專利名稱：：對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎或臭鼻亞種特異的its序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及克雷伯氏菌(K/eZwW/")中7個(gè)種和亞種的16srRNA-23srRNA之間的核苷酸全序列(16S-23SrRNAinternaltranscribedspacer,以下簡(jiǎn)稱ITS),尤其涉及對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎或臭鼻亞種特異的ITS核苷酸序列及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：克雷伯氏菌屬是條件致病菌，經(jīng)?？蓮娜祟惡蛣?dòng)物的多種感染中分離得到。作為條件致病菌，克雷伯氏菌能夠引起嚴(yán)重的敗血癥、肺炎、尿路感染和軟組織感染(BagIey，1985;Grimont,1992;PodschunandUlhnann,1998;GordonandFitzGibbon,1999)。在美國(guó)和歐洲，由克雷伯氏菌引起的感染占醫(yī)院感染的8%，成為醫(yī)院感染中最重要的8個(gè)致病菌之一(Homn，1988;Schaberg,1991.)。同時(shí)，克雷伯氏菌屬的耐藥性問題日益嚴(yán)重，特別是產(chǎn)超光譜p-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)克雷伯菌屬的出現(xiàn)，增加了臨床治療難度。因此研究克雷伯氏菌屬具有重要的臨床意義。醫(yī)院中最常分離到的克雷伯氏菌是肺炎克雷伯氏菌(包括三亞種肺炎亞種、臭鼻亞種和鼻硬結(jié)亞種)和產(chǎn)酸克雷伯氏菌，偶爾報(bào)道有土生克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和解鳥氨酸克雷伯氏菌(DanielJonas，2004)。目前在醫(yī)院中，常用基于生化反應(yīng)的自動(dòng)微生物鑒定儀器如VITEK檢測(cè)和鑒定克雷伯氏菌屬進(jìn)行，整個(gè)過程需要大約24-48個(gè)小時(shí)(KumpatiP,2004)。此外在臨床上檢測(cè)和鑒定克雷伯氏菌十分困難，經(jīng)常出現(xiàn)誤檢，因?yàn)榭死撞暇鷮俚母鱾€(gè)種之間經(jīng)常有共同的生化反應(yīng)。例如在臨床上，植生克雷伯氏菌、土生克雷伯氏菌和解鳥氨酸克雷伯氏菌常被錯(cuò)檢為肺炎克雷伯氏菌，植生克雷伯氏菌有時(shí)也被被錯(cuò)檢為產(chǎn)酸克雷伯氏菌(MonnetD，1991;MoriM，1989)。甚至，在臨床上，大多數(shù)克雷伯氏菌屬都被鑒定為肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌(HansenDS,1998;BrisseS，2001;LiuY,1997)，因此準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)和鑒定克雷伯氏菌屬具有重要的臨床意義和應(yīng)用價(jià)值。位于16SrRNA和23SrRNA之間的核苷酸序列(16S-23SrRNAinternaltranscribedspacer,ITS。以下均簡(jiǎn)稱為ITS)用來作為致病菌檢測(cè)的靶標(biāo)分子具有明顯的優(yōu)勢(shì)(TBany，1991;Rossau，1992;Gurtler，1996)。最明顯的優(yōu)勢(shì)是ITS在進(jìn)化過程中比16SrRNA和23SrRNA受到更多的選擇壓力，其進(jìn)化速率速率相當(dāng)于16SrRNA或者23SrRNA的十倍，有更多的集中超變區(qū)域(Leblond-bourgetN,1996)，同時(shí)兩端是保守的16SrRNA和23SrRNA區(qū)域，既可在兩端的保守區(qū)域設(shè)計(jì)細(xì)菌的通用引物，又可在ITS的超變區(qū)域設(shè)計(jì)特異探針。ITS的優(yōu)勢(shì)之二是其比較短(約200-1000bp)，在基因組上有一個(gè)或多個(gè)拷貝。如果多個(gè)拷貝，那么不同拷貝之間有的是相同的(如臉^m'"菌屬)，也有的是不同的(如￡.這些不同有可能是幾個(gè)核苷酸的變化，也有可能是大段序列的插入或缺失。正因?yàn)镮TS具有以上兩個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)，因此越來越被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌種或亞種的鑒定(TungSK,2007;XiongL，2006;VolokhovDV,2006)、分型(MaggiRG，2006;RegassaLB，2004)和進(jìn)化分析(YukphanP，2006;SongJ,2004;XuD,2003)，尤其是用于親緣關(guān)系較近的菌種的鑒定。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種特異的ITS核苷酸序列，其包括以下序列-a)SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的DNA或RNA序列；b)不同于a)但編碼的RNA序列與a)所編碼的RNA序列相同的核苷酸序列或其互補(bǔ)的DNA或RNA序列；c)上述a)或b)中缺失、替換或插入一個(gè)或多個(gè)堿基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列或其互補(bǔ)的DNA或RNA序列。上述的對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種特異的ITS核苷酸序列中，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種高度特異的核苷酸序列為SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的DNA序列。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的全長(zhǎng)分別為427和429個(gè)堿基。其中SEQIDNO:3所示的核苷酸序列選自SEQIDNO:1的第152-170堿基的核苷酸序列或其互補(bǔ)的DNA序列。其中SEQIDNO:4所示的核苷酸序列選自SEQIDNO:2的第400-420堿基的核苷酸序列或其互補(bǔ)的DNA序列。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供上述的對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種特異的ITS核苷酸序列的應(yīng)用，其可用于檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種。具體地，上述的對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種特異的ITS核苷酸序列作為PCR引物或雜交反應(yīng)的探針或基因芯片或微陣列用于檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種。本發(fā)明還提供一種擴(kuò)增對(duì)克雷伯氏菌屬特異的ITS核苷酸序列的引物，其為SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的DNA序列。本發(fā)明還提供一種獲得對(duì)克雷伯氏菌特異的ITS核苷酸序列的方法，其包括下述步驟(1)提取基因組；(2)通過PCR擴(kuò)增克雷伯氏菌的ITS基因簇；(3)構(gòu)建ITS克隆；(4)對(duì)ITS克隆測(cè)序；(5)拼接及分析核苷酸序列；(6)篩選特異核苷酸序列；其中步驟(2)中使用的擴(kuò)增引物是SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的DNA序列。本發(fā)明還提供一種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，其中的PCR弓I物包括SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的DNA序列。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述PCR引物為SEQIDNO:3和SEQIDN0.4所示的核苷酸序列。上述的試劑盒可用于檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種。本發(fā)明配制的一種可檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的PCR試劑盒，將PCR檢測(cè)方法需要使用的組分組合在一起，使用時(shí)，提取待檢樣品基因組，同時(shí)經(jīng)過較為簡(jiǎn)單的操作程序就可以進(jìn)行快速、靈敏、簡(jiǎn)便的檢測(cè)、試劑盒中各組分的用量和濃度均為試驗(yàn)所得，用該試劑盒檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種所使用的試驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低。本發(fā)明還提供一種應(yīng)用上述的試劑盒檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)提取待檢臨床樣品(血培養(yǎng)物、尿培養(yǎng)物、痰培養(yǎng)物等)中細(xì)菌的DNA作為模板；(2)在PCR薄壁管中加入dNTP、MgCl2、lOx酶特異性反應(yīng)緩沖液、Taq聚合酶、引物、從待檢樣品中提取的模版DNA和ddH20，混勻；(3)將PCR薄壁管中混勻的混合物在PCR儀上擴(kuò)增；(4)在電泳設(shè)備中電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，記錄結(jié)果；(5)分析并進(jìn)行結(jié)果判斷。本發(fā)明針對(duì)不同的待檢臨床樣品提供的一種通用的細(xì)菌基因組提取方法，具體如下(1)臨床樣品培養(yǎng)物1.0ml8000rpm離心5分鐘，去上清。(2)500ulddH2O重懸沉淀，8000rpm離心5分鐘，去上清，盡量控干。(3)100ulddH2O重懸沉淀，IO(TC沸水浴IO分鐘。(4)置冰上10分鐘后，12000rpm離心2分鐘。(5)取3ul中層上清作為PCR反應(yīng)的模板。陽(yáng)性對(duì)照品為已確定是肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的樣品，陰性對(duì)照品則為經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確定不是肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的樣品，如大腸桿菌。待檢樣品模板可以是臨床樣品中的血培養(yǎng)物、痰培養(yǎng)物、尿培養(yǎng)物、腦脊液培養(yǎng)物等的粗提液，也可以是肺炎克雷伯氏菌(肺炎亞種或臭鼻亞種)的純培養(yǎng)物的粗提液，或是純DNA,或者是陽(yáng)性對(duì)照品或陰性對(duì)照卯o本PCR試劑盒若用肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的菌懸液煮沸粗提DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與酚氯仿或試劑盒提取得到的DNA作為模板擴(kuò)增所得結(jié)果一致。敏感度和特異性無差別，這樣，可省去模板DNA的提取步驟，使操作方法得以簡(jiǎn)化。同時(shí)，相比常規(guī)生化檢測(cè)方法而言，本方法所采用的待檢樣品可以直接是臨床樣品培養(yǎng)液，或者對(duì)待檢樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單分離培養(yǎng)就可進(jìn)行檢測(cè)，因而節(jié)省了人力物力。其中檢測(cè)使用劑量為PCR引物各0.5ul，10mMdNTP0.25ul，10x酶特異性反應(yīng)緩沖液2.5ul，5U/ul耐熱DNA聚合酶0.2ul，25mMMgCl22.5ul，3ul待檢樣品模板DNA，用ddH20補(bǔ)足總體積至25ul。其中上述的耐熱DNA聚合酶可以為Taq聚合酶。上述的PCR擴(kuò)增參數(shù)為95°C5分鐘1個(gè)循環(huán)；94°C30秒，55°C30秒，72。C30秒，30個(gè)循環(huán)；72。C2分鐘1個(gè)循環(huán)。本發(fā)明提供了一種對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種特異的ITS核苷酸序列并利用上述序列設(shè)計(jì)引物，通過優(yōu)化和設(shè)計(jì)，提供一種用于肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種檢測(cè)的靈敏度高、速度快、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、檢測(cè)周期短的PCR試劑盒及利用該試劑盒檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的存在。該試劑盒可克服現(xiàn)有技術(shù)中操作煩瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)、假陽(yáng)性高等的不足，可廣泛應(yīng)用于食品和臨床樣品的監(jiān)督和檢測(cè)、食物中病原菌檢測(cè)、細(xì)菌學(xué)分類及流行病學(xué)調(diào)査等領(lǐng)域，具有較高的使用價(jià)值。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，作詳細(xì)說明如下。圖l是本發(fā)明的克雷伯氏菌屬各種ITS核苷酸序列擴(kuò)增后的電泳圖，其中M是DL2000DNAmarker;圖2是本發(fā)明的PCR試劑盒陽(yáng)性對(duì)照品，陰性對(duì)照品和檢測(cè)的肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種代表株的電泳圖3A-3B是本發(fā)明的PCR試劑盒檢測(cè)代表菌株的電泳圖4是本發(fā)明的PCR試劑盒檢測(cè)臨床菌株的電泳圖5是肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種含有tRNA-Ile和tRNA-Ala基因的ITS核苷酸序列截圖，框區(qū)為引物位置；圖6是肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種含有tRNA-Ile和tRNA-Ala基因的ITS核苷酸序列截圖，框區(qū)為引物位置。具體實(shí)施方式實(shí)施例一引物的設(shè)計(jì)本發(fā)明對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種以及其他克雷伯氏菌的ITS進(jìn)行了核苷酸測(cè)序，通過比對(duì)，確定含tRNA-Ile和tRNA-Ala基因的ITS核苷酸為耙序列，如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸，全長(zhǎng)427和429個(gè)堿基；或者具有一個(gè)或多個(gè)插入、缺失或取代的堿基，同時(shí)保持所述分離的核苷酸功能的SEQIDNO:l和SEQIDNO:2的核苷酸。弓I物對(duì)SEQIDNO:3(5，-GCGAAGCAAATTTGAAGAG-3，)和SEQIDNO:4(5，-CCGAAGATGTTTCACTTCTGA-3，)是根據(jù)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的最長(zhǎng)ITS核苷酸類型(含有tRAN-Ile和tRNA-Ala的ITS)設(shè)計(jì)合成的寡核苷酸引物，分別位于基因序列上的152-170和400-420位置(詳見圖5和圖6中的框區(qū)位置)。該引物可在試管中由DNA聚合酶選擇性的復(fù)制合成介于兩引物之間的DNA區(qū)段(針對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種和肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種為269bp靶DNA片段)，因而可以將及其微量的(10pgDNA)目的基因在較短的時(shí)間內(nèi)(1.5小時(shí))擴(kuò)增到電泳檢測(cè)顯而易見的水平。實(shí)施例二ITS核苷酸序列的獲得及篩選(1)基因組的提取將搜集到的肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種菌株用LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，收集菌液，按照常規(guī)提取普通革蘭氏陰性菌基因組的方法提取肺炎克雷伯氏菌肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種培養(yǎng)物的基因組DNA;(2)通過PCR擴(kuò)增肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種中的ITS基因簇以肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的基因組為模板通過PCR擴(kuò)增其ITS;根據(jù)ITS兩端保守的16SrRNA基因和23Sr脂A基因分別設(shè)計(jì)上游引物SEQIDNO:5(5'-TGTACACACCGCCCGTC-3，)和下游引物SEQIDNO:6(5，-GGTACTTAGATGTTTCAGTTC-3，)。PCR反應(yīng)程序如下94。C預(yù)變性5分鐘，94。C變性30秒，5(TC退火30秒，72t:延伸1分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72t:繼續(xù)延伸5分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小及其特異性；PCR產(chǎn)物切膠回收，并用上海生工生物工程技術(shù)公司的UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物；(3)構(gòu)建ITS克隆將PCR純化產(chǎn)物與Promega公司的3x10—3的pGEM-T-Easy載體于4-C連接24小時(shí)，總體積為lOjil，其中有1^1的10x緩沖液和0.5U的T4DNA連接酶，得到連接產(chǎn)物。用Bio-Rad公司的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5a細(xì)胞，取2-3)al連接產(chǎn)物與60pl感受態(tài)大腸桿菌DH5a混合后，轉(zhuǎn)到Bio-Rad公司的0.2cm的電擊杯中電擊，電壓為2.5kv，時(shí)間為5.0毫秒-6.0毫秒，電擊后立即在杯中加入lml的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37t:過夜培養(yǎng)，次日得到藍(lán)白菌落，將得到的白色菌落即白色克隆轉(zhuǎn)到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，同時(shí)從每個(gè)克隆中提取質(zhì)粒并用E"iI酶切鑒定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群即肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的ITS克?。?4)對(duì)ITS克隆測(cè)序挑選500bp-lkbp的插入片段，每種長(zhǎng)度的片段挑選3個(gè)克隆用ABI3770型DNA自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)克隆中的插入片段進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物為通用的引物SP6和T7，從而獲得ITS的序列；克雷伯氏菌屬各種和亞種的ITS核苷酸序列擴(kuò)增后的電泳圖如圖1所示，其中1是肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種，2是肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種，3是肺炎克雷伯氏菌鼻硬結(jié)亞種，4是土生克雷伯氏菌，5是植生克雷伯氏菌，6是產(chǎn)酸克雷伯氏菌，7是解鳥氨酸克雷伯氏菌，M是DL2000DNAMarker,N為PCR反應(yīng)的陰性對(duì)照。(5)核苷酸序列的拼接及分析用英國(guó)劍橋MRC(MedicalResearchCouncil)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室出版的Stadenpackage軟件包的Pregap4和Gap4軟件拼接和編輯所有的序列，從而得到肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的ITS的核苷酸全長(zhǎng)序列，序列的質(zhì)量主要由兩個(gè)方面來保證1)對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的基因組作3個(gè)PCR反應(yīng)，然后混合這些產(chǎn)物以建克隆。2)對(duì)每個(gè)堿基，保證3個(gè)以上高質(zhì)量的覆蓋率；在得到肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的ITS的核苷酸序列后，用美國(guó)霍華德.休斯醫(yī)學(xué)中心的tRNAscan-SEsearchserver(http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan曙SE/)確定tRNA基因的位置和類型，用ClustralW軟件做DNA序列間的精確比對(duì)，最后確定含有tRNA-Ile和tRNA-Ala基因的ITS包含對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的特異核苷酸區(qū)；(6)特異核苷酸序列的篩選針對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的ITS的特異區(qū)設(shè)計(jì)引物；在特異區(qū)設(shè)計(jì)一條上游引物(SEQIDNO:3)和下游引物(SEQIDNO:4)，用這對(duì)引物以9株的肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種、3株肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種、2株肺炎克雷伯氏菌鼻硬結(jié)亞種、l株土生克雷伯氏菌、l株植生克雷伯氏菌、4株產(chǎn)酸克雷伯氏菌和2株解鳥氨酸克雷伯氏菌以及其他如產(chǎn)氣腸桿菌、大腸桿菌等13株近緣菌株的基因組為模板進(jìn)行PCR，所有引物都在肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種和臭鼻亞種中得到陽(yáng)性結(jié)果，在其他組中都沒有擴(kuò)增出大小正確的帶，也就是說，在其他組中沒有得到任何PCR產(chǎn)物帶，所以該寡核苷酸對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種及其ITS都是高度特異的。實(shí)施例三試劑盒的制備本發(fā)明是針對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的PCR檢測(cè)試劑盒，整個(gè)檢測(cè)步驟包括樣品預(yù)處理——擴(kuò)增——電泳檢測(cè)結(jié)果。引物和PCR反應(yīng)體系所需要的試劑已預(yù)先加入擴(kuò)增管中，使用者只需將預(yù)處理后的樣本加入擴(kuò)增管啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)即可，簡(jiǎn)單擴(kuò)速的完成檢測(cè)工作。1.試劑盒組成(1)MgCl2(25mM)50ul;(2)dNTP(10mM)30ul;(3)10xbuffer(10x酶特異性反應(yīng)緩沖液)50ul;(4)Taq聚合酶(5U/uO5ul;(5)引物混合物(10uM)(引物間比例l:1)10ul;(6)陽(yáng)性對(duì)照品(肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的基因組DNA)10ul;(7)陰性對(duì)照品(ddH20)10ul;(8)ddH205ml。13每個(gè)試劑盒可用于檢測(cè)IO個(gè)樣品，每次反應(yīng)所用各組分的用量如下:(1)MgCl2(25mM)2.5ul;(2)dNTP(10mM)0.25ul;(3)10xbuffer(10x酶特異性反應(yīng)緩沖液)2.5ul;(4)Taq聚合酶(5U/ul)0.25ul;(5)引物混合物(10uM)lul;(6)待檢樣品模板DNA3ul;(7)ddH2015.5ul。其中MgCl2、10xbuffer、dNTP、Taq聚合酶由上海生工提供；引物混合物為自行設(shè)計(jì)的序列提供給上海英駿生物技術(shù)公司合成；陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品和ddH20由我們自行制備。檢測(cè)所使用的引物的上游引物是SEQIDNO:3(5，-GCGAAGCAAATTTGAAGAG-3，)下游引物是SEQIDNO:4(5，-CCGAAGATGTTTCACTTCTGA-3，)。2.儀器設(shè)備PCR儀(又名DNA熱循環(huán)擴(kuò)增儀)、電泳設(shè)備(包括電泳儀及電泳槽)、凝膠成像儀、-2(TC冰箱、高速離心機(jī)、微量移液器和0.2mlPCR薄壁管。實(shí)施例四待檢樣品的提供申請(qǐng)人從國(guó)內(nèi)外各菌種保藏機(jī)構(gòu)收集了11株肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種和肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的代表菌株、10株克雷伯屬其他菌株以及13株近緣菌株的代表菌株驗(yàn)證引物的特異性，菌株編號(hào)和來源見下表1。表l:用于驗(yàn)證引物特異性的菌株細(xì)菌名稱實(shí)驗(yàn)室編號(hào)原始編號(hào)來源總計(jì)14G1743ACCC10084中國(guó)醫(yī)學(xué)微8株G1744G1745G2119G2551CMCC46112CMCC46109CMCC46102CMCC46108生物菌種保藏管理中心G2349NCTC204捷克微生物G2313NCTC5056保藏所G2311ATCC10031美國(guó)典型微生物菌種保藏中心G2543CMCC46110中國(guó)醫(yī)學(xué)微3株G2545CMCC46115生物菌種保藏管理中心G2566CCM5792捷克微生物保藏所G2544CMCC46111中國(guó)醫(yī)學(xué)微2株G2546CMCC46116生物菌種保藏管理中心《/err扭""G2488CCM3568捷克微生物保藏所l株《.//a油'co/"G2489CCM4428捷克微生物保藏所l株G2562CCM1900捷克微生物保藏所4株G2605ATCC柳34美國(guó)典型微G2606ATCC49473生物菌種保G2607G2680G2702ATCC700324CCM4873ATCC31898G1660M1343G1669M1361G1191M1365G1192M1371G1481M387G1329CB9777G2277AS1.181藏中心捷克微生物2株保藏所美國(guó)典型微生物菌種保藏中心澳大利亞醫(yī)l株學(xué)和獸醫(yī)學(xué)研究中心澳大利亞醫(yī)l株學(xué)和獸醫(yī)學(xué)研究中心澳大利亞醫(yī)l株學(xué)和獸醫(yī)學(xué)研究中心澳大利亞醫(yī)l株學(xué)和獸醫(yī)學(xué)研究中心澳大利亞醫(yī)l株學(xué)和獸醫(yī)學(xué)研究中心德國(guó)Robertl株Koch研究所中國(guó)科學(xué)院l株微生物研究所16G2284CMCC45103中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心l株G1495M1561澳大利亞醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)研究中心l株G2539ATCC29544美國(guó)典型微生物菌種保藏中心l株G1757AS1.1476中國(guó)科學(xué)院微生物研究所l株G2290CCUG-14635瑞典歌德堡大學(xué)培養(yǎng)物保藏中心l株G1318CB18德國(guó)RobertKoch研究所l株注尤w^p./wewmom'ae:肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種尤月市炎克雷伯氏菌臭鼻亞禾中Kwfep.WwVzosc/eramato:月市炎克雷伯氏菌鼻硬結(jié)亞禾中尺fem'ge加土生克雷伯氏菌^.//a油'co/a:植生克雷伯氏菌ox少toca:產(chǎn)酸克雷伯氏菌iT.or"她/"o/,'c":解鳥氣酸克雷伯氏菌*S.w"""':宋氏志賀氏菌弗氏志賀氏菌S.6ojW"鮑氏志賀氏菌51.痢疾志賀氏菌5""/wo"e〃"e她r/ca:腸炎沙門氏菌大腸桿菌5她ra6ac妙c/oflcae:陰溝腸桿菌￡>2tera6"c/e,產(chǎn)氣腸桿菌mhoc/70/erae:霍舌L弧菌五"fera6"cferra&azaA7Y:阪崎腸桿菌S啤/iy/oCOCCUS金黃色葡萄球菌尸,o/綴yw/伊r&:普通變形桿菌CzYra6acter戶ew打d":弗氏校樣酸桿菌同時(shí)申請(qǐng)人搜集了102株2005年以來的天津7家醫(yī)院從病人身上分離得到的病原菌，所有的臨床菌株都經(jīng)醫(yī)院的細(xì)菌鑒定系統(tǒng)一一VITEK系統(tǒng)進(jìn)行了生化鑒定，其生化鑒定結(jié)果和PCR鑒定結(jié)果見表2，對(duì)兩者結(jié)果不一致的，申請(qǐng)人進(jìn)行了16srRNA基因測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果見下表2。表2:用于驗(yàn)證引物的臨床菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>C4981+/C7573+/C5009+/C7527尺,+/C5021—C7617+/注.A7eZw'e//a/wewmom'ae(月市炎克雷伯氏菌)；(肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種)；(肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種)；r/efo/e〃"om//zz'wo/j;"ca(解鳥氨酸克雷伯氏菌);A7e細(xì)W/"(產(chǎn)酸克雷伯氏菌)；五.CO〃；Esc/2m'c/2/"C。/《大腸埃希氏菌)；￡■c/o".'五她ra6(3cferc/oacae(陰溝腸桿菌)；jB.c/z.附5;^VM"(iz.mo"as<i/mi>n^a(缺P芻矢豆、波單胞菌)；.'五"feracoccws力ec/訓(xùn)(屎腸球菌)；五如"五wfera6ac妙/zor顧ec/ze/(霍氏腸桿菌)A6m^,'y4"'weto6ac妙6a簡(jiǎn)朋w'!'(鮑氏不動(dòng)桿菌)P附r7Vo/ews附/>06///>$1(奇異變形豐千菌)爿/c"/z;ge"asv(產(chǎn)堿桿菌)^c/zromo6(3c&r:(無色t干菌)"+":代表PCR檢測(cè)是陽(yáng)性結(jié)果；"一"代表PCR檢測(cè)是陰性結(jié)果；="/":代表生化鑒定和PCR檢測(cè)結(jié)果一致，所以未做16srRNA基因測(cè)序試驗(yàn)；實(shí)施例五PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)將上述34株收集的代表菌株和經(jīng)VITEK檢測(cè)的102株克雷伯屬臨床菌株在同樣條件下采用本發(fā)明所提供的PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR方法的檢測(cè)。1.待檢樣品模板DNA的提取A.針對(duì)購(gòu)買的代表菌株(1)1%接菌量無菌操作，接種于3mlLB培養(yǎng)基中，200rpm，37°C過夜培養(yǎng)；(2)收集l.Oml過夜培養(yǎng)物，8000rpm離心5分鐘，去上清。(3)500ulddH20重懸沉淀，8000rpm離心5分鐘，去上清，盡量控干。(4)100ulddH2O重懸沉淀，混勻，IO(TC沸水浴IO分鐘，(5)置冰上1分鐘后，12000rpm離心2分鐘。(6)取3ul中層上清作為PCR反應(yīng)的模板。B.針對(duì)臨床培養(yǎng)物(血培養(yǎng)物、痰培養(yǎng)物、尿培養(yǎng)物等)(1)收集陽(yáng)性培養(yǎng)物l.Oml，8000rpm離心5分鐘，去上清。(2)500ulddH2O重懸沉淀，8000rpm離心5分鐘，去上清，盡量控干。(3)100ulddH2O重懸沉淀，混勻，IO(TC沸水浴IO分鐘，(4)置冰上10分鐘后，12000rpm離心2分鐘。(5)取3ul中層上清作為PCR反應(yīng)的模板。2.用微量移液器分別吸取PCR試劑盒中10uM引物lul、25mMMgCl22.5ul、10xbuffer2,5ul、10mMdNTP0.25ul、5U/ulTaq聚合酶0.25ul及3ul的待檢樣品模板DNA到0.2ml的薄壁PCR管中，最后用ddH20補(bǔ)足至總體積25ul，充分混勻；3.將混合物高速離心數(shù)秒后在PCR儀上按下列溫度和時(shí)間進(jìn)行擴(kuò)增.-95。C5分鐘l個(gè)循環(huán)；94。C30秒，55。C30秒，72""C30秒，30個(gè)循環(huán)；72。C2分鐘l個(gè)循環(huán)。4.在電泳設(shè)備中電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，記錄結(jié)果。(1)取3ul擴(kuò)增產(chǎn)物與0.5ul6x溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合；(2)將混合液上樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上；(3)將瓊脂糖凝膠經(jīng)120v電壓穩(wěn)壓電泳約IO分鐘，用DL2000Marker進(jìn)行對(duì)照；(4)觀察前沿溴酚藍(lán)指示劑遷移至距加樣孔至少3cm停止電泳，在凝膠成像儀上觀察并并記錄試驗(yàn)結(jié)果。5.依據(jù)如下條件進(jìn)行結(jié)果判斷肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種和/或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種應(yīng)在269bp處有一條帶。陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照試驗(yàn)只要將待檢樣品模板換成陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品模板即可，含有陽(yáng)性對(duì)照品的模板檢測(cè)結(jié)果在269bp處有一條帶，陰性對(duì)照品的模板檢測(cè)結(jié)果無條帶顯示。肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的ITS核苷酸序列擴(kuò)增后的電泳圖如圖2所示，其中1陽(yáng)性對(duì)照品，2是陰性對(duì)照品，3是檢測(cè)的肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種代表菌株，M是DL2000DNAMarker。普通菌株電泳結(jié)果記錄見圖3A-3B所示圖3A中，l為肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種，2為肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種，3為肺炎克雷伯氏菌鼻硬結(jié)亞種，4為土生克雷伯氏菌，5為植生克雷伯氏菌，6為產(chǎn)酸克雷伯氏菌，7為解鳥氨酸克雷伯氏菌，8為產(chǎn)氣腸桿菌，M為DL2000DNAmarker。所有購(gòu)買的保藏菌株除肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種和臭鼻亞種菌株外，其他菌株均無擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3B中，1為陽(yáng)性對(duì)照品，2為宋氏志賀氏菌，3為弗氏志賀氏菌，4為鮑氏志賀氏菌，5為痢疾志賀氏菌，6為腸炎沙門氏菌，7為大腸桿菌，8為陽(yáng)性對(duì)照品，9為陰溝腸桿菌，IO為霍亂弧菌，11為阪崎腸桿菌，12為金黃色葡萄球菌，D為普通變形桿菌，14為弗氏檸檬酸桿菌，M為DL2000DNAmarker。臨床菌株部分電泳結(jié)果記錄見圖4所示其中，1為C1253，2為C1657，3為C2191，4為C2241，5為C2507，6為C2551，7為C3561，8為C3817，9為C4705，10為C1014，11為C1057，12為C1141，13為C1143，14為C1223，15為C1319，16為C1369，M為DL2000DNAmarker。以上16株臨床菌生化鑒定均為肺炎克雷伯氏菌，且未指明為哪種亞種，而PCR試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示C2507和C4705為陰性，經(jīng)16sRNA基因測(cè)序表明兩株菌分別為K.v"n'/co/a和c/o"cae,說明采用PCR方法同普通生化檢測(cè)方法相比，檢測(cè)準(zhǔn)確度提高了，避免了因檢測(cè)失誤而導(dǎo)致的不必要損失。試驗(yàn)表明使用本發(fā)明所提供的PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種，從臨床樣品只需要3-4個(gè)小時(shí)就可得到檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)周期縮短，檢測(cè)速度加快，同時(shí)，PCR檢測(cè)方法只需要待檢樣品中含有1-10個(gè)左右的菌體就可檢測(cè)到。這樣，克服了常規(guī)生化檢測(cè)周期太長(zhǎng)、不適應(yīng)市場(chǎng)需要等特點(diǎn)。并且采用PCR檢測(cè)方法比普通生化檢測(cè)方法更準(zhǔn)確，避免了因檢測(cè)的失誤而導(dǎo)致的不必要的損失。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例披露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作些許之更動(dòng)與改進(jìn)，因此本發(fā)明之保護(hù)范圍當(dāng)視權(quán)利要求所界定者為準(zhǔn)。序列表〈110>天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司<120>對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎或臭鼻亞種特異的ITS序列及應(yīng)用<130>7P13016-CN<160>6〈170>Patentlnversion3.2<210〉1〈211〉427<212>腿〈213〉肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種含有tRNA-lie和tRNA-Ala基因的ITS核苷酸序列〈400〉1ccttaaagaacctgcctttgcagtgctcacacagattgtctgatgaa幼acagcagtaaa60aacctctacaggcttgtagctcaggtggttagagcgcacccctgataagggtgaggtcgg120tggttcaagtccactcaggcctaccaaatttgcgsagcaaatttgaagaggttgtaaacg180atggggctatagctcagctgggagagcgcctgctttgcacgcaggaggtctgcggttcga240tcccgcatagctccaccatctttactgcgeiacacaagaaaacttcagagtgaacctgaaa300aggtgcactgcgaagttttgctctttaa幼atctggatcaagctgaaaattgaaacgaca360cactgtttaagtgtgttcgagtctctc肌attttcgcaatcagaagtgaaacatcttcgg420gttgtga427<210〉2〈211〉427<212〉廳<213〉肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種含有tRNA-lie和tRNA-Ala基因的ITS核苷酸序列<400>2ccttaaagaacctgtctttgtagtgctcacacagattgtctgatgaa助acagcagtaaa60犯cctctacaggcttgtagctcaggtggtt3gagcgcacccctgataagggtgaggtcgg120tggttcaagtccEictcaggcctaccaaatttgcgaagc犯atttgaag3ggttgca肪cg180atggggctatagctcagctgggagagcgcctgctttgcacgcaggaggtctgcggttcga240tcccgcatagctccaccatctttactgcgaacacaagaaaacttcagagtgaacctgaaa300aggtgcsctgcgaagttttgctctttaaaaatctggatca3gctgaaaattg肪acga,c3360cacagttaatgtgtgttcgagtctctcaaattttcgcaatcagaagtgaaacatcttcgg420gUgtga427<210>3<211>19<212>DNA<213〉PCR檢測(cè)引物上游序列〈400>3gcgaagcaaatttg肌gag19<210>4<211>21<212〉DNA<213〉PCR檢測(cè)引物下游序列<400>4ccgaagatgtttcacttctga21〈210>5<211>17〈212>腿<213>擴(kuò)增對(duì)克雷伯氏菌屬特異的ITS核苷酸序列的上游引物<400>5tgtacacaccgcccgtc17<210〉6<211>21<212>DNA〈213〉擴(kuò)增對(duì)克雷伯氏菌屬特異的ITS核苷酸序列的下游引物<400>6ggtacttagatgtttcagttc2權(quán)利要求1.一種對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種特異的ITS核苷酸序列，其特征在于包括以下序列a)SEQIDNO1或SEQIDNO2所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的DNA或RNA序列；b)不同于a)但編碼的RNA序列與a)所編碼的RNA序列相同的核苷酸序列或其互補(bǔ)的DNA或RNA序列；c)上述a)或b)中缺失、替換或插入一個(gè)或多個(gè)堿基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列或其互補(bǔ)的DNA或RNA序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于所述核苷酸序列為SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的DNA序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于SEQIDNO:3所示的核苷酸序列選自SEQIDNO:1的第152-170堿基的DNA序列或其互補(bǔ)的DNA序列。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于SEQIDNO:4所示的核苷酸序列選自SEQIDNO:2的第400-420堿基的核苷酸序列或其互補(bǔ)的DNA序列。5.—種權(quán)利要求1或2所述的核苷酸序列的應(yīng)用，其特征在于所述核苷酸序列用于檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述核苷酸序列作為PCR引物或雜交反應(yīng)的探針或基因芯片或微陣列用于檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種。7.—種擴(kuò)增對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種特異的ITS核苷酸序列的引物為SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的DNA序列。8.—種獲得對(duì)克雷伯氏菌特異的ITS核苷酸序列的方法，其特征在于包括下述步驟(1)提取基因組；(2)通過PCR擴(kuò)增肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種中的ITS基因簇；(3)構(gòu)建ITS克隆；(4)對(duì)ITS克隆測(cè)序；(5)拼接及分析核苷酸序列；(6)篩選特異核苷酸序列；其中步驟(2)中使用的擴(kuò)增引物是SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的DNA序列。9.一種PCR試劑盒，包括PCR引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，其特征在于所述PCR弓I物包括SEQIDNO:3或SEQIDNO:4所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)的DNA序列。10.權(quán)利要求9所述的試劑盒在檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種中的應(yīng)用。11.一種應(yīng)用權(quán)利要求9所述的試劑盒檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或肺炎克雷伯氏菌臭鼻亞種的PCR檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟(1)提取待檢臨床樣品模板；(2)在PCR薄壁管中加入dNTP、MgCl2、lOx酶特異性反應(yīng)緩沖液、耐熱DNA聚合酶、PCR引物、待測(cè)樣品模板和ddH20，混勻；(4)在電泳設(shè)備中電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，記錄結(jié)果；(5)分析并進(jìn)行結(jié)果判斷。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的PCR檢測(cè)方法，其特征在于各種成分的使用劑量為PCR引物各0.5ul，10mMdNTP0.25ul，10X酶特異性反應(yīng)緩沖液2.5ul，5U/ul耐熱DNA聚合酶0.2111，25mMMgCl22.5ul，3ul待檢樣品的模板DNA，用ddH20補(bǔ)足總體積至25ul。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述的耐熱DNA聚合酶為Taq聚合酶。14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的PCR檢測(cè)方法，其特征在于PCR擴(kuò)增參數(shù)為95°C5分鐘，l個(gè)循環(huán)；94°C30秒，55。C30秒，72°C30秒，回到第二步，計(jì)30個(gè)循環(huán)；72°C2分鐘，1個(gè)循環(huán)。全文摘要本發(fā)明涉及對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或臭鼻亞種特異的ITS，包括a)SEQIDNO1或SEQIDNO2、或b)不同于a)但編碼的RNA序列與a)所編碼的RNA序列相同的核苷酸序列，或上述a)或b)中缺失、替換或插入一或多個(gè)堿基、仍具有所述核苷酸功能的DNA序列或其互補(bǔ)DNA或RNA序列。上述ITS序列用于檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或臭鼻亞種。擴(kuò)增上述ITS序列的引物為SEQIDNO5-6或其互補(bǔ)的DNA序列。本發(fā)明還涉及檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或臭鼻亞種的PCR試劑盒。本發(fā)明的ITS序列及試劑盒實(shí)現(xiàn)了對(duì)肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種或臭鼻亞種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)和鑒定。文檔編號(hào)C12N15/11GK101469327SQ20071030136公開日2009年7月1日申請(qǐng)日期2007年12月25日優(yōu)先權(quán)日2007年12月25日發(fā)明者露馮,曹勃陽(yáng),敏王,磊王申請(qǐng)人:天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司