重組步驟影響Psod對(duì)天然啟動(dòng)子(PlysC)的置換的克隆出現(xiàn)期望的340bp大小的條帶。所測(cè)試的20個(gè)克隆中總共有2個(gè)為陽(yáng)性。實(shí)施例4天冬氨酸激酶(lysC)測(cè)定法在30。C下將包含帶有天然啟動(dòng)子的lysC""基因的染色體拷貝或PeftulysC""構(gòu)建物的染色體拷貝的谷氨酸棒桿菌林于CM培養(yǎng)基(IOg/l蛋白胨、5g/1牛肉膏、5g/1酵母提取物、2.5g/1NaCl、2g/1尿素、1%葡萄糖，pH6.8)中培養(yǎng)直至OD細(xì)為8。將細(xì)胞于4。C下旋轉(zhuǎn)離心，然后用冷的Tris-HCl緩沖液(0.1。/。，pH8.0)將細(xì)胞洗滌兩次。重新離心之后，將細(xì)胞溶解于冷的Tris-HCl緩沖液(0.1。/。，pH8.0)中并調(diào)整至OD綱為160。為了使細(xì)胞破裂，將1ml該細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至來(lái)自Hybaid的2mlRibolyser管中，以6.0的旋轉(zhuǎn)設(shè)定值在來(lái)自Hybaid的Ribolyser中裂解三次，每次30秒。通過(guò)在4'C下以15,000轉(zhuǎn)/分于Eppendorf離心機(jī)中離心30分鐘使裂解物澄清，將上清液轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf杯中。如Bradford,M.M.(1976)Anal.Biochem.72:248-254中所述測(cè)定蛋白質(zhì)含量。天冬氨酸激酶的酶活性測(cè)定如下。在30'C下，將lml反應(yīng)混合物(含有100mMTris-HCl(pH8.0)、10mMMgCl2、600mM羥胺HCl(用10NKOH調(diào)至pH7.0)、4mMATP、200mM天冬氨酸鹽(鈉鹽))與額外1mlH20孵育10分鐘，通過(guò)加入個(gè)別蛋白質(zhì)裂解物開(kāi)始分析并且在30。C下孵育30分鐘。通過(guò)向反應(yīng)混合物中加入1ml終止溶液(10%氯化鐵、3.3%三氯乙酸、0.7NNaCl)以終止反應(yīng)。離心步驟之后，測(cè)量上清液的ODs4。。在該狀況下，l單位相當(dāng)于每分鐘每mg蛋白質(zhì)形成lnmol天冬氨酸異羥將酸。結(jié)果示于表la。表la<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>可以通過(guò)將PsodlysC構(gòu)建物整合入染色體中使天冬氨酸激酶活性加倍。實(shí)施例5賴氨酸的生產(chǎn)為了研究PsodlysC構(gòu)建物對(duì)賴氨酸生產(chǎn)的作用，在30'C下將菌林ATCC13032、ATCC13032lysC^或ATCC13032PsodlysC^于CM平板(10.0g/1D-葡萄糖、2.5g/1NaCl、2.0g/l尿素、10.0g/1細(xì)菌用胰蛋白胨(Difco)、5.0g/1酵母提取物(Difco)、5.0g/1牛肉膏(Difco)、22.0g/1瓊脂(Difco),經(jīng)高壓滅菌(121。C下20分鐘))上培養(yǎng)2天。接著將細(xì)胞從平板上刮下并懸浮于鹽水中。就主要培養(yǎng)物而言，將10ml培養(yǎng)基I及0.5g經(jīng)高壓滅菌的CaC03(RiedeldeHaen)置于100mlErlenmeyer燒瓶中，用細(xì)胞懸浮液接種直至OD鋼為1.5,在InforsAJ118(來(lái)自Infors，Bottmingen，瑞士)型搖床上于220轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)39小時(shí)。然后確定分泌至培養(yǎng)基中的賴氨酸濃度。培養(yǎng)基I:40g/1蔗糖60g/1糖蜜(以100%糖含量計(jì)算)10g/1(NH4)2S040.4g/1MgS047H200.6g/1KH2P040.3mg/1硫胺素.HCl1mg/1生物素(來(lái)自1mg/ml儲(chǔ)存溶液，該儲(chǔ)存溶液已通過(guò)過(guò)濾除菌并用NH4OH調(diào)整至pH8.0)2mg/1FeS042mg/1MnS04用NHUOH調(diào)整至pH7.8，高壓滅菌(121。C，20分鐘)。此外，加入維生素Bu(羥鈷胺素，SigmaChemicals)儲(chǔ)存溶液(200pg/ml，通過(guò)過(guò)濾除菌)直至維生素812終濃度為100pg/1。在Agilent1100系列LC系統(tǒng)HPLC上通過(guò)Agilent高壓液相層析測(cè)定氨基酸濃度。用鄰苯二甲醛進(jìn)行柱前衍生化作用允許對(duì)所形成的氨基酸進(jìn)行定量，并且在HypersilAA柱(Agilent)上將氨基酸混合物分級(jí)分離。研究結(jié)果示于表2a。表2a<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>實(shí)施例6制備載體pCLiK5MCS首先，使用寡核苷酸引物SEQIDNO:23與SEQIDNO:24，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來(lái)擴(kuò)增氨節(jié)青霉素(ampicillin)抗性及栽體pBR322的復(fù)制起點(diǎn)。SEQIDNO:235'誦CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG畫(huà)3"SEQIDNO:245，-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3，除了pBR322的互補(bǔ)序列外，寡核苷酸引物SEQIDNO:23沿5，-3，方向含有限制性內(nèi)切核酸酶SmaI、BamHI、NheI及AscI的酶切位點(diǎn)，寡核苷酸引物SEQIDNO:24沿5，-3，方向含有限制性內(nèi)切核酸酶Xbal、Xhol、Notl及DraI的酶切位點(diǎn)。通過(guò)例如Innis等人(PCRProtocols.AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress(1990))的標(biāo)準(zhǔn)方法，用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，LaJolla，美國(guó))進(jìn)行PCR^應(yīng)。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(GelBandpurificationkit)(AmershamPharmacia,Freiburg)純化得到的約2.1kb大小的DNA片段。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用快速DNA連接試劑盒(RocheDiagnostics,Mannheim)將該DNA片段的平末端連接在一起，且通過(guò)如Sambrook等人(MolecularCloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor(1989))描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)的大腸桿菌XL-lBlue(Stratagene，LaJoUa，美國(guó))中。通過(guò)涂布在含有氨千青霉素(50照/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology,1:190)上來(lái)篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用Qiaprep離心式小量制備試劑盒(Qiaprepspinmniprepkit)(Qiagen，Hilden)分離每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA，且通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化來(lái)檢查。以該方式得到的質(zhì)粒稱為pCLiKl。從作為PCR良應(yīng)模板的質(zhì)粒pWLTl(Liebl等人，1992)開(kāi)始，使用寡核苷酸引物SEQIDNO:25與SEQIDNO:26擴(kuò)增卡那霉素抗性盒。SEQIDNO:25:5，畫(huà)GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA畫(huà)3'SEQIDNO:265，GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3除了pWLTl的互補(bǔ)序列外，寡核苷酸引物SEQIDNO:25沿5，-3，方向含有限制性內(nèi)切核酸酶XbaI、Smal、BamHI、Nhel的酶切位點(diǎn)，寡核普酸引物SEQIDNO:26沿5，-3，方向含有限制性內(nèi)切核酸酶AscI及Nhel的酶切位點(diǎn)。通過(guò)例如Innis等人(PCRProtocols.AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress(19卯))的標(biāo)準(zhǔn)方法，用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，LaJolla，美國(guó))進(jìn)行PCR反應(yīng)。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia,Freiburg)純化得到的約1.3kb大小的DNA片段。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)以限制性內(nèi)切核酸酶XbaI及AscI(NewEnglandBiolabs，Beverly,美國(guó))切割DNA片段，且隨后使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia,Freiburg)再次進(jìn)行純化。同樣地，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)以限制性內(nèi)切核酸酶Xbal及Ascl切割載體pCLiKl,且用堿性磷酸酶(I(RocheDiagnostics,Mannheim))去磷酸化。在0.8%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳之后，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia,Freiburg)分離線性化的載體(約2.1kb)。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用快速DNA連接試劑盒(RocheDiagnostics,Mannheim)將該載體片段與經(jīng)切割的PCR片段連接，且通過(guò)如Sambrook等人(MolecularCloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,(1989))描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)的大腸桿菌XL-lBlue(Stratagene，LaJolla，美國(guó))中。通過(guò)涂布在含有氨芐青霉素(50將/ml)及卡那霉素(20ng/ml)的LB瓊脂(Lennox,1955，Virology,l:l卯)上來(lái)篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用Qiapr印離心式小量制備試劑盒(Qiagen，Hilden)分離每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA，且通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化來(lái)檢查。以該方式得到的質(zhì)粒稱為pCLiK2。以限制性內(nèi)切核酸酶DraI(NewEnglandBiolabs，Beverly,美國(guó))切割載體pCLiK2。在0.8%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳之后，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia,Freiburg)分離約2.3kb大小的載體片段。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用快速DNA連接試劑盒(RocheDiagnostics,Mannheim)再連接該載體片段，且通過(guò)如Sambrook等人(MolecularCloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,(1989))描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)的大腸桿菌XL-lBlue(Stratagene，LaJolla，美國(guó))中。通過(guò)涂布在含有卡那霉素(20將/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology,l:l卯)上來(lái)篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用Qiaprep離心式小量制備試劑盒(Qiagen，Hilden)分離每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA，且通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化來(lái)檢查。以該方式得到的質(zhì)粒稱為pCLiK3。從作為PCR^應(yīng)模板的質(zhì)粒pWLQ2(Liebl等人，1992)開(kāi)始，使用寡核苷酸引物SEQIDNO:27與SEQIDNO:28擴(kuò)增復(fù)制起點(diǎn)pHM1519。SEQIDNO:27:5，-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA畫(huà)3'SEQIDNO:28:5，-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3，除了pWLQ2的互補(bǔ)序列外，寡核苷酸引物SEQIDNO:27及SEQIDNO:28含有限制性內(nèi)切核酸酶Notl的酶切位點(diǎn)。通過(guò)例如Innis等人(PCRProtocols.AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress(1990》的標(biāo)準(zhǔn)方法，用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，LaJolla,美國(guó))進(jìn)行PCIt良應(yīng)。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia,Freiburg)純化得到的約2.7kb大小的DNA片段。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)以限制性內(nèi)切核酸酶NotI(NewEnglandBiolabs，Beverly,美國(guó))切割該DNA片段，且以GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia,Freiburg)再次進(jìn)行純化。同樣地，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)以限制性內(nèi)切核酸酶Notl切割載體pCLiK3，且用堿性磷酸酶(I(RocheDiagnostics,Mannheim))去磷酸化。在0.8%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳之后，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)以GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia,Freiburg)分離線性化的載體(約2.3kb)。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用快速DNA連接試劑盒(RocheDiagnostics,Mannheim)將該載體片段與經(jīng)切割的PCR片段連接，且通過(guò)如Sambrook等人(MolecularCloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,(1989))描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)的大腸桿菌XL-lBlue(Stratagene，LaJolla，美國(guó))中。通過(guò)涂布在含有卡那霉素(20照/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology,1:190)上來(lái)篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用Qiaprep離心式d、量制備試劑盒(Qiagen，Hilden)分離每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA,且通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化來(lái)檢查。以該方式得到的質(zhì)粒稱為pCLiK5。為了以多克隆位點(diǎn)(MCS)延伸pCLiK5，將合成的基本上互補(bǔ)的寡核苷酸SEQIDNO:21與SEQIDNO:22在95。C下一起加熱并緩慢冷卻來(lái)結(jié)合，得到雙鏈DNA片段，所述寡核苷酸SEQIDNO:29與SEQIDNO:30含有限制性內(nèi)切核酸酶SwaI、Xhol、Aatl、Apal、Asp718、Mlul、Ndel、Spel、EcoRV、Sall、Clal、BamHI、XbaI及SmaI的酶切位點(diǎn)。SEQIDNO:29:5，-TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATATGACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAACAATTGGGATCCTCTAGACCCGGGATTTAAAT-3，SEQIDNO:30:5，-GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAGCATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCGGGCCCGACGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT-3，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)以限制性內(nèi)切核酸酶XhoI及BamHI(NewEnglandBiolabs,Beverly,美國(guó))切割載體pCLiK5,并用堿性磷酸酶(I(RocheDiagnostics,Mannheim))去磷酸化。在0.8%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳之后，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)以GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia,Freiburg)分離線性化的載體(約5.0kb)。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用快速DNA連接試劑盒(RocheDiagnostics,Mannheim)將該載體片段與合成的雙鏈DNA片段連接，且通過(guò)如Sambrook等人(MolecularCloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,(1989))描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)的大腸桿菌XL-lBlue(Stratagene，LaJolla，美國(guó))中。通過(guò)涂布在含有卡那霉素(20照/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology,1:190)上來(lái)篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用Qiaprep離心式小量制備試劑盒(Qiagen，Hilden)分離每個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA，且通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化來(lái)檢查。以該方式得到的質(zhì)粒稱為pCLiK5MCS。如Sanger等人(1977)ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences美國(guó)74:5463-5467的描述進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。使用ABIprism377(PEAppliedBiosystems，Weiterstadt)對(duì)測(cè)序反應(yīng)進(jìn)行分離及測(cè)定。將得到的質(zhì)粒pCLiK5MCS列為SEQIDNO:31。實(shí)施例7制備質(zhì)粒PmetAmetA如Tauch等人(1995)Plasmid33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology140:1817-1828所述，從谷氨酸棒桿菌ATCC13032制備染色體DNA。使用寡核苷酸引物SEQIDNO:32及SEQIDNO:33、作為模板的染色體DNA及PfuTurbo聚合酶(獲自Stratagene),通過(guò)如Innis等人(1990)PCRProtocols.AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress描述的標(biāo)準(zhǔn)方法以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增包括5，非編碼區(qū)的metA基因。SEQIDNO:325，-GCGCGGTACCTAGACTCACCCCAGTGCT-3'及SEQIDNO:335，-CTCTACTAGTTTAGATGTAGAACTCGATGT陽(yáng)3'根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia,Freiburg)純化得到的約1.3kb大小的DNA片段。接著以限制酶Asp718及Spel(RocheDiagnostics,Mannheim)切割該DNA片段，并以GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒純化。以限制酶Asp718及Spel切割載體pClik5MCSSEQIDNO:31，電泳分離之后，使用GFX^PCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒分離得到5kb大小的片段。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用快速DNA連接試劑盒(RocheDiagnostics,Mannheim)將載體片段與PCR片段連接在一起，且通過(guò)如Sambrook等人(MolecularCloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,(1989))描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)的大腸桿菌XL-lBlue(Stratagene，LaJolla，美國(guó))中。通過(guò)涂布在含有卡那霉素(20照/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology,1:190)上來(lái)篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞。以多種方法及使用來(lái)自Qiagen的材料制備質(zhì)粒DNA。如Sanger等人(1977)ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences美國(guó)74:5463-5467的描述進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。使用ABIprism377(PEAppliedBiosystems，Weiterstadt)對(duì)測(cè)序反應(yīng)進(jìn)行分離及測(cè)定。將得到的質(zhì)粒pCLiK5MCSPmetAmetA列為SEQIDNO:34。實(shí)施例8制備質(zhì)粒pCLiK5MCSPsodmetA如Tauch等人(1995)Plasmid33:168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology140:1817-1828所述，從谷氨酸棒桿菌ATCC13032制備染色體DNA。使用寡核苷酸引物SEQIDNO:35與SEQIDNO:36、作為模板的染色體DNA及PfuTurbo聚合酶(獲自Stratagene)，通過(guò)例如Innis等人(1990)PCRProtocols.AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress的標(biāo)準(zhǔn)方法以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增超氧化物歧化酶(Psod)的5，非編碼區(qū)(表達(dá)單元區(qū))的約200個(gè)^對(duì)的DNA片段。SEQIDNO:35:5，畫(huà)GAGACTCGAGAGCTGCCAATTATTCCGGG-3"及SEQIDNO:36:5，-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGGGTAAAAAATCCTTTCG-3'才艮據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)以GFX，PCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia,Freiburg)純化得到的DNA片段。從作為PCRJl應(yīng)模板的質(zhì)粒PmetAmetASEQIDNO:34開(kāi)始，使用寡核苷酸引物SEQIDNO:37與SEQIDNO:38擴(kuò)增一部分metA。SEQIDNO:375，-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3"與SEQIDNO:385，-CTGGGTACATTGCGGCCC-3'根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)以GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒純化得到的約470個(gè)4^對(duì)的DNA片段。在接下來(lái)的PCRJl應(yīng)中，將以上得到的兩個(gè)片段一起用作模板。由于與寡核苷酸引物SEQIDNO:36—起導(dǎo)入的序列及其與metA的同源性，因此在PCR反應(yīng)中兩個(gè)片段彼此連接，且通過(guò)所用的聚合酶延伸得到連續(xù)的DNA鏈。通過(guò)在第二個(gè)循環(huán)開(kāi)始時(shí)才向反應(yīng)混合物中加入所用的SEQIDNO:35及SEQIDNO:38寡核苷酸引物來(lái)改良標(biāo)準(zhǔn)方法。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，使用GFX^PCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒純化約675個(gè)堿基對(duì)的擴(kuò)增的DNA片段。接著，以限制酶XhoI及NcoI(RocheDiagnostics,Mannheim)切割該DNA片段且用凝膠電泳進(jìn)行分離。隨后，使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia,Freiburg),從瓊脂糖純化約620個(gè)堿基對(duì)大小的DNA片段。以限制酶NcoI及SpeI(RocheDiagnostics,Mannheim)切割質(zhì)粒PmetAmetASEQIDNO:34。在通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分離之后，使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒從瓊脂糖中純化約0.7kb大小的metA片段。以限制酶Xhol及SpeI(RocheDiagnostics,Mannheim)切割載體pCIik5MCSSEQIDNO:31，且在通過(guò)電泳進(jìn)行分離之后，使用Gfxtmpcr、dna及凝膠條帶純化試劑盒分離得到5kb大小的片段。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，使用快速DNA連接試劑盒(RocheDiagnostics,Mannheim)將該載體片段與PCR片段及metA片段連接在一起，且通過(guò)如Sambrook等人(MolecularCloning.ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,(1989))描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)的E.coliXL-lBlue(Stratagene，LaJolla，美國(guó))中。通過(guò)涂布在含有卡那霉素(20jug/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955,Virology,l:l卯)上來(lái)篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞。以多種方法及使用來(lái)自Qiagen的材料制備質(zhì)粒DNA。如Sanger等人(1977)ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences美國(guó)74:5463-5467的描述進(jìn)4亍測(cè)序反應(yīng)。使用ABIprism377(PEAppliedBiosystems，Weiterstadt)對(duì)測(cè)序反應(yīng)進(jìn)行分離及觀'J定。將得到的質(zhì)粒pCLiK5MCSPSODmetA列為SEQIDNO:39。實(shí)施例9MetA活性以(Liebl等人(1989)FEMSMicrobiologyLetters53:299-303)描述的方法，用質(zhì)粒pClik5MCS、pClikMCSPmetAmetA、pCLiK5MCSPsodmetA中的每一種轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌菌林ATCC13032。將轉(zhuǎn)化混合物涂布在另外含有20mg/l卡那霉素的CM平板上來(lái)篩選含有質(zhì)粒的細(xì)胞。挑取且分離得到的卡那霉素抗性克隆。在30X:下將含有這些質(zhì)粒構(gòu)建物之一的谷氨酸棒桿菌菌林在MMA培養(yǎng)基(40g/l蔗糖、20g/1(NH4)2S04、Ig/1KH2P04、Ig/1K2HP04、0.25g/1MgS04x7H20、54gAces、1mlCaCl2(10g/l)、1ml原兒茶酸鹽(300mg/10ml)、1ml孩i量元素溶液(lOg/1FeS04x7H20、10g/1MnS04xH20、2g/1ZnS04x7H20、0.2g/lCuSO4、0.02g/1MCl2x6H20)、100叫/1維生素812、0.3mg/l硫胺素、lmM亮氨酸、1mg/l吡,醛HCl、1ml生物素(100mg/l)，pH7.0)中培養(yǎng)過(guò)夜。將細(xì)胞在4。C下離心，接著用冷的Tris-HCl緩沖液(0.1%,pH8.0)洗滌兩次。重新離心之后，將細(xì)胞溶解在冷的Tris-HCl緩沖液(0.1。/o，pH8.0)中，并調(diào)節(jié)至OD細(xì)為160。為了使細(xì)胞破裂，將lml該細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至獲自Hybaid的2mlRibolyser管中，且以6.0的旋轉(zhuǎn)設(shè)定值在獲自Hybaid的Ribolyser中裂解三次，每次30秒。通過(guò)4。C下在Eppendorf離心機(jī)中15,000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘來(lái)使裂解產(chǎn)物澄清，且將上清液轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf杯中。如Bradford,M.M.(1976)Anal.Biochem.72:248-254中所述，測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。以如下方式測(cè)定metA的酶活性。1mL^應(yīng)混合物含有100mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)、5mMMgCl2、100pM乙酰輔酶A、5mML-高絲氨酸、500jtMDTNB(Ellman，s試劑)及細(xì)胞提取物。通過(guò)加入每個(gè)蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物啟始測(cè)定，并在室溫下孵育。接著在412nm處記錄動(dòng)力學(xué)10分^7。這些結(jié)果顯示于表3a中。表3a菌林比活性[nmol/mg/分鐘JATCC13032pClik5MCS12.6ATCC13032pClik5MCSPmetAmetA50.7ATCC13032pCliK5MCSPsodmetA100.7可能通過(guò)使用異源表達(dá)單元來(lái)顯著增加MetA的活性。<110>巴斯福股份乂〉司(BASFAKTIENGESELLSCHAFT)<Q20>Psod表達(dá)單元<130〉PF55185/Mec<140>20030320〈141〉<160>44<210>1<211>173<212>腿<213>谷氨酸棒桿菌(Corynebacteri咖glutamicum)〈220〉<223>超氧化物歧化酶RXA03119<400>1gctgccaattattccgggcttgtgacccgctacccgataaataggtcggctgaaaaattt60cgttgcaatatcaacaaaaaggcctatcattgggaggtgtcgcaccaagtacttttgcga120agcgccatctgacggattttcaaaagatgtatatgctcggtgcggaaacctac173<210>2<211>191<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220><223>超氧化物歧化酶RXA03119〈400>2agctgccaattattccgggcttgtgacccgtcgttgcaatatcaacaaaaaggcctatcaaagcgccatctgacggattttcaaaagatgattttttacccctacccgataaataggtcggctgaaaaatt60ttgggaggtgtcgcaccaagtacttttgcg120tatatgctcggtgcggaaacctacgaaagg180191<210>3<211>1365〈212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220〉<223〉RXA00077<400>3atgaatgatgagaatattcaaagctccaactatcagccattcccgagttttgacgattgg60ttctgatttg120aagagctgcc180aactggtaga360gagccaagaa420aaacagatcgaggtgtcgctcttagatgtcatcgaatcctcacgccatttaaagatagcactgatcgttctgcgttagatgctgcgctagagagagcaaagcagttgataccaatgccatagaaggaatcttccaaactgatcgcggttttacccataca240gttgc犯cgcaggtaggggcttgggagc犯ca犯tggcgatgaaaggcaaacatgtt犯g300cctgcgtttgacgatactctagaaggctttgagtatgttctcgatgcagtactccaatctctcagcaatggattagaaatttgcacgccgtcattctgcgagccacgaggtttttacagccgttggagtccaaaatcaggcgcttcagaaaggcgagtat480aaaactcagccaaatagtccacagcgctcagatggatctgtacatgcatacgccccagtt540gaagatactcctgctgaaatggctagatttatttcagaacttgaatctaaggaattctta600gcagccgagaaggttattcaagctgcctatgcccactatgctttcgtatgtattcatcct660tttgcagatgggaatggacgagttgcacgagccttggctagtgtttttctatacaaagat720cctggtgtccctctcgtaatctaccaagatcaacgcagagattacatccatgctctagaa780gcagcggacaagaataacccgctcctgctgattagattctttgctgaacgagtgaccgat840actattaactctattatcgttgatctcactaccccgatcgcgggtaaatctggttcggct900aagctttcggatgcgctacgccccactcgcgtattaccagaattacatgatgctgcacat%0aggctccaagaaagtttatttacagaaatccgatctcgattggatgaagaaggaaaaagg1020aatgggttggagtttctacttcaacggattUtatcggttccccattcaatctgccagag1080ggctataacgctttccctgatagctattgtctgaccttagctttcaatagcaactctcca1140aaacaaatcttccacccgctatccatagtaatagcagctcgagatgggaaaagagcgagc1200agcgacctcgtggcagctacttctattggatacaactttcacgcttacgggagcctgttgttactga犯gctttcgagaacgtgtgaaaatttacgccgaacgtgaagtc1260cgggattgta1320gatcacttcttaaccgaactggctaaaaagtttcaacagaattaa1365<210>4<211>454<212>PRT<213>谷氨酸棒桿菌〈400〉4MetAsn1AspGluAsnlieGinSerSerAsnTyrGinProPheProSer51015PheAspAspTrpLysGinlieGluValSerLeuLeuAspVallieGlu202530SerSerArgHisPheSerAspLeuLysAspSerThrAspArgSerAla354045LeuAspAlaAlaLeuGluArgAlaLysArgAlaAlaAlaValAspThr505560AsnAlalieGluGlyliePheGinThrAspArgGlyPheThrHisThr65707580ValAlaThrGinValGlyAlaTrpGluGinGinMetAlaMetLysGly859095LysHisValLysProAlaPheAspAspThrLeuGluGlyPheGluTyr100105110ValLeuA印AlaValThrGlyArgThrProlieSerGinGinTrplie115120125ArgAsnLeuHisAlaVallieLeuArgSerGinGluSerHisGluVal130135140PheThrAlaValGlyValGinAsnGinAlaLeuGinLysGlyGluTyr145150155160LysThrGinProAsnSerProGinArgSerAspGlySerValHisAla165170175TyrAlaProValGluA印ThrProAlaGluMetAlaArgPhelieSer180185190GluLeuGluSerLysGluPheLeuAlaAlaGluLysVallieGinAla195200205AlaTyrAlaHisTyrAlaPheValCyslieHisProPheAlaAspGly210215220AsnGlyArgValAlaArgAlaLeuAlaSerValPheLeuTyrLysAsp225230235240ProGlyValProLeuVallieTyrGinAspGinArgArgAspTyrlie245250255HisAlaLeuGluAlaAlaAspLysAsnAsnProLeuLeuLeulieArg260265270PhePheAlaGluArgValThrAspThrlieAsnSerlielieValAsp275280285LeuThrThrProlieAlaGlyLysSerGlySerAlaLysLeuSerAsp290295300AlaLeuArgProThrArgValLeuProGluLeuHisAspAlaAlaHis305310315320ArgLeuGinGluSerLeuPheThrGlulieArgSerArgLeuAspGlu325330335GluGlyLysArgAsnGlyLeuGluPheLeuLeuGinArgliePhelie340345350GlySerProPheAsnLeuProGluGlyTyrAsnAlaPheProAspSer355360365TyrCysLeuThrLeuAlaPheAsnSerAsnSerProLysGinliePhe370375380HisProLeuSerlieVallieAlaAlaArgAspGlyLysArgAlaSer385390395400SerAspLeuValAlaAlaThrSerlieGlyTyrAsnPheHisAlaTyr405410415GlyArgGluValGluProValValThrGluSerPheArgGluArgVal420425430LyslieTyrAlaAspGlylieValAspHisPheLeuThrGluLeuAla435440445LysLysPheGinGinAsn450535DNA谷氨酸棒桿菌<220><223>SEQ—ID5<400>5gagagagagacgcgtcccagtggctgagacgcatc35〈210〉6<211〉34<212〉DNA〈213〉谷氨酸棒桿菌<220〉<223>SEQJD一6<400〉6ctctctctgtcgacgaattcaatcttacggcctg34<210>7<211>4323<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌<220>〈223〉SEQ一ID一7<220〉<221〉misc_feature<222>(457亍..(1248)<223>KanR<220><221〉misc_feature<222>(1515).,(2375)<223>Ori-EC(pMB)<220><221〉misc一feature<222>(1515).■(2375)<223>Ori-EC(pMB)complement<220><221>misc—feature<222>(2418),,(3839)<223>SacBcomplement〈220〉<221>misc_fea/ture<222〉(3840)..(4302)<223>PsacBcomplement<400>7tcgagaggcctgacgtcgggcccggtaccacgcgtcatatgactagttcggacctaggga60tatcgtcgacatcgatgctcttctgcgttaattaacaattgggatcctctagacccggga120tttaaatcgctagcgggctgctaaaggaagcggaacacgtagaaagccagtccgcagaaa180cggtgctgaccccggatg犯tgtcagctactgggctatctggacaagggaaaacgcaagc240gcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggtt300ttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaag360ccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatca420agatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcac480gcaggttctccggccgcttgggtgg卿ggctattcggctatgactgggcacaacagaca540atcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttcttttt600gtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcg660tggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcggga720agggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgct780cctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccg840gctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatg900gaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagcc%0gaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccat1020ggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgac1080tgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatatt1140gctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgct1200cccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcgggactc1260tggggttcgaaatgaccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattcca1320ccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatga1380tcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccacgctagcggcgcgccggccg1440gcccggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttcc1500gcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagct1560cactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagELacEitg1620tgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttc1680cataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcga1740aacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctct1800cctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtxcgcctttctcccttcgggaagcgtgI860gcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaag1920ctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactat1980cgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaac2040aggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttg犯gtggtggcct犯c2100tacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttc2160ggaaa犯gagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttt2220tttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatc2280ttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatg2340agattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaaggccggccgcggccgccatcgg2400cattttcttttgcgtttttatttgttaactgttaattgtccttgttcaaggatgctgtct2460ttgacaacagatgttttcttgcctttgatgttcagcaggaagctcggcgcaaacgttgat2520tgtttgtctgcgtagaatcctctgtttgtcatatagcttgtaatcacgacattgtttcct2580ttcgcttgaggtacagcgaagtgtgagtaagtaaaggttacatcgttaggatcaagatcc2640atttttaac6Lcaaggccagttttgttcagcggcttgtatgggccagttaaagaattagaa2700acataaccaagcatgtaaatatcgttagacgtaatgccgtcaatcgtcatttttgatccg2760cgggagtcagtgaacaggtaccatttgccgttcattttaaagacgttcgcgcgttcaatt2820tcatctgttactgtgttagatgcaatcagcggtttcatcacttttttcagtgtgtaatca2880tcgtttagctcaatcataccgagagcgccgtttgctaactcagccgtgcgttttttatcg2940ctttgcagaagtttttgactttcttgacggaagaatgatgtgcttttgccatagtatgct3000ttgttaaata,eittcttcgccttggtagccatcttcagttccagtgtttgcttcaaat3060</column></row><row><column><220><223〉PCIS\LYSC<220><221>misc_feature〈222〉(155亍..(1420)<223>lysC〈220><221〉misc_feature<222>(1974)..(2765)<223〉KanR<220><221>misc_feature<222>(3032)..(3892)<223>Ori-ECcomplement<220><221>misc_feature<222>(3913)..(3934)<223>sacBdownstreamcomplement<220>〈221〉misc—feature<222>(3935)..(5356)<223>sacB(枯草芽胞4干菌(BacillusSubtilis))complement<220><221〉misc_feature<222>(5357)..(5819)<223>PromotorsacBcomplement<400>8cccggtaccacgcgtcccagtggctgagacgcatccgctaaagccccaggaaccctgtgc60agaaagaaaacactcctctggctaggtagacacagtttataaaggtagagttgagcgggt120aactgtcagcacgtagatcgaaaggtgcacaaaggtggccctggtcgtacagaaatatgg180cggttcctcgcttgagagtgcggaacgcattagaaacgtcgctgaacggatcgttgccac240caagaaggctggaaatgatgtcgtggttgtctg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ccgcaggc420aagatcgacatcgaagctccagttgcccacaacatcaacgcggtggcaaagtccaaggga480atcaacccttccgacgtcaccgttgtcgtgcttgaccgtcctcgccacatcgaactgatc540gcagacattcgtcgtgcaggcgcaaaggttcgtctcatctccgacggcgacgttgcaggt600gcagttgcagcagctcaggattccaactccgtggacatcatgatgggcaccggcggaacc660ccagaaggcatcatcactgcgtgcgccatgaagtgcatgggtggcgaaatccagggcatc720ctggccccaatgaacgatttcgagcgccagaaggcacacgacgctggtctggttcttgat780caggttctgcacaccaacgatctggtgagctccgacaactgctacttcgtggcaaccggt840gtgaccaacggtgacatgctccgtggcgtttcctaccgcgcaaacggcgcaaccacccgt900tccctggttatgcgcgcaaagtcaggcaccatccgccacatcgagtctgtccaccagctg960tccaagctgcaggaatactccgtggttgactacaccaccgcgacc1005<210>41<211>335〈212〉PRT<213>谷氨酸棒桿菌〈400>41MetAsnLeuLysAsn15ProGluThrProAspArg10AsnLeuAlaMetGlu15LeuValArgValThrGluAlaAlaAlaLeuAlaSerGlyArgTrpVal202530GlyArgGlyMetLysAsnGluGlyAspGlyAlaAlaValAspAlaMet354045ArgGinLeulieAsnSerValThrMetLysGlyValValVallieGly505560GluGlyGluLysA印GluAlaProMetLeuTyrAsnGlyGluGluVal65707580GlyThrGlyPheGlyProGluValAsplieAlaValAspProValA印859095GlyThrThrLeuMetAlaGluGlyArgProAsnAlalieSerlieLeu100105110AlaAlaAlaGluArgGlyThrMetTyrAspProSerSerValPheTyr115120125MetLysLyslieAlaValGlyProGluAlaAlaGlyLyslieAsplie130135140GluAlaProValAlaHisAsnlieAsnAlaValAlaLysSerLysGly145150155160lieAsnProSerAspValThrValValValLeuAspArgProArgHis165170175lieGluLeulieAlaAsplieArgArgAlaGlyAlaLysValArgLeu180185190lieSerA印GlyAspValAlaGlyAlaValAlaAlaAlaGinAspSer195200205AsnSerValAsplieMetMetGlyThrGlyGlyThrProGluGlylie210215220lieThrAlaCysAlaMetLysCysMetGlyGlyGlulieGinGlylie225230235240LeuAlaProMetAsnAspPheGluArgGinLysAlaHisAspAlaGly245250255LeuValLeuAspGinValLeuHisThrAsnAspLeuValSerSerAsp260265270AsnCysTyrPheValAlaThrGlyValThrAsnGlyAspMetLeuArg275280285GlyValSerTyrArgAlaAsnGlyAlaThrThrArgSerLeuValMet290295300ArgAlaLysSerGlyThrlieArgHislieGluSerValHisGinLeu305310315320SerLysLeuGinGluTyrSerValValAspTyrThrThrAlaThr325330335<210〉42<211〉6<212〉DNA〈213>谷氨酸棒桿菌<220>〈223〉POTENTIELLE—-10-區(qū)—1<400〉42tgcaat6<210〉43<211〉7<212>DNA<213>谷氨酸棒桿菌〈220>〈223>POTENTIELLE—-10-區(qū)_2<400>43tatcatt了<210>44<211>7<212>薩<213>谷氨酸棒桿菌<220>〈223〉RIBOSOMALE_BINDUNGSSTELLE\SHINE-DALGARNO<400〉44gaaagga權(quán)利要求1.一種具有啟動(dòng)子活性的核酸在基因轉(zhuǎn)錄中的用途，所述核酸包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通過(guò)核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.1衍生的，并在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.1雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段。2.—種表達(dá)單元在基因表達(dá)中的用途，所述表達(dá)單元包含根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸及額外的功能性連接的核酸序列，所述核酸序列確保核糖核酸的翻譯。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中所述表達(dá)單元包含E)核,列SEQ.ID.N0.2，或F)通過(guò)核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.2衍生的，并在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.2具有至少90%同一性的序列，或G)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.N0.2雜交的核酸序列，或H)E)、F)或G)序列的功能等效片段。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中所述表達(dá)單元由核酸序列SEQ.ID.NO.2組成。5.—種具有啟動(dòng)子活性的核酸，其包含A)核紗列SEQ.ID.NO.1,或B)通過(guò)核普酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.l衍生的，并在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.1具有至少90%同一性的序列，或C)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.l雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段，其前體條件是排除包含序列SEQ.ID.NO.l的核酸。6.—種表達(dá)單元，其包含根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸及額外的功能性連接的核酸序列，所迷核酸序列確保核糖核酸的翻譯。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)單元，其包含E)核,列SEQ.ID.N0.2，或F)通過(guò)核苦酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.N0.2衍生的，并在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.2具有至少90%同一性的序列，或G)在嚴(yán)格條件下與核酸序列SEQ.ID.N0.2雜交的核酸序列，或H)E)、F)或G)序列的功能等效片段，其前體條件是排除包含序列SEQ.ID.N0.2的核酸。8.—種與野生型相比，改變或影響微生物中基因轉(zhuǎn)錄速率的方法，其通過(guò)a)與野生型相比，改變微生物中根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源核酸的特異啟動(dòng)子活性，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或b)以根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸，或以具有根據(jù)實(shí)施方案a)所述的改變的特異啟動(dòng)子活性的權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸來(lái)調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中所述基因與所述具有啟動(dòng)子活性的核酸是異源的。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中以根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸，或以具有根據(jù)實(shí)施方案a)所述的改變的特異啟動(dòng)子活性的以下方式達(dá)到bl)將一種或多種根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或b2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的內(nèi)源核酸控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄，或b3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含根3據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中與野生型相比，為了提高或影響微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率，ah)與野生型相比，根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源核酸在微生物中的特異啟動(dòng)子活性是增加的，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或bh)以根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸，或以具有根據(jù)實(shí)施方案a)所述的增加的特異啟動(dòng)子活性的核酸來(lái)調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中所迷基因與所述具有啟動(dòng)子活性的核酸是異源的。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中以根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸，或以具有根據(jù)實(shí)施方案a)所述的增加的特異啟動(dòng)子活通過(guò)以下方式達(dá)到bhl)將一種或多種根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或bh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動(dòng)子活性的內(nèi)源核酸控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄，或bh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動(dòng)子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。12.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中與野生型相比，為了降低微生物中基因的轉(zhuǎn)錄速率，ar)與野生型相比，根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源核酸在孩i生物中的特異啟動(dòng)子活性是降低的，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或br)將具有根據(jù)實(shí)施方案a)所述的降低的特異啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在所述導(dǎo)入的具有降低的啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄。13.—種與野生型相比，改變或影響微生物中基因表^ii率的方法，其通過(guò)c)與野生型相比，改變微生物中根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的內(nèi)源表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，所迷內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，或d)以根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，或以具有根據(jù)實(shí)施方案c)中基因的表達(dá)，其中所述基因與所述表達(dá)單元是異源的。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中以根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，或以具有根據(jù)實(shí)施方案a)所述的改變的特異表達(dá)活性的權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元來(lái)調(diào)節(jié)微生物中基因表達(dá)通過(guò)以下方式達(dá)到dl)將一種或多種適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的表達(dá)單元控制下進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或d2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或，、'；'、…'d3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中與野生型相比，為了提高或影響微生物中基因的表達(dá)速率，ch)與野生型相比，根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性是增加的，所述內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)所述內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh)以根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，或以具有根據(jù)實(shí)施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元來(lái)調(diào)節(jié)微生物中基因表達(dá)，其中所述基因與所述表達(dá)單元是異源的。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中以根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，或以具有根據(jù)實(shí)施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元來(lái)調(diào)節(jié)微生物中基因表達(dá)通過(guò)以下方式達(dá)到dhl)將一種或多種適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元控制下進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的內(nèi)源表達(dá)單元控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或dh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。17.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中與野生型相比，為了降低微生物中基因的表^ii率，cr)與野生型相比，根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性是降低的，所述內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)所述內(nèi)源基因的表達(dá)，或dr)將根據(jù)實(shí)施方案cr)所述的具有降低的特異表達(dá)活性的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在所述導(dǎo)入的具有降低的表達(dá)活性的表達(dá)單元控制下進(jìn)行內(nèi)源基因的表達(dá)。18.根據(jù)權(quán)利要求8-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基因選自編碼來(lái)自蛋白型與非生蛋白氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自核苷酸與核苷的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自有機(jī)酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自二醇的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自糖類的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自維生素的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)蛋白質(zhì)的核酸，其中所述基因任選包含其他調(diào)節(jié)元件。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述來(lái)自氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二M庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氬酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysRl、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2、蘋(píng)果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶、胱硫醚Y合酶、胱硫醚P裂合酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙酰-轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶、蘇氨酸輸出子載體、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出子、生物素連接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶亞基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氬酶、RXA00655調(diào)節(jié)物、RXN2910調(diào)節(jié)物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸排出蛋白、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、果糖-l，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247、蛋白質(zhì)OpcA、l-磷酸果糖激酶及6-磷酸20.—種表達(dá)盒，其包含a)至少一種根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，及b)至少一種其他待表達(dá)核酸，及c)適當(dāng)條件下其他遺傳控制元件，其中至少一種表達(dá)單元與其他待表達(dá)核酸序列功能性連接在一起，且所述其他待表達(dá)核酸序列與所述表達(dá)單元是異源的。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的表達(dá)盒，其中所述其他待表達(dá)核酸序列選自編碼來(lái)自蛋白型與非生蛋白氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自核苷酸與核苷的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自有機(jī)酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自二醇的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自糖類的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自維生素的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、途徑的蛋白質(zhì)的核酸。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的表達(dá)盒，其中所述來(lái)自氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二氨基庚二,氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡"定二羧酸還原酶、甘油醛-3-辨酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysRl、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2、蘋(píng)果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶、胱硫醚Y合酶、胱硫醚P裂合酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙酰-轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶、蘇氨酸輸出子載體、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出子、生物素連接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、輔酶B12依賴型曱硫氨酸合酶、非輔酶B12依賴型曱硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶亞基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、RXA00655調(diào)節(jié)物、RXN2910調(diào)節(jié)物、精氨酰-tRNA合成酶、砩酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸排出蛋白、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、果糖-l，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247、蛋白質(zhì)OpcA、l-磷酸果糖激酶及6-磷酸23.—種表達(dá)栽體，其包含根據(jù)權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)所述的表達(dá)盒。24.—種基因修飾微生物，其中所述基因修飾導(dǎo)致與野生型相比，改變或影響至少一種基因的轉(zhuǎn)錄速率，并取決于a)改變微生物中至少一種根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源核酸的特異啟動(dòng)子活性，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)至少一種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或b)以根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸，或以具有根據(jù)實(shí)施方案a)所述的改變的特異啟動(dòng)子活性的權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸來(lái)調(diào)節(jié)^:生物中基因轉(zhuǎn)錄，其中所述基因與所述具有啟動(dòng)子活性的核酸是異源的。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的基因修飾微生物，其中以根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸，或以具有才艮據(jù)實(shí)施方案a)所述的改變的特基因的轉(zhuǎn)錄通過(guò)以下方式達(dá)到bl)將一種或多種根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入孩t生物基因組中，以便在導(dǎo)入的根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或b2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的內(nèi)源核酸控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄，或b3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有改變的特異啟動(dòng)子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的基因修飾微生物，其與野生型相比，至少一種基因具有提高或影響的轉(zhuǎn)錄速率，其中ah)與野生型相比，根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源核酸在微生物中的特異啟動(dòng)子活性是增加的，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或bh)以根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸，或以具有根據(jù)實(shí)施方案ah)的增加的特異啟動(dòng)子活性的核酸來(lái)調(diào)節(jié)微生物中基因的轉(zhuǎn)錄，其中所述基因與所述具有啟動(dòng)子活性的核酸是異源的。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的基因修飾微生物，其中以根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性的核酸，或以具有根據(jù)實(shí)施方案a)所述的增加的特基因的轉(zhuǎn)錄通過(guò)以下方式達(dá)到bhl)將一種或多種根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或bh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動(dòng)子活性的內(nèi)源核酸控制下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄，或bh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有啟動(dòng)子活性、適當(dāng)條件下具有增加的特異啟動(dòng)子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉(zhuǎn)錄核酸。28.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的基因修飾微生物，其與野生型相比，至少一種基因具有降低的轉(zhuǎn)錄速率，其中ar)與野生型相比，至少一種根據(jù)權(quán)利要求l所述的具有啟動(dòng)子活性的內(nèi)源核酸在微生物中的特異啟動(dòng)子活性是降低的，所述內(nèi)源核酸調(diào)節(jié)至少一種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，或br)將一種或多種具有根據(jù)實(shí)施方案a)所述的降低的啟動(dòng)子活性的核酸導(dǎo)入孩史生物基因組中，以便在所述導(dǎo)入的具有降低的啟動(dòng)子活性的核酸控制下進(jìn)行至少一種內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄。29.—種基因修飾微生物，其中所述基因修飾導(dǎo)致與野生型相比，改變或影響至少一種基因的表達(dá)速率，并取決于c)與野生型相比，改變微生物中根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的至少一種內(nèi)源表達(dá)單元的特異表達(dá)活性，所述內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)至少一種內(nèi)源基因的表達(dá)，或d)以根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，或以具有根據(jù)實(shí)施方案a)中基因的表達(dá)，其中所述基因與所述^^單元是異源的:、-30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的基因修飾微生物，其中以根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，或以具有根據(jù)實(shí)施方案a)所述的改變的特異表達(dá)活性的權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元來(lái)調(diào)節(jié)微生物中基因表達(dá)通過(guò)以下方式達(dá)到dl)將一種或多種適當(dāng)條件下具有改變的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在所述導(dǎo)入的適當(dāng)條進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或d2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在所述適當(dāng)條件下進(jìn)行一種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或d3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。31.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的基因修飾微生物，其與野生型相比，至少一種基因具有提高或影響的表達(dá)速率，其中ch)與野生型相比，根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的至少一種內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性是增加的，所述內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh)以根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，或以具有根據(jù)實(shí)施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元來(lái)調(diào)節(jié)微生物中基因的表達(dá)，其中所述基因與所述表達(dá)單元是異源的。32.根據(jù)權(quán)利要求31的基因修飾微生物，其中以根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元，或以具有根據(jù)實(shí)施方案a)所述的增加的特異表達(dá)活性的權(quán)到，，-.,,、、、、，土、.、、,，dhl)將一種或多種適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元控制下進(jìn)行一種或多種內(nèi)源基因的表達(dá)，或dh2)將一種或多種基因?qū)胛⑸锘蚪M中，以便在適當(dāng)條件下具有:種或多種導(dǎo)入基因的表達(dá)，或，5、；、'dh3)將一種或多種核酸構(gòu)建物導(dǎo)入微生物中，所述核酸構(gòu)建物包含適當(dāng)條件下具有增加的特異表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元及功能性連接的一種或多種待表達(dá)核酸。33.根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的基因修飾微生物，其與野生型相比，至少一種基因具有降低的表達(dá)速率，其中cr)與野生型相比，根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的至少一種內(nèi)源表達(dá)單元在微生物中的特異表達(dá)活性是降低的，所述內(nèi)源表達(dá)單元調(diào)節(jié)至少一種內(nèi)源基因的表達(dá)，或dr)將一種或多種具有降低的表達(dá)活性的根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元導(dǎo)入微生物基因組中，以便在導(dǎo)入的具有降低的表達(dá)活性的權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元控制下進(jìn)行至少一種基因的表達(dá)。34.—種基因修飾微生物，其包含根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)單元及以功能性連接的待表達(dá)基因，其中所述基因與所述表達(dá)單元是異源的。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的基因修飾微生物，其包含根據(jù)權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)所述的表達(dá)盒。36.根據(jù)權(quán)利要求24-35中任一項(xiàng)所述的基因修飾微生物，其中所述基因選自編碼來(lái)自蛋白型與非生蛋白氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自核苷酸與核苷的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自有機(jī)酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自二醇的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自糖類的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸、編碼來(lái)自維生素的生物合成途徑的蛋白質(zhì)的物合成途徑的蛋白質(zhì)的核酸，其中所述基因任選包含其他調(diào)節(jié)元件。37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的基因修飾微生物，其中所述來(lái)自氨基酸的生物合成途徑的蛋白質(zhì)選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二^J^庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡咬二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氬酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysRl、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2、蘋(píng)果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-砩酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮酶、轉(zhuǎn)醛酶、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶、胱硫醚Y合酶、胱石克醚P裂合酶、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶、蘇氨酸輸出子載體、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出子、生物素連接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶n、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶亞基1和2、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氬酶、RXA00655調(diào)節(jié)物、RXN2910調(diào)節(jié)物、精氨酰-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸排出蛋白、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、果糖-l，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247、蛋白質(zhì)OpcA、l-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。38.—種通過(guò)培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求24至37中任一項(xiàng)所述的基因修飾微生物來(lái)制備生物合成產(chǎn)物的方法。39.—種通過(guò)培射艮據(jù)權(quán)利要求24、25、31或32中任一項(xiàng)所述的基因修飾微生物來(lái)制備賴氨酸的方法，其中所述基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼二氨基庚二酸脫氫酶的核酸、編碼二氨基庚二酸脫羧酶的核酸、編碼二氫吡咬二羧酸合成酶的核酸、編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氬酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysRl的核酸、編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2的核酸、編碼蘋(píng)果酸-醌氧化還原酶的核酸、編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核酸、編碼6-磷酸葡糖酸脫氬酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)酮酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)醛酶的核酸、編碼賴氨酸輸出子的核酸、編碼生物素連接酶的核酸、編碼精氨酰-tRNA合成酶的核酸、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、編碼果糖-l，6-二磷酸酶的核酸、編碼蛋白質(zhì)OpcA的核酸、編碼l-磷酸果糖激酶的核酸及編碼6-磷酸果糖激酶的核酸。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，所述活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、二M庚二酸脫氫酶活性、二氨基庚二酸脫羧酶活性、二氫吡啶二羧酸合成酶活性、二氬吡啶二羧酸還原酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構(gòu)酶活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR的活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysRl的活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物L(fēng)ysR2的活性、蘋(píng)果酸-醌氧化還原酶活性、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、6-磷酸葡糖酸脫氫酶活性、轉(zhuǎn)酮酶活性、轉(zhuǎn)醛酶活性、賴氨酸輸出子活性、精氨酰-tRNA合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、果糖-l，6-二磷酸酶活性、蛋白質(zhì)OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-41.根據(jù)權(quán)利要求39或40所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，所述活性選自蘇氨酸脫水酶活性、高絲氨酸o-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、o-乙酰-高絲氨酸硫化氫解酶活性、烯醇丙酮酸砩酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、高絲氨酸激酶活性、高絲氨酸脫氫酶活性、蘇氨酸輸出子活性、蘇氨酸排出蛋白活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脫羧酶活性及蘇氨酸合酶活性。42.—種通過(guò)培射艮據(jù)權(quán)利要求24、25、31或32中任一項(xiàng)所述的基因修飾微生物來(lái)制備甲硫氨酸的方法，其中所述基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼高絲氨酸脫氫酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的核酸、編碼高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼胱硫醚Y合酶的核酸、編碼胱硫醚P裂合酶的核酸、編碼絲氨酸羥曱基轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼O-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶的核酸、編碼亞甲基四氫葉酸還原酶的核酸、編碼磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼磷酸絲氨酸磷酸酶的核酸、編碼絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼半胱氨酸合酶I的核酸、編碼半胱氨酸合酶II的核酸、編碼輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶的核酸、編碼非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶的核酸、編碼硫酸腺普酰轉(zhuǎn)移酶的核酸、編碼磷酸腺苷磷酰硫酸還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白-亞石危酸鹽還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白NADPH-還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白的核酸、編碼硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077的核酸、編碼硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248的核酸、編碼硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247的核酸、編碼RXA0655調(diào)節(jié)物的核酸及編碼RXN2910調(diào)節(jié)物的核43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，所述活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、高絲氨酸脫氬酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氬酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構(gòu)酶活性、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、胱硫醚Y合酶活性、胱硫醚P裂合酶活性、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性、O-乙酰高絲氨酸硫化氪解酶活性、亞甲基四氫葉酸還原酶活性、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸絲氨酸砩酸酶活性、絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、半胱氨酸合酶I活性、半胱氨酸合酶II活性、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶活性、磷酸腺苷-磷酰硫酸還原酶活性、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶活性、鐵氧還蛋白NADPH-還原酶活性、鐵氧還蛋白活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA077的活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA248的活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質(zhì)RXA247的活性、RXA655調(diào)節(jié)物的活性及RXN2910調(diào)節(jié)物的活性。44.根據(jù)權(quán)利要求42或43所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，所述活性選自高絲氨酸激酶活性、蘇氨酸脫水酶活性、蘇氨酸合酶活性、內(nèi)消旋二氨基庚二酸D-脫氫酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氫吡啶二羧酸合酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性及二氨基吡啶曱酸脫羧酶活性。45.—種通過(guò)培科艮據(jù)權(quán)利要求24、25、31或32中任一項(xiàng)所述的基因修飾微生物來(lái)制備蘇氨酸的方法，其中所述基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氬酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖磷酸異構(gòu)酶的核酸、編碼高絲氨酸激酶的核酸、編碼蘇氨酸合酶的核酸、編碼蘇氨酸輸出子載體的核酸、編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)醛酶的核酸、編碼轉(zhuǎn)酮酶的核酸、編碼蘋(píng)果酸-醌氧化還原酶的核酸、編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的核酸、編碼賴氨酸輸出子的核酸、編碼生物素連接酶的核酸、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、編碼蘇氨酸排出蛋白的核酸、編碼果糖-l，6-二磷酸酶的核酸、編碼OpcA蛋白質(zhì)的核酸、編碼l-磷酸果糖激酶的核酸、編碼6-磷酸果糖激酶的核酸及編碼高絲氨酸脫氬酶的核酸。46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，所述活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氬酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氬酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構(gòu)酶活性、蘇氨酸合酶活性、蘇氨酸輸出子載體活性、轉(zhuǎn)醛酶活性、轉(zhuǎn)酮酶活性、葡萄糖-6-磷酸脫氬酶活性、蘋(píng)果酸-醌氧化還原酶活性、高絲氨酸激酶活性、生物素連接酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、蘇氨酸排出蛋白活性、蛋白質(zhì)OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、果糖-l，6-二磷酸酶活性、6-磷酸葡糖酸脫氫酶活性及高絲氨酸脫氫酶活性。47.根據(jù)權(quán)利要求45或46所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，所述活性選自蘇氨酸脫水酶活性、高絲氨酸O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶活性、O-乙酰高絲氨酸石克化氫解酶活性、內(nèi)消旋二氨基庚二酸D-脫氫酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氫吡啶二羧酸合成酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性、天冬酰胺酶活性、天冬氨酸脫羧酶活性、賴氨酸輸出子活性、乙酰乳酸合酶活性、乙酮醇-酸還原異構(gòu)酶活性、支鏈氨基轉(zhuǎn)移酶活性、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、二幾基-酸脫水酶活性及二氨基吡啶甲酸脫羧酶活性。48.根據(jù)權(quán)利要求38-47中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物合成產(chǎn)物在培養(yǎng)步驟后和/或培養(yǎng)步驟期間中從培養(yǎng)基中分離，且在適當(dāng)條件下純化。49.核酸序列SEQ.ID.NO.44作為能使基因在棒桿菌屬或短桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)的表達(dá)單元中核糖體結(jié)合位點(diǎn)的用途。50.核^列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43作為能使基因在棒桿菌屬或短桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)的表達(dá)單元中-10區(qū)的用途。51.—種能使基因在棒桿菌屬或短桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)的表達(dá)單元，其包含核,列SEQ.ID.NO.44。52.才艮據(jù)權(quán)利要求51所述的表達(dá)單元，其中所述核酸序列SEQ.ID.NO.44作為核糖體結(jié)合位點(diǎn)。53.—種能使基因在棒桿菌屬或短桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)的表達(dá)單元，其包含核酸序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43中的至少一種。54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的表達(dá)單元，其中所述核酸序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43之一作為-10區(qū)。全文摘要本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的核酸序列的用途、新啟動(dòng)子及表達(dá)單元、用于改變或影響基因轉(zhuǎn)錄速率和/或表達(dá)速率的方法、包含所述表達(dá)單元的表達(dá)盒、具有改變的或受影響的轉(zhuǎn)錄速率和/或表達(dá)速率的基因修飾微生物及通過(guò)培育所述基因修飾微生物制備生物合成產(chǎn)物的方法。文檔編號(hào)C12N9/02GK101230351SQ20071030119公開(kāi)日2008年7月30日申請(qǐng)日期2004年12月16日優(yōu)先權(quán)日2003年12月18日發(fā)明者B·克勒格爾,C·克洛普羅格,H·施羅德,O·策爾德?tīng)?S·哈夫納申請(qǐng)人:巴斯福股份公司