專利名稱：：低分子量透明質(zhì)酸的產(chǎn)生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過控溫發(fā)酵(temperature-controlledfermentation)在革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中重組產(chǎn)生透明質(zhì)酸(HA或乙酰透明質(zhì)酸)的方法，所述透明質(zhì)酸具有低平均分子量(MW)。首先將產(chǎn)生HA的宿主細(xì)胞在有益于該細(xì)胞生長的溫度下發(fā)酵，繼而轉(zhuǎn)換至有利于產(chǎn)生期望的低分子量HA的較高溫度。在某些情況下，對于低分子量HA生產(chǎn)有利的溫度和pH甚至在通常認(rèn)為有利于發(fā)酵微生物生長的pH和溫度范圍之外。
背景技術(shù)：
：人體(body)最豐富的雜多糖是糖胺聚糖(glycosaminoglycan)。糖胺聚糖是無支鏈的糖聚合物，由重復(fù)的二糖單元組成(僅硫酸角質(zhì)素在糖的核心區(qū)是分支的)。所述二糖單元通常包含兩種修飾的糖(即N-乙?；肴樘前?GalNAc)或N-乙?；咸前?GlcNAc))之一，作為第一糖單元。另一單元通常是糖醛酸，例如葡糖醛酸(GlcUA)或艾杜糖醛酸(iduronate)。糖胺聚糖是負(fù)電分子，并且在溶液中(insolution)具有賦予高粘性的延伸構(gòu)象。糖胺聚糖主要位于細(xì)胞表面上或胞外基質(zhì)中。糖胺聚糖在溶液中還具有低壓縮性，并因此是理想的生理潤滑液體，例如關(guān)節(jié)(joint)。糖胺聚糖的剛性為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)的整體性并且提供細(xì)胞之間允許細(xì)胞遷移的通道。具有最高生理重要性的糖胺聚糖是乙酰透明質(zhì)酸(hyaluronan)、硫酸軟骨素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮膚素和硫酸角質(zhì)素。多數(shù)糖胺聚糖通過特異的寡糖結(jié)構(gòu)共價結(jié)合至蛋白聚糖核心蛋白。乙酰透明質(zhì)酸與某些蛋白聚糖形成大聚集體(largeaggregate),但例外是游離糖鏈與蛋白聚糖形成非共價復(fù)合體。本文中將透明質(zhì)酸定義為由N-乙?；咸前?GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)的重復(fù)二糖單元組成的未硫酸化糖胺聚糖，其通過交替的P-1,4和(3-l，3糖苷鍵連接到一起。透明質(zhì)酸也稱作乙酰透明質(zhì)酸(hyaluronan)、透明質(zhì)酸鹽(hyaluronate)或HA。術(shù)語乙酰透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸在本文可以互換使用。已鑒定了乙酰透明質(zhì)酸在人體中的許多作用(參見，LaurentT.C.andFraserJ.R.E.,1992,FASEBJ.6:2397-2404;andTooleB.R，1991,"Proteoglycansandhyaluronaninmorphogenesisanddifferentiation."In:CellBiologyoftheExtracellularMatrix,pp.305-341,HayE.D.，ed.,Plenum,NewYork)。乙酰透明質(zhì)酸存在于透明軟骨、滑膜關(guān)節(jié)液(synovialjointfluid)以及真皮和表皮皮膚組織中。還猜測乙酰透明質(zhì)酸在許多生理功能，例如粘附、發(fā)育、細(xì)胞運(yùn)動性、癌癥、血管發(fā)生和愈傷中具有作用。由于乙酰透明質(zhì)酸獨(dú)特的物理和生物特性，將其使用在眼和關(guān)節(jié)外科中，并且正在其它醫(yī)學(xué)方法中對其進(jìn)行評估。也已開發(fā)乙酰透明質(zhì)酸的產(chǎn)品用于整形外科學(xué)(orthopaedics)、風(fēng)濕病學(xué)(rheumatology)和皮月夫病學(xué)(dermatology)。雞冠是乙酰透明質(zhì)酸重要的商業(yè)來源。微生物是可選的來源。美國專利No.4,801,539公開了用于制備透明質(zhì)酸的發(fā)酵方法，其涉及獸瘟鏈球菌OS^eptococcuszooej9/fifew/ci^)的菌抹，報道的產(chǎn)率是約3.6g透明質(zhì)酸每升。歐洲專利No.EP0694616公開了使用改進(jìn)的獸瘟鏈球菌菌林的發(fā)酵方法，報道的產(chǎn)率是約3.5g透明質(zhì)酸每升。用來通過發(fā)酵產(chǎn)生透明質(zhì)酸的微生物是病原菌菌抹，它們之中最重要的是幾個《連球菌屬菌種(5^eptococcasspp.)。A組和C組鏈球菌使用由乙酰透明質(zhì)酸組成的非抗原性被嚢(capsule)將其自身包圍，其組成與結(jié)締組織和關(guān)節(jié)中存在的乙酰透明質(zhì)酸相同。另一種有被嚢的(encapsulating)病原菌多殺巴斯德氏菌(尸wteww〃a/^/to"Vfa)也用乙酰透明質(zhì)酸將其細(xì)胞包圍。已描述了來自脊推動物、細(xì)菌病原體和藻病毒的乙酰透明質(zhì)酸合酶(hyaluronansynthase)(DeAngelis,P.L.，1999，Cell.Mol.LifeSci.56:670-682)。WO99/23227公開了來自似馬鏈球菌(5^eptococcw^w/wVw7&)的I組透明質(zhì)酸鹽合酶(hyaluronatesynthase)。WO99/51265和WO00/27437描述了來自多殺巴斯德氏菌的II組透明質(zhì)酸鹽合酶。Ferretti等公開了釀膿鏈球菌(S^eptococcw/^ogew^)的乙酰透明質(zhì)酸合酶操縱子，其由三個基因hasA、hasB和hasC組成，分別編碼透明質(zhì)酸鹽合酶、UDP葡糖脫氬酶和UDP-葡糖焦磷酸化酶(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98,4658-4663，2001)。WO99/51265描述具有似馬鏈球菌乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼區(qū)的核酸片段。生產(chǎn)透明質(zhì)酸，特別是低平均分子量(如平均分子量為1MDa以下)的透明質(zhì)酸，最普遍的是通過最初從發(fā)酵液或從動物來源分離較高分子量的材料(〉1MDa)來實(shí)現(xiàn)。然后，通常以機(jī)械/物理方法，或者以化學(xué)方法，通過分級(fmctionation)來實(shí)現(xiàn)期望的分子量的降低。已將分級通過大小選擇膜進(jìn)行，所得級分具有范圍在30，000-730，000道爾頓的平均分子量，更大的分子則保留在膜上。溶劑沉淀法也沿用已久，較大的分子首先沉淀，但是這種方法缺乏膜分級的分辨率(resolution)。一般來i兌，分級方法趨向于對分離較大的分子有利，而不真正適合于產(chǎn)生小分子。使用機(jī)械方法，向分子施加足以引起斷裂的剪切應(yīng)力。例如，在高壓均質(zhì)器中，可將1,700,000Da的HA材料減小至500,000Da以下(W09104279-A)。該方法可通過例如Manton-Gaulin型機(jī)器來放大，這些機(jī)器有多種規(guī)?？捎?，并且能夠以10升/小時多至數(shù)立方米/小時的數(shù)量級的速率加工材料。也已報導(dǎo)了起作用的物理方法，例如曝露于超聲，但是難以在比實(shí)驗(yàn)室規(guī)沖莫大得多的任何情況下來實(shí)施這樣的方法(Orvisky"a/.1993.Sizeexclusionchromatographiccharacterizationofsodiumhyaluronatefractionspreparedbyhighenergeticsonication.CTzramatograp/z/avol.37(1-2):20-22)。也已描述了化學(xué)方法，例如在pH的極值或者在其它化學(xué)品的存在下進(jìn)行水解。如果終產(chǎn)物中必須不存在pH調(diào)制劑或化學(xué)品，或者如果起始和終止過程需要精確的控制，那么這些方法可能不合適；在大規(guī)模中混合速率可能是有限的。當(dāng)從動物來源分離HA時，對起始MW沒有控制，其幾乎總是在高數(shù)量級(〉5MDa)。從野生型微生物發(fā)酵的HA最通常具有低于動物來源HA的MW，但仍然高于lMda。經(jīng)常引述源自野生型鏈球菌屬發(fā)酵的HA具有1.5MDa至3.2MDa范圍的平均分子量。在使獸瘟鏈球菌在40°C具有最大比生長速率的裝置(setup)中培養(yǎng)該菌，據(jù)報道將發(fā)酵溫度從40。C降低至32。C時，該菌產(chǎn)生越來越高分子量的透明質(zhì)酸。將這認(rèn)為是比生長速率降低的結(jié)果(Armstrong&Johns.1997.々p/.五"WkM/cra^o/.vol.63:2759-2764)。其他作者確認(rèn)了獸瘋鏈球菌的比生長速率和它的HA生產(chǎn)力以及它產(chǎn)生的HA的分子量之間的關(guān)聯(lián)(ChongB.F.，da/.2005.Microbialhyaluronicacidproduction,j/p/.JVf/cro6z'o/.a"d所otec/z.vol.66(4):341-351)。然而，有關(guān)微生物HA產(chǎn)生這個主題的文獻(xiàn)全部致力于最大化HA的分子量，而非降低分子量。芽孢桿菌(bacilli)作為確定的宿主細(xì)胞系統(tǒng)用于產(chǎn)生天然蛋白和重組蛋白，包括重組表達(dá)外源乙酰透明質(zhì)酸合酶，該酶使得宿主細(xì)胞能夠產(chǎn)生透明質(zhì)酸(WO2003054163)。本發(fā)明的目的是提供在重組芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中產(chǎn)生透明質(zhì)酸的方法，所述透明質(zhì)酸具有范圍在20,000-800,000道爾頓的期望的低平均分子量。發(fā)明概述如上所述，具有低平均分子量(如800,000Da以下)的透明質(zhì)酸的生產(chǎn)最通常如下實(shí)現(xiàn)通過首先分離較高M(jìn)W的材料("MDa);其后通常以機(jī)械/物理方法，或者化學(xué)方法，通過分級將分子量降低。本發(fā)明提供使用重組宿主細(xì)胞的發(fā)酵方法，其直接產(chǎn)生具有期望的低平均MW的HA,所述平均分子量小于800,000Da，繼而提供許多下游加工益處。當(dāng)直接產(chǎn)生具有接近于期望的低MW的HA材料時，那么生產(chǎn)方法中的每個步驟，包括發(fā)酵和回收的單元操作，將受益于較低的粘度。此外，與較高M(jìn)W的分子相比，能夠在更高的總HA濃度下進(jìn)行操作。這使生產(chǎn)能力得到釋放，允許更快的通量(throughput),并且產(chǎn)生更容易控制的更有效的方法。在質(zhì)量控制方面同樣也是有益的。因此，在第一個方面本發(fā)明涉及產(chǎn)生透明質(zhì)酸的方法，所述透明質(zhì)酸具有范圍在20,000-800,000道爾頓的期望的平均分子量，該方法包括步驟(a)在有益于芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞生長的第一溫度培養(yǎng)該細(xì)胞，其中所述芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含與啟動子序列可操作地連接的乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼序列，所述啟動子序列對于所述乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼序列是外源的；(b)然后在適合于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的條件下，在高于步驟(a)中第一溫度的第二溫度，培養(yǎng)步驟(a)的重組芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，所述芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞由此產(chǎn)生具有范圍在20，000-800，000道爾頓的期望的平均分子量的透明質(zhì)酸；和(b)回收透明質(zhì)酸。附圖簡述圖1顯示如通過GPC-MALLS測定的，在發(fā)酵結(jié)束時平均分子量作為最終發(fā)酵溫度的函數(shù)的趨勢。該圖顯示可以通過操作發(fā)酵溫度來選擇期望的MW。在17。C的低最終溫度有最大值，而在52°C的高最終溫度有最小值。通過選擇分子量的非零起點(diǎn)來保護(hù)真實(shí)最大值的同一性(identity)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及產(chǎn)生透明質(zhì)酸的方法，所述透明質(zhì)酸具有范圍在20,000-800,000道爾頓的期望的平均分子量，該方法包括步驟(a)在有益于芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞生長的第一溫度培養(yǎng)該細(xì)胞，其中所述芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含與啟動子序列可操作地連接的乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼序列，所述啟動子序列對于所述乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼序列是外源的；(b)然后在適合于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的條件下，在高于步驟(a)中第一溫度的第二溫度，培養(yǎng)步驟(a)的重組芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，所述芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞由此產(chǎn)生具有范圍在20,000-800,000道爾頓的期望的平均分子量的透明質(zhì)酸；和(b)回收透明質(zhì)酸。本發(fā)明的方法描述了對于用后續(xù)方法步驟來降低分子量的從病原性有被嚢細(xì)菌中產(chǎn)生乙酰透明質(zhì)酸的方法的改進(jìn)。在有被嚢的細(xì)菌中，大量的乙酰透明質(zhì)酸在被嚢中產(chǎn)生。在從這樣的來源加工和純化乙酰透明質(zhì)酸的過程中，首先需要將乙酰透明質(zhì)酸從被嚢中移出，例如通過使用表面活性劑，或者洗滌劑，如SDS。這在乙酰透明質(zhì)酸的商業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生了復(fù)雜的步驟，因?yàn)楸匦杼砑颖砻婊钚詣﹣磲尫糯蟛糠值囊阴Ｍ该髻|(zhì)酸，而隨后在最終純化之前必須將表面活性劑去除。本發(fā)明允許大量的低-MW乙酰透明質(zhì)酸在安全的無被嚢宿主細(xì)胞中作為游離的乙酰透明質(zhì)酸產(chǎn)生。由于重組芽孢桿菌屬細(xì)胞的乙酰透明質(zhì)酸直接表達(dá)至培養(yǎng)基，所以可使用簡單的方法從培養(yǎng)基中分離乙酰透明質(zhì)酸。首先，將芽孢桿菌屬細(xì)胞和細(xì)胞碎片以物理方法從培養(yǎng)基中去除。如果需要的話，可以先將培養(yǎng)基稀釋，以降低培養(yǎng)基的粘度。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉許多用于從培養(yǎng)基中去除細(xì)胞的方法，例如離心或微濾。如果需要的話，然后可將剩余的上清過濾，例如通過超濾過濾，以濃縮并將小分子污染物從乙酰透明質(zhì)酸中去除。在去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片之后，通過已知機(jī)制來進(jìn)行從培養(yǎng)基中沉淀乙酰透明質(zhì)酸的簡單沉淀。鹽，醇，或者鹽和醇的組合可用于從濾出液沉淀乙酰透明質(zhì)酸。一旦轉(zhuǎn)化為(reduceto)沉淀物，通過物理方法能夠容易地將乙酰透明質(zhì)酸從溶液中分離?；蛘?，可以使用本領(lǐng)域已知的蒸發(fā)技術(shù)，例如噴霧干燥，從濾出物溶液中干燥或濃縮出乙酰透明質(zhì)酸。因此本法明的方法描述了對于通過發(fā)酵商業(yè)生產(chǎn)乙酰透明質(zhì)酸的現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)，所述改進(jìn)在于，在從培養(yǎng)物中的細(xì)胞純化乙酰透明質(zhì)酸的過程中，不需要使用表面活性劑。在本發(fā)明的方法中，將芽孢桿菌屬宿主在有益于它的生長的第一溫度培養(yǎng)，從而積累(buildup)大量的活性生物質(zhì)用于后續(xù)的HA合成。只要不存在其它限制因素，芽孢桿菌能夠在廣泛的溫度范圍中生長。例如，在豐富培養(yǎng)基中，必須保證在較高的溫度有充足的通氣以達(dá)到高比生長速率。因此，優(yōu)選的實(shí)施方式涉及第一方面的方法，其中第一溫度是10°C-60°C,優(yōu)選20°C-50°C,并且更優(yōu)選30°C-45°C，最優(yōu)選34°C-40°C。一旦建立了期望量的生物質(zhì)，則在第二溫度，并且在適合于透明質(zhì)酸產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)芽孢桿菌屬宿主，將所述第二溫度設(shè)置為高于生物質(zhì)積累期間的第一溫度。將第二溫度精確設(shè)定為高多少依賴于待產(chǎn)生的HA的期望MW。期望的MW越〗氐，必須將該溫度設(shè)定得越高。所以，優(yōu)選的實(shí)施方式涉及第一方面的方法，其中第二溫度是20°C-70°C，優(yōu)選30。C-60。C,并且更優(yōu)選40。C-55。C。當(dāng)然，應(yīng)將第一培養(yǎng)溫度的優(yōu)選范圍與本發(fā)明的方法中第二培養(yǎng)溫度的合適的優(yōu)選范圍進(jìn)行組合。在本發(fā)明的方法優(yōu)選的實(shí)施方式中，第二溫度比第一溫度高至少rc，優(yōu)選第二溫度比第一溫度高至少2°C,更優(yōu)選高至少3°C、4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、10°C、11°C、12°C、13°C、14°C、15°C、16°C、17°C、18°C、19°C、20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C、28。C、29°C，并且最優(yōu)選比第一溫度高至少30°C。在本發(fā)明的方法中，在第一溫度的培養(yǎng)步驟期間積累生物質(zhì)，該步驟的持續(xù)時間依賴于多種因素，包括培養(yǎng)條件、發(fā)酵體積、選擇的具體芽孢桿菌屬菌抹等，當(dāng)然還依賴于第一溫度。在第二溫度的培養(yǎng)步驟的持續(xù)時間是產(chǎn)生低MW的HA的時間，其也依賴于不同的因素。將總培養(yǎng)時間定義為兩個培養(yǎng)步驟的持續(xù)時間，因此確定總培養(yǎng)時間并不容易。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在第二溫度的培養(yǎng)步驟占到總培養(yǎng)時間的至少20%，優(yōu)選在第二溫度的培養(yǎng)步驟占到總培養(yǎng)時間的至少30%、40%、50%、60%、70%、80%，或最優(yōu)選總培養(yǎng)時間的至少90%。優(yōu)選的實(shí)施方式涉及第一方面的方法，其中第二溫度比第一溫度足夠高以允許芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞產(chǎn)生具有期望的平均分子量的透明質(zhì)酸，所述期望的平均分子量的范圍選自下組的分子量范圍20-50kDa、50-100kDa、100-150kDa、150-200kDa、200-250kDa、250-300kDa、300-350kDa、350-400kDa、400-450kDa、450-500kDa、500-550kDa、550-600kDa、600-650kDa、650-700kDa、700-750kDa和750-800kDa。另一個優(yōu)選的實(shí)施方式涉及第一方面的方法，其中第二溫度比第一溫度足夠高以允許芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞產(chǎn)生具有期望的平均分子量的透明質(zhì)酸，所述期望的平均分子量的范圍選自下組的分子量范圍20-100kDa、100-200kDa、200-300kDa、300-400kDa、400-500kDa、500-600kDa、600-700kDa、700-800kDa。由本發(fā)明的芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞產(chǎn)生的透明質(zhì)酸水平可以根據(jù)修飾的咔唑法測定(BitterandMuir，1962，AnalBiochem.4:330-334)。另外，透明質(zhì)酸的平均分子量可以4吏用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法測定，例如由Uenoetal.，1988,Chem.Pharm.Bull.36,4971-4975;Wyatt，1993,Anal.Chim.Acta272:l匿40;和WyattTechnologies,1999,"LightScatteringUniversityDAWNCourseManual"and"DAWNEOSManual"WyattTechnologyCorporation,SantaBarbara,California描述的那些?？梢詫νㄟ^本發(fā)明的方法獲得的透明質(zhì)酸施用多種已知的技術(shù)來修飾該透明質(zhì)酸，例如交fl關(guān)，如美國專利Nos.5,616,568、5，652，347和5,874,417中所述。另外，可以使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)改變透明質(zhì)酸的分子量。宿主細(xì)月包在本發(fā)明的方法中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞可以是適合于重組產(chǎn)生透明質(zhì)酸的任何芽孢桿菌屬細(xì)胞。芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞可以是野生型芽孢桿菌屬細(xì)胞或其突變體。在本發(fā)明的實(shí)踐中有用的芽孢桿菌屬細(xì)胞包括但不限于，5"c〃/wsagarad/zerera、嗜石咸芽孑包4干菌(5"c/〃wj1fl汰a/o//n7M力、解淀斗分芽孑包才干菌(5ac/〃us<am_y/o//《Mey^c/era)、短芽孑包桿菌(5ac/〃ws6;-ev/"、環(huán)狀芽孑包才干菌(5acz'〃us"Vcw/am1)、克勞氏芽孑包斗干菌(Bac/〃wsc/atm7)、凝結(jié)芽孑包詳干菌(5ac/〃twcoagw/a"s)、堅強(qiáng)芽孑包才干菌(5ac/〃ws/rmw力、火山爛芽孑包4干菌(5ac/〃ws/awfw力、遲緩芽孢桿菌C8ac/〃w/e"^s)、地衣芽孢桿菌(Bac/〃ws//c/zem/om2/力、巨大芽孑包才干菌(5"c/〃wsmega/en'ww)、4豆小芽孑包4干菌(5acz7/wpwrnz'/ws)、口耆熱月旨肪芽孑包軒菌(5flc/〃ws他flra^zermopM—、枯草芽孑包桿菌(_8a"7/iswto7")和蘇云金芽孢桿菌CSa"7/wAwn'wg/era/力細(xì)胞。特別適于重組表達(dá)的突變枯草芽孢桿菌細(xì)胞在WO98/22598有所描述。無被嚢的芽孢桿菌屬細(xì)胞在本發(fā)明中是特別有用的。在優(yōu)選實(shí)施方式中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，芽孢桿菌屬細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。在其它更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，芽孢桿菌屬細(xì)胞是克勞氏芽孢桿菌細(xì)胞。在其它更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，芽孢桿菌屬細(xì)胞是遲緩芽孢桿菌細(xì)胞。在其它更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，芽孢桿菌屬細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。在其它更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，芽孢桿菌屬細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌A164A5(參見，例如美國專利No.5，891，701)或枯草芽孢桿菌168A4。用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞可以，例如，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如ChangandCohen,1979,MolecularGeneralGenetics168:111-115)，通過使用感受態(tài)細(xì)胞(參見，例如YoungandSpizizen,1961，JournalofBacteriology81:823-829,或Dub腿andDavidoff-Abelson,1971，JournalofMolecularBiology56:209-221),通過電穿孑L(參見，例如ShigekawaandDower,1988，Biotechniques6:742-75l)或通過接合(參見，例如KoehlerandThome,1987,JournalofBacteriology169:5271-5278)來實(shí)現(xiàn)。核酸構(gòu)建體"核酸構(gòu)建體"在本文定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，其從天然存在的基因分離，或?qū)⑵湫揎椧院泻怂岬钠危撈我员静淮嬖谟谧匀唤绲姆绞浇M合和并置(juxtapose)。當(dāng)術(shù)語核酸構(gòu)建體含有表達(dá)編碼序列所需的所有調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體可與術(shù)語表達(dá)盒同義。術(shù)語"編碼序列"在本文中定義為，當(dāng)將其置于下面提到的調(diào)控序列的控制之下時，轉(zhuǎn)錄成mRNA并且翻譯成目標(biāo)酶(enzymeofinterest)的序列。編碼序列的邊界通常由核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子序列決定，所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)恰位于mRNA5，端開讀框的上游，而所述轉(zhuǎn)錄終止子序列恰位于mRNA3，端開讀^f醫(yī)的下游。編碼序列能夠包括，但不限于DNA、cDNA和重組核酸序列。用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的并且包括，例如從基因組DNA分離，從cDNA制備，或它們的組合。例如，能夠通過如下方法實(shí)現(xiàn)從這種基因組DNA克隆核酸序列使用表達(dá)文庫的抗體篩選以檢測具有共享結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段或公知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。參見，例濁口，Innisa/.，1990,PC7iVotoco/r爿GWcfeto7W^/zoA々p//ca^w，AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增方法例如連才妻酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、連接活化轉(zhuǎn)錄和基于核酸序列的擴(kuò)增?？寺》椒缮婕扒谐头蛛x所需的包含編碼多肽的核酸序列的核酸片段，將片段插入到載體分子中，和將該重組載體并入芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)胞中，其中所述核酸序列的克隆將被復(fù)制。所述核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任意組合。分離的編碼酶的核酸序列可以按多種方式操作以提供酶的表達(dá)。將核酸序列插入構(gòu)建體或載體之前對核酸序列進(jìn)行操作可能是理想的或必要的，這取決于表達(dá)載體或芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞。使用克隆方法修飾核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的。可以理解的是還可使用本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法在宿主細(xì)胞中體內(nèi)Ov/vo)操作該核酸序列。許多酶涉及透明質(zhì)酸的生物合成。這些酶包括乙酰透明質(zhì)酸合酶、UDP-葡糖-6-脫氬酶、UDP-葡糖焦磷酸化酶、UDP-N-乙酰基葡糖胺焦磷酸化酶、葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶、己糖激酶、葡糖磷酸變位酶、酰胺轉(zhuǎn)移酶、變位酶和乙酰轉(zhuǎn)移酶。乙酰透明質(zhì)酸合酶是透明質(zhì)酸生產(chǎn)中的關(guān)4建酶。"乙酰透明質(zhì)酸合酶，，在本文中定義為通過添加GlcUA和GlcNAc糖前體催化乙酰透明質(zhì)酸鏈的延伸的合酶。鏈球菌乙酰透明質(zhì)酸合酶、脊推動物乙酰透明質(zhì)酸合酶和病毒乙酰透明質(zhì)酸合酶的氨基酸序列與巴斯德氏菌屬(尸aWewe〃a)乙酰透明質(zhì)酸合酶截然不同，并且已提議將其分類為I組和II組乙酰透明質(zhì)酸合酶，I組乙酰透明質(zhì)酸合酶包括鏈^求菌乙酰透明質(zhì)酸合酶(DeAngelis,1999)。為了在芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中產(chǎn)生乙酰透明質(zhì)酸，真核來源的乙酰透明質(zhì)酸合酶，例如哺乳動物乙酰透明質(zhì)酸合酶是較不優(yōu)選的。乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼序列可以是任何能夠在芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中表達(dá)的核酸序列。所述核酸序列可以是任何來源的。優(yōu)選的乙酰透明質(zhì)酸合酶基因包括I組或II組中的任何基因，例如來自似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌(5^e/3tococcwsw6e"》和馬鏈球菌獸瘋亞種(5^ptococcwszooep^ew/cw力的I組乙酰透明質(zhì)酸合酶基因，或多殺巴斯德氏菌的II組乙酰透明質(zhì)酸合酶基因。本發(fā)明的方法還包括構(gòu)建體，憑借所述構(gòu)建體將乙酰透明質(zhì)酸的前體糖供應(yīng)至宿主細(xì)胞，或者供應(yīng)至培養(yǎng)基，或者通過在芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中由內(nèi)源基因、由非內(nèi)源基因或由內(nèi)源基因和非內(nèi)源基因的組合編碼。所述前體糖可以是D-葡糖醛酸或N-乙?；?葡糖胺。在本發(fā)明的方法中，核酸構(gòu)建體可以進(jìn)一步包含一個或多個編碼乙酰透明質(zhì)酸前體糖生物合成中的酶的基因。或者，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞可以進(jìn)一步包含一個或多個另外的核酸構(gòu)建體，其包含一個或多個編碼前體糖生物合成中的酶的基因。通過使用具有編碼一個或多個基因的一個或多個核酸序列來改進(jìn)乙酰透明質(zhì)酸生產(chǎn)，所述基因指導(dǎo)乙酰透明質(zhì)酸前體糖合成途徑中的步驟。"指導(dǎo)乙酰透明質(zhì)酸前體糖合成途徑中的步驟"的意思是該基因表達(dá)的蛋白在N-乙?；?葡糖胺或D-葡糖醛酸，或N-乙?；?葡糖胺和D-葡糖醛酸中任一個的前體糖的形成中有活性。在提供前體糖的優(yōu)選方法中，通過培養(yǎng)具有重組構(gòu)建體的宿主細(xì)胞來提供構(gòu)建體用于改進(jìn)具有乙酰透明質(zhì)酸合酶的宿主細(xì)胞中的乙酰透明質(zhì)酸生產(chǎn)，該重組構(gòu)建體具有異源啟動子區(qū)，其與編碼基因的核酸序列可操作連接，所述基因指導(dǎo)乙酰透明質(zhì)酸前體糖的合成途徑中的步驟。在優(yōu)選方法中，宿主細(xì)胞還包含重組構(gòu)建體，其具有與乙酰透明質(zhì)酸合酶可操作地連接的啟動子區(qū)，所述構(gòu)建體可使用與N-乙?；?葡糖胺生物合成中涉及的合酶的核酸序列相同或不同的啟動子區(qū)。在另一個優(yōu)選實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞可以具有帶有啟動子區(qū)的重組構(gòu)建體，所述啟動子區(qū)與編碼另一種基因的不同核酸序列可操作連接，所述另一個基因涉及乙酰透明質(zhì)酸前體糖的合成。因此，本發(fā)明還涉及構(gòu)建體，通過使用具有編碼基因的核酸序列的構(gòu)建體來改進(jìn)乙酰透明質(zhì)酸產(chǎn)生，所述基因指導(dǎo)乙酰透明質(zhì)酸前體糖的合成途徑中的步驟?？捎膳c編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸序列相同或不同的啟動子表達(dá)有關(guān)前體糖的核酸序列。用于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的前體糖的生物合成中涉及的基因包括UDP-葡糖6-脫氫酶基因、UDP-葡糖焦磷酸化酶基因、UDP-N-乙?；咸前方沽姿峄富?、葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因、己糖激酶基因、葡糖磷酸變位酶基因、酰胺轉(zhuǎn)移酶基因、變位酶基因和乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。在含有乙酰透明質(zhì)酸合酶的細(xì)胞中，可表達(dá)/za^、/zoyC和/70Z)中任何一個或者兩個或更多個的組合，或它們的同源物(homolog),分別如枯草芽孑包桿菌fwaZ)、gtoB和gcaD，以及/za^，以增加可用于乙酰透明質(zhì)酸合酶的前體糖的庫(pool)?？莶菅挎邨U菌基因組在Kunst，"iWm^e390,249-256,"ThecompletegenomesequenceoftheGram-positivebacterium6腦7/msw6"fe"(1997年11月20日)中描述。在一些情況下，如宿主細(xì)胞不具有天然的乙酰透明質(zhì)酸合酶活性時，構(gòu)建體可以包括基因。編碼生物合成酶的核酸序列對于宿主細(xì)胞可以是天然的，而在其它情況下，可以使用異源序列。如果表達(dá)兩個或更多個基因，它們可以是在天然操縱子中彼此相連的基因，例如似馬鏈球菌HAS操縱子的基因，其包含/zoy丄/zasA/zoyC和/zosZ)。在其它情況下，使用前體基因序列的一些組合可為理想的，而不包括操縱子的每個元件。使用天然存在于宿主細(xì)胞的一些基因和其它外源基因在其它情況下也可以是優(yōu)選的。該選擇將取決于所給出的宿主細(xì)胞中糖的可用庫，細(xì)胞適應(yīng)過量產(chǎn)生而不干擾宿主細(xì)胞其它功能的能力，和細(xì)胞對來自其天然基因的表達(dá)的調(diào)控是否不同于外源基因。舉例來說，取決于細(xì)胞的代謝需要和生長條件，以及可用的前體糖庫，理想的是通過如下方法增加N-乙酰基-葡糖胺的產(chǎn)生表達(dá)編碼UDP-N-乙?；咸前方沽姿峄傅暮薙l^列，例如/zosZ)基因、芽孢桿菌屬gcaD基因和它們的同源物?；蛘?，前體糖可以是D-葡糖醛酸。在一個這樣的實(shí)施方式中，核酸序列編碼UDP-葡糖-6-脫氫酶。這些核S交序列包括芽孢桿菌屬rt/"D基因、鏈球菌屬(5^eptococcw)的/zasB基因和它們的同源物。所述核酸序列還可以編碼UDP-葡糖焦磷酸化酶，例如在芽孢桿菌屬gtoB基因、鏈球菌屬的/z^C基因和它們的同源物。在本發(fā)明的方法中，UDP-葡糖6-脫氫酶基因可以是/zo^基因或^aZ)基因；或它們的同源物。在本發(fā)明的方法中，UDP-葡糖焦磷酸化酶基因可以是基因或gto^基因；或它們的同源物。在本發(fā)明的方法中，UDP-N-乙?；咸前方沽姿峄富蚩梢允?7wD或gca/)基因；或它們的同源物。在本發(fā)明的方法中，葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因可以是/2os￡或其同源物。在本發(fā)明的方法中，乙酰透明質(zhì)酸合酶基因和編碼前體糖的一個或多個基因在相同啟動子的控制下?；蛘撸幋a前體糖的一個或多個基因在相同啟動子的控制下，但不同的啟動子驅(qū)動乙酰透明質(zhì)酸合酶基因。其它替換方案是乙酰透明質(zhì)酸合酶基因和每個編碼前體糖的基因在不同啟動子的控制下。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，乙酰透明質(zhì)S臾合酶基因和編碼前體糖的一個或多個基因在相同啟動子的控制下。在某些情況下，宿主細(xì)胞將具有帶有異源啟動子區(qū)的重組構(gòu)建體，所述異源啟動子區(qū)可操作地連接于編碼基因的核酸序列，所述基因指導(dǎo)乙酰透明質(zhì)酸前體糖合成途徑中的步驟，其可與來自重組構(gòu)建體的乙酰透明質(zhì)酸合酶的表達(dá)相協(xié)調(diào)(inconcertwith)。乙酰透明質(zhì)酸合酶可由與編碼涉及前體生物合成的酶的核酸序列相同或不同的啟動子區(qū)表達(dá)。在另一個優(yōu)選實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞可具有帶有啟動子區(qū)的重組構(gòu)建體，該啟動子區(qū)可操作地連接于不同的核酸序列，所述核酸序列編碼涉及乙酰透明質(zhì)酸前體糖合成的另一基因。編碼涉及前體糖生物合成的酶的核酸序列可由與編碼乙酰透明質(zhì)酸合酶的核酸序列相同或不同的啟動子表達(dá)。在之前的含義中，構(gòu)建"人工操縱子"，其可才莫仿似馬鏈球菌操縱子而具有每個/zos丄/za^、/zosC和/20sD或其同源物，或者，可以使用少于似馬鏈球菌操縱子中存在的全補(bǔ)體(fullcomplement)。人工操縱子還可以包含葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因(/zo^)以及一個或多個選自下組的基因己糖激酶基因、葡糖磷酸變位酶基因、酰胺轉(zhuǎn)移酶基因、變位酶基因和乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。在人工操縱子中，元件中的至少一個與元件中的另一個是異源的，如啟動子區(qū)與編碼序列是異源的。在優(yōu)選實(shí)施方式中，核酸構(gòu)建體包含/za^、fMflZ)和gtoB。在另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，核酸構(gòu)建體包含/7as丄化gD、gtoB和gcaD。在另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，核酸構(gòu)建體包含/zaW和fwaZ)。在另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，核酸構(gòu)建體包含/zasA在另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，核酸構(gòu)建體包含/zoyA/w"D、gto5、gcoD和/za^。在另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，核酸構(gòu)建體包含/7flW、/za^、/70C和/zoyD。在另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，核酸構(gòu)建體包含/7oy丄/7aW、/2^C、/osD和/7a^?；谝陨蟽?yōu)選實(shí)施方式，所提到的基因能夠用其同源物取代。在本發(fā)明所述方法中，核酸構(gòu)建體包含與啟動子序列可操作連接的乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼序列，該啟動子序列對于乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼序列是外源的。所述啟動子序列可以是，例如，單一啟動子或串聯(lián)(tandem)啟動子。"啟動子，，在本文定義為參與結(jié)合RNA聚合酶以起動基因轉(zhuǎn)錄的核酸序列。"串聯(lián)啟動子"在本文定義為兩個或更多個啟動子序列，其中每個均與編碼序列可操作連接并且介導(dǎo)將編碼序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。"可操作連接"在本文定義為這樣的結(jié)構(gòu)，其中將調(diào)控序列，例如啟動子序列適當(dāng)?shù)刂糜谂c編碼序列相關(guān)的位置，以使該調(diào)控序列指導(dǎo)由編碼序列編碼的多肽的產(chǎn)生。如較早所提到的，"編碼序列"在本文定義為這樣的核酸序列，將其置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列控制下時其轉(zhuǎn)錄為mRNA并且翻譯成多肽。編碼序列的邊界通常由核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子序列決定，所述核糖體結(jié)合位點(diǎn)恰位于該mRNA5，端開讀框的上游，而所述轉(zhuǎn)錄終止子序列恰位于該mRNA3，端開讀框的下游。編碼序列能夠包括，但不限于，基因組DNA、cDNA、半合成的、合成的和重組的核酸序列。在優(yōu)選實(shí)施方式中，啟動子序列可以從細(xì)菌來源獲得。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，啟動子序列可以從革蘭氏陽性細(xì)菌獲得，例如芽孢桿菌屬菌抹，例如，5ac/〃wagarad/zewra、嗜石咸芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孑包桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強(qiáng)芽孢桿菌、杣爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬(5^wtom3;ces)菌才朱，例如，淺青紫4連霉菌(5^e;tomyc&s//Wt/ara)或灰鼠鏈霉菌(5^e/to/7^cesmwn'm^);或從革蘭氏陰性菌獲得，例如，大腸桿菌(Eco/Z)或假單胞菌屬菌獲得的啟動子大腸桿菌/ac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌(5^epto^yc^coe//co/o。瓊脂糖酶基因(&gj)、遲緩芽孢桿菌或克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(a;r//)、地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(枯草蛋白酶Carlsberg基因)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sflcB)、枯草芽孢桿菌a-淀粉酶基因(twy^)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(awyZ)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因("wyM)、解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyg)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因0^w尸)、枯草芽孢桿菌和x少/B基因、蘇云金芽孢桿菌擬步行曱亞種(Sac/〃wf/7wn."g/e"s^subsp./e"eZ)"'om》CryIIIA基因(C77/7L4)或其部分，原核(3-內(nèi)酰胺酶基因(Villa隱Kamaroffefa/"1978,尸raceWwg^AeAto/o""/Jc"6fe，5WewcML/iSJ75:3727-3731)。其它實(shí)例是jpo7噬菌體啟動子的啟動子和tac啟動子(DeBoer"/,，1983，/VoceW"gsAejV"http://o"a/爿caefe柳yo/5We"ces80:21-25)。另夕卜的啟動子在"Useflilproteinsfromrecombinantbacteria"in5Wew/訴cj膨n'固，1980，242:74-94;和Sambrook,Fritsch,andManiatus,1989,Mo/ecw/arC7om'"g,爿丄a6orato^yMawwa/,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork中描述。啟動子還可以是"共有"啟動子，其具有"-35"區(qū)的序列TTGACA和"-10"區(qū)的TATAAT。共有啟動子可以從能夠在芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的任何啟動子獲得?？梢酝ㄟ^定位誘變完成"共有"啟動子的構(gòu)建以創(chuàng)造啟動子，該啟動子更加完美地符合枯草芽孢桿菌營養(yǎng)型(vegetative)"(iA型"啟動子"-10"和"-35"區(qū)的已確定的共有序列(Voskuil&"/.,1995,Mo/ecw/"rM/craWo/ogv17:271-279)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，"共有"啟動子從得自以下的啟動子獲得大腸桿菌/ac操縱子、天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(A^4)、克勞氏芽孢桿菌或遲緩芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(a;^T)、地衣芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(枯草蛋白酶Carlsberg基因)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(racS)、枯草芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyE)、地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amj;丄)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌(x-淀粉酶基因(m^0、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(pe"尸)、枯草芽孢桿菌砂M和xy/S基因、蘇云金芽孢桿菌擬步行曱亞種CryIIIA基因(co/7/")或其部分，或原核P-內(nèi)酰胺酶基因j/o7細(xì)菌的噬菌體啟動子。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，"共有"啟動子從解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因Omy0獲得。Widner等在美國專利No.6,255,076和5，955，310中描述用于在芽孢桿菌屬細(xì)胞中表達(dá)的串聯(lián)啟動子和構(gòu)建體以及方法，包括短的共有amj2啟動子(也稱作scBAN)。其中還描述了07//"穩(wěn)定子(stabilizer)序列的用途，以及使用該序列的構(gòu)建體，其用于改進(jìn)芽孢桿菌屬中的生產(chǎn)。串聯(lián)啟動子的每個啟動子序列可以是在所選芽孢桿菌屬細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截斷的和雜合的啟動子，并且可由編碼與該芽孢桿菌屬細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。每個啟動子序列對于編碼多肽的核酸序列可以是天然的或外源的，并且對于芽孢桿菌屬細(xì)胞可以是天然的或外源的。所述啟動子序列可以是相同的啟動子序列或不同的啟動子序列?；蛘?，串聯(lián)啟動子的啟動子序列中的一個或多個可以在芽孢桿菌屬細(xì)胞生長的不同階段啟動核酸序列的轉(zhuǎn)錄。在優(yōu)選實(shí)施方式中，串聯(lián)啟動子含有至少解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因的amy^啟動子。在另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，串聯(lián)啟動子含有至少"共有"啟動子，其具有"-35"區(qū)的序列TTGACA和"-10"區(qū)的序列TATAAT。在另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，串聯(lián)啟動子含有至少地衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因的a^y丄啟動子。在另外的優(yōu)選實(shí)施方式中，串聯(lián)啟動子含有至少c^y//"啟動子或其部分(AgaisseandLereclus，1994，Mo/ecw/orMfcraWo/ogy13:97-107)。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，串聯(lián)啟動子含有至少啟動子和啟動子。在另外的更加優(yōu)選實(shí)施方式中，串if關(guān)啟動子含有至少"wyG啟動子和co^/"啟動子。在另外的更加優(yōu)選實(shí)施方式中，串聯(lián)啟動子至少含有具有"-35"區(qū)的序列TTGACA和"-10"區(qū)的序列TATAAT的"共有"啟動子以及co^X4啟動子。在另外的更加優(yōu)選實(shí)施方式中，串聯(lián)啟動子含有至少兩個拷貝的flmy丄啟動子。在另外的更加優(yōu)選實(shí)施方式中，串聯(lián)啟動子含有至少兩個拷貝的"wy2啟動子。在另外的更加優(yōu)選實(shí)施方式中，串聯(lián)啟動子含有至少兩個拷貝的"共有"啟動子，其具有"-35"區(qū)的序列TTGACA和"-10"區(qū)的序列TATAAT。在另外的更加優(yōu)選實(shí)施方式中，串聯(lián)啟動子含有至少兩個拷貝的啟動子。"mRNA加工/穩(wěn)定化序列"在本文定義為位于一個或多個啟動子序列下游和編碼序列上游的序列，該編碼序列與一個或多個啟動子序列中的每個可操作地連接，這樣可以將所有從每個啟動子序列合成的mRNA加工以產(chǎn)生mRNA轉(zhuǎn)錄物，在該轉(zhuǎn)錄物的5'端具有穩(wěn)定子序列。在mRNA轉(zhuǎn)錄物5，端的這種穩(wěn)定子序列的存在增加它們的半衰期(AgaisseandLereclus,1994,Hueefa/.,1995,Jowma/。/Ba"en'o/ogy177:3465-3471)。mRNA加工/穩(wěn)定化序列與細(xì)菌16S核糖體RNA的3，端互補(bǔ)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，mRNA加工/穩(wěn)定化序列產(chǎn)生基本上單一大小的轉(zhuǎn)錄物，在該轉(zhuǎn)錄物5'端具有穩(wěn)定化序列。mRNA加工/穩(wěn)定化序列優(yōu)選是一個與細(xì)菌16S核糖體RNA的3'端互補(bǔ)的序列。參見，美國專利No.6,255,076和5,955,310。在更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，mRNA加工/穩(wěn)定化序列是蘇云金芽孢桿菌mRNA加工/穩(wěn)定化序列，其公開于WO94/25612和AgaisseandLereclus，1994,同上，或其保留mRNA加工/穩(wěn)定化功能的部分。在另外的更加優(yōu)選實(shí)施方式中，mRNA加工/穩(wěn)定化序列是枯草芽孢桿菌SP82mRNA加工/穩(wěn)定化序列，其公開于Hued,1995，同上，或其保留mRNA加工/穩(wěn)定化功能的部分。當(dāng)將啟動子及其mRNA加工/穩(wěn)定化序列用于本發(fā)明的方法中時，可以使用DNA片段，其含有WO94/25612和AgaisseandLereclus,1994,同上公開的序列或其保留啟動子和mRNA加工/穩(wěn)定化功能的部分。此外，可以使用本領(lǐng)域公知的方法制備僅含有co^7"啟動子或僅含有c^//"mRNA加工/穩(wěn)定化序列的DNA片段，以構(gòu)建不同的串聯(lián)啟動子和mRNA加工/穩(wěn)定化序列組合。在該實(shí)施方式中，C7//"啟動子及其mRNA加工/穩(wěn)定化序列優(yōu)選地位于構(gòu)成串聯(lián)啟動子的其它啟動子序列的下游和目標(biāo)基因的編碼序列的上游。然后可將分離的核酸序列進(jìn)一步進(jìn)行操作以改進(jìn)該核酸序列的表達(dá)，所述核酸序列編碼所需的涉及透明質(zhì)酸產(chǎn)生的酶?？衫斫獾氖潜磉_(dá)包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于，轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。使用克隆方法修飾核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。可將包含編碼酶的核S臾序列的核酸構(gòu)建體與一個或多個調(diào)控序列可操作連接，該調(diào)控序列在與其相容的條件下能夠指導(dǎo)芽孢桿菌屬細(xì)胞中編碼序列的表達(dá)。需的或有利的所有成分。每種調(diào)控序列對于編碼酶的核酸序列可以是天然的或外源的。除了上述的啟動子序列之外，這些調(diào)控序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、信號序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況下，調(diào)控序列包括啟動子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯的停止信號。調(diào)控序列可以與接頭一起提供，所述接頭的目的是引入特異性限制位點(diǎn)，促進(jìn)調(diào)控序列與編碼酶的核酸序列的編碼區(qū)的連接。調(diào)控序列還可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其是由芽孢桿菌屬細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列與編碼酶或操縱子最后的酶的核酸序列3，末端可操作連接。在所選芽孢桿菌屬細(xì)胞中有功能的任何終止子均可以在本發(fā)明中使用。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其是mRNA非翻譯區(qū)，對于芽孢桿菌屬細(xì)胞的翻譯是重要的。前導(dǎo)序列與編碼酶的核酸序列的5，末端可操作連接。在所選芽孢桿菌屬細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列可以用于本發(fā)明中。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的氨基末端連接的氨基酸序列，其能夠指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。信號肽編碼區(qū)對于多肽可以是天然的或可以得自外源。核酸序列編碼序列的5'端可以固有地j(inherently)含有信號肽編碼區(qū)，其天然地在翻譯閱讀框之內(nèi)與編碼所分泌多肽的編碼區(qū)片段連接。或者，編碼序列的5，端可以含有信號肽編碼區(qū)，其對于編碼所分泌多肽的編碼序列部分是外源的。當(dāng)編碼序列通常不含有信號肽編碼區(qū)時，所述外源信號肽編碼區(qū)可能是需要的?；蛘?，外源信號肽編碼區(qū)可以筒單地取代天然信號肽編碼區(qū)，以獲得相對于通常與編碼序列連接的天然信號肽編碼區(qū)增強(qiáng)的多肽分泌。信號肽編碼區(qū)可以從芽孢桿菌屬菌種的淀粉酶或蛋白酶基因獲得。然而，能夠指導(dǎo)表達(dá)多肽進(jìn)入所選芽孢桿菌屬細(xì)胞分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)可以在本發(fā)明中使用。對于芽孢桿菌屬細(xì)胞有效的信號肽編碼區(qū)是獲得自以下基因的信號肽編碼區(qū)來自芽孢桿菌屬NCIB11837的產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因、嗜熱脂肪芽孢4干菌a-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌(3-內(nèi)酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因("/rr、"/aS、w/^局和枯草芽孢桿菌praJ基因。另夕卜的信號肽由SimonenandPalva，1993,Mi'cra6/o/og7'ca/i^We柳57:109-137描述。調(diào)控序列還可以是前肽編碼區(qū)(propeptidecodingregion),其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽被認(rèn)為是酶原(proenzyme)或多肽原(propolypeptide)(或在某些情況下是酶原(zymogen))。多肽原通常是無活性的，并且能夠通過催化或自催化切割來自該多肽原的前肽而轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。前肽編碼區(qū)可以從枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(op^)和枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(^^7)的基因獲得。當(dāng)信號肽和前肽區(qū)二者均存在于多肽的氨基末端時，將前肽區(qū)置于緊4妾著多肽的氨基末端，而將信號肽區(qū)置于緊接著前肽區(qū)的氨基末端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細(xì)胞的生長調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是響應(yīng)化學(xué)或物理刺激，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而引起基因表達(dá)開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括/ac、toc和^p操縱基因系統(tǒng)。表達(dá)載體在本發(fā)明的方法中，可以使用重組表達(dá)載體用于重組生產(chǎn)在透明質(zhì)酸生產(chǎn)中涉及的酶，所述載體包含核酸序列，啟動子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號?？梢詫⑸鲜龅亩喾N核酸和調(diào)控序列結(jié)合在一起，以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，其可能包括一個或多個方便的限制位點(diǎn)，以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽或酶的核酸序列?；蛘撸梢酝ㄟ^將核酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入用于表達(dá)的適當(dāng)載體中來表達(dá)核酸序列。在制備表達(dá)載體的過程中，將編碼序列置于載體中，使得該編碼序列與用于表達(dá)和可能用于分泌的適當(dāng)調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是能夠方便地進(jìn)行重組DNA方法并且能夠使核酸序列表達(dá)的任何載體。載體的選擇將通常依賴于載體與引入該載體的芽孢桿菌屬細(xì)胞的相容性。載體可以是線性的或閉合環(huán)狀的質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制的載體，即，作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可以含有保證自復(fù)制的任何手段。或者，載體可以是一種當(dāng)被引入芽孢桿菌屬細(xì)胞中時，整合到基因組中并且與其所整合的染色體一起復(fù)制的載體。載體系統(tǒng)可以是單一載體或質(zhì)粒，或者是兩個或更多個的載體或質(zhì)粒，其共同包含待引入芽孑包桿菌屬細(xì)胞基因組中的總DNA,或可使用轉(zhuǎn)座子。本發(fā)明的載體優(yōu)選包含允許該載體整合到芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞基因組的元件，或者允許該載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組自主復(fù)制的元件。為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可以依賴于編碼多肽的核酸序列或任意其它載體元件，其用于通過同源或非同源重組將載體整合到基因組中。或者，載體可以包含額外的核酸序列用于指導(dǎo)通過同源重組入芽孢桿菌屬細(xì)月包的基因組來進(jìn)行的整合。所述額外的核S交序列使載體能夠整合入芽孢桿菌屬細(xì)胞基因組中染色體內(nèi)的精確位置上。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)該優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，例如100-1,500;咸基對，優(yōu)選400-1,500堿基對，并且最優(yōu)選800-1,500堿基對，其與相應(yīng)的目標(biāo)序列高度同源以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與芽孢桿菌屬細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核S吏序列。另一方面，可以通過非同源重組將載體整合到宿主細(xì)胞基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含復(fù)制起點(diǎn)，其^f吏載體能夠在所述的芽孢桿菌屬細(xì)胞中自主地復(fù)制。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMm的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是一種具有突變的復(fù)制起點(diǎn)，該突變使其在芽孢桿菌屬細(xì)胞中的功能具有;顯度每丈感'f生(參見，例^口，Ehrlich，1978，尸racee^wg^o/AeA^"'o"a/^cat3fe附;/o/Sc/置es園75:1433)。載體優(yōu)選含有一個或多個選擇性標(biāo)記，其允許易于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的&/基因，或賦予抗生素抗性(如氨千青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性)的標(biāo)記。另外，可以通過共轉(zhuǎn)化進(jìn)行選擇，例如，如WO91/09129中所述，其中選擇性標(biāo)記在單獨(dú)的載體上?？梢詫⒍嘤谝粋€拷貝的核酸序列插入宿主細(xì)胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。核酸序列拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或?qū)⒖蓴U(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因包括在核酸序列中，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來選擇含有選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增的拷貝的細(xì)胞，并由此選擇核酸序列的額外拷貝。用于實(shí)現(xiàn)基因組DNA序列擴(kuò)增的方便的方法在WO94/14968中描述。用于連接上述元件以構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見，例如，Sambrookefa/"1989，同上)。生產(chǎn)方法在本發(fā)明的方法中，使用本領(lǐng)域已知的方法，將芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞在適合于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，可以通過在合適的培養(yǎng)基中以及允許涉及透明質(zhì)酸合成的酶表達(dá)和透明質(zhì)酸分離的條件下進(jìn)行的、實(shí)驗(yàn)室中或工業(yè)發(fā)酵罐中的搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細(xì)胞。在包含碳源和氮源和無機(jī)鹽的合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，使用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可以從商業(yè)供應(yīng)商獲得，或可以根據(jù)已公開的組成(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。分泌的透明質(zhì)酸能夠直接從培養(yǎng)基中回收。所得透明質(zhì)酸可以通過本領(lǐng)域已知的方法分離。例如，透明質(zhì)酸可以乂人營養(yǎng)培養(yǎng)基中通過常規(guī)方法分離，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。然后可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法進(jìn)一步純化分離的透明質(zhì)酸，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、色譜聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)或提取(參見，例如，Pw折ca"o",J,C.JansonandLarsRyden，editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。在本發(fā)明的方法中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞產(chǎn)生每升多于約4g，優(yōu)選多于約6g,更優(yōu)選多于約8g,甚至更優(yōu)選多于約10g，并且最優(yōu)選多于約12g的透明質(zhì)酸。缺失/破壞可以使用基因缺失或取代技術(shù)將選擇性標(biāo)記基因或其它不需要的基因完全去除。在這些方法中，選擇性標(biāo)記基因的缺失可以通過使用質(zhì)粒的同源重組完成，將該質(zhì)粒構(gòu)建成鄰近地(contiguously)包含在選擇性標(biāo)記基因側(cè)翼的5'和3'區(qū)?？梢詫⑧徑?'和3'區(qū)引入芽孢桿菌屬細(xì)胞中的溫度敏感型質(zhì)粒，例如pE194上，與第二選擇性標(biāo)記相連，在允許的溫度下使質(zhì)粒在細(xì)胞中確立(established)。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至非允許溫度以選擇在同源側(cè)翼區(qū)之一具有整合入染色體的質(zhì)粒的細(xì)胞。質(zhì)粒整合的選擇通過選擇第二選擇標(biāo)記來實(shí)現(xiàn)。整合之后，通過將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至允許溫度不進(jìn)行選擇地增殖幾代來刺激第二同源側(cè)翼區(qū)的重組事件。將細(xì)胞涂板以獲得單菌落，并檢查所述菌落的兩種選擇標(biāo)記的缺失(參見，例如，Perego,1993,/"A丄.Sonneshein,J.A.Hoch,andR.Losick，editors,Bac/〃usswto'fc朋c(9f/zerGV調(diào)-Po礎(chǔ)ve6a"en'a,Chapter42,AmericanSocietyofMicrobiology,Washington,D.C.,1993)。選擇性標(biāo)記基因還可以如下通過同源重組去除將包含缺陷型基因的5'和3'區(qū)，但是缺乏選擇性標(biāo)記基因的核酸片段引入突變細(xì)胞，然后在反選才奪培養(yǎng)基(counter-selectionmedium)上選4奪。通過同源重組，將含有選擇性標(biāo)記基因的缺陷型基因用缺乏選擇性標(biāo)記的核酸片段取代。也可以使用本領(lǐng)域已知的其它方法。美國專利No.5,891,701公開了用于缺失幾種基因的技術(shù)，包括wo/L4C、a/rE1、"/r五和am_y￡。也可以通過上述方法去除其它不需要的生物化合物，例如由c;^Z(登錄在優(yōu)選的實(shí)施方式中，未用任何異源或外源選擇性標(biāo)記對芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞不產(chǎn)生由cypZ和yvmC合成的任何紅色素。實(shí)施例實(shí)施例1如WO2003054163中詳細(xì)公開的來構(gòu)建重組芽孢桿菌屬菌抹，將其涉及菌抹構(gòu)建的內(nèi)容通過引用并入本文。然后如下培養(yǎng)該菌抹首先是于恒溫在瓊脂上的種子階段(seedstage);然后是于恒溫在攪拌罐中的種子階段；最鄉(xiāng)冬是在有利于芽孢桿菌屬菌林的生長的初始溫度(例如37。C)在攪拌罐中的補(bǔ)料分批主發(fā)酵。隨后，在起始之后，在不同的實(shí)驗(yàn)中，將發(fā)酵溫度調(diào)高或調(diào)4氐至范圍在17-52°C的多種其它設(shè)定溫度。然后在補(bǔ)料分批階段起始之后，在7小時期間保持該溫度恒定。在每升由6.5gKH2P04、4.5gNa2HP04、3.0g(NH4)2S04、2.0gNar檸檬酸-21120、3.0gMgS04'7H20、6.0mlMikrosoy-2、0.15mg生物素(lml0.15mg/ml乙醇)、15.0g蔗糖、1.0mlSB2066、2.0mlP2000、0.5gCaCl2.2H20組成的培養(yǎng)基中，在標(biāo)準(zhǔn)小型發(fā)酵罐中發(fā)酵芽孢桿菌屬菌林。在高壓滅菌之前培養(yǎng)基是pH6.3-6.4(未調(diào)節(jié))。CaCl2'2H20在高壓滅菌之后添加。使用的種子培養(yǎng)基是B-3，即，不含瓊脂的Agar-3，或者"S/S-1"培養(yǎng)基。Agar-3培養(yǎng)基每升由4.0g營養(yǎng)肉湯(nutrientbroth)、7.5g水解蛋白、3.0g酵母提取物、1.0g葡萄糖和2%瓊脂組成。未調(diào)節(jié)pH;高壓滅菌之前的pH為約6.8;高壓滅菌之后約為pH7.7。蔗糖/大豆種子搖瓶培養(yǎng)基(S/S-l)每升由65g蔗糖、35g大豆粉(soyflour)、2gNa3-檸檬酸'2H20(二水合檸檬酸三鈉)、4gKH2P04、5gNa2HP04和6ml痕量元素組成。用NaOH將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至大約pH7;在將培養(yǎng)基分配至搖瓶后，添加0.2%植物油來抑制起泡。痕量元素每升由100g檸檬酸-H20、20gFeS04.7H20、5gMnS04.H20、2gCuS04.5H20和2gZnCl2組成。在接種之前用氨水將pH調(diào)節(jié)至6.8-7.0，并且在此之后用氨水和H3P04將pH控制在pH7.0+0.2。將溫度保持在37。C。在3升的罐中，初始體積為1.5升，使用6cm直徑的兩個6-葉片拉什頓葉輪(6-bladedrushtonimpeller)以最大1300RPM進(jìn)行攪拌。通氣最大值為1.5VVM。就補(bǔ)料而言，使用簡單的蔗糖溶液。在接種約4小時之后，當(dāng)溶解氧仍然在降低時(即，蔗糖耗盡之前)，開始補(bǔ)料。將溫度轉(zhuǎn)換到預(yù)先選擇的范圍在37-52。C的較高溫度。然后在7小時的時間跨度(timespan)期間，將補(bǔ)料速率從0斜線上升(ramplineariy)至大約6g蔗糖/L0-小時。在某些發(fā)酵中，也使用較低的發(fā)酵速率，即從O斜線上升至大約2g蔗糖/L0-小時。通過如下方法去除細(xì)胞用3份水稀釋1份培養(yǎng)物，充分混合并于大約30,000xg離心以產(chǎn)生澄清的上清和能夠被洗滌并干燥的細(xì)胞沉淀。基于結(jié)合乙酰透明質(zhì)酸的蛋白，使用ELISA方法進(jìn)行透明質(zhì)酸濃度的測定(蛋白和試劑盒可從SeikagakuAmerica,Falmouth,MA以商業(yè)方法獲得)。佳_用修飾的呻哇法(carbazolemethod)測定透明質(zhì)酸濃度(BitterandMuir，1962，AnalBiochem.4:330-334)。使用GPCMALLS.試驗(yàn)測定分子量。使用以下步驟從GPCMALLS試-驗(yàn)收集數(shù)據(jù)。GPC-MALLS(與多角度激光散射偶聯(lián)的凝膠滲透或大小排阻層析)廣泛用于表征高分子量(MW)聚合物?；诓煌琈W的分子在洗脫劑和樹脂之間的差示分配(differentialpartition),通過GPC實(shí)現(xiàn)聚合物的分離。通過MALLS基于不同MW的分子的差示散射范圍/角度來測定單獨(dú)聚合物的平均分子量。適用于透明質(zhì)酸的GPC-MALLS的原理和》見程由Uenoda/.,1988,C/zew.尸/zam.Bw〃.36,4971-4975;Wyatt，1993，^cto272:l畫40;和WyattTechnologies,1999，"LightScatteringUniversityDAWNCourseManual"and"DAWNEOSManual"WyattTechnologyCorporation,SantaBarbara,California描述。使用Agilent1100等度(isocratic)HPLC，TosohBiosepG6000PWxl柱用于GPC，和WyattDownEOS用于MALLS。將AgilentG1362A折于洗脫液濃度的測定。分子量已知的各種商業(yè)透明質(zhì)酸產(chǎn)品作為標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果示于圖1，如通過GPC-MALLS所測定的，趨勢是在發(fā)酵結(jié)束時的平均分子量是保持恒定7小時的最終發(fā)酵溫度的函數(shù)。附圖令人驚訝地顯示能夠通過謹(jǐn)慎地選擇和操作發(fā)酵溫度來選擇期望的MW。在17。C的低最終溫度存在最大MW,而在52°C的高最終發(fā)酵溫度存在最小MW。通過選擇分子量的非零起點(diǎn)來保護(hù)真實(shí)最大值的同一性(identity)。權(quán)利要求1.用于產(chǎn)生具有范圍在20,000-800,000道爾頓的期望平均分子量的透明質(zhì)酸的方法，所述方法包括步驟:(a)在有益于重組芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞生長的第一溫度培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，其中所述芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含與啟動子序列可操作地連接的乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼序列，所述啟動子序列對于所述乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼序列是外源的；(b)然后在適合于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的條件下，在高于步驟(a)中第一溫度的第二溫度，培養(yǎng)步驟(a)的重組芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，所述芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞由此產(chǎn)生具有范圍在20,000-800,000道爾頓的期望平均分子量的透明質(zhì)酸；和(b)回收透明質(zhì)酸。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼序列編碼I組乙酰透明質(zhì)酸合酶。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述I組乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼序列獲得自《連3求菌屬菌才朱。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述鏈球菌屬菌抹是似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌或馬鏈球菌獸瘟亞種。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述乙酰透明質(zhì)S臾合酶編碼序列編碼II組乙酰透明質(zhì)酸合酶。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述II組乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼序列獲得自巴斯德氏菌屬菌才朱。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述巴斯德氏菌屬菌林是多殺巴斯德氏菌。8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中向芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞供應(yīng)透明質(zhì)酸的前體糖或者由芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞產(chǎn)生透明質(zhì)酸的前體糖。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述前體糖是D-葡糖醛酸或N-乙?；?葡糖胺。10.權(quán)利要求8或9的方法，其中在芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞中，所述前體糖由內(nèi)源基因編碼，由非內(nèi)源基因編碼，或者內(nèi)源基因和非內(nèi)源基因的組合編碼。11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包含編碼透明質(zhì)酸的前體糖生物合成中的酶的一個或多個基因；或者所述芽^i干菌屬宿主細(xì)胞進(jìn)一步包含一個或多個另外的核酸構(gòu)建體，其包含編碼透明質(zhì)酸的前體糖生物合成中的酶的一個或多個基因。12.權(quán)利要求ll的方法，其中所述一個或多個基因選自下組UDP-葡糖6-脫氫酶基因、UDP-葡糖焦磷酸化酶基因、UDP-N-乙酰基葡糖胺焦磷酸4匕酶基因、葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因、己糖激酶基因、葡糖磷酸變位酶基因、酰胺轉(zhuǎn)移酶基因、變位酶基因和乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述UDP-葡糖6-脫氫酶基因是/z^S基因或/waD基因；或它們的同源物。14.權(quán)利要求12的方法，其中所述UDP-葡糖焦磷酸化酶基因是/zosC基因或gtoB基因；或它們的同源物。15.權(quán)利要求12的方法，其中所述UDP-N-乙酰基葡糖胺焦磷酸化酶基因是/z^D或gcaD基因；或它們的同源物。16.權(quán)利要求12的方法，其中所述葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因是/zo^基因或其同源4勿。17.權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼前體糖的一個或多個基因與乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼序列在相同或不同的啟動子控制下。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述相同或不同的啟動子序列包含"共有"啟動子，其具有"-35"區(qū)的序列TTGACA和"-10"區(qū)的TATAAT。19.權(quán)利要求17或18的方法，其中所述相同或不同的啟動子序列是串聯(lián)啟動子，其中所述串聯(lián)啟動子中的每一個啟動子與乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼序列可操作地連接。20.權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包含mRNA加工/穩(wěn)定化序列，其位于啟動子序列的下游和乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼序列的上游。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包含mRNA加工/穩(wěn)定化序列，其位于編碼前體糖生物合成中酶的一個或多個基因的另外的一種或另外的多種啟動子的下游，和所述一個或多個基因的上游。22.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包含選擇性標(biāo)記基因。23.權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞選自下組5acz7/wagara^2wms、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌；優(yōu)選所述芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。24.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸構(gòu)建體包含與amyg的短"共有，，啟動子可操作地連接的乙酰透明質(zhì)酸合酶基因、UDP-葡外唐6-脫氫酶基因和UDP-葡糖焦磷酸化酶基因，所述啟動子具有"-35"區(qū)的序列TTGACA和"-10"區(qū)的TATAAT。25.權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)的方法，其中所述芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞含有破壞的或缺失的qy;^和/或yvmC基因。26.權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一溫度是30。C-40。C，第二溫度是40°C-52°C。27.權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二溫度比第一溫度高至少rc，優(yōu)選第二溫度比第一溫度高至少2°C,更優(yōu)選比第一溫度高至少3°C、4°C、5。C、6°C、7°C、8°C、9°C、10°C、11°C、12°C、13°C、14°C、15°C、16°C、17°C、18°C、19°C、20°C、21°C，并且最優(yōu)選比第一溫度高至少22°C。28.權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)的方法，其中所述在第二溫度的培養(yǎng)步驟占總培養(yǎng)時間的至少20%，優(yōu)選在第二溫度的培養(yǎng)步驟占總培養(yǎng)時間的至少30%、40%、50%、60%、70%、80%，或者最優(yōu)選至少90%。29.權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二溫度與第一溫度相比足夠高，以使芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞產(chǎn)生具有期望的平均分子量的透明質(zhì)酸，所述平均分子量的范圍是選自下組的分子量范圍20-50kDa、50-100kDa、100-150kDa、150-200kDa、200-250kDa、250-300kDa、300-350kDa、350-400kDa、400-450kDa、450-500kDa、500-550kDa、550-600kDa、600-650kDa、650-700kDa、700-750kDa和750-800kDa。全文摘要本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的方法，所述透明質(zhì)酸具有范圍在20,000-800,000道爾頓的期望的平均分子量，所述方法包括步驟(a)在有益于重組芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞生長的第一溫度培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，其中所述芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞包含核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含與啟動子序列可操作地連接的乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼序列，所述啟動子序列對于所述乙酰透明質(zhì)酸合酶編碼序列是外源的；(b)然后在適合于產(chǎn)生透明質(zhì)酸的條件下，在高于步驟(a)中第一溫度的第二溫度下，培養(yǎng)步驟(a)的重組芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞，所述芽孢桿菌屬宿主細(xì)胞由此產(chǎn)生具有范圍在20,000-800,000道爾頓的期望的平均分子量的透明質(zhì)酸；和(b)回收透明質(zhì)酸。文檔編號C12P19/26GK101384724SQ200780005664公開日2009年3月11日申請日期2007年2月15日優(yōu)先權(quán)日2006年2月15日發(fā)明者斯圖爾特·M·斯托克斯,斯蒂芬·布朗申請人:諾維信生物聚合物公司