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Fgf2結(jié)合肽及其用途的制作方法

文檔序號(hào):438050閱讀:1215來(lái)源:國(guó)知局

專利名稱::Fgf2結(jié)合肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉M纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2)結(jié)合肽,其在體外和體內(nèi)能與FGF2結(jié)^f抑制FGF2的做管生成活性,樹先^疫沒有預(yù)期影響。
背景技術(shù)
:ii聚蛋白是以五聚體結(jié)構(gòu)為特征的蛋白超家族1。經(jīng)典的^Jti聚蛋白C-A^蛋白(CRP)和血清淀粉狀蛋白P組分(SAP)A^^別^A^老鼠體內(nèi)由肝產(chǎn)生的,對(duì)A^介質(zhì)應(yīng)答的急性被白2'3。Jti聚蛋白與多種酉沐結(jié)^4f涉Wj對(duì)微生物的先天的私f生,以;5Ut細(xì)胞碎片和細(xì)^卜M組分的清除1,6。^i聚蛋白的特點(diǎn)在于具有無(wú)關(guān)的與類U聚蛋白的C末端結(jié)構(gòu)樹目連的N-末端結(jié)構(gòu)域7。原型^ii聚蛋白PTX3"是一個(gè)主要由10-20聚體的多聚體纟JLf^的45kD的糖J^t^白ie。對(duì)初始炎癥信號(hào)響應(yīng)時(shí),由不同類型的細(xì)胞,特別是單核吞喧細(xì)胞,樹突細(xì)#內(nèi)皮細(xì)^部產(chǎn)生^#^出PTX311。對(duì)ptx3—〃老鼠的研究顯示,在體內(nèi)從富^t明質(zhì)酸的細(xì)l^卜M的敘己,到雌性生育力和^^ft微生物的先天免疫,該分子^復(fù)雜的而非多余的作用12'13。這些至少部分地與PTX3高親合力地與4H^成分Clq,細(xì)l^卜基質(zhì)蛋白質(zhì)TSG6和選擇的孩t生物結(jié)合的能力,#傳激活的活化作用和傻逸巨噬細(xì)^^樹突細(xì)胞的病原體識(shí)別有關(guān)'"。因此,PTX3是一種在多種病理生理糾下具有獨(dú)特的而非多余的功能的可溶解模式的識(shí)別受體U4。成纖維細(xì)魁長(zhǎng)因子2(FGF2)是一種rt結(jié)合生長(zhǎng)因子,其絲養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中通過(guò)與高親合力酪氨^L敝體(FGFRs)的相互作用誘導(dǎo)細(xì)麟殖,趨化性,和蛋白酶的產(chǎn)生15。FGF2在體內(nèi)誘導(dǎo)血管生成并在傷口愈合,炎癥,動(dòng)脈粥樣硬化,和胂瘤的生長(zhǎng)期間調(diào)節(jié)新血管生成16。在細(xì)i^卜環(huán)鴻中,;ut分子與FGF2*,因此PiUL了它與內(nèi)皮細(xì)胞FGFRs的相互作用并抑制了它的血管生成活性(16中的#)。許多這種抑制劑^部和/或全身性產(chǎn)生/#^的,i^A血管生成過(guò)程復(fù)雜調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)。長(zhǎng)PTX3高親合力且特異地與FGF2結(jié)合。因此,長(zhǎng)PTX3在體外抑制FGF2^!負(fù)的內(nèi)皮細(xì)麟殖,在體內(nèi)抑制血管生成7。絲,在動(dòng)脈受損后,整個(gè)PTX3抑制FGF2^i負(fù)的平滑肌細(xì)胞活^f沐內(nèi)勵(lì)口厚18。因此,PTX3有可能潛^W助于在以兩種蛋白共表達(dá)為特征的不同病理背景下調(diào)節(jié)FGF2的活性,所述病理背景包括炎癥,傷口愈合,動(dòng)脈粥樣硬化,和腫瘤形成。然而,已經(jīng)揭示該蛋白沒有治療作用,表明無(wú)法利用這種大襯以及該蛋白的雞的活性。事實(shí)上,PTX3通過(guò)C末端U聚蛋白結(jié)構(gòu)域與Clq結(jié)合1。。目前,i^殳有發(fā)現(xiàn)PTX3的N-末端的生物學(xué)功能?;诖耍l(fā)明人研究了PTX3N-末端與FGF2的相互作用的能力。發(fā)明詳述已敏J腿轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的錄達(dá)PTX3的N-末端片段(1-178)的內(nèi)皮細(xì)胞,顯示出f^f氐的響應(yīng)FGF2的賄絲分絲性。純化的重組體PTX3(1-178)結(jié)合FGF2并&jh了PTX3/FGF2的相互作用。還有,識(shí)別PTX3(87-99)表位的單克隆MmAb-MNB4也P且止了FGF2/PTX3的相互作用并消除了PTX3的FGF2拮抗活性。發(fā)明人驚奇_現(xiàn)非常短的肽也^#這樣的活性并可用作治療藥物。同樣地,合成的肽PTX3(82-110),PTX3(97-110),PTX3(97-107)和PTX3(100-104)擅合FGF2,并抑制FGF2與固定在BIAcore傳感器芯片上的整個(gè)長(zhǎng)PTX3相互作用及體內(nèi)FGF2,的內(nèi)皮細(xì)自歹1^血管生成。因此,這些數(shù)據(jù)允許在PTX3N-末端擴(kuò)展區(qū)(5f"度為PTX3(97-110)的區(qū)域)內(nèi)鑒定非常短的FGF2結(jié)合結(jié)構(gòu)域。與該序列相關(guān)的合成肽能夠結(jié)合FGF2并在體外抑制FGF2^r管生成,并iL^體內(nèi)對(duì)先^Jt疫沒有預(yù)期的影響。因此4^發(fā)明的主要目的是式I的FGF2結(jié)合肽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(I)其中X,是選自Arg和Lys的^J^;X2是選自Cys和Thr的^tJ^;H或者林在或者由選自SEQIDNO:1和SEQIDNO:3的^Ju^序列纟咸;R2或者不存在或者由選自SEQIDNO:2和SEQIDNO:4的#^序列纟iL^,并遵從如下如下M:當(dāng)R,不^^在時(shí),R2也:^"在;當(dāng)R,;i^J^f列SEQIDN0:1時(shí),R2是-tJ^列SEQIDNO:2;當(dāng)是^J^列SEQIDNO:3時(shí),R2是選自SEQIDNO:2和SEQIDNO:4的^J^序列;其功能矛汴生物,前體和藥學(xué)上可接受的鹽。優(yōu)選&是Arg。更優(yōu)選的是&是Cys。甚至更^Li^斤述肽由選自SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7和SEQIDNO:10的^J^列纟賦。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是綴^^合肽,其含有式I的M其功能衍生物。術(shù)語(yǔ)"肽""^用于指包含4到100或更多的連續(xù)^J^的多肽鏈,通常是5到20個(gè)連續(xù)^J^。術(shù)語(yǔ)"功能,,定義為肽顯示FGF2結(jié)々陣性,能大大降低FGF2生物學(xué)活性。FGF2的生物學(xué)活性包M有絲分fl^血管生成作用。特別地,本發(fā)明的肽能夠抑制FGF2i秀導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)g平滑肌細(xì)胞的增殖。"前體"是通過(guò)新陳代it^S^的加工^fe用到細(xì)^iSl人^ML前或之后能夠轉(zhuǎn)變?yōu)閊^明^^的^^。本文中,術(shù)語(yǔ)"鹽"指的是本發(fā)明的肽,多肽,或其類似物的M^團(tuán)的鹽和氨基的酸加成鹽。M基團(tuán)的鹽可以通過(guò)^4頁(yè)域已知的方法制成,包括無(wú)機(jī)鹽,例如鈉,銀銨,三價(jià)鐵的或鋅鹽等等,以及因制備而帶有有積堿的鹽,例如帶有胺,比如三乙醇胺,精氨酸或賴氨酸,旅咬,普魯卡因等等。酸加成鹽包括,例如,用無(wú)才幾酸的鹽,例如鹽酸或硫酸,和用有才幾酸的鹽,例如,乙酸或草酸。任何一種這樣的鹽應(yīng)該^i^^上具有本發(fā)明的^多M其類似物的類似的活性。本文中所用的術(shù)語(yǔ)"^t生物,,指的是可以根據(jù)已知的方法由存在于^J^部分的側(cè)鏈或N-/或C-末端基團(tuán)上的官能團(tuán)制備的衍生物。這樣的衍生物包括例如^i^團(tuán)的酉旨或脂肪族氨"f雄,游離^JJ^團(tuán)的N-^^衍生物,或游離羥M團(tuán)的0-^4衍生物以及由^^團(tuán)例如&10&11(^1-或芳^^-基團(tuán)形成的衍生物。本發(fā)明還包括已經(jīng)披露的肽的肽才勤以物,其中肽的性質(zhì)已^氨J^^f則鏈,tt^手性和/或肽主^^平上以化學(xué)方法改變。這些改變意,于提供具有類似的(如果沒有改善)治療,診斷及藥代動(dòng)力學(xué)'&貢的FGF2結(jié)合制劑。例如,當(dāng)注射到受體后,#易#^^,用不可,的^^勤以^^換特別敏感的肽鍵可以提l種更穩(wěn)定的肽,因此治療時(shí)更有效。同樣地,L-M^基的置^^一種標(biāo)準(zhǔn)方式,用于^M"蛋白7JC,用具有較低的敏感性,而最終更類似于有才ji^^而非肽。還可采用^JjW的封閉基團(tuán)比力喊Xl^^J^,乙錄,琥珀醋,甲^j45t祐錄,環(huán)絲,己二絲,壬二酰基(azelayl),丹絲,節(jié)萄基羰基,芴基曱ltj^絲,曱錄壬二錄,曱M己二g,曱lLiJ^J^,和2,4-^5肖_^^基。許多,的用于增加效力,延長(zhǎng)活性,^it提純,和/或延長(zhǎng)半衰期的#^在^4頁(yè)^#是已知的。本發(fā)明的肽的性質(zhì)可以在突變的肽中保持,甚至加強(qiáng)。正如^4頁(yè)域已知的方法決定的或下面的實(shí)例所的,突變的肽包括其中一個(gè)或多個(gè)^J^J^,皮保守替4戈的^序列,只要它們擬目等甚至較高水平Ji^示出^^發(fā)明的相同的生物學(xué)活性。才本發(fā)明,突變肽艦的通常是已知的"保守"或"^^"^f戈。保守M酸^R^)那些具有十分類似的化學(xué)'1"^"的^J^酸進(jìn)行的,以^#^的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能。文獻(xiàn)提供了許多模型,利用這些模型可以基于對(duì)天然蛋擇。、、5'、,"、,突變的肽可以由傳統(tǒng)的編碼DNA定點(diǎn)誘變技術(shù),編碼DNA序列(比如DNA移碼,噬菌體展示/選擇)或^水平上的組合技術(shù),計(jì)^4雄助設(shè)計(jì)研究,或^^可雞的已知的適當(dāng)技術(shù)來(lái)產(chǎn)生,這些技^M1供了一個(gè)J^上與突變糾目應(yīng)的有限集合,而這些敗逸??梢杂杀镜俄?yè)域的技^A員利用#技#本專利申請(qǐng)的實(shí)施例的教導(dǎo)^yf或I^E。本發(fā)明的另一個(gè)目的是融^^合肽,^"有式(I)的M其功肯^f生物。所定義的它們的突變體/衍生物,以M于除PTX3以外的蛋白序列的^J^列,以提供額外的私資而不會(huì),削弱FGF2結(jié)合活性??砂谌赹V或嵌合的蛋白內(nèi)的額外的蛋白序列可以選自膜結(jié)合序列,膜結(jié)妙白的*卜區(qū)域,免疫球蛋白的恒定區(qū),多聚化(multimerization)結(jié)構(gòu)域,4&卜蛋白,^f言號(hào)肽的蛋白,棘出信號(hào)的蛋白。由融沐/或嵌合的多賊趙示出的額外寸^^|^容易提純的能力,在體液中更長(zhǎng)的持續(xù)半衰期,或細(xì)*卜定位等。這個(gè)后天的特'l"樹特定的包括在上述定義內(nèi)的一組融合或嵌M白來(lái)^^有特別的重要意義,因?yàn)樗试S本發(fā)明的肽定4i^一個(gè)空間內(nèi),在這個(gè)空間里不但^^的分離和提純變得^/方便,而且在其中PTX3與FGF2自然^目互作用。與FGF2結(jié)合,合的一個(gè)或多個(gè)序列的選擇取決于所述的肽特殊用途。做為^^r法,融妙白的制備可以通處成編碼其的核酸片段,利用普通的遺傳工程技術(shù),在用于修飾原核或^#宿主細(xì)胞的病毒粒源的可復(fù)制載體中克隆,利用附加型或非-/同源#^栽體,以絲于轉(zhuǎn)化,4錄,或轉(zhuǎn)染的技術(shù)。這些載^lf允許包括FGF2結(jié)^'J在內(nèi)的融M白4^核或4^宿主細(xì)胞中,在其自身的轉(zhuǎn),臺(tái)/終止調(diào)節(jié)序列的控制下表達(dá),這些調(diào)節(jié)序列在所述的細(xì)胞中選擇為^^型活^iU^可誘導(dǎo)的。然后可以分離提供穩(wěn)定細(xì)胞系的細(xì)胞系。特別地,不^f可時(shí),被《辨用于表ii^發(fā)明的FGF2結(jié)射"的細(xì)l^皮直接利用或施用,絲細(xì)胞為正常扭PTX3的人類細(xì)胞。如*卜序列,輸出信號(hào),或信號(hào)肽的情況下,當(dāng)額外的蛋白序列允許FGF2結(jié)合結(jié)構(gòu)域分泌到細(xì)I^卜空間中時(shí),考慮到下一步的處理,試劑可以更容易^kA^養(yǎng)細(xì)胞中收集和純化,或者可選擇地直樹^D或施用細(xì)胞。如膜結(jié)^"白序列的情況下,當(dāng)額外的蛋白允許FGF2結(jié)^'固定在細(xì)絲面時(shí),考慮到下一步的處理,試劑可能不太容易M養(yǎng)細(xì)胞中收集和純化,但可以直^fM或施用細(xì)胞,以一種對(duì)應(yīng)于某種天然PTX3的形式提供試劑,盡可育^W:高其性能。還可以通過(guò)計(jì)^Llt助藥物設(shè)計(jì)的方法ilt^定本發(fā)明FGF2結(jié)合肽,該方法利用本發(fā)明的肽結(jié)構(gòu)和/或序列,或如上面定義的相應(yīng)的活性突變體。利用計(jì)#4對(duì)財(cái)支術(shù)可更有艦用本發(fā)明的肽研究PTX3與FGF2之間的相互作用。這種計(jì)#^贈(zèng)助分析可浮,來(lái)開發(fā)合成的有才;i^或肽(例如:4-20個(gè)^4^狄)形式的改善的肽或非肽擬似藥。一M些^^經(jīng)篩選并發(fā)現(xiàn)能與FGF2結(jié)合,那么將利用細(xì)月狄動(dòng)物才莫型對(duì)其用iti^f恃定。本發(fā)明的多肽可以與異源部分^h或非M結(jié)合,或直接或通過(guò)^JD4給劑或接頭構(gòu)成活性綴合物或復(fù)合物,這些異源部分可以選自細(xì)l^lit劑,#^己(例如,生物素,熒光4朽己),藥物或,的治療劑??梢岳帽绢I(lǐng)域已知的分子和方法(iW性或熒光^i己,生物素,細(xì)l^4生劑,藥物或,的治療劑)制備可用的綴*或復(fù)^。細(xì)脅f生劑包括化療劑,毒素(例如,細(xì)菌,真菌,植物或動(dòng)物來(lái)源的酶活性毒素或其片段),或者iMt性同位素(即,性綴^4勿)。能用的酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈,白喉毒素非結(jié)合活性的片段,夕卜毒素A鏈(源自^l^f菌(Pseudomonasaeruginosa)),11^4"蛋白A鏈,相思豆絲白A鏈,蒴蓮^^素(modeccin)A鏈,or帚曲霉素(a-Sarcin),油桐(Aleuritesfordii)蛋白,石竹素蛋白,美洲商陸(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI,PAPII,和PAP-S),苦瓜(Momordicacharantia)抑制劑,麻W"素蛋白,巴豆毒蛋白,石堿草(Saponariaofficinalis)抑制劑,白樹毒蛋白(gelonin),mitogellin,局限曲菌素,酚霉素,伊諾霉素,和單端^#烯族^^物(tricothecenes)。M,性核素可用于制備;^yt性綴合蛋白。實(shí)例包括2"Bi,131I,131In,9°Y,和le。還可以制名^r用的綴*或者復(fù)*以改善試劑的藥物的遞a力。為此,本發(fā)明的肽可以與分子比如聚乙二醇及務(wù)池天然的或合成的聚合物形成活性綴^7或者復(fù)"^(Harris頂和ChessRB,NatRevDrugDiscov.(2003),2(3):214-21;Gree畫ldRB等,AdvDrugDelivRev.(2003),55(2):217-50;Pillai0和PanchagnulaR,Curr0pinChemBiol.(2001),5(4):447-51)。在這一點(diǎn)上,正如在本文中公開的,本發(fā)明關(guān)注以化學(xué)方法修飾的肽,其中肽是與聚^連接的'4,聚*是7條性的,以便綴錄在7j^目,比如生理恥免中不^^D定。用于治療的綴^可以包含藥學(xué)可接受的水溶法聚^部分。iM的水可溶性聚絲包緣乙KPEG),單曱|1^-PEG,單-(C1"C10)^I^PEG,芳llJ^PEG,聚-(N-乙烯基他咯烷酮)PEG,tresyl單曱lL4PEG,PEG丙醛,雙-彭白^iE胺基(succinimidyl)碳BPEG,丙二醇均聚物,聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙;^聚物,^乙烯多元醇(例如,甘油),聚乙烯醇,葡彩瞎,纖維素,或其他的基于碳水^^物的聚合物。適用的PEG可以具有從大約600到大約60,000,包括,例如,5,000,12,000,20,000和25,000的M量。綴^也可以包^i些7j^性聚^的;;^^。綴合物的實(shí)例包含了本發(fā)明的肽和附著至所述多肽N-末端的,1^化物部分。PEG是一種合適的^S^IU膽。作為說(shuō)明,本發(fā)明的肽可以用PEG來(lái)修飾,該過(guò)程被稱為"PEG^匕"??梢杂帽绢I(lǐng)域已知的任何PEG化^M行PEG化。例如,可以用反應(yīng)性的聚乙JHl^通itm^i^^或者^(guò)i^版應(yīng)進(jìn)行PEG化。在一種替換的方法中,通it^合激活的PEG形成綴合物,其中PEG的末端羥^ll^已經(jīng)^^性接頭4^。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼本發(fā)明的FGF2結(jié)^^肽的核酸,與上述核酸雜交的核酸,具有簡(jiǎn)并序列的核酸。本發(fā)明還包括病毒i^貧粒源的表ii^體,其^^發(fā)明的核酸得以表達(dá),以^這樣的栽^#化的原核或真核宿主細(xì)胞和由》諷到的穩(wěn)定的細(xì)胞系,這些細(xì)月汰達(dá)FGF2結(jié)^1],所述FGF2結(jié)合劑可以被分泌或在g面jL4達(dá)。實(shí)例是人類B細(xì)胞。本發(fā)明的FGF2結(jié)合肽可以利用這樣的方法制備,即徊菱當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)上面描述的宿主細(xì)胞并收集FGF2結(jié)合劑。編碼本發(fā)明的肽的DNA序列可以插入并連接到適當(dāng)?shù)妮d體中。一旦制成,將表錄體導(dǎo)Ait當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中,該宿主細(xì)胞歸表達(dá)出肽。利用適當(dāng)?shù)谋韎i^體,在M細(xì)胞(例如,酵母,昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)或原核細(xì)胞中可以表達(dá)^f可在本文中提到的本發(fā)明重組肽。可以釆用^4貞域已知的任,何方法。為了能夠表ii^斤需的蛋白,4ii^體應(yīng)該還包^^有與編碼所需蛋白的DNA相連的轉(zhuǎn)^^調(diào)節(jié)信息的特定核苷酸序列,由J^吏得基因表達(dá)并產(chǎn)生該蛋白。首先,為了轉(zhuǎn)絲因,基因之前必須有可被RNA聚^i只別的啟動(dòng)子,聚M與^^f由此開始轉(zhuǎn)^t程。通用的這種啟動(dòng)子有很多種,其以不同的效率(強(qiáng)啟動(dòng)子和弱啟動(dòng)子)起作用。對(duì)于真核宿主,可以才M居宿主的棒I"生,采用不同的轉(zhuǎn)^^調(diào)節(jié)序列。它們可能衍生自病毒,比如腺病毒,牛乳頭瘤病毒,猿猴病毒等等,其中的調(diào)節(jié)信號(hào)與具有高表ii7jc平的特殊基因相關(guān)。實(shí)例是皰滲病毒的TK啟動(dòng)子,SV40早期啟動(dòng)子,酵母gal4基因的啟動(dòng)子,等等??梢赃x擇能夠允i午抑制和激活的轉(zhuǎn)^i臺(tái)調(diào)節(jié)信號(hào),以^更調(diào)節(jié)基因的^Ji。#^有編碼本發(fā)明蛋白的核苷齡列的DNAM插^^具有有^j^接的轉(zhuǎn)^N^W1節(jié)信號(hào)的載體中,該栽體能夠?qū)⑺璧幕蛐蛄旋g到宿主細(xì)胞中。也可以通過(guò)導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)允許用于選擇包含表ii^體的宿主細(xì)胞的才朽己^it擇已^皮導(dǎo)入的DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。^i誠(chéng)可以為營(yíng)養(yǎng)缺陷型的宿主提供M營(yíng)養(yǎng),還可以提供^^t物劑抗性,如抗生素抗性,或重金屬抗性比如銅抗性等等??蛇x擇的才朽己基因可以直接與待表達(dá)的DNA基因序列連接,也可以通過(guò)共轉(zhuǎn)染導(dǎo)Ai'J同一個(gè)細(xì)胞中。載體的附加元件還可f沐利于獲得本發(fā)明蛋白的最佳產(chǎn)品,特別是對(duì)于選棒f爭(zhēng)別的包含質(zhì)iNsl病毒載體的細(xì)胞易于從不^^體的受體細(xì)胞中識(shí)別并挑選出包M體的受體細(xì)胞;在特殊的宿主中要求的栽體的拷貝數(shù);以及載體是否能如意^不同種類的宿主細(xì)胞間"穿梭"。一旦制M用于表達(dá)的包^J建體的載^DNA序列,就可以采用<封可合適的方法轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)染,接合,原生質(zhì)體融合,電穿孔法,磷酸铞沉淀,直接的顯微注射等等將DNA構(gòu)建體導(dǎo)AJiJ適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中。宿主細(xì)胞可以是原核的或真核的。優(yōu)選M的宿主,例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞,比如人,猴子,小鼠,以及中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞,因?yàn)樗鼈兲酠白質(zhì)分子的l^f后^,,包括正確的折疊或^JE確的位點(diǎn)糖基化。酵母細(xì)艦可以進(jìn)行包4甜唐基化作用的肽的^后#^。存在許多利用強(qiáng)啟動(dòng)子序列和質(zhì)粒高拷貝數(shù)的重組DNA策略可以用于在酵母中制備所需蛋白。酵母能i尸Jj克隆的哺乳動(dòng)物基因產(chǎn)物的前導(dǎo)序列并分泌具有前導(dǎo)序列的肽(也f^U^前肽)。導(dǎo)入載體后,在選#^養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞,該培養(yǎng)基用于篩選包M體的細(xì)胞的生長(zhǎng)??寺』蛐蛄械谋磉_(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生出所需的蛋白。許多綜述和書籍|€供了々"可利用栽體和原核或M宿主細(xì)胞克隆并生產(chǎn)重組蛋白的教導(dǎo),例如一些由牛津大學(xué)出版社出版的系列標(biāo)題為"實(shí)踐方法"的書籍("DNA克隆2:表達(dá)體系"1995;"DNA克隆4:哺乳動(dòng)物體系",1996;"蛋白表達(dá)"1999;"蛋白純^4支術(shù)",2001)?;瘜W(xué)合^^支術(shù)的實(shí)例是固相合成和斜目合成,其為生產(chǎn)本發(fā)明的FGF2結(jié)合劑(以liiUM^以物的形式)提供了更多的指導(dǎo)。例如固相合成時(shí),與待合成的肽C-末端對(duì)應(yīng)的^iJ^合到不溶于有才;i^劑的支持物上,!5l^gj^的交替重復(fù),具有^J^側(cè)鏈官能團(tuán)用適當(dāng)?shù)谋Wo(hù)基團(tuán)保護(hù)的^J^^l從C-末端到N-末端縮合,再做出與樹脂結(jié)合的^J^或肽的^J^呆護(hù)基,如jfc^f申肽鏈。才財(cái)居4吏用的1呆護(hù)基團(tuán)的類型,固才目^^成方法主#為tBoc方法和Fmoc方法。的保護(hù)基團(tuán)包括用于絲的tBoc(叔丁^J^tt),Cl一Z(2-氯千M^),Br-Z(2-溴千^JO,Bzl(苯甲基),F(xiàn)moc(9-芴甲城基),Mbh(4,4,-二曱^^1苯甲基),Mtr(4-甲錄-2,3,6-三甲J^絲),Trt(三苯甲基),Tos(甲^t^JO,Z(千Il4絲)和ClfBzl(2,6-二絲甲基);用于胍絲團(tuán)的恥2(硝基)和Pmc(2,2,5,7,8-五甲基色烷-6-^tJO;和用于羥基的tBu(叔丁基)。需要的肽合成后,對(duì)其進(jìn)行脫保護(hù)^并從固體支持物上將其切下。這種肽的切除^,對(duì)于Boc方法可以用氟化氬或三氟代曱^t^進(jìn)行,而對(duì)于Fmoc方法則用TFA。通過(guò)DNA重組或化學(xué)合^U支^I^得的FGF2結(jié)射ij最^"經(jīng)過(guò)一次或多次的純化??梢酝ㄟ^(guò)^f^f可用于此目的的已知的方法來(lái)進(jìn)行純化,也#&,任何包括萃取,W定,層析,電泳等等的常財(cái)法。例如可以4^1HPLC(高效斜目色譜法)??梢岳猛ǔS糜诘鞍准兓幕?K-乙腈的溶劑進(jìn)fr冼脫。本發(fā)明包括了本發(fā)明FGF2結(jié)射'j的純化制劑。本文中^JD的純化制劑指的是本發(fā)明的4^物干重至少1%,M至少5°/。的制劑。如上所述的本發(fā)明的4^物(蛋白,肽,有4X4^物)可以用做藥物。優(yōu)選用于抗由于血管生成改變導(dǎo)致的疾病。更優(yōu)選由生長(zhǎng)因子FGF2的活性引fejk管生成的改變。口^疾病選自關(guān)節(jié)炎疾病,腫瘤#^多,糖尿病'f織網(wǎng)膜病變,牛皮癬,慢性炎癥,動(dòng)樂W更^il肺瘤。^(fei^W瘤選自肉瘤,癌,類癌,骨瘤或神經(jīng)內(nèi)分泌瘤。如上所述的本發(fā)明的化合物(蛋白,肽,有才;i/f化物)可被用于抗與FGF2依賴的成纖維細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞增殖不受控制,與成纖維細(xì)^^it/l相關(guān)的瘢痕形成以;^jk管成形后再狹窄相關(guān)的疾病。事實(shí)上,本發(fā)明的FGF2結(jié)合肽一旦與FGF2結(jié)合,才MJFGF2的抑制劑。實(shí)際Ji^發(fā)明的肽能夠抑制FGF2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞的增殖。所以這種分子的治療潛力在,防和/或治療在其中抑制FGF2有好處的疾病。其隨后的^ii可以用&成少表達(dá)FGF2的細(xì)胞的lt量。本發(fā)明的FGF2結(jié)合肽可被用作用,防和/或治療由血管生成改變導(dǎo)致的疾病的藥物組^中的活性成分,其中的血管生成^A由于FGF2的活性引起的。所述疾病的實(shí)例是關(guān)節(jié)炎疾病,肺瘤##,糖尿病'船見網(wǎng)膜病變,牛皮癉,慢性炎癥,動(dòng)樂W更^il腫瘤,其中肺瘤是,例如,肉瘤,癌,類癌,骨瘤或神經(jīng)內(nèi)分泌瘤。本發(fā)明的FGF2結(jié)^'J還可^UIHM,防和/或治療與FGF2依賴的成纖維細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞增殖不受抑樹目關(guān)的疾病(例如與成纖維細(xì)^jSitl相關(guān)的瘢痕形成以Ajk管成形后再狹窄)的藥物組,中的活性成分。本發(fā)明還提供了用預(yù)防和/或治療上述疾病的,含有治療有效量的式I的肽或其功能衍生物以及適當(dāng)?shù)南♂寗┖?或賦形劑和/或佐劑藥物的藥物組合物。這些藥物組*可以與藥學(xué)可接受的栽體,賦形劑,穩(wěn)定劑,或稀釋劑一起配制。才^居制劑的'^t,藥物組^/可以用于與CD4+T細(xì)l&f關(guān)的疾病,例如自身免疫疾病,炎癥,或感染。包含本發(fā)明的FGF2結(jié)合肽的藥物組*包括了所有的組合物,其中所述的^^物為治療有效量,也^^^治療的動(dòng)物中iii'j醫(yī)學(xué)上期望的^的有效量。藥物組^中可以包^t當(dāng)?shù)乃帉W(xué)可接受的載體,生物學(xué)相容的適于對(duì)動(dòng)物給藥的介質(zhì)(例如,生理鹽水)和^包含的,^更于將活性^^加工成制劑(其在藥學(xué)上可被使用)的輔劑(像賦形劑,穩(wěn)定劑或稀釋劑)藥物組^可以按照^fT^接受的方法配制以滿A^藥方式的需要。用于藥物遞送的生物材料及^聚^^的使用,以及不同的用于^iE^藥的特定方式的技#模型在文獻(xiàn)中e^"披露。對(duì)本發(fā)明的化^進(jìn)行^i^以^ii其穿透血腦屏障也是有利的。^^頁(yè)域的技^A員可以決定并采用^fTT接受的給藥方式。例如,可以通過(guò)樹腸胃外途徑比如經(jīng)皮下,靜脈內(nèi),皮內(nèi),肌內(nèi),內(nèi),鼻內(nèi),經(jīng)皮,口腔,或面頰來(lái)給藥??梢酝ㄟ^(guò)推注或長(zhǎng)時(shí)間的平緩灌注iMi行腸胃外給藥。用于腸胃外給藥的制劑包括無(wú)菌水或非水f生溶液,懸浮劑,和乳劑,其可以包含;^4頁(yè)域已知的助劑或賦形劑,并且可以按常規(guī)方法制備。Hi^卜,活性^^;懸浮劑如油性注射懸浮劑可以用于給藥。適當(dāng)?shù)挠H脂性的溶劑或介質(zhì)包括脂肪油,例如,芝麻油,或合^J旨肪酸S旨,例如,芝麻油,或合^J旨肪酸酯,例如,油酸乙酯或甘油三酸酯。水性注射懸浮液可以包含增加懸浮劑粘性的物質(zhì),包括,例如,羧曱基纖維素鈉鹽,山梨糖醇,和/或葡聚瞎。任g,懸浮劑還可以包^^急定劑。藥物組^;包^it當(dāng)?shù)挠糜谧⑸浣o藥的溶液,并包^^從大約百分之0.01到99,優(yōu)i^A大約百分之20到75的與賦形劑-^的活性^^??梢裕o藥的組合物包緣劑。應(yīng)理解的是給藥劑量將取決于受體的年齡,性別,W:和體重,以及同時(shí)發(fā)生的治療方式,如M,還有治療的頻率,以及要求的^t^的'^t。正如本領(lǐng)域^支術(shù)人員明白和可決定的,劑量^"適合個(gè)體目標(biāo)。每種治療所需的總劑量可以通過(guò)多次劑量或單次劑量給藥。本發(fā)明的藥物組合物可以直^4十對(duì)病況或針對(duì)病況的^^狀單獨(dú)或連同其他的療法給藥。通常洽性成分的每日劑量在0.01到100毫克^/〉斤體重之間。本發(fā)明的^^可以在藥學(xué)可接受的載體(例如生理鹽水)中通過(guò)靜脈內(nèi)給病A^用。可以釆用肽的胞內(nèi)遞送的標(biāo)準(zhǔn)方法,例如,通i^旨質(zhì)體遞送。這些方法對(duì)于;^頁(yè)域的技7pv員來(lái)i)L^0^斤周知的。本發(fā)明的制劑可以用于腸胃外給藥,例力0#脈內(nèi),皮下,肌內(nèi),和^M內(nèi)。正如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域/^的,用于任何一個(gè)的病人的劑量MiS午多因素,包括病人的個(gè)體大小,體表面積,橫,待施用的特殊^^/,性別,給藥時(shí)間和途徑,綜合的健康狀況,和將同時(shí)施用的其它藥物。本^/斤有《I用的文獻(xiàn)在此以《1用方式完4^f入,包4封皮?1用的參考文獻(xiàn)中的所有的數(shù)據(jù),表格,圖形和正文。jW卜,在本文中引用的參考文獻(xiàn)中引用的參考文獻(xiàn)的所有內(nèi)容也以?1用方式完4^fA^iL。無(wú)^M可,對(duì)已知方法步驟,常旨法步驟,已知的方法或常^r法的參考文獻(xiàn)不屬于W目關(guān)
技術(shù)領(lǐng)域
中披露,教導(dǎo)或建i5C^發(fā)明的任何方面,描itiH沐實(shí)施方案。一旦了解本申#的方法和產(chǎn)品的沐吾、,可以m^易艦itt^"技術(shù)的綜述推導(dǎo)出必要的和額外的步驟,對(duì)于描ii^發(fā)明基本細(xì)節(jié)和一些應(yīng)用的非限制性的附圖和實(shí)施例也;i如此。圖1.通過(guò)jjj轉(zhuǎn)錄病4^導(dǎo)的Ntera-PTX3對(duì)FGF2的促有絲分裂活性的抑制。(A)對(duì)用EGFP,人4^PTX3,sC,-PTX3,或N咖-PTX3逆轉(zhuǎn)錄病絲染的鼠科主動(dòng)脈內(nèi)皮(MAE)細(xì)胞的M培養(yǎng)的蛋白質(zhì)印跡分析。在sC,-PTX3泳道中存在兩條對(duì)應(yīng)于糖基4詠非糖基化形式的重組蛋白ie的免^J^性的條帶。(B)用FGF2(0.55nM)刺激逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的MAE細(xì)胞。48小時(shí)后,用胰蛋白酶處理細(xì)胞并進(jìn)^i十?dāng)?shù)。數(shù)據(jù)表示為在才對(duì)以物感染的FGF2處理的細(xì)胞中觀瘵到的增殖的百分比(細(xì)l&Wt力口0.8倍)。(C)用來(lái)自感染的MAE細(xì)胞的糾培養(yǎng)^j顯育GM7373細(xì)胞并立即用0.55nM的FGF2處理。24小時(shí)后,用胰蛋白,理細(xì)胞并進(jìn)^i十?dāng)?shù)。數(shù)據(jù)表示為在添加有FGF2的新鮮培養(yǎng)基中溫育的的GM7373細(xì)胞中觀蕃到的增殖的百分比(細(xì)l^^增加1.0倍)。在B和C中,數(shù)據(jù)是一式三份的3個(gè)獨(dú)立實(shí)糊平均數(shù)士SD。圖2.重組N咖-PTX3對(duì)FGF2/PTX3的相互作用的抑制。(A)由轉(zhuǎn)化的;^桿菌細(xì)l^達(dá)并純化重組的帶6xHis標(biāo)簽的N咖-PTX3和C咖-PTX3。(插圖顯示的"口載純化蛋白的SDS-PAGE皿的銀染)。然后,涂有FGF2的孔與全長(zhǎng)PTX3,N咖-PTX3或C咖-PTX3(都是44nM)在37。C溫育30分鐘。通定化的FGF2結(jié)合的蛋白的相對(duì)的量。(B)在不含或^it量10倍摩爾量的全長(zhǎng)PTX3,N咖-PTX3或C咖-PTX3的*下,涂有FGF2的孔與生物素化(biotinylated)的PTX3(bPTX3,22nM)—起溫育。然后,測(cè)定與固定的FGF2結(jié)合的bPTX3的量,數(shù)據(jù)表示為在不含^f可竟?fàn)幷叩臈l件下測(cè)定的結(jié)合的百分比。所有的數(shù)據(jù)都是一式三^j3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)士SD。圖3.PTX3表位圖鐠。(A)利用單克隆脅mAb-MNB4和mAb-16B5對(duì)4^PTX3,Nterm—PTX3,和Ct咖-PTX3(200ng/泳道)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。(B)通迚泉合成技術(shù)將橫跨整個(gè)人PTX3序列的128個(gè)重疊的13肽排列在纖維素膜上。然后,用抗體mAb-MNB4(黑色柱)和mAb-16B5(灰色柱)對(duì)膜進(jìn)^^!,J,并用光密;t^析法對(duì)菔上的免疫復(fù)^^進(jìn)行定量分析。被兩種圖4.mAb-MNB4阻礙FGF2/PTX3的相互作用。(A)用22nM的bPTX3在不含或含4^PTX3,mAb-MNB4,或mAb-16B5(全都是220nM)的條件下溫育涂有FGF2的孔。然后,測(cè)定與固定的FGF2結(jié)合的bPTX3的量,數(shù)據(jù)表示為在不含"f壬何竟^的條件下測(cè)定的結(jié)合的百分比。(B)用FGF2(0.55nM)外加PTX3(220nM)在不含或含mAb-MNB4,或mAb-16B5(兩者都是2.2jiM)的條件下培養(yǎng)GM7373細(xì)胞。24小時(shí)后,用胰蛋白i^t理細(xì)胞并進(jìn)^i十?dāng)?shù)。數(shù)據(jù)表示為在,F(xiàn)GF2培養(yǎng)的GM7373細(xì)胞中XC^到的增殖的百分比。所有的數(shù)據(jù)都是一式三份的3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)±SD。圖5.合成的PTX3財(cái)FGF2/PTX3相互作用的抑制。(A)人PTX3的N-末端和相關(guān)的合成ptx3肽的示意圖。(b)涂有標(biāo)明的ptx3肽的孔(200jjg/孔)加入FGF2(80nM),并測(cè)定FGF2結(jié)合的量。數(shù)據(jù)是一式三份的3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)士SD,其表示為與涂有PTX3的孑L^合的FGF2量的百分比。(C)上圖FGF2(0.8iaM)注射到涂有PTX3或明膠的BIAcore傳感器芯片上。下圖Sensogram;tJi^示遞增量的FGF2(0.1,0.5,0.8和1.1pM)與固定的PTX3的結(jié)合。M記錄為時(shí)間函數(shù)(以共4Il^(立RU表示)。(D)在增加濃度的全長(zhǎng)PTX3(園)或合成的PTX3肽(82-110)(),混雜的PTX3(82-110)(),或PTX3(57-85)(□)的存在下將FGF2(0.8|aM)注射到涂有PTX3的BIAcore傳感芯片上。在注射結(jié)束時(shí)記^A^并繪制為拮抗劑M的函數(shù)。對(duì)于^"^種肽,在2-3個(gè)的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中M到了刻以的結(jié)果。(E)在不含PTX3或含PTX3(220nM)或含標(biāo)明的PTX3肽(都是66juM)的條件下,用FGF2(0.55nM)培養(yǎng)GM7373細(xì)胞。數(shù)據(jù)是一式三份的3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)±SD,其表示為在^UUFGF2培養(yǎng)的GM7373細(xì)胞中,膝到的增殖的百分比。圖6.PTX3(97-110)肽歸FGF2拮抗劑。U)PTX3(82-110)區(qū)間肽示意圖。(B)涂有標(biāo)明的PTX3肽(200jag/孑L)的孔用FGF2(80nM)溫育并測(cè)定結(jié)合的FGF2的量。數(shù)據(jù)是一i^X份的3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)士SD,表示為與涂有PTX3的孑L結(jié)合的FGF2量的百分比。(C)在PTX3(82-110)(),PTX3(97-110)(o),PTX3(82-101)(■),或PTX3(82-96)(▲)濃度增加的^下將FGF2(0.8)iM)注射到涂有PTX3的BIAcore傳感器芯片上'在注射結(jié)束時(shí)記^Ml并繪制為拮抗劑濃度的函數(shù)。對(duì)于^-種肽,在2-3個(gè)的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中麟到了類似的結(jié)果。(D)在不含或含標(biāo)明的PTX3肽(都是66/aM)的務(wù)降下用FGF2(0.55nM)溫育GM7373細(xì)胞。數(shù)據(jù)是一式三份的3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)士SD,表示為在^UDFGF2溫育的GM7373細(xì)胞中觀測(cè)到的增殖的百分比。(E)在PTX3(97—110)()PTX3(100-110)(),PTX3(97-104)(▲),或PTX3(97-107)(T),PTX3(104-113)(),PTX3(100-113)(▲),PTX3(100-104)(■)^!增加的糾下將FGF2(0.8nM)注射到涂有PTX3的BIAcore傳感器芯片上。在注射結(jié)束時(shí)記^A^并斜'J為拮抗劑濃變的函數(shù)。對(duì)于^"種肽,在2-3個(gè)的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中,到了類似的結(jié)果。圖7.PTX3(82-110)肽的:Rjk管生成活性。在第11天#^有介質(zhì)(a)或含16pmol的FGF2且不含(b)或含有(c)3nmol的PTX3(82-IIO)的藻^珠子才lA^鳥胚胎絨4^^M(CAM),在第14AXt其進(jìn)行拍照。原始放大倍數(shù),x5。實(shí)施例實(shí)施例1化學(xué)藥品分別在大腸桿菌和和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中表達(dá)人重組FGF2(登記號(hào)碼09038)和PTX3(躬己號(hào)碼swiss-protP26022)^^文獻(xiàn),進(jìn)4詢化。合成的人PTX3(31-60),PTX3(57-85),和PTX3(107-132)肽由Primm(Milan,意大利)|^供,^fe所有的肽由Tecnogen(PianadiMonteverna,Caserta,意大利)提供(HPLC純度>95%)。表1以單字母^^顯示了所有的肽的^tj^列,編號(hào)是從PTX3前導(dǎo)序列位置1中的曱石M^^^開始。表l.人PTX3的N-末端區(qū)間的合頗。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>針對(duì)純化的人PTX3的大鼠單克隆^#4之賄所描述1D'2°(MNB1目錄號(hào)ALX-804-463,MNB4目錄號(hào)ALX-804-464,AlexisBiochemicals)。細(xì)月姊養(yǎng)胎牛主動(dòng)脈內(nèi)皮GM7373細(xì)胞"在含有10^胎牛血清(FCS)的Eagle,sMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。人胚腎(EcoPack2-293)包裝細(xì)胞(Clontech,CA,美國(guó))在含有10%FCS的DMEM培養(yǎng)基(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)中生長(zhǎng)。Balb/c鼠科主動(dòng)脈內(nèi)皮22106細(xì)胞(MAE細(xì)胞)獲自R.Auerbach(Wisconsin大學(xué),Madison,WI)并妙有10%FCS的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染編石馬人PTX3和增強(qiáng)型綠色熒光的蛋白(EGFP)的cDNA才財(cái)居e^的文獻(xiàn)"描^:得。通過(guò)PCR和標(biāo)準(zhǔn)的克隆技術(shù)由pLX-PTX3"產(chǎn)生編碼與用于PTX3分泌的前導(dǎo)序列PTX3(1-17)融合的N-末端片段PTX3(1-178)(N咖-PTX3)和C末端片段PTX3(179-381)(sC咖-PTX3)的cDNA。所有的cDNA克隆到pBABE逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中,生成pBABE-PTX3,pBABE-Nterm-PTX3,pBABE-sC咖-PTX3,和pBABE-EGFP,用于在Lipofectamin"存在的條件下轉(zhuǎn)染EcoPack2-293錄細(xì)胞(packagingcells)。用嘌呤霉素(1Mg/ml,Sigma)篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞,持續(xù)2周。病毒滴A變高于106cfu/mL的克隆用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。然后在含有聚凝胺(8ug/ml,Sigma)的條件下,將MAE細(xì)胞的鋪滿培#^用來(lái)自pBABE-PTX3,pBABE-Nterm-PTX3,pBABE-sC咖-PTX3,或pBABE-EGFP^細(xì)胞的M培養(yǎng)^顯育24小時(shí)。用嘌呤霉素篩選受感染的細(xì)l^并持續(xù)7天。用,焚絲孩i鏡(AxiovertS100顯孩£鏡,x10/0.25;ZeissG6ttingen,德國(guó))對(duì)感染EGFP細(xì)胞的觀測(cè)顯示逆轉(zhuǎn)錄病毒的感^t率高于80%。為了評(píng)定受感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因蛋白的表^#放的水平,在M清^t下培養(yǎng)細(xì)胞2天。然后,收集糾培養(yǎng)基,離心分離,用CentriconYM-10過(guò)濾器(Millipore)棘10倍,取100ju1的等^#進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)分析。細(xì)麟殖微按照文獻(xiàn)描述22用內(nèi)皮細(xì)^^行細(xì)^>曾殖"。簡(jiǎn)而言之,GM7373或廳細(xì)月&^種在96孔的平皿中,接種量分別為75,000細(xì)胞/cm2或25,000細(xì)胞/cm2。16小時(shí)后,在含或不含不同拮抗劑的糾下,在包含0.4%FCS夕卜加FGF2(0,55nM)的新鮮培養(yǎng)基中溫育細(xì)胞。分別在24或48小時(shí)后,在Burker小室中對(duì)細(xì)艦行胰蛋白艦S^i十?dāng)?shù)。重組的帶6xHis-標(biāo)各的PTX3片段的;t^桿菌的表缺純化利用含外加的核苷酸的引物通過(guò)PCR由pLX-PTX3擴(kuò)增出NtOT-PTX3和Cterm-PTX-3的c薩ptx3-n:(+)caccgagaactcggatgattatga8(seqid17);(-)ttaacctgccggcagccagctcc(seqid18);ptx3-c:(+)cacctgtgaaacagctatttta(seqid19);(-)ttatgaaacatactgagctcc(seqid20).將這些cDNA克隆到pENTRT0P0載體中(pENTRDiectinonalT0P0CloningKit,Invitrogen)并測(cè)序。然后利用Gateway(g)^支術(shù)(Invitrogen),將源自pENTRT0P0栽體的Ntem-PTX3和Cterffl-PTX3的cDNA克隆到pDEST17載體中,使得6xHis標(biāo)^4iA^重纟且蛋白的C-末端上。然后用逸兩個(gè)重《rt粒轉(zhuǎn)化^桿菌BL21-AI細(xì)胞(Invitrogen),^ff吏:t^桿菌在37。C下,在含100iag/mL氨千青霉素的LB培養(yǎng)Ui生長(zhǎng)。在0.2%的L-阿拉伯糖存在的條件下,30。C培養(yǎng)過(guò)夜以誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)后,將細(xì)胞重懸于緩沖溶液中(20mM磷酸鈉,0.5MNaCl,10raM咪峻,pH7.4)并用超聲處理使細(xì)胞H^。澄清的懸浮,;M0.45lam的itj慮器i^慮并上才羊到3.OmlHiTrapImmobilizedMetalAffinityColumn(IMAC)(AmershamBiosciences)上用4^提純。用^"有100niM咪哇的結(jié)合緩液滌沖^^析柱,#^照廠商的說(shuō)明用300虛的咪哇'皿下結(jié)合的蛋白。通狄疫印^^v測(cè)出含有重組蛋白的流分,收集陽(yáng)性流分并在PBS中通過(guò)^Mit;慮層析法(SephadexG25columnPD10,Amersha邁)進(jìn)行脫鹽。通過(guò)SDS-PAGE隨后為的銀染的測(cè)定顯示重組蛋白的#高于90%(參見圖2A的插圖)。在4。C下用含有FGF2(270nM)100ial/孔100mMNaHC03,pH9.6CIA緩沖'測(cè)溫育的ELISA微平板16小時(shí)。然后,在室溫下用含5。/。fa旨奶粉的;t^緩沖液涂敷小孔2小時(shí)。接下來(lái),在37。C在涂有FGF2的小:JUi溫育100ja1等份試樣的含有全長(zhǎng)PTX3,重組N咖-PTX3或C,-PTX3(4^P是44nM)的PBS30^4中。然后,用MPTX3的多克隆M(1:2000稀釋)(在蛋白質(zhì)印#ELISA中,該抗體以相同的效率識(shí)別PTX3片段)在37。C繼續(xù)溫育小孔1小時(shí),用抗觸物素化的脅(1:2000),和100ja1的抗生蛋白鏈菌素,^itlU匕物酶(1:5000,Amersham)在室溫下溫育1小時(shí)。然后加入100m1/孔的色原體底物2,29-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基笨并二氫噢唑磺酸)(2,29-azinobis(3-ethylbenzthiazolinesulfonicacid))。在自動(dòng)ELISA讀取器中讀取405nm處的piUb值。在某些實(shí)驗(yàn)中,是^"或者沒有竟?fàn)幬锏牡腲Ht下在涂有FGF2的小孔上,于37'C溫育100ju1等^#的含有生物素#^的PTX3(bPTX3)(22nM)的PBS30分鐘。然后,沖洗小孔,射口文獻(xiàn)描述"測(cè)定結(jié)合bPTX3的量??蛇x擇地,#成的PTX3肽如上所述固定到ELISA的微平板孔上(200pg/孔)。然后,加入FGF2(80nM),射口上所艦itjf]兔抗FGF2的多克隆抗體(l:7000)在37'C溫育1小時(shí),艇為免^Jj^檢測(cè),對(duì)與固^i^合的FGF2進(jìn)^f^則。PTX3表位圖譜為了確定與抗PTX3單克隆M結(jié)合的表位的^J^序列,通迚泉合^^^"將128個(gè)肽排列在纖維素紅。肽^113個(gè)>^,且具有3個(gè)^JJ^的移碼。用在Tween-TBS(MBS)中的2%的牛奶在4。C封閉膜16小時(shí)。洗涂后,用單克隆脅mAbMNB4或mAb16B5(都是在MBS中1:1000稀釋)在37'C孵育薄膜90^t,然后再用兔的堿性^^酶綴合的抗大鼠IgG(1:30,000,Sigma)在MBS中于37。C孵育90分鐘。如文獻(xiàn)描述"發(fā)生顯色反應(yīng),利用光密^"析法對(duì)薄膜的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)#^則。BIAcore結(jié)^i^r輛BIAcoreX設(shè)備(BIAcoreInc,Piscataway,NJ)。利用表面等離子絲振iM^則由FGF2結(jié)合固定在BIAcore傳感器芯片上的PTX3的能力引起的折射率變化。為此,允許PTX3(2,2laM)與CM4傳感器芯片的流動(dòng)細(xì)^^,所述細(xì)_前用50ia1的0.2MN-乙基-N'-(3-二甲絲丙基)-碳二亞胺氫氯化物與0.05M的N-^^t珀itit胺的混^激活。這些實(shí)lNHt得以固定住5,000^#4^立(RUs),相當(dāng)于大約0.1pmol的PTX3。明膠固定^^得了類似的結(jié)果,其作為陰'f樹照,用于空白扣除。然后,林或者沒有合成PTX3肽的務(wù)ft下,用4分鐘將f^l增加的FGF2注射到覆蓋在PTX3表面的稀,沖液(PBS夕卜加O.005。/。表面活性劑P20,5.0juig/mL的CaCl2和MgCU中(使得其與固定的PTX3接觸),然后洗滌直^!£#到分離。雞胚胎絨樣鰊(CAM)微如文獻(xiàn)描述24制備包含介質(zhì)或16pmol的FGF2,并舍有或者不含合成的PTX3肽的藻g珠子(5Ml)并在溫育的第11天將其置于受精的白色來(lái)亨雞卵的CAM的頂端(每實(shí)驗(yàn)組10個(gè)雞卵)。72小時(shí)后,在立體顯微鏡(STEMI-SR,x2/0.12;Zeiss)下兩個(gè)觀測(cè)者以雙盲的方式統(tǒng)計(jì)朝著^^v物方向匯合的血絲PTX3N-末端區(qū)域結(jié)合脂PTX3蛋白的特點(diǎn)在于與經(jīng)典的^liLi聚蛋白CRP和SAP同源的C末端203tt酸區(qū)域(C咖-PTX3),以M示出與i^f可雞已知的蛋白沒有^^T明顯的同源性N-末端178-^擴(kuò)展區(qū)(N咖-ptx3)8。在鑒定PTX3的^管生成的FGF2結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嘗試中,^f古了C咖或Nterm-PTX3部分與FGF2相互作用的能力。上述的觀測(cè)顯示由于#^文的PTX3結(jié)合到外源生長(zhǎng)因子上和其的l^卜環(huán)嫂聚J^出上,用含有人^PTX3,PTX3N-絲擴(kuò)展區(qū)N咖-PTX3,或與PTX3前導(dǎo)序列融合用于分泌的PTX3C-末端(sCtera-PTX3)的逆轉(zhuǎn)錄病#染鼠科主動(dòng)脈內(nèi)皮(MAE)細(xì)胞。對(duì)照細(xì)胞用含EGFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。受感染的細(xì)胞it4達(dá)^i文出相似數(shù)量的相應(yīng)蛋白(圖1A),而JL^示出在^i-^^Ht下相似的生^iiJL然而,樹外源FGF2響應(yīng)時(shí),與妙PTX3錄達(dá)類似,N咖-PTX3的it^達(dá)導(dǎo)致受感染細(xì)胞增殖能力的明顯下降(圖1B)。當(dāng)與受EGFP感染的對(duì)照細(xì)l^目比時(shí),sCtera-PTX3的it^Ji^而沒有產(chǎn)生抑制。為了進(jìn)一步確定N咖-PTX3作為FGF2拮抗劑的能力,用被感染的MAE細(xì)1C)。如同預(yù)期的,在N咖-PTX3感染或PTX3感染的MAE細(xì)胞的M培養(yǎng)基存在的條件下,用FGF2溫育GM7373細(xì)胞導(dǎo)fW生長(zhǎng)因子的M絲分裂活性的明顯抑制,而sCtera-PTX3感染的和EGFP感染的MAE細(xì)胞的糸件培養(yǎng)基卻沒有絲(圖1C)。所有糾培養(yǎng)絲不導(dǎo)致由10%FCS引起的GM7373細(xì)J^曾殖的明顯抑制,因此證實(shí)了作用的特異性。為了證實(shí)N,-PTX3的FGF2拮抗活性是由于其與生長(zhǎng)因子直接相互作用的能力,由轉(zhuǎn)化的;U^桿菌表錄純化重組的帶6xHis-標(biāo)蒼的蛋白Nterm-PTX3;純化的重組的帶6xHis-標(biāo)各的C咖-PTX3用作對(duì)照(圖2A,插圖)。當(dāng)"^f古FGF2的相互作用時(shí),MPTX3和重組的UTX3片段顯示出與固定在非組織培養(yǎng)的塑辨'J品上的FGF2結(jié)合的能力。相^J殳有^L^到與重組CM-PTX3間的相互作用(圖2A)。因此,過(guò)量10倍摩爾量的重組N咖-PTX3或4^lPTX3,而不是C,-PTX3,F(xiàn)iUi了生物素化的PTX3(bPTX3)與固定的FGF2的結(jié)合(圖2B)。綜上所述,這些結(jié)果暗示了PTX3N-末端區(qū)域與FGF2的相互作用??筃咖-PTX3的單克隆^MtFGF2/PTX3相互作用的抑制針對(duì):RAJ^艮PTX3的一組大鼠單克隆g的篩選鑒定出MmAb~MNB42°(MNB4目錄號(hào)ALX-804-464,AlexisBiochemicals)和mAb-16B51。(MNB1目錄號(hào)ALX-804-463,AlexisBiochemicals),二者在蛋白質(zhì)印跡中分別選棒l"生地結(jié)合重組N咖一PTX3和C』一PTX3(圖3A)。為了標(biāo)出被兩種M識(shí)別的PTX3表位,作者利用了點(diǎn)合^^支術(shù)23,通itil種才支^纖維素MJL朝^'J了橫J^4^人PTX3序列的128個(gè)重疊的13肽。當(dāng)用二個(gè)單克隆^^t該膜進(jìn)4刊果測(cè)時(shí),免疫復(fù)楊檢測(cè)顯示mAb-MNB4識(shí)別存在于PTX3N-末端擴(kuò)展區(qū)的表位PTX3(87-99),而mAb-16B5識(shí)別位于PTX3C-末端區(qū)域的表位PTX3(306-312)(圖3B)。當(dāng)針對(duì)影響FGF2/PTX3相互作用的能力進(jìn)行測(cè)試時(shí),mAb-MNB4,而不是mAb-16B5,Pibh了bPTX3與固定的FGF2的結(jié)合,類似于過(guò)量摩爾量的游離的無(wú)才朽己的PTX3(圖4A)。因此,mAb-MNB4消除了4^:PTX3在內(nèi)皮GM7373細(xì)胞中抑制由FGF2產(chǎn)生的促有絲分裂活性的能力,而mAb-16B5則沒有作用(圖4B)。因此,mAb-鵬4對(duì)N-末端PTX3(87-99)表位的識(shí)別中和了FGF2/PTX3的相互作用。FGF2拮抗劑的合成的N!era-PTX3相關(guān)肽為了進(jìn)一步確定在PTX3N-末端擴(kuò)展區(qū)域中的FGF2結(jié)合區(qū),發(fā)明AJft合成肽PTX3(82-110)以及部^t跨N咖-PTX3^J^序列的三個(gè)不同的合成肽PTX3(31-60),PTX3(57-85),和PTX3(107-132)的FGF2拮抗活性進(jìn)行了評(píng)估,所述合成肽PTX3(82-110)包舍陂中和性mAb-MNB4識(shí)別的PTX3(87-99)表位(參iLL面)(圖5A)。在第一組實(shí)驗(yàn)中,在固相結(jié)^^瞼中,"^了四個(gè)合成的PTX3片段與FGF2相互作用的能力。如圖5B所示,游離的FGF2與固定在非組織培養(yǎng)的塑料制品上的PTX3(82-110)結(jié)合,而不是與固定的PTX3(31-60)或PTX3(57-85)結(jié)合,與固定的PTX3(107—132)條示出有限的相互作用。接下來(lái),利用表面等離子共振(surfaceplasmonresonance)來(lái)譯階四種肽影響FGF2/PTX3相互作用的能力。結(jié)果顯示,F(xiàn)GF2(0.8jaM)具有;f艮強(qiáng)的與固定在BIAcore傳感器芯片上的PTX3結(jié)合的能力(在注射階^a^期結(jié)合了350-400RU)(圖5C,上圖)。與涂有明膠的傳感器芯片沒有結(jié)合證明了相互作用的特異性。還將^1增加的FGF2(從0.1到1.1jiM,圖5C,下圖)注射在PTX3表面上,以測(cè)定FGF2/PTX3相互作用的動(dòng)力學(xué)^IL結(jié)^t拾逸明^jt的相互作用的動(dòng)力學(xué)解離常數(shù)(k。ff)是6xl(T5s—?jiǎng)恿W(xué)締合常數(shù)(KJ是0.2x103s1M"1,因此產(chǎn)生的L值等于0.3x10"6NT1。^jtt^P出上,在流動(dòng)相中評(píng)估了四種合成的PTX3肽務(wù)^FGF2的能力,由此P且止了FGF2與PTX3傳感器芯片相互作用。如圖5D所示,PTX3(82-110)以劑量依賴方式抑制了FGF2與PTX3表面的結(jié)合,其效力比游離的4^:PTX3所顯示出的效力低30倍(而對(duì)于游離的PTX3和PTX3(82-110)肽瓜。分別等于1.OpM和30"M)。在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下,使用PTX3(31-60),PTX3(57-85),和PTX3(107-132)躍而沒有抑制錄(圖5D及^tUi集的數(shù)據(jù))。還有,^J^I賦相當(dāng)于PTX3(82—110)的混雜的^^U^(scrambledsyntheticp印tide)[sPTX3(82-110),表l]顯示出有限的抑制絲(ID5。>3000|iM)(圖5D),由此表明PTX3(82-110)中的一^tJ^序列對(duì)FGF2相互作用是很重要的。PTX3(82-IIO)肽與FGF2的結(jié)合能力促使了發(fā)明AJt其做為FGF2拮抗劑的能力進(jìn)^ffWK當(dāng)對(duì)內(nèi)皮GM7373細(xì)^i^f^時(shí),^:PTX3和PTX3(82-IIO)都f^卬制由外源FGF2產(chǎn)生的M絲分裂活性,而混雜的PTX3(82-110),PTX3(31-60),PTX3(57—85),和PTX3(107-132)肽則沒有作用(圖5E)。劑量響應(yīng)曲線證實(shí)PTX3(82-110)的FGF2拮抗活性;UH量依賴型的(對(duì)于PTX3(82-110)和PTX3,m。分別等于30iaM和30nM)。PTX3的N-末端擴(kuò)展區(qū)域中最小的線性FGF2結(jié)合序列的識(shí)別綜上所述,上述數(shù)據(jù)表明在PTX3N-末端擴(kuò)展區(qū)域中的線'^tJ^列82-110在FGF2相互作用中^重要的作用。在試圖鑒定最小的線性FGF2結(jié)合序列時(shí),在固相結(jié)^iH3,橫跨整個(gè)PTX3(82-IIO)序列的三個(gè)重疊的合成肽PTX3(82-96),PTX3(82-101),和PTX3(97-110)(圖6A和表1)^UU來(lái)評(píng)估其與FGF2相互作用的能力。在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下,游離的FGF2與固定的PTX3(97-110)結(jié)合,與親本PTX3(82-110)和4^:PTX3—樣,而與PTX3(82-96)或PTX3(82-101)沒有相互作用(圖6B)。因此,在流動(dòng)相中,PTX3(97-110)結(jié)合FGF2,由此阻止了FGF2與固定在BIAcore傳感器芯片上的PTX3相互作用(圖6C)。PTX3(97-110)的抑制活性與親本肽PTX3(82-110)類似,而PTX3(82—96)和PTX3(82—101)則沒有作用(圖60。與這些觀測(cè)相一致的是,在內(nèi)皮GM7373細(xì)胞中PTX3(97-110),而不是PTX3(82-96)或PTX3(82-101)抑制了由FGF2產(chǎn)生的促有絲分裂活性(圖6D)。為了進(jìn)一步研究橫跨肽PTX3(97-110)的最小的線性FGF2結(jié)合序列,發(fā)明Aii過(guò)測(cè)定FGF2與固定在BIAcore傳感器芯片上的PTX3相互作用分析了下列短肽與FGF2的結(jié)合:PTX3(97—107),PTX3(97—104),PTX3(100-104)和PTX3(100-110),(圖6E)。肽PTX3(97-107)和PTX3(100-104)顯示出明顯的與FGF2的結(jié)合。相反,肽PTX3(97-104)和PTX3(100-110)則沒有阻止游離的FGF2與固定在BIAcore傳感器芯片上的PTX3結(jié)合(圖6E)。因此,PTX3(100-104)似乎^^了在PTX3N-末端擴(kuò)展區(qū)域中最小的線性FGF2結(jié)合^J^f列。因此,PTX3(100-104)抑制FGF2i秀導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)g殖。合成的N咖-PTX3相關(guān)肽抑制FGF2的血管生成活性為了評(píng)估N咖-PTX3-相關(guān)肽影響體內(nèi)FGF2誘導(dǎo)的新血管形成的能力,將僅吸附FGF2或添加有PTX3肽的海綿膠植入11天的雞胚CAMs的頂端。如圖7所示,與吸附介質(zhì)的藻皿珠子相比,吸附FGF2(16pmol/胚胎)的珠子產(chǎn)生有效的血管生^X^(肉眼可JU月著^v物的血管錄,對(duì)于二個(gè)實(shí)I^BL分別為44士7和11士5條血管/胚胎)。與體外觀測(cè)一致的是,通錄FGF2;^t^物中加入3.0nmol的PTX3(82-110)肽,體內(nèi)FGF2絲的血管生^A^明顯減少(28±5條血管/胚胎,方差分析p<0.05)(圖7)。因此,80nmol的PTX3(97-110)導(dǎo)致由FGF2引起的血管生^JS50M皮抑制;PTX3(82-96)反而無(wú)效。#論發(fā)明人指出FGF2的相互作用是由PTX3的N-末端擴(kuò)展區(qū)域介導(dǎo)的。絲,用中和性單克隆抗體和合成的PTX3相關(guān)lidi行的實(shí)驗(yàn)指出M酸線性序列PTX3(97-110)是itA該相互作用的原因。這些結(jié)論是以下列實(shí)聰^E^為基礎(chǔ)的i)短jti聚蛋白CRP和SAP是^^L率的FGF2結(jié)合劑17,盡管它們的序列與PTX3的C-末端同源7;ii)PTX3的N-末端片段(1-178)(N咖-PTX3),而不是sCte-PTX3的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)在內(nèi)皮細(xì)胞中抑制了由外源的FGF2產(chǎn)生的賄絲分裂活性;iii)重組Nterm-PTX3,而不是Cterm-PTX3,與固定的FGF2結(jié)合并抑制PTXVFGF2的相互作用;iv)針對(duì)線性表位PTX3(87-99)的單克隆抗體raAb-MNB4阻止了FGF2/PTX3的相互作用并在內(nèi)皮細(xì)胞中消除了PTX3的FGF2拮抗活性;v)基于PTX3的N-末端不同區(qū)域的合成的肽PTX3(82-110)和較短的肽PTX3(97-110),PTX3(97—107)和PTX3(100-104),而不另_務(wù)池的肽,通it^合FGF2阻止了FGF2/PTX3的相互作用,由jtb^制了體夕卜FGF2^的內(nèi)皮細(xì)自歹1^體內(nèi)的血管生成。PTX3由巨噬細(xì)胞27,成纖維細(xì)胞9,^細(xì)胞28,小M細(xì)胞29,和內(nèi)皮細(xì)胞8產(chǎn)生,表明它對(duì)內(nèi)皮能夠產(chǎn)生旁分泌(paracrine)和自分泌(autocrine)的功能。類A她,^4t刺激,包括jil^介質(zhì)IL-1和一氧化氮3°'"^it受刺激的自分泌環(huán)的內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)FGF2的M。因此,PTX3和FGF2^以由內(nèi)皮細(xì)月^^其它類型的細(xì)g達(dá)。因此,由炎癥細(xì)M內(nèi)皮細(xì)胞自身產(chǎn)生的PTX3可以在體外和體內(nèi)影響由內(nèi)^Ji的FGF2產(chǎn)生的自分泌咖旁分泌活性。這些將允i^iiitik管生成抑制劑和刺激劑的產(chǎn)生,密調(diào)節(jié)新血管形成。FGF2是多效性的生長(zhǎng)因子,其刺激樹內(nèi)胚層和中胚缺源的細(xì)胞類型32。因此,在各種病理生理?xiàng)l件下由FGF2產(chǎn)生的作用不P艮于其血管生成活性。例如,F(xiàn)GF2刺激傷口愈合期間的成纖維細(xì)胞以及動(dòng)脈粥樣硬化33'34和再狹窄35期間的平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖。同時(shí),它可以在受損的中;^申經(jīng)系統(tǒng)中倡進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的存活和神皿質(zhì)細(xì)胞的增殖36。在所有的這些情況中,PTX3的伴隨產(chǎn)生37'38調(diào)節(jié)由這些細(xì)胞且的FGF2產(chǎn)生的活性。事實(shí)上PTX3體外抑制FGF2的平滑肌細(xì)胞活化,體內(nèi)抑制在動(dòng)脈受損后的內(nèi)勵(lì)口厚18。總之,發(fā)明人首次證明了PTX3的N-末端涉及FGF2的相互作用。PTX3在先a疫,炎癥,M^^、,和雌性生育力之間的交JU、是個(gè)多功能的可溶解的模式識(shí)別受體。它通過(guò)與許多具有不同襯'&貢的酉e^目互作用發(fā)揮其多功能的活'性。參考文獻(xiàn)1.GariandaC,BottazziB,BastoneA,MantovaniA.Pentrax'msatthecrossroadsbetweeninnateimmunity,inflammation,matrixdeposition,andfemalefertility.AnnuRevImmunol.2005;23:337-3662.SteelDM,WhiteheadAS.Themajoracutephasereactants:C-reactiveprotein,serumamyloidPcomponentandserumamyloidAprotein.ImmunolToday,1994;15:81-883.PepysMB,BateMLAcutephaseproteinswithspecialreferencetoC-reactiveproteinandrelatedproteins(pentaxins)andserumamyloidAprotein.AdvImmunol.1983;34:141-2124.DuClosTW.TheinteractionofC-reactiveproteinandserumamyloidPcomponentwithnuclearantigens.MolBiolRep.1996;23:253-2605.GewurzH,ZhangXH,LintTF.Structureandfunctionofthepentraxins,CurrOpinImmunol.1995;7:54-646.NautaAJ,DahaMR,vanKootenC,RoosA.Recognitionandclearanceofapoptoticcells:aroleforcomplementandpentraxins.TrendsImmunol.2003;24:148-1547.GoodmanAR,CardozoT,AbagyanR,AltmeyerA,WisniewskiHG,Vilcek丄Longpentraxins:anemerginggroupofproteinswithdiversefunctions.CytokineGrowthFactorRev,1996:7:191-2028.BreviarioF,d'AnielloEM,Go,ayJ,PeriG,BottazziB,BairochA,SacconeS,MarzellaR,PredazziV,RocchiM,etal*lnterleukin-1-induciblegenesinendothelialcells.CloningofanewgenerelatedtoC-reactiveproteinandserumamyloidPcomponent.JBiolChem.1992;267:22190-221979.LeeGW,LeeTH,Vilcek丄TSG-14,atumornecrosisfactor-andIL-1-inducibleprotein,isanovelmemberofthepentaxinfamilyofacutephaseproteins.JImmunol.1993;150:1804-181210.BottazziB,Vouret-CraviariV,BastoneA,DeGio舊L,MatteucciC,PeriG,SpreaficoF,PausaM,D'EttorreC,GianazzaE,TagliabueA,SalmonsM,TedescoF,lntronaM,MantovaniA.MultimerformationandligandrecognitionbythelongpentraxinPTX3.SimilaritiesanddifferenceswiththeshortpentraxinsC-reactiveproteinandserumamyloidPcomponent.JBiolChem.1997:272:32817-3282311,BasileA,SicaA,d'AntelloBreviarioF,GanldoG,CastellanoM,MantovaniA,lntronaM.CharacterizationofthepromoterforthehumanlongpentraxinPTX3,RoleofNF-kappaBintumornecrosisfactor-alphaandinterleukin-1betaregulation.JBiolChem.1997;272:8172-817812.SalustriA,GariandaC,HirschE,DeAcetisM,MaccagnoA,BottazziB,DoniA,BastoneA,MantovaniG,BeckPeccozP,SalvatoriG,MahoneyDJ,DayAJ,SiracusaG,RomaniL,MantovaniA.PTX3playsakeyrateintheorganizationofthecumulusoophorusextracellularmatrixandininvivofertilization.Development.2004;131:1577-158613.GarlandaC,HirschE,BozzaS,SalustriA,DeAcetisM,NotaR,MaccagnoA,RivaF,BottazziB,PeriG,DoniA,VagoL,BottoM,DeSantisR,CarminatiP,SiracusaG,AltrudaF,VecchiA,RomaniL,MantovaniA.Non-redundantraleofthelongpentraxinPTX3inanti-fungalinnateimmuneresponse.Nature.2002;420:182-18614.MantovaniA,GarlandaC,BottazziB.Pentraxin3,anon-redundantsolublepatternrecognitionreceptorinvolvedininnateimmunity.Vaccine.2003;21Suppl2:S43"4715.GerwinsP,SkoldenbergE,Claesson-WelshL.Functionoffibroblastgrowthfactorsandvascularendothelialgrowthfactorsandtheirreceptorsinangiogenesis.CritRev.Oncol.Hematol.2000:34:185>19416.PrestaM,De"'EraP,MitolaS,MoroniE,RoncaR,RusnatiM.Fibroblastgrowthfactor/fibroblastgrowthfactorreceptorsysteminangiogenesis.CytokineGrowthFactorRev.2005;16:159-17817.RusnatiM,CamozziM,MoroniE,BottazziB,PeriG,IndraccoloS,AmadoriA,MantovaniA,PrestaM.Selectiverecognitionoffibroblastgrowthfactor-2bythelongpentraxinPTX3inhibitsangiogenesis.Blood.2004;104:92-9918.CamozziM,ZacchignaS,RusnatiM,ColtriniD,Ramirez-CorreaG,BottazziB,MantovaniA,GiaccaM,PrestaM.Pentraxin3inhibitsfibroblastgrowthfactor2-dependentactivationofsmoothmusclecellsinvitroandneointimaformationinvivo.ArteriosclerThrambVaseBiol.2005;25:1837-184219.IsacchiA,StatutoM,ChiesaR,BergonzoniL,RusnatiM,SarmientosP,RagnottiG,PrestaM.Asix-aminoaciddeletioninbasicfibroblastgrowthfactordissociatesitsmitogenicactivityfromitsplasminogenactivator-inducingcapacity.ProcNatlAcadSciUSA.1991:88:2628-263220.PeriG,IntronaM,CorradiD,lacuittiG,SignoriniS,AvanziniF,PizzettiF,MaggioniAP,MoccettiT,MetraM,CasLD,GhezziP,SipeJD,ReG,OlivettiG,MantovaniA,LatiniR.PTX3,Aprototypicallongpentraxin,isanearlyindicatorofacutemyocardialinfarctioninhumans.Circulation.2000;102:636-64121.GrinspanJB,MuellerSN,LevineEM.Bovineendothelialcellstransformedinvitrobybenzo(a)pyrene.JCellPhysiol.1983;114:328-33822.PrestaM,MaierJA,RusnatiM,RagnottiG.Basicfibroblastgrowthfactor:production,mitogenicresponse,andpost-receptorsignaltransductioninculturednormalandtransformedfetalbovineaorticendothelialcells.JCellPhysiol.1989;141:517-52623.FrankR,OverwinH.SPOTsynthesis.Epitopeanalysiswitharraysofsyntheticpeptidespreparedoncellulosemembranes.MethodsMolBiol.1996;66:149-16924.KnollA,SchmidtS,ChapmanM,WileyD,BulgrinJ,Blank丄KirchnerLAcomparisonoftwocontroHed.releasedeliverysystemsforthedeliveryofamiloridetocontrolangiogenesis.MicrovascRes.1999;58:1-925.EmsleyJ,WhiteHE,O'HaraBP,OlivaG,SrinivasanN,TickleIJ,BlundellTL,PepysMB,WoodSP,StructureofpentamerichumanserumamyloidPcomponent.Nat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