專利名稱：：具有α-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的半乳糖苷酶的制作方法具有a-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性的半乳糖苷酶產(chǎn)品及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有半乳糖基轉(zhuǎn)移活性的P-半乳糖苷酶，其能將乳糖轉(zhuǎn)化為p-連接的寡糖的混合物，且意外地產(chǎn)生oc-連接的二糖-a1-6半乳二糖。本發(fā)明特別涉及分離自最近發(fā)現(xiàn)的一林雙歧雙歧桿菌(5277c^6a"er/咖6/尸2V咖)菌林的P-半乳糖苷酶。本發(fā)明具體涉及編碼所述分離的P-半乳糖苷酶的DNA序列；由這才羊的DNA序列編碼的酶；及包含所述DNA序列或摻入所述DNA序列的重組載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及所述DNA序列編碼的酶或所述含有DNA序列或重組載體的宿主細(xì)胞用于生產(chǎn)寡糖的應(yīng)用。雙歧桿菌天然定殖于腸道下段，該環(huán)境中缺少單糖和二糖，因?yàn)檫@類糖優(yōu)先被宿主及存在于腸道上段的微生物消耗。為了在腸道下段生存，雙歧桿菌產(chǎn)生多種表面結(jié)合和/或胞外形式的外切及內(nèi)切糖苷酶，通過這些酶其可利用多樣的碳水化合物。雙歧桿菌的一些酶除水解酶活性之外還顯示轉(zhuǎn)移酶活性。糖苷酶的這一糖基轉(zhuǎn)移活性被廣泛用于多種寡糖的酶促合成，已證明所述寡糖充當(dāng)雙歧桿菌生長(zhǎng)促進(jìn)因子。已知雙歧桿菌的成員產(chǎn)生|3-半乳糖苷酶，其涉及乳糖的細(xì)菌代i射。M0llerP.L.等人在Appl&Environ.Microbial.，2000，且(5):2276-2283中描述了從一林雙歧雙歧桿菌中分離并表征三種P-半乳糖苷酶基因。他們發(fā)現(xiàn)，所有三種P-半乳糖苷酶都能通過半乳糖基轉(zhuǎn)移作用催化形成P-連接的半乳寡聚糖。D畫rtier等人在CarbohydrateResearch,201,(1990),115-123中描述了用雙歧雙歧桿菌DSM20456進(jìn)行乳糖水解過程中通過半乳糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)形成P-連接的寡糖。他們對(duì)所產(chǎn)生的寡糖混合物結(jié)構(gòu)的分析顯示，連接是p-(1—3)、P-(1—6)及P-(1—4)-D-半乳糖基連接，Dumortier提出雙歧雙歧桿菌產(chǎn)生的化合物涉及大腸內(nèi)細(xì)菌的黏附。已發(fā)現(xiàn)一林雙歧雙歧桿菌能產(chǎn)生將乳糖轉(zhuǎn)化為新的半乳寡聚糖混合物的半乳糖苷酶活性，所述半乳寡聚糖混合物意外含有多至35%的二糖包括半乳二糖(Gal(ccl-6)-Gal)。這種二糖是已知的(參見Paton，JC和Paton，AW(1998)，Clin.Microbiol.Revs.，U，450-479;Carlsson，KA(1989),Ann.ReviewsBiochem.，^，309-350)，是能防止毒素(如志賀菌毒素)和病原體(如大腸桿菌)勦附到腸壁的抗黏附劑。這林雙歧雙歧桿菌已于2003年3月31日保藏在位于英國(guó)阿伯丁的國(guó)立工業(yè)與海洋微生物保藏所，保藏號(hào)為NCIMB41171。此菌林還在英國(guó)專利No2412380中描述?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)這林雙歧雙歧桿菌產(chǎn)生幾種半乳糖苷酶，其中一種意外顯示出cc-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性。此酶產(chǎn)生多種不同的P-連接的寡糖，但也產(chǎn)生a-連接的二糖-半乳二糖。根據(jù)本發(fā)明，提供了DNA序列，其編碼具有如SEQ.IDNO:2所給出的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或在嚴(yán)格條件下與編碼此蛋白的DNA序列雜交。所述DNA序列在SEQ.IDNO:l中給出，或可包含其片段或簡(jiǎn)并體。用詞"簡(jiǎn)并體"應(yīng)理解為是指與SEQ.IDN0:1至少50%同源，優(yōu)選50-98%同源，最優(yōu)選75-95%同源的DNA序列。這樣的DNA序列可包含核苷酸置換、添加或缺失，其導(dǎo)致SEQ.IDNO:2所示氨基酸序列中少于60%、優(yōu)選少于45%、更優(yōu)選少于25%的改變。核苷酸置換可導(dǎo)致保守氨基酸置換。根據(jù)本發(fā)明第二方面，提供了由如上定義的DNA序列編碼的酶。這樣的酶可包含SEQ.IDNO:2所給出的氨基酸序列或其片段。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了重組載體，優(yōu)選表達(dá)載體，其包含如上定義的DM序列。這樣的載體可被引入宿主細(xì)胞如細(xì)菌、酵母或真菌細(xì)胞中?；蛘撸訢NA序列可被引入這樣的宿主細(xì)胞中。合適的宿主細(xì)胞可選自雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobaci1lus)、芽孢桿菌屬(Baci1lus)例如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilus)或環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、埃希氏菌屬(Escherichia)及曲霉屬(Aspergi1lus)如黑曲霉(Aspergillusniger)。使用乳糖作為底物，如上定義的DNA序列編碼的酶產(chǎn)生二糖混合物，包含Gal(pi-3)Glc、Gal(p1-3)Gal、Gal(P1-6)Gal及Gal(oc1-6)Gal。所述寡糖混合物中還存在三糖Gal((31-6)Gal(P1-4)Glc、Gal(pi-3)Gal(pi-4)Glc，四糖Gal(pi-6)Gal(pi-6)Gal(pl-4)Glc及五糖Gal(pi-6)Gal(pi-6)Gal(pi-6)GaUpl-4)Glc。如上所述的酶或宿主細(xì)胞可用于生產(chǎn)二糖的混合物，包括Gal(ocl-6)-Gal(半乳二糖)，其可組成用于改善腸健康的產(chǎn)品的一部分。這樣的產(chǎn)品可選自乳制品(例如液體奶；干奶粉如全脂奶粉、脫脂奶粉、換脂奶粉、乳清粉；嬰兒奶、嬰兒配方奶、冰洪淋、酸奶、奶酪、經(jīng)發(fā)酵乳制品)，飲料如果汁，嬰兒食品，谷物類食品，面包，餅干，糖果，蛋糕，食品增補(bǔ)劑，膳食補(bǔ)充劑，益生菌可食用產(chǎn)品，益生元可食用產(chǎn)品，動(dòng)物飼料，家禽飼料或?qū)嶋H上任何其它食品或飲料。此外，這樣生產(chǎn)的寡糖可用于制備防止病原體或由病原體產(chǎn)生的毒素黏附到腸壁上的藥物(例如以片劑或膠嚢形式)。所述藥物可在例如抗生素治療療程(其常改變甚至破壞正常的健康腸菌群)后施用于患者。根據(jù)本發(fā)明再一方面，提供了生產(chǎn)如上定義的酶的方法，其包括在合適的培養(yǎng)基中于允許所述酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)如上定義的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收所產(chǎn)生的酶。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)寡糖(包括Gal(ocl-6)-Gal(半乳二糖))混合物的方法，其包括在導(dǎo)致形成所述寡糖混合物的條件下，使如上定義的酶或如上定義的宿主細(xì)胞與含乳糖物質(zhì)接觸。合適的含乳糖物質(zhì)可選自商品化的乳糖、全脂奶、半脫脂奶、脫脂奶、乳清及換脂奶、乳清滲透物。這樣的奶制品可獲自奶牛、水牛、綿羊或山羊。換脂奶定義為經(jīng)脫脂除去乳脂后代之以添加植物脂肪或油的全脂奶。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示本發(fā)明的雙歧雙歧桿菌P-半乳糖苷酶的核苷酸序列(SEQ.IDNO:1)。圖2顯示對(duì)應(yīng)于圖1的核苷酸序列的氨基酸序列(SEQ.IDN0:2)。圖3為顯示用p-半乳糖苷酶和40%(w/w)乳糖于O.IM磷酸鹽緩沖液(pH6.0)中作為底物進(jìn)行半乳寡聚糖合成期間的時(shí)程反應(yīng)的圖。圖4顯示用40%(w/w)乳糖于0.1M磷酸鹽緩沖液(pH6.0)中作為底物由來自雙歧雙歧桿菌NCIMB41171的P-半乳糖苷酶合成的半乳寡聚糖混合物的高效陰離子交換色語圖。(Glc-葡萄糖，Gal-半乳糖，Lac-乳糖，oc(l-6)半乳二糖，DP-聚合度)。使用Lawson等人(1989)FemsMicrobiolLetters,仏(1-2)，41-45的方法從雙歧雙歧桿菌菌林(NCIMB41171)分離基因組DM。用限制性內(nèi)切酶消化所述DNA,將最大大小為15kbp的片段與經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶消化的pSP72載體連接。用含有由經(jīng)PstI、EcoRI、BamHI、Kpnl、Smal或HindIII消化的雙歧雙歧桿菌染色體DNA組成的插入物的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞。在含有對(duì)硝基苯，X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-P-D-半乳糖苷)及異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LuriaBertani瓊脂平板上選擇具有P-半乳糖普酶活性的克隆。具有BamHI染色體DNA的連接混合物產(chǎn)生7個(gè)P-半乳糖苷酶陽性克隆，其中之一被鑒定為pBl。<吏用Sanger的雙脫氧鏈終止法(RusselP.，2002iGenetics，PearsonEducation,Inc.,SanFrancisco,187-189),用BigDyeTerminator(3.0版)循環(huán)測(cè)序試齊'j盒(AppliedBiosystems，USA)，對(duì)插入的DNA片段Bl進(jìn)行DNA測(cè)序。Bl的DNA序列顯示于圖1中(SEQ.IDNO:1)。通過使用NCBI(國(guó)立生物技術(shù)信息中心)的0RFfinder,定位可讀框(ORF)。以所有6種可能的閱讀框翻譯圖1的核苷酸序列，鑒定了編碼推定的p-半乳糖苷酶的一個(gè)1052個(gè)氨基酸的可讀框。翻譯顯示于圖2中(SEQ.IDNO:2)。將參考下列實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例1材料與方法該研究全程中使用的所有化學(xué)試劑和培養(yǎng)基制劑均得自Sigma(Dorset,英國(guó))、Invitrogen(Paisley,英國(guó))、Oxoid(Basingstoke,英國(guó))、Qiagen(WestSussex,英國(guó))和Promega(Southampton,英國(guó))。細(xì)菌菌抹雙歧雙歧桿菌菌林(NCIMB41171)保存在-70。CMicrobank管中的低溫珠上。菌林在WilkinsonChalgren(WC)瓊脂(Oxoid，英國(guó))和TPY培養(yǎng)基(胰胨植胨酵母提取物培養(yǎng)基)上復(fù)蘇，并于37'C厭氧培養(yǎng)(C02和NJ且成分別是80%和20%)48小時(shí)，以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過革蘭氏染色檢測(cè)菌落形態(tài)及有無污染。大腸桿菌菌株本研究所用大腸桿菌菌林DH5a通常于37。C有氧條件下在LuriaBertani(LB)瓊月旨或培養(yǎng)液(SambrookJ.和Russel1W.D.(2001).MolecularCloning:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)中培養(yǎng)，需要時(shí)添力口抗生素(100jlig/ml氨芐青霉素和/或15|ag/ml氯霉素)，并將40jil2%X-P-Gal，7pi20%(異丙基-p-D-硫代半乳糖苷)IPTG涂到預(yù)制的90mm瓊脂平板表面上。大腸桿菌DH5oc菌抹(Invitrogen，Paisley,英國(guó))(基因型Fcj)80/acZAMA(/acZYAargF)U169recAlendAlhsdR17(rk—，mk_)p力oA^;E44M/-lg/rA96re/Al入—)是ct-半乳糖苷酶陽性菌林，其用于表達(dá)實(shí)驗(yàn)及其它遺傳操作。從雙歧雙歧桿菌提取基因組DNA使用以下方法從雙歧雙歧桿菌菌株(NCIMB41171)分離基因組DNA,其中由從100mlWC厭氧菌肉湯中收獲的細(xì)胞沉淀制備染色體DNA。將細(xì)胞重懸于10mlTES緩沖液(lOmMTris-HCl、10mMEDTA、10mMNaCl，pH8),并于37。C用200m1的溶菌酶/變?nèi)芫鼗旌衔?4:1，10rag/ml溶菌酶，lmg/ml變?nèi)芫?處理30分鐘。然后將細(xì)胞用200ia1蛋白酶K(20mg/ml)和200ju1RNA酶(均10mg/ml)處理，混合并于65。C溫育1小時(shí)。最后用2ml10%SDS處理細(xì)胞并于65。C溫育15分鐘。加入12ml苯酚/氯仿，并重復(fù)抽提至水相可容易地從界面分離。用異丙醇沉淀基因組DM，并重懸于lOmMTris-HCl-lmMEDTA(pH8)。之后用限制性內(nèi)切酶消化基因組DM，并將其連接到經(jīng)相同酶消化并用堿性磷酸酶處理的pSP72中。用Acoy/、戶W/、Aa/z^/、S/na/及進(jìn)行雙歧雙歧桿菌基因組DNA消化。用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5oc，并將p-半乳糖苷酶陽性克隆鑒定為含有X-Gal的平板上的藍(lán)色菌落。載體DM制備在本研究中全程用于克隆和表達(dá)的載體是PSP72(Promega，英國(guó))(Krieg,P.A.和Melton，D.A.(1987).InvitroRNAsynthesiswithSP6RNApolymerase,^ef力oc/si!nz，o/o^y.155:397-415)。選此載體是因?yàn)槠淙狈-半乳糖苷酶的ct-片段(其不在pSP72中編碼)的互補(bǔ)活性。此載體不攜帶含有調(diào)節(jié)序列和P-半乳糖苷酶前146個(gè)氨基酸編碼信息的大腸桿菌DNA短片段，所述p-半乳糖苷酶前146個(gè)氨基酸編碼信息與表達(dá)此p-半乳糖苷酶羧基末端部分的大腸桿菌菌抹(即DH5ot)組合可產(chǎn)生有活性的p-半乳糖苷酶(ot-互補(bǔ))。按照生產(chǎn)商的說明書，使用相對(duì)于DNA十倍過量的酶(酶單位pgrDNA=10個(gè)單位的酶/1jjgr質(zhì)粒DNA，或10個(gè)酶單位/O.5pmo1質(zhì)粒DNA)，用以下限制性內(nèi)切酶消化所述載體戶W/、&邁#/、&'/^///、5toa/、J;/7/及fc0y/。熱滅活酶(65'C,20分鐘)后通過水平凝膠電泳分析限制圖譜。凝膠上只存在一個(gè)片段表明載體消化完全，且為單一限制酶切消化。還通過將未連接的分子轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5ot細(xì)胞中來檢測(cè)載體是否充分消化。在添加氨芐青霉素(100Ugr/ml)的LB瓊脂平板上形成的菌落數(shù)指示未消化分子和在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中預(yù)期的背景。按照生產(chǎn)商的說明書用牛腸堿性磷酸酶CIAP(Promega，Southampton,英國(guó))進(jìn)一步去磷酸化所述載體。在轉(zhuǎn)化到DH5oc細(xì)胞中后，通過自身連接(用噬菌體T4DNA連接酶，依產(chǎn)品說明書)檢測(cè)處理效率。所形成的菌落數(shù)表示重新環(huán)化的分子(非克隆載體)數(shù)，將上述數(shù)值減去無CIAP載體處理而形成的菌落數(shù)顯示非去磷酸化的載體數(shù)。構(gòu)建基因組DNA文庫用識(shí)別原核生物DNA中常見的六核苷酸序列的6種限制性內(nèi)切酶部分消化基因組DNA。fcoW/、&邁#/、戶W/、5"則/及"'/^/i7是II型限制性內(nèi)切酶，分別特異性識(shí)別序列5，G/AATTC，3、5，G/GATCC，3、5，CTGCA/G，3、5，GGTAC/C3，、5，CCC/GGG3，及5，A/AGCTT3，，在這些序列內(nèi)產(chǎn)生雙鏈斷裂，對(duì)于fcoA/、"a/z^/及#//^////分別產(chǎn)生4個(gè)核苷酸的5，突出端AATT、GATC、AGCT，對(duì)于戶W/和^w/分別產(chǎn)生3，突出端ACGT、GTAC，以及對(duì)于S邁a/產(chǎn)生平末端。所有這些酶只有在2價(jià)鎂離子存在下有活性且能夠切割DNA。這些離子是唯一需要的輔因子。DNA的限制酶切消化對(duì)基因組DNA樣品的所有限制酶切消化均于37。C溫育2小時(shí)，并最后在65。C熱滅活20分鐘。之后反應(yīng)冷卻至室溫，加入適量上樣緩沖液后用密封的玻璃毛細(xì)管輕輕混勻。之后將所述溶液上樣到0.8%瓊脂糖凝膠的孔中(電源4-5V/cm，14-16小時(shí))，用lkbp的DNA標(biāo)準(zhǔn)品(Promega，英國(guó))估計(jì)消化的DNA的大小(SambrookJ.MolecularCloning:ALaboratoryManual(2002))。限制酶切消化后產(chǎn)生的片段的純化用來自Qiagen的QIAEX凝膠提取試劑盒(WestSussex,英國(guó))進(jìn)行從反應(yīng)混合物和瓊脂糖凝膠的片段純化。方案的詳細(xì)描述見生產(chǎn)商的操作手冊(cè)。DNA連接和轉(zhuǎn)化DM片段經(jīng)Qiaex凝膠提取試劑盒純化后與經(jīng)CIAP處理的pSP72載體連接。如表l所示將適量DNA移入無菌的0.5ml微型離心管中以進(jìn)行連接反應(yīng)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>連接反應(yīng)中質(zhì)粒DNA載體與DNA插入片段的摩爾比應(yīng)為約1:1。DNA的終濃度應(yīng)為約long/jlii。爾:"Cfefe表l:連接反應(yīng)混合物。管A顯示自身連接的栽體DNA數(shù)，其必須從轉(zhuǎn)化后的轉(zhuǎn)化體總數(shù)中扣除。管B顯示載體與DNA片段的連接，管C顯示對(duì)照組，藉此計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。每次連接反應(yīng)前，將DNA片段于45。C溫?zé)?分鐘以解鏈任何在片段制備過程中重新退火的粘性末端。對(duì)于所有連接反應(yīng)選用載體與插入DNAl:l的摩爾比，并依Promega公司的說明書進(jìn)行反應(yīng)裝配。向管A和管B中加入1.0u110x連接緩沖液和0.5Weiss單位的T4DNA連接酶(Promega，英國(guó))，用分子生物學(xué)級(jí)水調(diào)節(jié)連接反應(yīng)體積至10ial。向管c加入1.0m110x連接緩沖液，并用分子生物學(xué)級(jí)水調(diào)節(jié)連接反應(yīng)體積至10ja1。向所述管中加入DNA片段連同水后溫?zé)嶂?5。C持續(xù)5分鐘以解鏈任何在制備過程中重新退火的粘性末端。將DNA冷卻至0'C后加入剩余的連接試劑，并將反應(yīng)混合物于16。C過夜溫育(Sambrook和Russell2001)。乙醇沉淀及純化連接片段(以除去連接反應(yīng)混合物，其可降低轉(zhuǎn)化效率)后，依Hanahan流程指南進(jìn)行轉(zhuǎn)化。向100u1感受態(tài)大腸桿菌DH5oc細(xì)胞中加入含50ng連接DNA的5]u1溶液。熱處理并表達(dá)氨節(jié)青霉素抗性基因后，將細(xì)胞鋪展于含有氨千青霉素(100ingr/ml)、X-p-Gal(40|a12%X-p-Gal)和IPTG(7|i120%IPTG)的LB平板表面。測(cè)量每個(gè)連接反應(yīng)的轉(zhuǎn)化體數(shù)。從管C通常得到的轉(zhuǎn)化體數(shù)是2xlO5-lxl06cfu/Mg，而從管A則是500-600cfu/g。管A中的轉(zhuǎn)化體數(shù)指示對(duì)栽體DM的有效處理。管B中的轉(zhuǎn)化體數(shù)在2-4x104cfu/yg的范圍內(nèi)。轉(zhuǎn)化體數(shù)含尸W/染色體DNA的連接反應(yīng)混合物從約2500個(gè)所篩選轉(zhuǎn)化體中產(chǎn)生13個(gè)P-半乳糖苷酶陽性克隆，而以^邁A7產(chǎn)生7個(gè)陽性克隆(所篩選轉(zhuǎn)化體約1500個(gè))，^c^/產(chǎn)生3個(gè)陽性克隆(所篩選轉(zhuǎn)化體約1300個(gè))，///7/產(chǎn)生7個(gè)陽性克隆(所篩選轉(zhuǎn)化體約2000個(gè))，S鵬/產(chǎn)生3個(gè)陽性克隆(所篩選轉(zhuǎn)化體約1600個(gè))，&'/^////產(chǎn)生2個(gè)陽性克隆(所篩選轉(zhuǎn)化體約1200個(gè))。陽性克隆消化根據(jù)下表消化從陽性克隆分離的質(zhì)粒，以鑒定不同的P-半乳糖苷酶基因。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>第一個(gè)字母(p)表示質(zhì)粒和插入基因，而第二個(gè)字母(P、B、E、S、K)表示用于從基因組分離相應(yīng)克隆的限制性內(nèi)切酶對(duì)消化后所產(chǎn)生片段的凝膠電泳分析顯示質(zhì)粒pBl、pPl、pP2和pPll各有一個(gè)編碼不同P-半乳糖苷酶的插入片斷。含有pBl的克隆用于進(jìn)一步分析。DNA測(cè)序用BigDyeTerminator(3.0版)循環(huán)觀'j序試齊寸盒(AppliedBiosystems，美國(guó))，依Sanger的雙脫氧鏈終止法進(jìn)行DNA測(cè)序，并用ABIPrism3100(兼并毛細(xì)管電泳的基于熒光的DNA分析系統(tǒng))分析。用載體特異性引物對(duì)插入DM片段的5，和3，端進(jìn)行測(cè)序。用GenomePrimingSystem(GPS-1)(NewEnglandBiolabs，英國(guó))對(duì)插入片段進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)序。GPS-l是基于TN7轉(zhuǎn)座子的體外系統(tǒng)，其用TnsABC轉(zhuǎn)座酶將轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入目標(biāo)DNA中。依生產(chǎn)商說明書采用1:4的供體目標(biāo)DNA質(zhì)量比。向目標(biāo)質(zhì)粒插入Transprimer后用于測(cè)序分離的質(zhì)粒數(shù)是25。該數(shù)目是依生產(chǎn)商說明書計(jì)算的，其假定5倍的覆蓋深度。對(duì)于質(zhì)粒PB1，在所用載體的多克隆位點(diǎn)下游973bp位置處插入一個(gè)約1699bp的轉(zhuǎn)座子插入物完全消除了p-半乳糖苷酶活性，表明起始密碼子位于載體MCS(多克隆位點(diǎn))和轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)之間，而在MCS下游841bp位置處插入所述插入片段則導(dǎo)致形成有活性的p-半乳糖苷酶，表明起始密碼子存在于MCS下游841bp與973bp之間。在MCS下游3565bp位置處插入所述插入片段完全消除了所述酶活性，表明終止密碼子在該位置下游。而且，在1239bp、1549bp、1683bp、1832bp、2108bp、2189bp、2270bp、2340bp、2414bp、2574bp、2648bp、2734bp、2807bp和3410bp位置處插入也完全消除所述酶活性。測(cè)序反應(yīng)混合物含有約400-600ng質(zhì)粒DM，3.2pmo1引物溶液和4ju1BigDyeTerminator溶液?？勺x框確定用NCBI的ORFfinder定位B1的可讀框(ORF)。采用細(xì)菌的遺傳密碼，確定框長(zhǎng)度為100bp。以所有六種可能的框翻譯核苷酸序列，鑒定了一個(gè)編碼推定的P-半乳糖苷酶的1052個(gè)氨基酸的可讀框(所述翻譯顯示于圖2中)。實(shí)施例2在大腸桿菌宿主(DH5oc株)中用分離自雙歧雙歧桿菌NCIMB41171的克隆酶一P-半乳糖苷酶進(jìn)行合成除非另作說明，用濃度為2000ppm的甲苯處理大腸桿菌生物質(zhì)(通過10000g離心收集)以通過破壞其細(xì)胞質(zhì)膜增加細(xì)胞通透性并使細(xì)胞不能生活后，用全大腸桿菌DH5oc宿主細(xì)胞進(jìn)行下述合成。如實(shí)施例1中"大腸桿菌菌林"所述制備大腸桿菌生物質(zhì)。應(yīng)用克隆酶的合成以40%(w/w)初始乳糖濃度的底物濃度用p-半乳糖苷酶進(jìn)行合成。在pH6.8的0.1M磷酸鹽緩沖液(或pH6.2的檸檬酸鹽緩沖液或pH6.8的磷酸鉀緩沖液)中制備合成溶液。于40'C在150rpm的搖動(dòng)水浴中進(jìn)行合成?；谠谧兓膒H值下對(duì)特定酶制劑的活性測(cè)量(使用鄰硝基苯-P-D-半乳吡喃糖苷為底物)選擇對(duì)特定酶的最佳pH。為合成半乳寡聚糖，將5ml大腸桿菌DH5oc細(xì)胞懸液(活性為2.2U/ml)離心(10000g)以收集生物質(zhì)，并棄去上清液。用10g40%(w/w)的底物溶液重懸該生物質(zhì)以進(jìn)行合成。合成過程中混合物中存在的不同糖的濃度顯示于圖3。由克隆自雙歧雙歧桿菌NCIMB41171的P-半乳糖苷酶合成的半乳寡聚糖混合物的高效陰離子交換色諳法聯(lián)合脈沖電流檢測(cè)(HPAEC-PAD)的色謙圖顯示于圖4。在最佳合成時(shí)間點(diǎn)時(shí)半乳寡聚糖混合物中的糖濃度顯示于表1。表l.以40%(w/w)初乳糖濃度在觀察到最大寡糖濃度的時(shí)間點(diǎn)時(shí)半乳寡聚糖合成的碳水化合物組成。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>Lac:乳糖，Glc:葡萄糖，Gal:半乳糖，DP:聚合度權(quán)利要求1.DNA序列，所述DNA序列a)編碼具有SEQ.IDNO:2所給出氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或b)在嚴(yán)格的雜交條件下與a)中序列雜交，或c)是a)或b)中序列的簡(jiǎn)并體。2.權(quán)利要求1的DNA序列，其中所述序列如SEQ.IDNO:1給出或是其片段。3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的DM序列，其中所述序列包括核苷酸置換、添加或缺失，其導(dǎo)致SEQ.IDNO:2所示氨基酸序列或其片段中少于60%、優(yōu)選少于45%、更優(yōu)選少于25%的改變。4.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的DNA序列，其中所述序列包括導(dǎo)致保守氨基酸置換的核苷酸置換。5.由^l利要求1至4中任一項(xiàng)的DNA序列編碼的酶。6.酶，其包含SEQ.IDNO:2所示氨基酸序列或其片段。7.具有如SEQ.IDNO:2所示序列的|3-半乳糖苷酶。8.重組載體，其包含權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的DNA序列。9.權(quán)利要求8的載體，其中所述載體是表達(dá)載體。10.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的DNA序列。11.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的載體。12.權(quán)利要求IO或權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或真菌細(xì)胞。13.權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自雙歧桿菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬、埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬及曲霉屬。14.權(quán)利要求13的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自雙歧雙歧桿菌、枯草芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌及黑曲霉。15.權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)的酶或權(quán)利要求10至14中任一項(xiàng)的細(xì)胞用于生產(chǎn)寡糖混合物的應(yīng)用。16.權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中所述混合物包含二糖Gal(pi-3)Glc、Gal(pi-3)Gal、Gal(pi-6)Gal及Gal(oc1-6)Gal。17.權(quán)利要求15或權(quán)利要求16的應(yīng)用，其中所述混合物包含三糖Gal(卩l(xiāng)-6)Gal(pi-4)Glc、Gal(pi-3)Gal(pi-4)Glc,四糖Gal(pi-6)Gal(M-6)Gal(pi-4)Glc及五糖Gal(pi-6)Gal(pi-6)Gal(P1-6)Gal(卩H)Glc。18.權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)的酶或權(quán)利要求10至14中任一項(xiàng)的細(xì)胞用于生產(chǎn)寡糖混合物的應(yīng)用，所述寡糖混合物是選自以下的產(chǎn)品的一部分乳制品例如液體奶、干奶粉、嬰兒奶、嬰兒配方奶、冰淇淋、酸奶、奶酪、經(jīng)發(fā)酵乳制品，飲料如果汁，嬰兒食品，谷物類食品，面包，餅干，糖果，蛋糕，食品增補(bǔ)劑，膳食補(bǔ)充劑，益生菌可食用產(chǎn)品，益生元可食用產(chǎn)品，動(dòng)物飼料，家禽飼料及藥物。19.權(quán)利要求18的應(yīng)用，其中所述混合物包含二糖Gal(P1-3)Glc、Gal(P1-3)Gal、Gal(P1-6)Gal及Gal(ot1-6)Gal，三糖Gal(P1-6)Gal(P1-4)Glc、Gal(pi-3)Gal(pi-4)Glc，四糖Ga"pi-6)Gal(Pl-6)Gal(Pl-4)Glc及五糖Gal(Pl-6)Gal(Pl-6)Gal(Pl-6)Gal(Pl-4)Glc。20.權(quán)利要求10至14中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞在生產(chǎn)選自以下的產(chǎn)品中的應(yīng)用乳制品例如液體奶、干奶粉、嬰兒奶、嬰兒配方奶、水洪淋、酸奶、奶酪、經(jīng)發(fā)酵乳制品，飲料如果汁，嬰兒食品，谷物類食品，面包，餅干，糖果，蛋糕，食品增補(bǔ)劑，膳食補(bǔ)充劑，益生菌可食用產(chǎn)品，益生元可食用產(chǎn)品，動(dòng)物飼料，家禽飼料及藥物。21.權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)的酶的生產(chǎn)方法，其包括在合適的培養(yǎng)基中于允許所述酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求10至14中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，并從所述培養(yǎng)物中回收所產(chǎn)生的酶。22.寡糖混合物的生產(chǎn)方法，所述寡糖混合物包含二糖Gal(P1-3)Glc、Gal(P1-3)Gal、Gal(Pl-6)Gal及Gal(ctl-6)Gal，三糖Gal(pi-6)Gal(pl-4)Glc、Gal(pi-3)Gal(pl-4)Glc，四糖Gal(pl-6)Gal(P1-6)Gal(01-4)Glc及五糖Gal(P1-6)Gal(pi-6)Gal(P1-6)Gal(pl-4)Glc;所述生產(chǎn)方法包括使權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)的酶或權(quán)利要求10至14中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞與含乳糖物質(zhì)接觸o全文摘要本發(fā)明涉及具有半乳糖基轉(zhuǎn)移活性、分離自雙歧雙歧桿菌的β-半乳糖苷酶。所述β-半乳糖苷酶能將乳糖轉(zhuǎn)化為β-連接的寡糖的混合物，且意外地產(chǎn)生α-連接的二糖-半乳二糖。所述混合物可摻入許多食品或動(dòng)物飼料中，通過促進(jìn)腸內(nèi)雙歧桿菌生長(zhǎng)并抑制致病性微生物菌群生長(zhǎng)而改善腸健康。文檔編號(hào)C12N9/10GK101379186SQ200780004121公開日2009年3月4日申請(qǐng)日期2007年1月23日優(yōu)先權(quán)日2006年1月31日發(fā)明者A·K·高拉斯,G·楚特齊斯,T·高拉斯申請(qǐng)人:科拉薩多公司