專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種α-酮戊二酸高產(chǎn)菌及其篩選方法和用該菌株發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮戊二酸的制作方法一種ot-酮戊二酸高產(chǎn)菌及其篩選方法和用該菌株發(fā)酵法生產(chǎn)a-酮戊二酸一種a-酮戊二酸高產(chǎn)菌及其篩選方法和用該菌株發(fā)酵法生產(chǎn)a-酮戊二酸，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是一株高產(chǎn)a-酮戊二酸的解脂亞洛酵母。技術(shù)背景a-酮戊二酸，又稱(chēng)a-膠酮酸，2-氧代戊二酸或a-羰基戊二酸，是三羧酸(TCA)循環(huán)中重要的中間產(chǎn)物之一，在微生物細(xì)胞的代謝中起著重要的作用，也是合成多種氨基酸、蛋白質(zhì)的重要前體物質(zhì)。其結(jié)構(gòu)式為a-酮戊二酸在醫(yī)藥、有機(jī)合成、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用前景，目前主要應(yīng)用領(lǐng)域?yàn)樽鳛檫\(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)飲料的成分；有機(jī)中間體；生化試劑和測(cè)肝功能的配套試劑；體格增強(qiáng)補(bǔ)劑；降低術(shù)后患者和長(zhǎng)期病人的機(jī)體損耗；在腦部作為酪氨酸和谷氨酸的前體；同時(shí)研究還表明，a-酮戊二酸具有抗氰作用，與亞硝酸鈉、硫代硫酸鈉配合使用可提高抗氰能力，且有抗驚厥作用。a-酮戊二酸目前主要消費(fèi)于醫(yī)療機(jī)構(gòu)，用來(lái)診斷和對(duì)神經(jīng)疾病進(jìn)行治療。隨著a-酮戊二酸應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，a-酮戊二酸的市場(chǎng)需求也在不斷增長(zhǎng)。但是目前a-酮戊二酸的生產(chǎn)主要還是采用有機(jī)合成方法，包括一系列復(fù)雜的化學(xué)合成過(guò)程，這在原料來(lái)源和安全生產(chǎn)上存在一定的問(wèn)題，主要是存在爆炸的危險(xiǎn)。所以開(kāi)發(fā)一種利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)a-酮戊二酸的高效安全的方法很重要。發(fā)酵法生產(chǎn)a-酮戊二酸的研究最早始于1946年，當(dāng)時(shí)Lockwood和Stodola對(duì)利用細(xì)菌生物合成oc-酮戊二酸進(jìn)行了初步的研究。之后Asai等人發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬、產(chǎn)氣桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌可以過(guò)量合成a-酮戊二酸，并且提出過(guò)量合成a-酮戊二酸的必要條件是培養(yǎng)基中碳源、氮源的濃度。上世紀(jì)60年代中期，T.V.FiriogeiKwa等人在利用解脂亞洛酵母發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞(SCP)蛋白的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了該酵母也具有過(guò)量合成有機(jī)酸(a-酮戊二酸、2-羥基酮戊二酸、檸檬酸等)的能力。在硫胺素(一種該酵母菌不能合成，但對(duì)于a-酮戊二酸脫氫酶活性是必需的維生素)缺乏的情況下，解脂亞洛酵母可以利用烷烴分泌大量的a-酮戊二
技術(shù)領(lǐng)域：
a-酮戊酸結(jié)構(gòu)式目前對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)a-酮戊二酸研究較多的是俄國(guó)的一個(gè)微生物生化和生理研究所。該研究所發(fā)現(xiàn)不同種屬的硫胺素缺陷型酵母可能都有生產(chǎn)a-酮戊二酸的能力，合成a-酮戊二酸的主要條件就是硫胺素缺乏引起的生長(zhǎng)限制。1999年，T.V.Finogenova等人利用y"mH7'"/z>o/_K/c"VKMY-2373的突變菌株N1在以乙醇為碳源的培養(yǎng)基上通過(guò)調(diào)節(jié)硫胺素的添加量、氮源、溶氧以及pH值等條件使得a-酮戊二酸的產(chǎn)量達(dá)到49g/L，對(duì)乙醇的產(chǎn)率是42。/。。并且確定了生產(chǎn)a-酮戊二酸的最重要條件是由硫胺素缺乏引起的生長(zhǎng)限制和過(guò)量的氮源(碳源不足時(shí)，碳源流向檸檬酸合成)。并且在基于對(duì)乙醇代謝和a-酮戊二酸合成途徑中關(guān)鍵酶活性的分析中，初步肯定了a-酮戊二酸的合成與氮源代謝之間具有密切的關(guān)系。后來(lái)又以l^row^/^o/j^^自然菌株為生產(chǎn)菌，在以石蠟為碳源的培養(yǎng)基上得到了109g/L的a-酮戊二酸，產(chǎn)率為120%。目前國(guó)內(nèi)對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)a-酮戊二酸的研究很少，仍處于研究的初步階段。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種a-酮戊二酸高產(chǎn)菌及其篩選方法和用該菌株發(fā)酵法生產(chǎn)a-酮戊二酸。本發(fā)明的技術(shù)方案一種a-酮戊二酸高產(chǎn)菌，分類(lèi)命名為解脂亞洛酵母(Tamw/a/^o/,'c^WSH-Z06,巳保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207143。解脂亞洛酵母CCTCCNO:M207143的篩選方法，從煉油廠(chǎng)附近的土壤中經(jīng)對(duì)照在完全培養(yǎng)基、基本培養(yǎng)基和補(bǔ)充培養(yǎng)基平板上菌落生長(zhǎng)情況篩選出硫胺素營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株，然后對(duì)初篩出的硫胺素缺陷型菌株采用一級(jí)發(fā)酵逐一搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵液利用硅膠層析方法分析，將保留有a-酮戊二酸顯色斑點(diǎn)的菌株再轉(zhuǎn)接于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩，發(fā)酵液經(jīng)高效液相方法測(cè)定，比較a-酮戊二酸產(chǎn)量高低而得到高產(chǎn)a-酮戊二酸的菌株。一種a-酮戊二酸的生產(chǎn)方法，采用解脂亞洛酵母CCTCCNO:M207143為出發(fā)菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵生產(chǎn)a-酮戊二酸；(1)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)葡萄糖20，蛋白胨10，七水硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀1，pH5.5;培養(yǎng)條件溫度28'C、搖床轉(zhuǎn)速200rpm條件下，培養(yǎng)20-24h;(2)液體發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)甘油50-150，硫酸銨1.5-7，磷酸二氫鉀1-5，七水硫酸鎂0.1-1.5，氯化鈉0.5，磷酸氫二鉀0.1，碳酸鈣10-30，初始pH4-6;發(fā)酵條件接種量10%，溫度25-30°C、搖床轉(zhuǎn)速170-200rpm條件下，發(fā)酵卯-144h。所生產(chǎn)的ot-酮戊二酸產(chǎn)量達(dá)到39.3g/L。微生物菌株的篩選與鑒定在本發(fā)明中建立一個(gè)快速有效的篩選高產(chǎn)oc-酮戊二酸菌株的模型。根據(jù)高產(chǎn)a-酮戊二酸的菌株的活性較低，而a-酮戊二酸脫氫酶的活性由該酶重要的輔因子硫胺素調(diào)控這一特點(diǎn)，可初步設(shè)計(jì)一種以篩選硫胺素營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株為目標(biāo)的實(shí)驗(yàn)方案。即首先將在CM上培養(yǎng)好的菌株分別點(diǎn)種到MM和含有微量硫胺素的SM上，篩選出在MM上不能生長(zhǎng)而在SM上生長(zhǎng)良好的菌株，及硫胺素缺陷型菌株。由于硫胺素不僅是a-酮戊二酸脫氫酶的重要輔因子，也是丙酮酸脫氫酶的輔因子，因此硫胺素營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株在亞適量的硫胺素水平發(fā)酵可以積累a-酮戊二酸和丙酮酸兩種有機(jī)酸。所以需對(duì)篩選到的硫胺素營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株進(jìn)行發(fā)酵初篩，用硅膠層析方法確定出產(chǎn)a-酮戊二酸的菌株，然后對(duì)這些菌株進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵，用HPLC方法分析以獲得高產(chǎn)a-酮戊二酸的菌株。本發(fā)明從無(wú)錫煉油廠(chǎng)附近的土壤中取樣，采土樣于含硫胺素的富集培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)2-4次，菌液經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布于CM上，30°C培養(yǎng)2-3天，然后分別點(diǎn)種于MM和SM上，篩選出硫胺素營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。然后通過(guò)進(jìn)行發(fā)酵初篩選取在TCL中保留有a-酮戊二酸顯色斑點(diǎn)的菌株再轉(zhuǎn)接于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩，4天后，用HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中a-酮戊二酸的含量。經(jīng)過(guò)對(duì)多個(gè)土壤樣品的大量菌株篩選工作，從分離出來(lái)的數(shù)十株硫胺素營(yíng)養(yǎng)缺陷型土壤微生物中篩選得到雜酸較少，遺傳穩(wěn)定性好的產(chǎn)a-酮戊二酸菌株WSH-Z06菌株。本發(fā)明篩選得到的能有效積累a-酮戊二酸的微生物WSH-Z06，經(jīng)18SrRNA基因測(cè)定和按《微生物分類(lèi)學(xué)》生理生化鑒定，認(rèn)為屬子囊菌綱假絲酵母屬的解脂亞洛酵母。該菌有兩種形態(tài)。在液體培養(yǎng)基中可見(jiàn)典型的酵母菌特征，即散開(kāi)的卵形、橢圓形，大小為2-5.5x3.5-15iam，有菌環(huán)和醭膜，可見(jiàn)出芽生殖現(xiàn)象；在YPD瓊脂培養(yǎng)基上的菌落呈奶酪狀、乳白色至灰白色，表面有鈹褶、不透明，邊緣不平整，在3(TC條件下培養(yǎng)3天，直徑可達(dá)3-5mm，菌體較黏，電鏡觀(guān)察可見(jiàn)大量成鏈狀的假絲，并可見(jiàn)子囊和孢子。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌溫度為115-121'C，15min。維生素等熱敏性材料配制后經(jīng)0.2pm膜濾除菌，接種前加入。將實(shí)驗(yàn)菌株接種到種子培養(yǎng)基中，500mL搖瓶裝液50mL，于28°C，200rpm條件下培養(yǎng)20-24h。按10%的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，25-30°C，170-200rpm條件下培養(yǎng)90-144h。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的特點(diǎn)是從土壤中分離出有效產(chǎn)生CC-酮戊二酸的解脂亞洛酵母CCTCCNO:M207143,其在適宜條件下，能顯著地積累a-酮戊二酸，產(chǎn)a-酮戊二酸達(dá)到13.2-39.3g/L。生物材料樣品保藏解脂亞洛酵母(Tam9Ka/o/;/"cWSH-Z06，保藏日期2007年9月10日，包藏單位名稱(chēng)及簡(jiǎn)稱(chēng)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M207M3。具體實(shí)施方式以下是解脂亞洛酵母CCTCCNO:M207143篩選、鑒定及發(fā)酵生產(chǎn)ot-酮戊二酸的實(shí)施例。實(shí)施例1從無(wú)錫市某煉油廠(chǎng)附近的土壤中采樣，稱(chēng)取5g土樣(濕重)，加到裝有50mL含硫胺素的富集培養(yǎng)基的三角瓶中，30°C，200rpm條件下培養(yǎng)2-3天，按10%的接種量再進(jìn)行兩次富集。取富集培養(yǎng)物用PBS(0.145mol/L氯化鈉，0.01mol/L磷酸鈉水溶液)稀釋并涂布于CM上，30°C培養(yǎng)2-3天，對(duì)應(yīng)點(diǎn)種MM和SM上，選擇不能在MM而能在SM上生長(zhǎng)的菌株，即硫胺素營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵初篩。28°C，200rpm條件下培養(yǎng)3天后取發(fā)酵液離心，上清液點(diǎn)樣到硅膠層析薄板上，于苯乙酸乙酯乙酸體積比為2:1:0.03系統(tǒng)中展層，用溴酚蘭顯色。將保留有oc-酮戊二酸顯色斑點(diǎn)的菌株再轉(zhuǎn)接于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩，4天后，用HPLC法(StableBondd8反相柱250x4.6mm，流動(dòng)相0.1%(v/v)H3PO3，pH2.7，溫度28。C，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210nm)測(cè)定ot-酮戊二酸的含量。其中富集培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，瓊脂20，土壤浸出液200，蒸餾水800，調(diào)pH5.5;121°C高壓蒸汽滅菌15min。土壤浸出'液制備用蒸餾水與等量的上層土或沙壤土混合，去掉重的顆粒，然后過(guò)四層紗布得清液。完全培養(yǎng)基(CM)(g/L):葡萄糖20，酵母膏10，蛋白胨10，pH5.5，加入2%瓊脂即為固體CM。基本培養(yǎng)基(MM)(g/L):葡萄糖20，KH2P041，MgS047H200.5，(NH4)2S043，青霉素0.05，制霉菌素0.08，pH5.5，加入2%瓊脂即為固體MM。補(bǔ)充基本培養(yǎng)基(SM)(g/L):在MM中添加10|ag/L的硫胺素，加入2%瓊脂即為固體SM。斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨IO，酵母膏IO，瓊脂20，28。C培養(yǎng)3天。種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨10，磷酸二氫鉀1，七水硫酸鎂0.5，pH5.5，28°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)時(shí)間20-24h。6發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖IOO，硫酸銨3，磷酸二氫鉀1，七水硫酸鎂0.7，氯化鈉0.5，磷酸氫二鉀0.1，碳酸鈣20，初始pH4.5;發(fā)酵條件28°C，200rpm，發(fā)酵時(shí)間6天。實(shí)施例2對(duì)篩選的WSH-Z06菌株按《微生物分類(lèi)學(xué)》進(jìn)行生理生化特性鑒定(見(jiàn)表1、2、3)，并按精編分子生物學(xué)指南的方法提取染色體DNA，以pl和p2為正向和反向引物，pl:5'-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3'，p2:5，-GATCCTTCCGCAGGTTCACC扁3'，用PCR擴(kuò)增18SrDNA基因，委托上海生工生物工程公司進(jìn)行18SrDNA測(cè)序，得到本菌株部分18SrDNA基因片斷后，在NCBI網(wǎng)站上用BLAST檢索GenBank中相關(guān)菌株的18SrDNA的基因序列，并進(jìn)行同源性比對(duì)，基于18SrDNA序列分析和生理生化特性鑒定，結(jié)合對(duì)該菌的生長(zhǎng)和發(fā)酵特性研究，認(rèn)為是解脂亞洛酵母的變種，命名為解脂亞洛酵母(Kwow/a/*0/>^力WSH-Z06，此菌株已保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNO:207143。表1菌株的碳源發(fā)酵葡萄糖+蜜二糖_麥芽糖一甘露醇+半乳糖_甘油+蔗糖_檸檬酸鹽—乳糖_醋酸鹽_棉子糖—乙醇+表2碳源和氮源的同化及其它生理和生化特征葡萄糖+甘油+.可溶性淀粉—￡30。C+麥芽糖一檸檬酸鹽+海藻糖—■〉35。C半乳糖±醋酸鹽+纖維二糖—50。/。葡萄糖庶糖一乙醇(<3g/L)+D-阿拉伯糖60%葡萄糖—乳糖一肌醇_木糖無(wú)硫胺素—棉子糖一認(rèn)04+L-阿拉伯糖一無(wú)生物素+蜜二糖一(NH4)2S04++甘露醇+甲醇一表3假菌絲和類(lèi)淀粉化合物形成假菌絲+類(lèi)淀粉化合物一實(shí)施例3將培養(yǎng)好的CCTCCNO:M207143種子以10%的接種量接種到含相同碳濃度(32g/L)的葡萄糖、乙酸鈉、甘露醇、乙醇、甘油等不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基其余組成為硫酸銨3g/L，磷酸二氫鉀1g/L，七水硫酸鎂0.7g/L，氯化鈉0.5g/L，磷酸氫二鉀0.1g/L，硫胺素4pg/L,培養(yǎng)基初始pH4.5，接種后補(bǔ)加碳酸鈣20g/L用來(lái)調(diào)節(jié)pH，在28t:，200rpm條件下發(fā)酵90h，用HPLC測(cè)定發(fā)酵液中的a-酮戊二酸的含量。結(jié)果表明以甘油為碳源發(fā)酵時(shí)明顯優(yōu)于其它種類(lèi)的碳源(32g/L的碳源折算成甘油的濃度為82g/L)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，a-酮戊二酸產(chǎn)量為13.2g/L;而以葡萄糖為碳源時(shí)產(chǎn)量?jī)H為9.5g/L;當(dāng)采用其它種類(lèi)的碳源時(shí)則產(chǎn)生更少量或不產(chǎn)生a-酮戊二酸。實(shí)施例4以甘油為碳源，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度(0-16pg/L)的微量硫胺素，發(fā)酵培養(yǎng)基其余組成同實(shí)施例3，接入培養(yǎng)好的CCTCCNO:M207143種子液，在上述的條件下進(jìn)行發(fā)酵6天，用HPLC測(cè)定發(fā)酵液中的a-酮戊二酸的含量。結(jié)果顯示硫胺素濃度為1pg/L時(shí)相對(duì)最有利于a-酮戊二酸的積累，產(chǎn)量達(dá)到29.2g/L。實(shí)施例5以甘油為碳源，向接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度(10-60g/L)的碳酸鈣，發(fā)酵培養(yǎng)基其余組成同實(shí)施例3，以上述的條件進(jìn)行發(fā)酵6天，用HPLC測(cè)定發(fā)酵液中的a-酮戊二酸的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加20g/L的碳酸鈣最有利于a-酮戊二酸的發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)a-酮戊二酸的產(chǎn)量可達(dá)到39.3g/L。權(quán)利要求1、一種α-酮戊二酸高產(chǎn)菌，分類(lèi)命名為解脂亞洛酵母(Yarrowialipolytica)WSH-Z06，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNOM207143。2、一種解脂亞洛酵母CCTCCNO:M207143的篩選方法，其特征是從煉油廠(chǎng)附近的土壤中經(jīng)對(duì)照在完全培養(yǎng)基、基本培養(yǎng)基和補(bǔ)充培養(yǎng)基平板上菌落生長(zhǎng)情況篩選出硫胺素營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株，然后對(duì)初篩出的硫胺素缺陷型菌株采用一級(jí)發(fā)酵逐一搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵液利用硅膠層析方法分析，將保留有a-酮戊二酸顯色斑點(diǎn)的菌株再轉(zhuǎn)接于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩，發(fā)酵液經(jīng)高效液相方法測(cè)定，比較a-酮戊二酸產(chǎn)量高低而得到高產(chǎn)a-酮戊二酸的菌株。3、一種a-酮戊二酸的生產(chǎn)方法，其特征是采用解脂亞洛酵母CCTCCNO:M207143為出發(fā)菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵生產(chǎn)a-酮戊二酸；(1)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)葡萄糖20，蛋白胨10，七水硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀1，pH5.5;培養(yǎng)條件溫度28。C、搖床轉(zhuǎn)速200rpm條件下，培養(yǎng)20-24h;(2)液體發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)甘油50-150，硫酸銨1.5-7，磷酸二氫鉀1-5，七水硫酸鎂0.1-1.5，氯化鈉0.5，磷酸氫二鉀0.1，碳酸鈣10-30，初始pH4-6;發(fā)酵條件接種量10%，溫度25-3(TC、搖床轉(zhuǎn)速170-200rpm條件下，發(fā)酵90-144h。全文摘要一種α-酮戊二酸高產(chǎn)菌及其篩選方法和用該菌株發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮戊二酸，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明菌株為一株解脂亞洛酵母(Yarrowialipolytica)WSH-Z06，保藏編號(hào)CCTCCNOM207143。該菌株是從煉油廠(chǎng)附近的土壤中經(jīng)在完全培養(yǎng)基、基本培養(yǎng)基和補(bǔ)充培養(yǎng)基平板上菌落生長(zhǎng)情況的對(duì)照篩選出硫胺素營(yíng)養(yǎng)缺陷型的菌株，然后對(duì)篩選出的硫胺素缺陷型菌株采用一級(jí)發(fā)酵逐一搖瓶培養(yǎng)初篩，發(fā)酵液利用硅膠層析方法分析，將保留有α-酮戊二酸顯色斑點(diǎn)的菌株再轉(zhuǎn)接于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩，發(fā)酵液經(jīng)高效液相方法測(cè)定，比較α-酮戊二酸產(chǎn)量高低而得到的高產(chǎn)α-酮戊二酸的一株菌，通過(guò)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中重要組成成分進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)酵6天時(shí)α-酮戊二酸產(chǎn)量可達(dá)到39.3g/L。文檔編號(hào)C12N1/16GK101215529SQ20071030244公開(kāi)日2008年7月9日申請(qǐng)日期2007年12月26日優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日發(fā)明者劉立明,周海巖,堅(jiān)陳申請(qǐng)人:江南大學(xué)