專利名稱：一種玉米品種真?zhèn)慰旖蓁b定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種玉米品種真?zhèn)慰旖蓁b定方法， 具體而言是一種利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行玉米品種真?zhèn)慰焖勹b定的方法。
背景技術(shù)：
植物新品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)是鼓勵(lì)品種培育人不斷培育新的品種(系)或雜 交種的積極性的有力措施。發(fā)展高區(qū)分力的鑒定玉米材料技術(shù)對(duì)玉米的真?zhèn)舞b 定乃至新品種注冊(cè)、產(chǎn)權(quán)登記保護(hù)等都是十分必要的。
理想的品種鑒定技術(shù)不但要準(zhǔn)確、可靠，還要簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)，這是品 種鑒定實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的前提。傳統(tǒng)的同工酶和蛋白電泳技術(shù)形態(tài)鑒定方法，產(chǎn)生 的多態(tài)性有限，且對(duì)親緣關(guān)系較近及遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜的材料難以鑒別。SSR分子標(biāo) 記是近年來發(fā)展起來的建立在PCR基礎(chǔ)上的新型DNA指紋技術(shù)。SSR標(biāo)記的等位 基岡變異來源于基因組DNA復(fù)制時(shí)的滑動(dòng)、不對(duì)稱交換等原因引起的重復(fù)序列 的變化，因而表現(xiàn)出高度的多態(tài)性。同時(shí)，該遺傳標(biāo)記具有直接以DNA表現(xiàn)、 標(biāo)記數(shù)量多、遺傳穩(wěn)定、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，再加上檢測(cè)快捷，簡(jiǎn)便，穩(wěn)定， 成為玉米品種鑒定的首選方法。
根據(jù)SSR分子標(biāo)記建立的玉米指紋圖譜庫(kù)可直接對(duì)市面上出現(xiàn)的疑似親本 品種，做真?zhèn)舞b定。另外，玉米籽粒的果皮是全部繼承母本遺傳信息的F1代組 織，分離并提取果皮基因組DNA，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)即可獲得雜交種的親本 母本信息及相應(yīng)的父本信息，因此可判斷該品種在選育過程中是否使用了已中
請(qǐng)保護(hù)的品種，使品種所有權(quán)人的合法利益得到有效維護(hù)。
利用SSR對(duì)玉米品種進(jìn)行真實(shí)性鑒定，國(guó)內(nèi)外有報(bào)道，如中國(guó)專利 200310117180. 3及20061006573. 4，但現(xiàn)有技術(shù)操作過程繁瑣、費(fèi)時(shí)，針對(duì)此
3問題，本發(fā)明人重新篩選了引物，采用優(yōu)化了 TouchDown PCR程序及DNA提取 方法。發(fā)展了一套適合的分子標(biāo)記，建立了一種玉米品種真?zhèn)慰焖勹b定方法， 可用于主要商業(yè)用自交系的品種鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快捷、操作簡(jiǎn)單的玉米品種真?zhèn)舞b定方法。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案
本發(fā)明提供了 一種玉米品種真?zhèn)舞b定方法，該方法采用單粒干種子的胚提
取待檢樣品的基因組DNA; PCR擴(kuò)增中使用了如下20對(duì)核心引物bnlgl866， phi001, bnlgl017， umcl042， phi029, bnlgl108， bnlg2162， umc2188， bnlgl006, bnlg602， umcl023， phi031， umcl406， bnlgl792， bnlgl131， d叩ssrl4, umcl636， bnlgl129， phi041， umcl291。
其中，用單粒干種子的胚提取待檢樣品的基因組DNA方法如下取干種子 的2/3胚放入離心管中，加入150 u L 0. lmol/L NaOH，沸水中放置5min，冷至 室溫后加入150uL 1XTE (pH 2.0)緩沖液，吸打混勻后4。C放置。
本發(fā)明使用上述的20對(duì)核心引物，在體外擴(kuò)增多態(tài)性特征譜帶時(shí)采用 TouchDown PCR程序。
PCR擴(kuò)增在普通PCR儀上進(jìn)行即可，TouchDown PCR程序可采用其它程 序，但為快速達(dá)到本發(fā)明目的，本發(fā)明優(yōu)選的TouchDown PCR程序如下94 °C 預(yù)變性5 min, 94 °C 1 min， 67°C 50 S、每個(gè)循環(huán)降低1. 5 °C ， 72 °C延伸 lmin6個(gè)循環(huán)；然后，94 °C變性1 min， 58 °C退火45 s， 72 °C延伸45min ， 共30個(gè)循環(huán)；72 °C 10 rain。
本發(fā)明的玉米品種真?zhèn)舞b定方法有如下優(yōu)點(diǎn)
1、在提取待檢樣品基因組DNA的方法時(shí)，采用了單粒干種子的提取方法。 與常規(guī)的葉片提取方法相比，該方法省去了材料發(fā)芽的時(shí)間，歷時(shí)短，操作步 驟簡(jiǎn)單，方便快捷，而且所提基因組質(zhì)量高且穩(wěn)定，特別適宜大量樣品的材料 鑒定(一小時(shí)內(nèi)能完成IOO粒種子的DNA提取)。
42、 PCR擴(kuò)增采用的是優(yōu)化的TouchDown PCR程序。
其中，PCR程序中所用的20對(duì)引物是發(fā)明人在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上篩選得出， 這些引物多態(tài)性豐富，帶型穩(wěn)定，均勻分布在染色體的IO條染色體上，而且特 征譜帶大小均勻分布在50—400bp之間。
另外，利用SSR檢測(cè)其多態(tài)性，采用touch-down PCR技術(shù)，可避免各個(gè)引 物都要調(diào)PCR反應(yīng)參數(shù)Z設(shè)計(jì)引物時(shí)無需按照統(tǒng)一的條件設(shè)計(jì)，無需考慮引物 的TM值差異，方便快楗，設(shè)計(jì)成本大大降低。
通過下列實(shí)施例將更具體的說明本發(fā)明，但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是為了說 明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l鑒定市面上正在熱銷的玉米雜交種M的母本是否為已申請(qǐng)保護(hù)的自交 系N
鑒定操作流程如下
(1) DNA提取 樣品M基因組DNA的提取
試材為干種子，僅需要一粒干種子即可。千種子的胚提取如下取千種子 的2/ 3胚放入0. 5ml離心管中，加入150 u L 0. lmol/L Na0H沸水中放置5min， 冷至室溫后加入150" L 1XTE(pH 2. O)緩沖液，吸打混勻后4'C放置備用；
樣品M果皮DNA組織的提取
① 先取雜交種M種子20粒，用純水洗凈，再用無菌水洗一遍，浸泡于1.0 %的氫氧化鈉溶液中約20 min取出，然后用純凈水沖洗子粒3 5遍；用 鑷子小心剝離每粒種子的果皮，再將果皮用無菌水洗兩遍，晾干。液氮研碎， 收集于1.5 mL EP管中；
② 果皮DNA提取。在裝有果皮樣的EP管中先加入氯仿500 txL浸泡10 min，后放入離心機(jī)中12， 000 rpm/ min 10min ，離心后再加入預(yù)熱約60°C SDS 提取液500u L ( 100 mM Tris-- HCI , 100 mM EDTA pH 8. 0 , 500 mM NaCl ,
51.5% SDS )，離心10 min。離心結(jié)束后，上清液加入500 u L預(yù)冷的無水乙 醇，靜置30 min，觀察會(huì)看到EP管溶液中上部有略微發(fā)白色分散微小團(tuán)狀物 析出，用剪去了槍尖的lmL槍頭將靜置管中的中上部溶液緩慢移入另一新離心 管中，12,000 rpm/ min 10min。最后收集沉淀用70 %的酒精清洗兩次，自然 吹千，然后用50 uL TE溶解備用。 自交系N基因組DNA的提取
試材為干種子，僅需要一粒干種子即可。干種子的胚提取如下取干種子 的2/ 3胚放入0. 5ml離心管中，加入150uL 0. lmol/L NaOH沸水中放置5min， 冷至室溫后加入150pL 1XTE(pH 2.0)緩沖液，吸打混勻后4'C放置備用。
(2) 引物合成
合成如下20對(duì)核心引物bnlgl866， phi001， bnlgl017，咖cl042， phi029， bnlgl108， bnlg2162， umc2188， bnlgl006, bnlg602， umcl023， phi031， umcl406， bnlgl792， bnlgl131， dupssrl4， umcl636，bnlgl129，phi041， umcl291。 本實(shí)施例由北京奧科生物技術(shù)公司合成，每管引物為4.0 0D。
(3) PCR擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增用1一20對(duì)引物分別以樣品M基因組DNA，樣品M果皮DNA，自 交系N基因組為模板分別同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物分別命名為la， lb， lc; 2a， 2b， 2c,以此類推。20uL體系中含1XTaqDNA聚合酶緩沖液(含Mg、)、 0. 2誦ol/L dNTP、 1 pmol/uL上下游引物，100 ng DNA模板。
采用touch-down PCR程序94 °C預(yù)變性5min ， 94 。Clmin, 67°C 50S、 每個(gè)循環(huán)降低1.5 °C ， 72 °C延伸lmin 6個(gè)循環(huán)；然后，94 °C變性lmin， 58 °C退火45s , 72 °C延伸45min ，共30個(gè)循環(huán)。72 °C 10 min。
PCR擴(kuò)增在普通PCR儀上進(jìn)行即可，本實(shí)施例使用了 MyCycler Bio—Rad
6(4)電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物
PCR產(chǎn)物中加入4uL 6X loading buffer ,在4% SFR (AMRESCO)凝膠上 電泳，點(diǎn)樣順序?yàn)镈NA Marker la, lb， lc, 2a, 2b, 2c,以此類推。EB(溴 化乙錠)染色，在紫外燈下檢測(cè)帶型。
結(jié)果分析20對(duì)引物擴(kuò)出的多態(tài)性條帶完全相同；說明雜交種M的母本是 已申請(qǐng)保護(hù)的自交系N。
實(shí)施例2鑒定某公司正在使用的親本自交系P是否為已申請(qǐng)保護(hù)的自交系Q 鑒定操作流程如下 (1) DNA提取 樣品P， Q基因組DNA的提取
試材為干種子，僅需要一粒干種子即可。千種子的胚提取如下取干種子 的2/ 3胚放入0. 5ml離心管中，加入150 w L 0. lmol/L NaOH沸水中放置5min， 冷至室溫后加入150yL 1XTE(pH 2.0)緩沖液，吸打混勻后4'C放置備用。 (2)引物合成
合成如下20對(duì)核心引物bnlgl866， phi001, bnlgl017， umcl042， phi029， bnlgl108， bnlg2162, umc2188， bnlgl006， bnlg602，咖cl023， phi031， umcl406， bnlgl792， bnlgl131, dupssrl4,匿1636，bnlgl129，phi041， uracl291。 本實(shí)施例由北京奧科生物技術(shù)公司合成，每管引物為4.0 0D。 (3) PCR擴(kuò)增
用l一20對(duì)引物分別以樣品P基閑組DNA、樣品Q基因組DNA為模板同時(shí) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物分別命名為la，lb; 2a， 2b，以此類推。20uL體系中含1 XTaq DNA聚合酶緩沖液(含Mg2+)、 0. 2誦ol/L dNTP、 1 prao1/y L上下游引物，
7100 ng DNA模板。
采用touch-down PCR程序94 °C預(yù)變性5min ， 94 °C lmin, 67°C 50S、 每個(gè)循環(huán)降低1.5 °C ， 72 °C延伸lmin 6個(gè)循環(huán)，然后，94 °C變性lrain, 58 °C退火45s ， 72 °C延伸45min ，共30個(gè)循環(huán)，72 °C 10 min。
PCR擴(kuò)增在普通PCR儀上進(jìn)行即可，本實(shí)施例使用的是MJ Research, USA, PCR儀。
(4)電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物
PCR產(chǎn)物中加入4uL 6X loading buffer , 4% SFR (AMRESC0)凝膠上電 泳，點(diǎn)樣順序?yàn)镈NA Marker, la， lb， 2a， 2b,以此類推。EB(溴化乙錠)染 色，在紫外燈下檢測(cè)帶型。
結(jié)果分析la, lb; 3a, 3b; 17a, 17b多態(tài)性條帶不同；說明樣品P不是己 屮請(qǐng)保護(hù)的自交系Q。
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權(quán)利要求
1、一種玉米品種真?zhèn)舞b定方法，其特征在于采用單粒干種子的胚提取待檢樣品的基因組DNA；PCR擴(kuò)增程序中使用了如下20對(duì)核心引物bnlg1866，phi001，bnlg1017，umc1042，phi029，bnlg1108，bnlg2162，umc2188，bnlg1006，bnlg602，umc1023，phi031，umc1406，bnlg1792，bnlg1131，dupssr14，umc1636，bnlg1129，phi041，umc1291。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米品種真?zhèn)舞b定方法，其特征在于用單粒千 種子的胚提取待檢樣品的基因組DNA方法如下取千種子的2/3胚放入離心管 中，加入150 y L 0. lmol/L NaOH，沸水中放置5rain，冷至室溫后加入150y L 1 XTE (pH 2.0)緩沖液，吸打混勻后4'C放置。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米品種真?zhèn)舞b定方法，其特征在于所述的PCR 擴(kuò)增程序?yàn)門ouchDown PCR程序。
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的玉米品種真?zhèn)舞b定方法，其特征在于所述的TouchDown PCR程序如下94 °C預(yù)變性5 min， 94 °C 1 min， 67°C 50 S、每個(gè)循環(huán)降 低1. 5 °C ， 72 °C延伸1 min 6個(gè)循環(huán)；然后，94 °C變性1 min， 58 °C退 火45 s， 72 °C延伸45min ，共30個(gè)循環(huán)；72 °C 10 min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種玉米品種真?zhèn)慰旖蓁b定方法，該方法中采用單粒干種子的胚提取待檢樣品的基因組DNA，省時(shí)且所提基因組質(zhì)量高而穩(wěn)定；使用了20對(duì)SSR分子標(biāo)記核心引物，這些引物多態(tài)性豐富，帶型穩(wěn)定，均勻分布在染色體的10條染色體上；該方法還采用了優(yōu)化的TouchDown PCR擴(kuò)增程序。本發(fā)明的玉米品種真?zhèn)舞b定方法引物設(shè)計(jì)成本低，操作簡(jiǎn)單、省時(shí)，可方便、快速的對(duì)玉米品種的真實(shí)性進(jìn)行鑒定，特別適宜大量樣品的材料鑒定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101469347SQ200710304458
公開日2009年7月1日 申請(qǐng)日期2007年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日
發(fā)明者劉玲霞, 榮 孔, 張紅偉, 李明源, 王曉娜, 云 莫, 譚振波 申請(qǐng)人:北京金色農(nóng)華種業(yè)科技有限公司