專利名稱：βⅢ-微管蛋白基因檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及長春瑞賓抗癌藥敏感性預測相關(guān)基因檢測試劑盒，是通過利用SYBR GREEN I熒光定量PCR,檢測腫瘤組織中長春 瑞賓抗癌藥敏感性相關(guān)基因，Pm-微管蛋白(PlII-tubuin)基因mRNA表達 水平的試劑盒。 技術(shù)背景長春瑞濱為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案不僅是非小細胞肺癌標準的輔助化療方 案，而且是晚期非小細胞肺癌一線化療方案。盡管長春瑞濱為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療 方案能明顯延長非小細胞肺癌患者的生存時間，但最終只有5%-15%的患者從 中獲益，生存得以延長。因此，若能篩選出從該化療方案中獲益的患者，預測 化療療效，對患者進行個體化治療，將減少不必要的治療和浪費，提高療效。在過去的二十多年，人們對腫瘤生物學研究已有了非常深入的了解，腫瘤 的治療也有了巨大的進步。生長因子結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞周 期、凋亡調(diào)控和血管生成等生物學行為的研究不僅為腫瘤治療奠定了新的理論 基礎(chǔ)，指明了新的方向，而且為從分子水平指導臨床用藥，決定治療方案提供 了可能。長春瑞濱作為細胞周期特異性藥物主要通過抑制著絲點微管蛋白的聚合, 使細胞分裂停止于有絲分裂的中期來發(fā)揮作用。在抗微管藥物耐藥機制的研究 中，e微管蛋白III (Pill-Tubulin)逐漸被人們所關(guān)注。P微管蛋白是組成微 管蛋白二聚體重要結(jié)構(gòu)之一，P微管蛋白III是其中的一種同分異構(gòu)體，在多 種腫瘤組織中均有高表達。前期的研究實驗表明，P III-Tubulin的過表達能改 變抗微管類藥物的敏感性，Mll-Tubulin高表達能增加機體對長春瑞濱的敏感 性，是判斷其療效的預見性因子。免疫組化是檢測組織標本中3 III-Tubulin蛋白表達常用的方法，但大多數(shù) 腫瘤患者是晚期，失去了手術(shù)機會，大快腫瘤組織難以獲得。而實時熒光定量 PCR技術(shù)以其特異性強、所需組織少(活檢組織，脫落細胞等)、定量、敏感、 方便等優(yōu)點己得到全世界的公認，廣泛用于腫瘤相關(guān)基因、病原體等諸多臨床檢測。用定量RT-PCR法檢測藥物敏感相關(guān)基因來預測藥物療效是必然趨勢， 而成熟、標準的試劑盒是定量PCR成功檢測的關(guān)鍵。目前熒光實時定量PCR 所使用的熒光化學方法主要有染料法(SYBRGreen I染料)和探針法。其中SY服 Green I染料法不需要設(shè)計合成序列特異性探針，而且熔點曲線來分析產(chǎn)物的 均一性有助于更準確地分析和識別擴增產(chǎn)物和引物二聚體，是一種簡便，性價 比較高的實時監(jiān)測方法。目前熒光實時定量PCR所使用的熒光化學方法主要有 染料法(SYBR Green I染料)和探針法。其中SYBR Green I熒光染料定量PCR 法不需要設(shè)計合成序列特異性探針，而且熔點曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于 更準確地分析和識別擴增產(chǎn)物和引物二聚體，是一種簡便，性價比較高的實時 監(jiān)測方法。 發(fā)明內(nèi)容本實用新型的目的是為克服定量PCR探針法技術(shù)需要設(shè)計合成序列特異 性探針，檢測成本高的不足之處，提供MlI-微管蛋白(Tubulin)基因檢測試 劑盒，是采用SYBR Green I染料定量PCR技術(shù)，預測長春瑞濱抗癌藥敏感性。本實用新型由盒體、襯墊、染料法(SYBR Green I染料)PCR反應液、 Taq酶、標準品、陰性對照、陽性對照組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分別放置染 料法(SYBR Green I染料)PCR反應液、Taq酶、標準品、陰性對照、陽性 對照。本實用新型是由盒體、襯墊、染料法(SYBRGreen I染料)PCR反應液、 Taq酶、標準品、陰性對照、陽性對照及操作說明書組成，襯墊上設(shè)有容器孔， 分別放置染料法(SYBR Green I染料)PCR反應液、Taq酶、標準品、陰性 對照、陽性對照。其中染料法(SYBR Green I染料)PCR反應液的成份包含PCR緩沖液、 SYBR Green I染料、MgCl2、 dNTPs、檢測用引物。檢測用引物有兩對檢測基因，P III -Tubulin;管家基因3-磷酸甘油醛 脫氫酶(GAPDH )。其中eiII-Tubulin引物P III-Tubulin -F ACAGCAGCTACTTCGTGGAGTGGATC P III-Tubulin -R GTCTTCGTACATCTCGCCCTCTTCC GAPDH弓I物GAPDH-F GAAGGTGAAGGTCGGAGTCGAPDH-R GAAGATGGTGATGGGATTTC P III-Tubulin標準品序列為a cagcagctac ttcgtggagt ggatccccaa caacgtgaag gtggccgtgt gtgacatccc gccccgcggc ctcaagatgt cctccacctt catcgggaac agcacggcca tccaggagct gttcaagcgc atctccgagc agttcacggc catgttccgg cgc犯ggcct tcctgcactg gtacacgggc gagggcatgg acgagatgga gttcaccgag gccgagagca acatgaacga cctggtgtcc gagtaccagc sgtaccaggs cgccacggcc g鄉(xiāng)a卿gg gcg卿tgts Cg3卿CGAPDH標準品序列為gaa ggtg卿gtc ggagtcaacg gatttggtcg tattgggcgc ctggtcacca gggctgcttt taactctggt aaagtggata ttgttgccat caatgacccc ttcattgacc tcaactacat ggtttacatg ttccaatatg attccaccca tggcaaattc catggcaccg tcaaggctga g犯cgggaag cttgtcatca atggaaatcc catcaccatc ttc對照品分為陽性對照和陰性對照，陰性對照為無P III-Tubulin表達的 cDNA樣本，陽性對照為有P III-Tubulin表達的cDNA樣本。 本試劑盒保存于-4°C，盡量減少反復凍融。本實用新型建立了利用SYBR Green I熒光染料PCR技術(shù)檢測P III-Tubulin 表達的方法，并經(jīng)檢測患者標本證實該方法切實可行。SYBR Green I是一種結(jié) 合于小溝中的雙鏈DNA結(jié)合染料，檢測靈敏度很高。但是，由于SYBR Green I與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴 增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性。在本檢測項目中，通過優(yōu)化引物和 SYBR Green I PCR反應液，避免了非特異性的擴增，通過溶解曲線分析確定這 種定量方法不僅保持了 PCR的高靈敏性，而且使得被檢測基因的特異性大大提 高。與探針法相比較，方便且便宜。 本實用新型試劑盒使用方法每次檢測均應設(shè)立陽性和陰性對照。標準品用無菌去離子水稀釋為1X108 一lXl(y2拷貝/ml。擴增檢測在熒光定量PCR儀上進行，總體積50ul,其中47.5ul PCR反應 液，2.0ul檢測樣品(逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、標準品、陽性和陰性對照)，0.5ulTaqDNA 聚合酶。反應條件50°C 2分鐘，95°C 10分鐘，95°C 15秒、60°C 1分鐘共 40個循環(huán)，72"C10分鐘。溶解曲線分析擴增產(chǎn)物確定無非特異性擴增，根據(jù) 所獲得的標準曲線，分別計算標本中P III-Tubulin和GAPDH的量(拷貝/ul)。 P III-Tubulin與GAPDH的比值即為P III -Tubulin表達指數(shù)。本實用新型具有的特點是探針法和SYBR Green I熒光染料法是實時定 量PCR中的常用方法，本實用新型通過優(yōu)化PCR的引物、SYBRGreenI熒光 染料的濃度和PCR的條件，避免了 SYBR Green I熒光染料的缺陷，非特異性 的擴增，通過溶解曲線分析該試劑盒不僅保持了 PCR的高靈敏性，而且使得 被檢測基因的特異性大大提高。本實用新型設(shè)計合理，與現(xiàn)有探針法相比不需 要設(shè)計熒光探針，操作方便且節(jié)約成本。

圖1為試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為GAPDH標準品(濃度為1X1012-lXl()S拷貝/ul)擴增曲線。圖3為GAPDH標準曲線。圖4為GAPDH標準品溶解曲線。圖5為P III-Tubulin標準品(濃度為1 X 1012 -1 X 108拷貝/111)擴增曲線。 圖6為P III-Tubulin標準曲線。 圖7為P III-Tubulin標準品溶解曲線。
具體實施方式
本實用新型結(jié)合具體實施例和附圖作進一步說明。應理解，這些實施例僅 用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。 實施例l參見圖l，本實用新型試劑盒由盒體l、襯墊2，染料法(SYBRGreen I 染料)PCR反應液3、 Taq酶4、標準品5、陰性對照6、陽性對照7組成，襯 墊2上設(shè)有容器孔，分別放置染料法(SYBR Green I染料)PCR反應液3、 Taq酶4、標準品5、陰性對照6、陽性對照7。本實用新型試劑盒也可加放操作說明書8。其中染料法(SYBR Green I染料)PCR反應液的成份包含PCR緩沖液、 SYBR Green I染料、MgCl2、 dNTPs、檢測用引物。檢測用引物有兩對檢測基因，-Tubulin;管家基因3-磷酸甘油醛 脫氫酶(GAPDH )。其中e III-Tubulin引物P III-Tubulin -F ACAGCAGCTACTTCGTGGAGTGGATC P III-Tubulin -R GTCTTCGTACATCTCGCCCTCTTCCGAPDH引物GAPDH-F GAAGGTGAAGGTCGGAGTCGAPDH-R GAAGATGGTGATGGGATTTC P III-Tubulin標準品序列為a cagcagctac ttcgtggagt ggatccccaa caacgtgaag gtggccgtgt gtgacatccc gccccgcggc ctcaagatgt cctccacctt catcgggaac agcacggcca tccaggagct gttcaagcgc atctccgagc agttcacggc catgttccgg cgcaaggcct tcctgcactg gtacacgggc gagggcatgg acgagatgga gttcaccgag gccgagagca acatgaacga cctggtgtcc gagtaccagc agtaccagga cgccacggcc g鄉(xiāng)a卿gg gcg卿tgt3 cga卿cGAPDH標準品序列為gaa ggtgaaggtc ggagtcaacg gatttggtcg tattgggcgc ctggtcacca gggctgcttt taactctggt aaagtggata ttgttgccat caatgacccc ttcattgacc tcaactacat ggtttacatg ttccaatatg attccaccca tggcaaattc catggcaccg tcaaggctga gaacgggaag cttgtcatca atggaaatcc catcaccatc ttc對照品分為陽性對照和陰性對照，陰性對照為無P III-Tubulin表達的 cDNA樣本，陽性對照為有P III-Tubulin表達的cDNA樣本。 本試劑盒保存于-4。C，盡量減少反復凍融。實施例2SYBR Green I熒光染料PCR技術(shù)檢測P III-Tubulin表達及應用1. 材料組織總RNA提取試劑盒購于美國Qiagen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Green I熒光染料購于美國Invitrogen公司，pGEM -TEasy克隆系統(tǒng)，Taq DNA 聚合酶購于美國Promega公司。7500型定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。2. 引物及探針設(shè)計與合成分別以3 III-Tubulin和GAPDH全長cDNA序列(GeneBank登錄號分別為AF427491和NM-002046)為模板，在www.idtdna.com網(wǎng)上設(shè)計并分析引物，并根據(jù)基因組DNA序列情況，從中選擇最佳組合。標準品PCR和檢測用PCR引物序列相同， P III-Tubulin -F ACAGCAGCTACTTCGTGGAGTGGATC P III-Tubulin -R GTCTTCGTACATCTCGCCCTCTTCC GAPDH陽F GAAGGTGAAGGTCGGAGTC GAPDH-R GAAGATGGTGATGGGATTTC3. 檢測準備品制備取卵巢癌癌組織，組織提取試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)成cDNA， 取0.5ulcDNA在普通PCR儀上擴增P III-Tubulin和GAPDH基因片段，凝膠電泳分離純化PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物插入pGEM -T Easy克隆系統(tǒng),取陽性克隆， EcoRI酶切鑒定，Stathmin 308 bp, GAPDH 226bp。測定濃度并換算成(拷貝 數(shù)/ul)。4. 標本檢測30例經(jīng)病理確診的非小細胞肺癌活檢癌組織標本，標本用組織提取試劑盒 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)成cDNA。標本cDNA、標準品(1X108—1 X10"拷貝/ul)、陽性和陰性對照各取2.0ul，總體積50ul，在熒光定量PCR儀 ABI7500上分別進行PlII-Tubulin和GAPDH擴增。反應條件50°C 2分鐘， 95°C IO分鐘，95°C 15秒、60°C l分鐘共40個循環(huán)，72°C IO分鐘。溶解曲 線分析擴增產(chǎn)物確定無非特異性擴增，根據(jù)所獲得的標準曲線，得出標本中e III-Tubulin和GAPDH的量(拷貝/ul)。 P III-Tubulin與GAPDH的比值即為e III-Tubulin表達指數(shù)。5. 結(jié)果GAPDH標準品擴增結(jié)果參見圖2;標準曲線見參圖3，其中標準曲線的斜 率為-3.19;相關(guān)系數(shù)為0.998;溶解曲線參見圖4，其中溶解曲線表明GAPDH 擴增無非特異性產(chǎn)物，特異性產(chǎn)物溶解溫度為81.0"C; P III-Tubulin標準品擴 增結(jié)果參見圖5;標準曲線參見圖6，圖中標準曲線的斜率為-3.63;相關(guān)系數(shù) 為0.999;溶解曲線參見圖7，圖中溶解曲線表明P III-Tubulin擴增無非特異性 產(chǎn)物，特異性產(chǎn)物溶解溫度為86.4。C。(1) 30例患者組織檢;則結(jié)果如下IDGADPH Qtytubulin-beta-III Qtyratio12.10E+073.43E+0816. 3321.72E+104.57E+080. 0332.07E+096.61E+080. 3243.08E+088.07E+070. 2653. 21E+080.OOE+000. 0061.1犯+093.29E+080. 2971.50E+081.45E+080. 9782.12E+093. 01E+080. 1499.02E+060. OOE+000. 00101.01E+106. 65E+090. 66113. 21E+081.41E+080. 44129.67E+082. 45E+080. 25138.09E+094.15E+080. 05142.30E+093.05E+080.13155.03E+073.21E+070.64163.30E+091.90E+080.06174.22E+081.90E+094.50181.57E+081.61E+081.03197.77E+081.86E+080.24206.62E+091.3犯+080.02214.16E+084.36E+070.10228.09E+075.31E+070.66238.95E+075.53E+070.62242.55E+081.44E+095.65251.66E+090.00E+000.00261.24E+083.58E+070.29276.30E+070.00E+000.00286.25E+093,85E+080.06291.6犯+114.00E+090.02302.47E+104.47E+080.0權(quán)利要求1. 一種III-微管蛋白基因檢測試劑盒，其特征是由盒體(1)、襯墊(2)、染料法PCR反應液(3)、Taq酶(4)、標準品(5)、陰性對照(6)、陽性對照(7)組成，襯墊(2)上設(shè)有容器孔，分別放置染料法PCR反應液(3)、Taq酶(4)、標準品(5)、陰性對照(6)、陽性對照(7)。
專利摘要一種βIII-微管蛋白(Tubulin)基因檢測試劑盒，由盒體1、襯墊2，染料法(SYBR Green I染料)PCR反應液3、Taq酶4、標準品5、陰性對照6、陽性對照7組成。本實用新型不僅保持了PCR的高靈敏性，避免了非特異性的擴增，而且使得被檢測基因的特異性大大提高。與探針法相比較，不需要設(shè)計熒光探針，方便且便宜。本實用新型設(shè)計合理，可在檢測長春瑞賓敏感性相關(guān)基因βIII-微管蛋白中應用。
文檔編號C12M1/34GK201125248SQ200720183948
公開日2008年10月1日 申請日期2007年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月30日
發(fā)明者丹 蘇, 馬勝林 申請人:浙江省腫瘤醫(yī)院