專(zhuān)利名稱(chēng)：殘粒樣脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及臨來(lái)險(xiǎn)查中成為動(dòng)脈硬化癥等的危險(xiǎn)因素的殘粒樣脂 蛋白中的膽固醇的測(cè)定方法及測(cè)定試劑。
背景技術(shù)：
臨床檢查中，高密度脂蛋白(HDL)中的膽固醇，作為動(dòng)脈硬化癥的 危險(xiǎn)因素的負(fù)因素，低密度脂蛋白(LDL)中的膽固醇作為動(dòng)脈硬化癥的 危險(xiǎn)因素的正因素，在臨床檢查的領(lǐng)域中經(jīng)常被測(cè)定。
近年來(lái)，像殘粒樣脂蛋白這樣的，由于脂質(zhì)的代謝等引起而生成的 脂蛋白中的膽固醇，作為動(dòng)脈硬化癥的危險(xiǎn)因素，顯示出成為比LDL 中的膽固醇更為緊密的指標(biāo)，有效測(cè)定生物體試樣中的脂蛋白中的殘粒 樣脂蛋白中的膽固醇正成為課題。
關(guān)于殘粒樣脂蛋白中的膽固醇的酶測(cè)定法，報(bào)道了通過(guò)在膽固醇酯 酶和膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶中添加用于分解磷脂的酶，并才艮據(jù)情 況再添加表面活性劑的測(cè)定方法(例如，參照專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。
但是，這些方法中，從酶反應(yīng)的選擇性、筒便性方面來(lái)說(shuō)，未必能 說(shuō)是充分的。
專(zhuān)利文獻(xiàn)l:特開(kāi)平2001-231597號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供操作更為簡(jiǎn)便且敏感度良好的測(cè)定試樣中的 殘粒樣脂蛋白中的膽固醇的方法及測(cè)定試劑。
本發(fā)明人鑒于這種情況，研究了使用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶、 或膽固醇酯酶和膽固醇脫氬酶測(cè)定脂蛋白中的膽固醇時(shí)的各種條件，發(fā)
現(xiàn)可以通過(guò)使用特定的表面活性劑從含有高密度脂蛋白(HDL)、低密度 脂蛋白(LDL)、乳糜微粒(CM)、超低密度脂蛋白(VLDL)、 CM殘粒、 VLDL殘粒、中密度脂蛋白(IDL)殘留等的脂蛋白的生物體試樣中選擇 性地高敏感度地測(cè)定殘粒樣脂蛋白中的膽固醇，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及一種殘粒樣脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定方法，通過(guò)使 膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶、或膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶作用于含有 脂蛋白的被檢試樣，測(cè)定由酶反應(yīng)生成的過(guò)氧化氫或還原型輔酶，從而 測(cè)定脂蛋白中的膽固醇，其特征在于，使用分子中具有苯磺酸結(jié)構(gòu)的表 面活性劑或聚丙烯酸系高分子表面活性劑。
而且本發(fā)明還涉及殘粒樣脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定試劑，其含有膽 固醇酯酶和膽固醇氧化酶、或膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶，以及分子中 具有苯磺酸結(jié)構(gòu)的表面活性劑或聚丙烯酸系高分子表面活性劑。
通過(guò)使用本發(fā)明的測(cè)定方法和測(cè)定試劑，可以通過(guò)極為簡(jiǎn)便的方法 敏感度良好地測(cè)定殘粒樣脂蛋白中的膽固醇。


圖1:是表示使用本發(fā)明品1時(shí)的各脂蛋白的反應(yīng)曲線(xiàn)的圖。 圖2:是表示使用本發(fā)明品2時(shí)的各脂蛋白的反應(yīng)曲線(xiàn)的圖。 圖3:是表示使用本發(fā)明品3時(shí)的各脂蛋白的反應(yīng)曲線(xiàn)的圖。 圖4:是表示使用本發(fā)明品4時(shí)的各脂蛋白的反應(yīng)曲線(xiàn)的圖。 圖5:是表示使用本發(fā)明品5時(shí)的各脂蛋白的反應(yīng)曲線(xiàn)的圖。 圖6:是表示使用本發(fā)明品6時(shí)的各脂蛋白的反應(yīng)曲線(xiàn)的圖。 圖7:是表示使用比較品1時(shí)的各脂蛋白的反應(yīng)曲線(xiàn)的圖。 圖8:是表示使用比較品2時(shí)的各脂蛋白的反應(yīng)曲線(xiàn)的圖。 圖9:是表示使用比較品3時(shí)的各脂蛋白的反應(yīng)曲線(xiàn)的圖。 圖10:是表示使用比較品4時(shí)的各脂蛋白的反應(yīng)曲線(xiàn)的圖。
圖11:是表示使用比較品5時(shí)的各脂蛋白的反應(yīng)曲線(xiàn)的圖。
圖12:是表示使用比較品6時(shí)的各脂蛋白的反應(yīng)曲線(xiàn)的圖。
圖13:是表示使用比較品7時(shí)的各脂蛋白的反應(yīng)曲線(xiàn)的圖。
圖14:是表示使用比較品8時(shí)的各脂蛋白的反應(yīng)曲線(xiàn)的圖。
圖15:是表示由本發(fā)明的測(cè)定方法求得的吸光度值(縱軸)和使用市售的 RLP-膽固醇測(cè)定試劑盒獲得的值(橫軸)之間的相互關(guān)系的圖。
圖16:是表示由本發(fā)明的測(cè)定方法求得的吸光度值(縱軸)和使用市售的 RLP-膽固醇測(cè)定試劑盒獲得的值(橫軸)之間的相互關(guān)系的圖。
圖17:是表示由本發(fā)明的測(cè)定方法求得的吸光度值(縱軸)和使用市售的 RLP-膽固醇測(cè)定試劑盒獲得的值(橫軸)之間的相互關(guān)系的圖((A):未添 加抗apoB-100抗體，(B)添加抗apoB-100抗體)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的測(cè)定方法為通過(guò)使用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶、或膽固 醇酯酶和膽固醇脫氳酶，以及分子中具有笨璜酸結(jié)構(gòu)的表面活性劑或聚丙 烯酸系高分子表面活性劑作為試劑，使它們作用于含有脂蛋白的被檢試樣， 測(cè)定由酶反應(yīng)生成的過(guò)氧化氫或還原型輔酶，來(lái)測(cè)定脂蛋白中的膽固醇。
本發(fā)明的酶反應(yīng)在水性介質(zhì)中進(jìn)行，但特別優(yōu)選在緩沖液中進(jìn)行。
作為在緩沖液中使用的緩沖劑，可以列舉，例如三(羥甲基)氨基甲 烷、磷酸緩沖劑、硼酸緩沖劑和Good's緩沖劑等。作為Good's緩沖劑， 可以列舉，N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙碌酸(ACES)、 N-(2-乙酰胺基)亞氨 基二乙酸(ADA)，N,N-雙(2-羥基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-[N,N-雙 (2-羥基乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸(DIPSO)、 N-(2-羥基乙基)哌嚷-1\，-2-乙磺酸(HEPES)、 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、 3-(N-嗎淋代)丙磺酸(以下 稱(chēng)為MOPS)、 3國(guó)(N畫(huà)嗎啉代)國(guó)2-羥基丙磺酸(MOPSO)、艱喚畫(huà)N，N,畫(huà)雙(2畫(huà) 乙磺酸)(PIPES)、艱噪-N，N，-雙(2-羥基丙烷-3-磺酸)(POPSO)等。
緩沖液的pH為4 10,優(yōu)選5~9。緩沖液的使用濃度優(yōu)選為5~ 500mM，更優(yōu)選10 200mM，特別優(yōu)選20 ~ 100mM。作為膽固醇酯酶，如果是具有水解膽固醇酯的能力的酶，則沒(méi)有特 別的限定，可以列舉來(lái)源于微生物或動(dòng)物的膽固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶 等。已知這種酶的很多除了該酯酶活性之外，還同時(shí)具有脂蛋白脂肪酶 活性。本發(fā)明中，優(yōu)選使用至少一種與膽固醇酯酶活性相比，脂蛋白脂 肪酶活性更強(qiáng)的膽固醇酯酶。
具體而言，優(yōu)選使用至少一種以上的脂蛋白脂肪酶與膽固醇酯酶的
活性比率(月旨蛋白脂肪酶活性/膽固醇酯酶活性)為12 ~ 7000，優(yōu)選20 ~ 1000，更優(yōu)選28~800的膽固醇酯酶，通過(guò)使用這種酯酶，可以提高該 酶對(duì)殘粒樣脂蛋白的選擇性。而且，所謂脂蛋白脂肪酶活性，表示由使 用橄欖油乳劑的脂蛋白脂肪酶活性分析法計(jì)算時(shí)的活性單位(Horiiichi Y. etal， JBiochem 1976;80:367-370)，所謂膽固醇酯酶活性，表示由使 用胎兒牛血清的CEN活性分析法計(jì)算出的活性單位(Kameno Y. et al， Jap J Clin Path 1976;24:650)。
作為具有這種活性比率的膽固醇酯酶，可以列舉例如LP(旭化成制 藥公司制，活性比率460 ~ 800)、 LPBP(旭化成制藥公司制，活性比率 5600~6900)、 CEN(旭化成制藥公司制，活性比率13.0 ~ 16.0)、 CE(天 野酶社制，活性比率13.0 ~ 16.0)、 COE311(東洋紡社制，活性比率28.0 ~ 35.0)或與它們具有同等活性比率的酶，更優(yōu)選將它們組合使用。具體可 以列舉，CEN和LP、 COE311和LP等的組合。
作為膽固醇氧化酶，如果是具有氧化膽固醇而生成過(guò)氧化氫的能力 的酶，則沒(méi)有特別的限定，可以列舉，例如微生物或動(dòng)物來(lái)源的膽固醇 氧化酶。
作為膽固醇脫氫酶，如果是具有氧化膽固醇而還原氧化型輔酶的能 力的酶，則沒(méi)有特別的限定，可以列舉，例如微生物或動(dòng)物來(lái)源的膽固 醇脫氬酶。
而且，這些酶，可以是為了使該酶的特異性、穩(wěn)定性進(jìn)一步提高， 在以聚乙二醇作為主要成分的基團(tuán)、水溶性的寡糖殘基、磺丙基等上進(jìn) 行化學(xué)修飾的酶，而且，也可以是通過(guò)基因操作獲得的具有同等活性的 改良酶。
上述膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶和膽固醇脫氫酶的使用量，在反應(yīng)
液中均優(yōu)選0.01 ~ 200U/ml、更優(yōu)選0.1 ~ 100 U/ml。
作為分子中具有苯磺酸結(jié)構(gòu)的表面活性劑或聚丙烯酸系高分子表面 活性劑，可以是能夠提高膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶對(duì) 于殘粒樣脂蛋白的選擇性的表面活性劑，換言之，可以是通過(guò)提高該酶 對(duì)殘粒樣脂蛋白的作用，或者使該酶對(duì)殘粒樣脂蛋白之外的脂蛋白的作 用降低，從而使對(duì)殘粒樣脂蛋白的酶反應(yīng)相對(duì)地增強(qiáng)的表面活性劑。作 為分子中具有苯磺酸結(jié)構(gòu)的表面活性劑，可以?xún)?yōu)選列舉，例如，月桂基 苯磺酸、十二烷基苯磺酸等的烷基苯磺酸、聚苯乙烯磺酸、烷基二苯醚 二磺酸或它們的鹽類(lèi)等，作為鹽類(lèi)，可以列舉例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、 鎂鹽、銨鹽等。具體而言，可以?xún)?yōu)選列舉例如NEWREXR(烷基苯磺酸 鈉；日本油脂)、NEOPELEX No.6、 NEOPELEX No.25(十二烷基^M^ 酸鈉;花王)、PELEX SS-L(烷基二苯醚二磺酸鈉;花王)、聚苯乙烯磺酸 鈣(三和化學(xué))等，其中，從提高酶反應(yīng)的選擇性的方面出發(fā)，特別優(yōu)選 使用NEWREX R、 PELEX SS-L。
作為聚丙烯酸系高分子表面活性劑，可以列舉聚丙烯酸鹽、交聯(lián)型 聚丙烯酸鹽、聚丙烯酸鹽共聚物等，作為鹽，可以列舉鈉鹽、鉀鹽等， 特別優(yōu)選鈉鹽。具體而言，可以列舉，例如Jurymer AC-103(聚丙烯酸 鈉；日本純藥)、JurymerAC-20N(聚丙烯酸鈉共聚物；日本純藥)、Rheogic 252L、 Rheogic 306L(交聯(lián)型聚丙烯酸鈉；日本純藥)等，這其中優(yōu)選 Jurymer AC-103。
這種表面活性劑的使用濃度沒(méi)有特別的限定，優(yōu)選0.001~10%，更 優(yōu)選0.01~5%，特別優(yōu)選0.05~1%。
而且，本發(fā)明的測(cè)定方法中，進(jìn)而優(yōu)選聯(lián)合使用與正常的脂蛋白中 所含的載脂蛋白B-100反應(yīng)、而不與變性的載脂蛋白B-100反應(yīng)的抗 apoB-100抗體。由此可以抑制與殘粒樣脂蛋白之外的脂蛋白的酶反應(yīng)， 可以相對(duì)地增強(qiáng)與殘粒樣脂蛋白的酶反應(yīng)。這種抗apoB-100抗體可以 是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，例如，優(yōu)選抗人apoB-100小鼠 單克隆抗體(JI-H 、 JIMRO公司制)。
這種抗體的使用濃度沒(méi)有特別的限定，但優(yōu)選0.01 10mg/mL，更
優(yōu)選0.1 ~ 5 mg/mL。
而且，抗apoB-100多克隆抗體可以按以下方式制備。也就是說(shuō)， 作為免疫原使用的正常人血清LDL，可以使用用常規(guī)方法純化的產(chǎn)品， 例如，可以按照超離心法(續(xù)生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座3 "膜脂質(zhì)和血漿脂蛋白" 597-612p)適當(dāng)調(diào)制。然后，對(duì)于人之外的動(dòng)物，單次乃至數(shù)次免疫這種 純化的LDL，在血清中的抗體效價(jià)上升時(shí)取血，可以以抗血清的形式獲 得。而且，該抗血清中存在與殘粒樣脂蛋白反應(yīng)的抗體時(shí)，根據(jù)需要， 通過(guò)添加殘粒樣脂蛋白，吸收該脂蛋白，可以在測(cè)定中使用這種抗血清。
而且，作為抗apoB-100單克隆抗體的制備步驟，首先，以上述正 常人血清來(lái)源的純化LDL作為抗原，使其與弗氏佐劑等混合，對(duì)小鼠 進(jìn)行數(shù)次免疫，使免疫終止后摘出的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(例如， NS-1細(xì)胞等)融合，制備雜交瘤，獲得克隆(特公平4-53516號(hào)公報(bào))。產(chǎn) 生目的抗體的克隆的檢索，可以通過(guò)比較對(duì)于上述正常人純化LDL和 高脂血癥患者來(lái)源的純化LDL的結(jié)合性，選擇與正常人純化LDL較強(qiáng) 結(jié)合的雜交瘤，來(lái)獲得目的克隆。本實(shí)施例中使用的單克隆抗體JI-H 按照該步驟制備。
而且，免疫動(dòng)物還可以根據(jù)需要使用小鼠之外的動(dòng)物，例如大鼠等。 此時(shí)，作為骨髓瘤細(xì)胞，可以?xún)?yōu)選使用Y3、 Agl23細(xì)胞等。
本發(fā)明的測(cè)定方法中，使用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶時(shí)，通過(guò)膽 固醇的反應(yīng)由氧生成過(guò)氧化氫。可以在例如過(guò)氧化酶的存在下，使用4-氨基安替比林和苯酚類(lèi)，4-氨基安替比林和Trinder試劑或高敏感度的 色素源來(lái)定量生成的過(guò)氧化氫。
作為苯酚類(lèi)，可以列舉例如苯酚、4-氯酚、間甲酚、3-羥基-2，4，6-三 碘苯甲酸(HTIB)等。
作為T(mén)rinder試劑(同仁化學(xué)研究所第19版綜合索引，2002年)，可 以列舉N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-m-曱苯胺(TOOS)、 N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羥基 -3畫(huà)磺丙基)-3,5-二曱氧基苯胺(DAOS) 、 N-乙基-N-磺丙基-m國(guó)甲苯胺 (TOPS)、 N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、 N,N-二曱基
-m-甲苯胺、N,N-二磺丙基-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-m-茴 香胺、N-乙基-N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3,5-二曱氧基苯胺、N-磺丙基-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3,5-二甲基苯胺、N-乙基 -]\-(2-羥基-3-磺丙基)-111-茴香胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-]\-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-m-3-磺丙基-3-曱 氧基苯胺(APPS)、 N-乙基-N-3-磺丙基苯胺(ALPS)等苯胺類(lèi)或N-乙基 -]\-(3-曱基苯基)-]\，-琥珀酰乙二胺(EMSE)、 N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N，-乙?；被彝榈取?br> 作為高敏感度的色素源，可以列舉特公昭60-33479號(hào)公報(bào)中所示的 10-(1\-甲基氨基甲酰)-3，7-雙(二甲基氨基)吩噻嚷(MCDP)、特公平 4-27839中所示的雙[3- 二 (4-氯苯基)甲基-4- 二甲基氨基苯基胺 (BCMA)、特開(kāi)昭62-296號(hào)公才艮中所示的化合物等。
作為這些色素源的濃度，優(yōu)選0.01 10mM。
而且，^^用膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶時(shí)，通過(guò)膽固醇的反應(yīng)，由 氧化型輔酶NAD(P)生成還原型輔酶NAD(P)H。 NAD(P)H，可以通過(guò)測(cè) 定300 ~ 500nm，優(yōu)選330 ~ 400nm，特別優(yōu)選約340nm處的反應(yīng)液的 吸光度來(lái)定量。而且，NAD(P)H的定量還可以通過(guò)添加黃遞酶、四唑 鹽，使曱月替色素生成，對(duì)甲月替色素進(jìn)行比色來(lái)實(shí)施。
反應(yīng)在10 50n，優(yōu)選30 40C通常在37L下，進(jìn)行1 ~ 30分 鐘，優(yōu)選2 10分鐘。
本發(fā)明的測(cè)定方法是使上述試劑作用于被檢試樣的方法，如果維持 被檢試劑與上述表面活性劑，或與表面活性劑和正常的脂蛋白中所含的 載脂蛋白B-100反應(yīng)、而不與變性的栽脂蛋白B-100反應(yīng)的抗apoB-lOO 抗體反應(yīng)，然后膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶、或膽固醇酯酶和膽固醇脫 氫酶發(fā)生反應(yīng)這樣的作用順序，則各試樣的添加方法、添加順序沒(méi)有特 別的限制。而且，由于反應(yīng)是在水性介質(zhì)中進(jìn)行，因此優(yōu)選在緩沖液等 構(gòu)成的水性介質(zhì)中添加被檢試樣，于25t: 40lC攪拌調(diào)制后，添加本發(fā) 明的試劑，使之反應(yīng)1~10分鐘，進(jìn)行測(cè)定。
因此，本發(fā)明試劑的構(gòu)成為，分別各自準(zhǔn)備含有表面活性劑的試劑，
含有表面活性劑和與正常的脂蛋白中所含的載脂蛋白B-100反應(yīng)、而不 與變性的載脂蛋白B-100反應(yīng)的抗apoB-100抗體的試劑，含有膽固醇 酯酶和膽固醇氧化酶、或膽固醇酯酶和膽固醇脫氬酶的試劑，或者也可 以由它們作為一個(gè)整體來(lái)構(gòu)成。分別構(gòu)成時(shí)，可以將它們依次添加來(lái)使 用或者也可以一次性添加來(lái)使用。
而且，上述各試劑可以是液狀，也可以是片劑、粉末等固體形狀。
另外，這種測(cè)定試劑中，根據(jù)需要，可以使之含有用于將生物試樣 中的球蛋白等蛋白質(zhì)可溶化的各種鹽類(lèi)、脂蛋白凝集劑、其它酶等。
作為這種鹽類(lèi)，可以列舉氯化鈉，硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、氯化 鎂、硫酸鎂、醋酸鎂、氯化鋰、硫酸鋰、氯化銨、硫酸銨、硝酸鎂、硝 酸鉀等，在0 100mM的范圍內(nèi)使用。
作為脂蛋白凝集劑，可以列舉鵠磷酸鹽、葡聚糖硫酸鹽、肝素等的 聚陰離子，鎂、鈣、鈷等二價(jià)的金屬鹽。作為其它酶，可以列舉抗壞血 酸氧化酶等。
而且，適用于本發(fā)明的被檢試樣沒(méi)有特別的限定，具體而言，對(duì)于 生物體試樣，可以使用血液本身或血漿、血清等血液成分。
實(shí)施例
以下，列舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。 實(shí)施例1
(1) 試樣的調(diào)制
將血清成分分離為殘粒樣脂蛋白部分，LDL部分和HDL部分，進(jìn) 行各脂蛋白的測(cè)定。該蛋白質(zhì)的分離方法如下所示。
分別制備抗apoB-100抗體結(jié)合親合層析柱、抗apoA-l抗體結(jié)合親 合層析柱，添加血清，回收結(jié)合部分，分別作為L(zhǎng)DL、 HDL。而且， 在前述兩根層析柱上添加血清，回收只流過(guò)的部分，作為殘粒樣脂蛋白 部分(RLP)。各個(gè)脂蛋白用HPLC分析進(jìn)行確認(rèn)。而且，用總膽固醇測(cè) 度用試劑試劑盒將各脂蛋白中的膽固醇的濃度調(diào)制為5mg/dl。
(2)測(cè)定試劑的調(diào)制
制備下述所示的殘粒樣脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定試劑。 表l 試劑1
Good's緩沖劑pH6.8(PIPES,同仁化學(xué)社制) 50mM HDAOS(同仁化學(xué)社制) lmM 表面活性劑(參照表l;本發(fā)明品1~2，比較品2~8)
試劑2
Good's緩沖劑pH6.8(BES，同仁化學(xué)社制) 4-氨基安替比林(關(guān)東化學(xué)社制) 過(guò)氧化物酶(天野酶社制) 膽固醇酯酶
(COE311:活性比率31.8、東洋紡社制) 膽固醇氧化酶(天野酶社制) (3)測(cè)定方法 結(jié)果
50mM 3mM
10單位/mL 15單位/mL
6單位/mL
將試劑1裝入210 n L分光光度計(jì)的小室中，添加20 n L試樣進(jìn)行 攪拌，于371C加溫。然后，在344秒后添加70nL的試劑2,進(jìn)行攪拌， 在主波長(zhǎng)572nm和副波長(zhǎng)748nm處進(jìn)行測(cè)定直到667秒后。
求出添加試劑2時(shí)，即344秒后(測(cè)光點(diǎn)20)至667秒后(測(cè)光點(diǎn)38) 的吸光度變化量，計(jì)算對(duì)于RLP、 HDL和LDL而言以RLP的吸光度 變化量為100時(shí)的相對(duì)比率。結(jié)果示于表2和圖1~14中。
表2<image>image see original document page 12</image>
根據(jù)表2和圖1~14，本發(fā)明品1~6，與比較品1~8相比，都抑制 針對(duì)LDL和HDL的酶反應(yīng)，而針對(duì)RLP的酶作用的選擇性顯著上升 了。
實(shí)施例2
然后，使用自動(dòng)分析裝置TBA-20R(東芝)，按照本發(fā)明測(cè)定方法測(cè) 定人血清中的RLP-膽固醇量。使用NUREXR(本發(fā)明品)作為表面活性 劑。
試樣人血清106樣品
表3
試劑1
Good's緩沖劑pH6.8(PIPES，同仁化學(xué)社制) 50mM HD AOS(同仁化學(xué)社制) lmM NUREX R (日本油脂牙土制) 0.01%
試劑2
Good's緩沖劑pH6.8(BES，同仁化學(xué)社制)
4-氨基安替比林(關(guān)東化學(xué)社制)
過(guò)氧化物酶(天野酶社制)
膽固醇酯酶
(COE311:活性比率31.8、東洋紡社制) 膽固醇氧化酶(天野酶社制)
50mM 3mM
10單位/mL 15單位/mL
6單位/mL
測(cè)定方法為，將試劑1裝入210 jjL分光光度計(jì)的小室中，添加5 HL血清進(jìn)行攪拌，于37C加溫。然后，在344秒后添加在37C下預(yù)加溫的70jliL的試劑2，進(jìn)行攪拌，在主波長(zhǎng)572nm和副波長(zhǎng)748nm 處進(jìn)行測(cè)定直到667秒后。
求出測(cè)光點(diǎn)34 ~ 38(595 ~ 667秒)的吸光度(空白測(cè)光點(diǎn)15 ~ 19(251 ~ 328秒))，獲得與市售的RLP-膽固醇測(cè)定試劑盒(JIMRO公司 制)的相互關(guān)系(圖15)。根據(jù)圖15確認(rèn)其結(jié)果為，用本發(fā)明的測(cè)定方法 求出的值與試劑盒之間有高度相關(guān)性。
實(shí)施例3
使用自動(dòng)分析裝置7080(日立)，通過(guò)本發(fā)明的測(cè)定方法測(cè)定人血清 中的RLP-膽固醇量。而且，使用PELEXSS-L(本發(fā)明品4)作為表面活 性劑，使用COE311(活性31.8)和LP(活性比率512)作為膽固醇酯酶。
試樣人血清 30樣品
表4
試劑1
Good's緩沖劑pH6.5(PIPES，同仁化學(xué)社制) 50mM HD AOS(同仁化學(xué)社制) 1 mM
PELEX SS-L 0.02%
試劑2
Good's緩沖劑pH6.5(PIPES，同仁化學(xué)社制)
4-氨基安替比林(關(guān)東化學(xué)社制)
過(guò)氧化物酶(天野酶社制)
膽固醇酯酶
50mM
3mM 10單位/mL 10單位/mL
(COE311:活性比率31.8、東洋紡社制)
膽固醇酯酶
20單位/mL
(LP:活性比率Sl2、旭化成制藥>^司制)
測(cè)定方法為，將血清5pL裝入分光光度計(jì)的小室中，添加210nL 試劑1，進(jìn)行攪拌，于37C加溫。然后，在320秒后添加70nL的試劑 2，進(jìn)行攪拌，在主波長(zhǎng)570nm和副波長(zhǎng)750nm處進(jìn)行測(cè)定直到980 秒后。
求出測(cè)光點(diǎn)33(660秒)和測(cè)光點(diǎn)17(340秒)的吸光度差，獲得與市售 的RLP-膽固醇測(cè)定試劑盒(JIMRO公司制)的相互關(guān)系(圖16)。根據(jù)圖 16確認(rèn)其結(jié)果為，用本發(fā)明法求出的值與市售的試劑盒之間有高度相關(guān) 性(R-0.9294)。
實(shí)施例4
使用自動(dòng)分析裝置7080(日立)，通過(guò)本發(fā)明的測(cè)定方法測(cè)定血清中 的RLP-膽固醇量。
試樣人血清 27樣品
表5
試劑1
PIPES ( pH6.8 )(同仁化學(xué)社制) 膽固醇氧化酶(天野酶社制) PELEX SS-L(花王社制) HDAOS(同仁化學(xué)社制) 抗apoB-lOO單克隆抗體 (JI-H，(林)JIMRO社制) 試劑2
50mM 2U/mL 0.05% lmM
lmg/mL
BES(pH6.8)(同仁化學(xué)社制)
50mM
膽固醇酯酶(東洋紡社制) 15U/mL 過(guò)氧化酶(天野酶社制) 10U/mL 4-氨基安替比林(關(guān)東化學(xué)社制) 3mM 牛血清白蛋白(SIGMA-ALDRICH JAPAN公司制) 0.1 % 測(cè)定條件 方法
如下述方式設(shè)定測(cè)定參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。 測(cè)定方法Rate法測(cè)試讀數(shù)時(shí)機(jī)[22-[25
試樣量5juL Rl量210 pL R2量70 nL 測(cè)定波長(zhǎng)主波長(zhǎng)570nm 副波長(zhǎng)750nm 測(cè)度溫度37匸
在5nL樣品中添加210pL試劑1,進(jìn)行攪拌，于37X:加溫。然后， 在5分鐘后添加70 n L的試劑2，進(jìn)行攪拌，在主波長(zhǎng)570nm和副波長(zhǎng) 750nm處進(jìn)行測(cè)定。求出試劑2添加后的每1分鐘時(shí)的吸光度變化量， 獲得與市售的RLP-膽固醇測(cè)定試劑盒(JIMRO爿>司制)的相互關(guān)系(圖 17)。根據(jù)圖17確認(rèn)其結(jié)果為，添加apoB-lOO抗體的情況與未添加相 比，與試劑盒之間有更高的相關(guān)性。
權(quán)利要求
1.一種殘粒樣脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定方法，通過(guò)使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶、或膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶作用于含有脂蛋白的被檢試樣，測(cè)定由酶反應(yīng)生成的過(guò)氧化氫或還原型輔酶，從而測(cè)定脂蛋白中的膽固醇，其特征在于，使用分子中具有苯磺酸結(jié)構(gòu)的表面活性劑或聚丙烯酸系高分子表面活性劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的測(cè)定方法，其特征在于，還使用與正常 脂蛋白中所含的載脂蛋白B-100反應(yīng)、而不與變性的載脂蛋白B-100反 應(yīng)的抗apoB-100抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的測(cè)定方法，其特征在于，使表面活 性劑或使表面活性劑和抗apoB-100抗體作用于被檢試樣后，使膽固醇 酯酶和膽固醇氧化酶、或膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶作用，其中所述抗 apoB-100抗體與正常的脂蛋白中所含的栽脂蛋白B-100反應(yīng)、而不與變 性的載脂蛋白B-100反應(yīng)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，作 為表面活性劑，使用烷基苯磺酸、聚苯乙烯磺酸、烷基二苯醚二磺酸或 它們的鹽類(lèi)或聚丙烯酸鹽。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的測(cè)定方法，其特征在于，使 用至少l種脂蛋白脂肪酶與膽固醇酯酶的活性比率為12~7000的膽固 醇酯酶，其中所述活性比率是指脂蛋白脂肪酶活性/膽固醇酯酶活性。
6. —種殘粒樣脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定試劑，其特征在于，含有 膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶、或膽固醇酯酶和膽固醇脫氬酶，以及分子 中具有苯磺酸結(jié)構(gòu)的表面活性劑或聚丙烯酸系高分子表面活性劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的測(cè)定試劑，其特征在于，還含有與正常 脂蛋白中所含的載脂蛋白B-100反應(yīng)、而不與變性的載脂蛋白B-100反 應(yīng)的抗apoB-lOO抗體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的測(cè)定試劑，其特征在于，表面活性 劑是烷基苯磺酸、聚苯乙烯磺酸、烷基二苯醚二磺酸或它們的鹽類(lèi)或聚 丙烯酸鹽。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6~8中任一項(xiàng)所述的測(cè)定試劑，其特征在于，使 用至少l種脂蛋白脂肪酶與膽固醇酯酶的活性比率為12 ~ 7000的膽固 醇酯酶，其中所述活性比率是指脂蛋白脂肪酶活性/膽固醇酯酶活性。
全文摘要
本發(fā)明提供一種操作更為簡(jiǎn)便且敏感度良好的測(cè)定試樣中的殘粒樣脂蛋白中的膽固醇的方法和測(cè)定試劑。一種殘粒樣脂蛋白中的膽固醇的測(cè)定方法，通過(guò)使膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶、或膽固醇酯酶和膽固醇脫氫酶作用于含有脂蛋白的被檢試樣，測(cè)定由酶反應(yīng)生成的過(guò)氧化氫或還原型輔酶，來(lái)測(cè)定脂蛋白中的膽固醇，其特征在于，使用分子中具有苯磺酸結(jié)構(gòu)的表面活性劑或聚丙烯酸系高分子表面活性劑。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK101374957SQ200780003240
公開(kāi)日2009年2月25日 申請(qǐng)日期2007年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月20日
發(fā)明者中野隆光, 新見(jiàn)學(xué), 荻原富美子, 金谷一司 申請(qǐng)人:株式會(huì)社Jimro